Summary
이 기사는 암컷과 수컷을 포함한 여러 속의 모기에서 성공적이고 저소음 근위전도를 위한 단계별 프로토콜을 자세히 설명합니다.
Abstract
암컷 모기는 지구상에서 가장 치명적인 동물로, 혈액 식사를 할 때 전염되는 병원체로 인해 매년 100만 명이 넘는 사람들의 목숨을 앗아갑니다. 먹이를 먹을 숙주를 찾기 위해 모기는 시각적, 기계적, 열적, 후각적 등 다양한 감각 신호에 의존합니다. 이 연구는 연구자들이 모기가 농도에 따라 개별 화학 물질과 화학 물질의 혼합을 감지 할 수 있는지 여부를 평가할 수있는 전기 전기 검사 (EAG) 기술에 대해 자세히 설명합니다. 가스 크로마토 그래피 (GC-EAG)와 결합 할 때,이 기술은 안테나를 전체 헤드 스페이스 / 복잡한 혼합물에 노출시키고 모기가 검출 할 수있는 관심있는 샘플에 존재하는 화학 물질을 결정합니다. 이것은 숙주의 체취뿐만 아니라 식물 꽃다발 또는 기타 생태학적으로 관련된 냄새(예: 산란 부위 냄새 물질)에 적용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 긴 기간의 준비 반응 시간을 허용하고 Aedes, Culex, Anopheles 및 Toxorhynchites 모기를 포함한 여러 속의 암컷 및 수컷 모기 모두에 적용할 수 있는 프로토콜을 설명했습니다. 후각은 일반적으로 모기 숙주 상호 작용 및 모기 생물학에서 중요한 역할을하기 때문에 EAG 및 GC-EAG는 새로운 질병 벡터 제어 전략 (예 : 미끼)의 개발을위한 관심 화합물을 밝힐 수 있습니다. 행동 분석으로 보완하면 각 화학 물질의 원자가 (예 : 유인 물질, 기피제)를 결정할 수 있습니다.
Introduction
모기는 지구상에서 가장 치명적인 유기체로, 연간 백만 명 이상의 목숨을 앗아가고 세계 인구의 절반 이상을 그들이 전염시키는 병원체에 노출될 위험에 처하게합니다. 이 곤충들은 먹이를 먹을 숙주(식물과 동물 모두)를 찾고, 짝짓기와 산란을 하고, 애벌레와 성충 단계 모두에서 포식자를 피하기 위해 광범위한 단서(즉, 열, 시각, 기계, 후각, 청각)에 의존한다 2,3. 이러한 감각 중에서, 후각은 위에서 언급한 행동, 특히 냄새 분자 2,3의 중장거리 검출에 중요한 역할을 한다. 숙주 또는 산란 부위에서 방출되는 냄새는 모기, 족근 및 더듬이에 위치한 다양한 특정 후각 수용체(예: GR, OR, IR)에 의해 감지됩니다 2,3.
후각은 숙주 탐색(식물과 동물), 짝짓기 및 산란 행동의 핵심 구성 요소이기 때문에 모기 방제를 위한 새로운 도구를 개발하기 위한 이상적인 목표가 된다4. 모기 퇴치제(예: DEET, IR3535, 피카리딘)와 미끼(예: BG 센티넬 인간 미끼)에 대한 연구는 매우 풍부하지만5, 현재 모기 방제의 과제(예: 살충제저항성, 침입종)로 인해 모기 생물학에 입각한 새롭고 효율적인 방제 방법을 개발하는 것이 필수적이다.
많은 기술(예: 후각계, 착륙 분석, 전기생리학)이 모기에서 화합물 또는 화합물 혼합물의 생체 활성을 평가하는 데 사용되었습니다. 그 중에서도 electroantennography (또는 electroantennograms (EAG))를 사용하여 냄새 물질이 모기 안테나에 의해 감지되는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이 기술은 Schneider6에 의해 처음 개발 되었으며 그 이후로 나방 7,8,9, 땅벌10,11, 꿀벌 12,13, 초파리14,15를 포함하여 다양한 곤충 속에서 사용되었습니다. Electroantennography는 또한 모기 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25의 단일 또는 다중 안테나를 포함하여 다양한 프로토콜을 사용하여 사용되었습니다.
모기는 비교적 작고 섬세한 곤충으로 다소 얇은 안테나를 가지고 있습니다. 나방이나 땅벌과 같은 더 큰 곤충에 대해 EAG를 수행하는 것은 크기가 크고 안테나가 두껍기 때문에 비교적 쉽지만 모기에서 EAG를 수행하는 것은 어려울 수 있습니다. 특히, 우수한 신호 대 잡음비를 유지하고 지속적인 응답 준비는 데이터 재현성과 신뢰성을 위한 두 가지 주요 요구 사항입니다.
여기에 제안 된 저소음 EAG에 대한 단계별 가이드는 이러한 한계에 대한 솔루션을 직접 제공하고이 프로토콜을 Aedes, Anopheles, Culex 및 Toxorhynchites를 포함한 다양한 속의 여러 모기 종에 적용 할 수 있도록하고 여성과 남성 모두를위한 기술을 설명합니다. Electroantennography는 행동 분석을 통해 원자가를 결정한 후 미끼 개발에 활용할 수 있는 생리 활성 화합물을 스크리닝하고 결정하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
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Protocol
1. 식염수 준비
- 식염수를 미리 준비하여 냉장고에 보관하십시오.
- Beyenbach와 Masia26 을 따라 솔루션을 준비합니다.
참고: mM 단위의 식염수 제조법: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 포도당, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl 2 및 1.0 MgCl2. pH는 1M NaOH로 7.1로 조정됩니다. 선반 보관을 늘리기 위해 이때 포도당이나 자당을 준비에 첨가하지 마십시오. EAG를 실행하기 직전에 식염수에 필요한 양을 추가하십시오 (실험 당 약 50 mL).
2. 냄새 준비 및 보관
- 1.5mL 호박색 바이알에 악취 혼합물 또는 단일 화합물 희석액을 미리 준비하고 화합물 분해를 방지하기 위해 -20°C에서 보관하십시오.
알림: 농도는 수행할 테스트에 따라 다릅니다. 0.1% 또는 1%는 일반적으로 화합물을 검출할 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. 용량-반응 곡선의 경우 주어진 화학 물질의 연속 희석액을 준비하고 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도까지 테스트합니다. - 테스트 된 화학 물질의 용해도에 따라 물, 에탄올, 헥산, 파라핀 오일 또는 미네랄 오일로 희석액을 준비하십시오.
- 실험을 위해 용매 대조군(용매만 들어 있는 바이알)을 준비해야 합니다.
- 실험을 시작하기 30분 전에 냉동실에서 냄새 물질을 제거하여 해동합니다. 화학 물질과 용매를 잘 혼합하기 위해 사용하기 전에 각 바이알을 소용돌이칩니다.
- 라벨이 붙은 유리 주사기 또는 파스퇴르 피펫 내부에 적재된 여과지(0.5cm x 2cm)에 용액 10μL를 피펫팅합니다.
- 오염을 방지하기 위해 특정 파스퇴르 피펫 또는 주사기에 각 화합물 또는 혼합물을 로드합니다.
알림: 실험을 시작하기 10분 전에 로드하여 냄새가 주사기에 퍼질 수 있지만 분해를 방지하기 위해 더 오래 퍼지지 않도록 합니다. 실험이 시작되기 전에 화학 물질이 잘 확산될 수 있도록 이 시점에서 파스퇴르 피펫이나 주사기를 캡을 씌운 상태로 두십시오. - 각 EAG 실행 후 여과지 조각을 폐기하고 새 것으로 교체하여 용지가 너무 많이 젖어 바늘이 막히는 것을 방지하십시오. 바늘을 정기적으로 교체하십시오 (10 회마다).
3. 모기 분리
- 실험 당일 모기를 분리하십시오.
- 실험 당일 최소 6 일 된 모기를 사용하여 암컷이 숙주 관련 냄새 물질에 대한 반응을 향상시키기 위해 짝짓기 할 가능성을 높입니다.
알림: 프로젝트에 따라 테스트 시 모기 나이를 조정하십시오. 생리적 상태(예: 혈액 공급, 굶주림, 이전에 먹인 적이 없음 등)를 확인하고 조화시킵니다. - 모기를 최대 12시간 동안 굶주리게 하여(즉, 설탕에 접근할 수 없음) 동기 부여와 민감성을 높입니다.
- 모기 용기를 냉장고(4°C)에 넣어 비행이 멈출 때까지 두어 개인이 집게로 단일 컵에 쉽게 옮길 수 있도록 합니다.
알림: 추위에 대한 내성이 더 높은 종은 CO2 플라이 패드를 사용하여 내려놓을 수 있습니다. 모기가 건조를 방지하기 위해 오랫동안 모기에 머 무르지 않도록하여 모기 EAG 준비의 반응성을 감소시킵니다. - EAG를 수행하기 전에 단일 모기가 들어있는 컵을 실온에서 보관하고 낮에는 사용하지 않을 수있는 모기를 버리십시오.
4. 전극 홀더 및 모세관 준비
- 모세관 당김, 준비 및 보관
- 필라멘트가 있는 붕규산 모세관(ID: 0.78mm, OD: 1mm)을 사용하십시오. 장비에 따라 당기십시오27.
알림: 당겨진 모세관을 페트리 접시에 보관하십시오. 페트리 접시를 왁스 조각이나 무향 모델링 점토 위에 올려 놓아 움직이거나 깨지지 않도록 합니다. - EAG 실험을 실행하기 전에 현미경으로 한 쌍의 집게로 2 모세 혈관의 끝을 부드럽게 부수십시오.
알림: 목(더 큰 모세관) 또는 더듬이의 끝(더 작은 모세관)에 맞도록 하나가 다른 것보다 약간 더 큰지 확인하십시오. 모세관 벽에 균열이 없고 절단이 깨끗한지 확인하십시오. 이를 위해서는 인내와 연습이 필요합니다. - 그래도 손상되지 않은 경우 실험이 끝난 후 탈이온수(DI)로 헹군 후 이 모세관을 재사용하십시오. 팁에 청소용 물티슈를 부드럽게 발라 여분의 물을 제거합니다. 보관 페트리 접시에 다시 넣으십시오. 팁이 비뚤어지면 모세관을 버리십시오.
- 필라멘트가 있는 붕규산 모세관(ID: 0.78mm, OD: 1mm)을 사용하십시오. 장비에 따라 당기십시오27.
- 전극 홀더 및 모세관 장착
- 서로 다른 색상의 실험실 테이프 조각을 사용하여 두 개의 전극 홀더에 "기록" 및 "참조"라는 레이블을 지정합니다. 이것은 모기 머리와 전극의 장착을 안내하는 데 도움이 될 것입니다.
- 전극 홀더 내부가 깨끗하고 붕규산 파편이 없는지 확인하십시오.
- 염소화: 전극 홀더의 은선을 순수한 표백제에 약 5분 동안 담급니다. 전선은 반짝이는 밝은 회색에서 무광택 짙은 회색으로 바뀝니다.
- 고무 마개를 풀고 20G 바늘을 사용하여 모세관 내부를 10% 식염수로 채웁니다.
- 주사기를 사용하여 붕규산 모세관을 식염수로 채 웁니다. 전극 홀더나 당겨진 모세관에 기포가 없는지 확인하십시오.
알림: 모세관에 기포가 생길 가능성을 줄이려면 바늘을 부드럽게 잡아당기면서 모세관에 식염수를 계속 밀어내고 필라멘트가 있는 모세관을 사용하십시오. 모세관에 1:3 전극 겔과 식염수로 구성된 용액을 로딩할 수 있습니다. 이것은 식염수의 증발을 방지하는 데 도움이 될 수 있으며 실험자가 다른 단계를 완료하는 데 더 많은 시간이 필요하기 때문에 EAG를 배우고 연습 할 때 특히 유용 할 수 있습니다. - 담근 후 은선을 DI 물로 헹구고 두 개의 모세관에 삽입합니다. 와이어 끝이 모세관 끝에서 1mm 미만인지 확인하십시오. 모세관이 전극 홀더 내부의 고무 링이 깨지지 않고 통과하는지 확인하십시오. 고무 마개를 부드럽게 조입니다. 기포가 없는지 확인합니다.
- 기준 전극 홀더(목)에 더 넓은 개구부가 있는 모세관을 사용하고 기록 전극 홀더(안테나)에 더 작은 개구부가 있는 모세관을 사용합니다.
- 헤드를 장착할 준비가 될 때까지 팁이 마르지 않도록 두 개의 장착된 전극 홀더를 습식 청소 물티슈에 그대로 두십시오.
5. EAG 장비 준비 (그림 1)
- 에어 테이블이 위로 올라가 있는지, 항공사에 막힘이 없는지 확인하십시오. 실험 도중에 교체하지 않도록 의료용 공기 탱크가 여전히 가득 차 있는지 확인하십시오. 가습기에 기포가 있는지 확인하십시오.
- 공기 및 펄스 전달 시스템
- 의료용 공기 가스 탱크를 켭니다.
- 두 유량계의 레벨을 확인하십시오.
알림: 전체 실험 동안 준비를 하는 주 기류를 제어하는 유량계는 140mL/분이어야 하고 냄새 펄스와 관련된 다른 유량계는 15mL/분을 읽어야 합니다.
- GC-EAD를 수행하는 경우 기계, 가스 탱크를 켜고 file/메서드를 생성/로드합니다.
- 컴퓨터, 소프트웨어 응용 프로그램, 밸브 전원 공급 장치를 켜고 소프트웨어 응용 프로그램이 작동하려면 인터넷 연결을 확인하십시오.
- 소프트웨어 응용 프로그램: 펄스를 전달하기 위해 짧은 스크립트를 작성할 수 있습니다.
- EAG 소프트웨어 : 전기 생리학 소프트웨어를 사용하십시오.
- 소프트웨어에서 파라미터를 구현합니다(예: 증폭기, 녹음 시간, 펄스 지속 시간 등).
- 펄스를 전달하는 밸브가 작동하는지 확인하기 위해 제어 펄스를 전달합니다.
- 전원 공급 장치를 5.2V로 설정합니다. 증폭기 매개변수를 확인합니다.
알림: 여기에 제시된 데이터에 사용된 매개변수는 다음과 같습니다. 0.1Hz의 낮은 차단 필터; 500Hz의 높은 차단 필터; x100의 이득.
6. 모기 머리 준비 및 장착(그림 2)
- 얼음 위에 알루미늄 판을 놓고 그 위에 습식 세정 물티슈를 놓습니다.
- 구석에 작은 전극 젤 덩어리를 넣으십시오.
- 얼음 위에 모기 컵을 놓고 모기가 몇 분 동안 또는 비행이 멈출 때까지 식히십시오.
알림: 일부 종은 내한성이 있으며 내려가려면 CO2 플라이 패드에 대한 빠른 마취가 필요할 수 있습니다. 모기가 가장 적게 머무를수록 좋습니다. - 모기를 뒤쪽에 놓고 마이크로 가위로 각 안테나의 끝 부분 (마지막 부분의 작은 부분 만)을 자릅니다.
- 집게를 사용하여 전극 젤 덩어리 옆에 모기를 끌고 각 안테나의 끝을 젤에 부드럽게 담그십시오. 전극 젤의 마지막 부분보다 더 많이 담그지 마십시오.
- 집게를 사용하여 모기 안테나를 서로 옆에 유지하면서 잡아 당깁니다. 젤에서 함께 나오게하십시오. 안테나가 청소용 물티슈의 표면에 닿지 않도록 하거나 분리될 수 있습니다.
- 모기를 옆으로 눕히고 마이크로 가위 또는 면도날을 사용하여 머리를 자릅니다.
알림: 헤드가 잘리면 다음 단계와 EAG 장비로 빠르게 진행하여 녹음을 시작하십시오. 준비는 약 30분 동안 반응성을 유지해야 합니다. - 기준 전극을 잡고 젤의 팁을 부드럽게 깊숙이 넣습니다. 목 조직과 접촉을 유지하고 머리가 그 위에 붙도록하십시오.
- 전극 홀더를 EAG 현미경 아래로 이동하고 현미경을 통해 view 헤드 (즉, 기준) 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 배치합니다. 안테나가 중앙에 있는지 확인하십시오.
- 녹음 전극을 잡고 안테나 팁 앞에 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 팁에 최대한 가깝게 이동하고 정렬합니다. 현미경을 사용하여 기록 전극의 끝을 안테나 쪽으로 이동합니다.
- 두 전극 홀더를 앰프에 연결하여 삽입 후 움직이지 않도록 팁을 삽입하기 전에.
- 안테나 팁을 녹음 전극에 삽입합니다. 식염수와 전극 젤에 접촉하기만 하면 모세관을 통해 투명하게 볼 수 있습니다. 안테나는 "흡입 효과"에 의해 들어갑니다.
- 필요한 경우 현미경으로 집게로 머리와 팁의 위치를 조정합니다.
- 공기 튜브를 모기 머리 준비물 가까이에 놓습니다(거리: 1cm).
알림: 머리가 떨어지면 해부소로 돌아가 머리를 다시 장착하거나 분실했거나 머리가 잘린 후 5분 이상 경과한 경우 새 머리를 준비하십시오. 모세관과 목/안테나 사이의 양호한 연결은 저소음 및 안정적인 녹음을 위해 필수적입니다. 이상적으로, 안테나 팁은 일단 삽입되면 기록 전극의 와이어에서 1mm 미만에 있어야 합니다. - 사용하는 경우 광원을 끕니다.
- 모기 머리 준비(거리: 20cm) 근처에 진공 라인을 배치하고 주 항공사에 맞춥니다.
알림: 진공은 자극 후 헤드 준비를 둘러싼 화학 물질을 제거하는 데 도움이 되며, 이는 펄스가 적용된 후 EAG 반응을 유발할 수 있습니다.
7. 녹음
- 안테나의 끝을 삽입한 후 앰프와 노이즈 리듀서를 켭니다. 기준선 신호를 관찰하고 잡음이 없는지 확인하십시오.
알림: 전기 신호에 큰 진동이 있는지 관찰하십시오. 신호가 깨끗해질 때까지 필요에 따라 헤드와 안테나 팁의 위치를 조정합니다. 악어 클립을 사용하여 패러데이 케이지 또는 에어 테이블에 소음을 유발하는 모든 것을 접지하십시오. 진폭이 0.01 mV 미만인 기준선 신호는 미세한 EAG 응답을 감지하고 구별하는 데 이상적입니다. - 소음 수준이 만족스러우면 첫 번째 냄새 주사기를 삽입하여 에어라인 구멍에 테스트합니다.
- 패러데이 케이지를 닫습니다. 소음을 줄이기 위해 준비물 앞에 머 무르지 마십시오.
- EAG 소프트웨어에서 기록을 클릭하십시오.
- 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 펄스를 전달합니다.
알림: 펄스의 수와 지속 시간은 실험에 따라 다릅니다. 여기서, 단일 1 s. 냄새 물질 당 펄스가 사용되었습니다. 냄새 물질은 45 초로 분리되었습니다. - 실험실 노트에서 모기 안테나의 반응을 확인하십시오.
알림: 모기 안테나에서 냄새 물질이 감지되면 신호의 명확한 편향이 관찰됩니다( 그림 3A 참조). - 다음 냄새 또는 농도로 진행하십시오. 용량-반응 곡선이 수행되지 않는 한 냄새 물질의 표시를 무작위로 지정하는 것을 잊지 마십시오.
참고: 음성 대조군과 양성 대조군을 실험에 사용해야 합니다. 이렇게 하면 관찰된 반응이 기계적 또는 전기적 노이즈로 인한 것이 아니라 실제로 후각 반응임을 확인할 수 있습니다. - 녹음이 끝나면 양성 컨트롤을 적용하여 안테나가 여전히 반응하는지 확인합니다.
참고: 지금까지 테스트한 모든 모기 종이 이 화합물에 반응하므로 0.1% 또는 1% 벤즈알데히드를 사용하십시오. - 다음 모기 준비를 진행하십시오.
8. 청소
- 앰프, 소음 감소기, 항공사 및 컴퓨터를 끕니다.
- 냄새 물질을 냉동실에 다시 넣으십시오.
- 유리 주사기에서 여과지를 제거하고 벽에 잔류물이 보이면 100% 에탄올로 청소합니다. 밤새 청소용 물티슈로 말리십시오.
- 전극 홀더를 DI 물로 청소하여 가능한 소금 흔적을 제거합니다. 청소용 물티슈에 부드럽게 발라 물기를 제거합니다.
- 모기 잔여물을 냉동실에 넣고 24시간 후에 폐기하십시오.
알림: 감염된 모기를 다루는 경우 해당 기관의 안전 요구 사항을 따르십시오.
9. 데이터 분석
- EAG 응답을 수동 또는 자동으로 측정하십시오.
참고 : EAG 진폭 (-mV)이 여기에서 측정됩니다. 각 화합물에 대해 여러 펄스가 적용된 경우의 평균입니다. 사용 된 소프트웨어에 따라 EAG를 자동으로 감지하고 측정 할 수 있습니다. 그러나 각 응답을 개별적으로 검사하여 응답의 형태를 확인하고 가능한 이월, 지연 응답 등을 평가하는 것이 중요합니다. 이상적인 EAG 반응은 맥박과 정렬되고, 명확한 편향을 나타내며, 모기 준비간에 반복 가능합니다 (그림 3). - 최소 변동성, 낮은 잡음 신호 및 명확한 응답을 보여주기 위해 원시 데이터를 표시합니다(그림 3B).
참고: 데이터를 정규화할 수도 있습니다(예: Z-점수). 음성 대조군 값(예: 미네랄 오일)(즉, 기준선)은 반응에서 뺄 수 있으며 그렇지 않은 경우 그림으로 제시해야 합니다. 양성 대조군도 제시해야 합니다. - 통계 소프트웨어를 사용하여 통계 분석수행 28.
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Representative Results
Electroantennography는 곤충 안테나에 의해 화학 물질 또는 화학 물질 혼합물이 감지되는지 여부를 결정하는 강력한 도구입니다. 또한 농도의 점진적인 증가를 사용하여 주어진 화학 물질에 대한 검출 역치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다(즉, 용량 곡선 반응, 그림 4B). 또한, 숙주 관련 악취에 대한 반응에 대한 방충제의 효과를 시험하는 것이 유용하다(29).
양성 및 음성 대조군은 항상 EAG에서 사용해야합니다. 여기서, 양성대조군으로 벤즈알데히드를 사용하였다(도 3B, 3C, 4A). 이 화합물은 지금까지 테스트 된 모든 모기 종에서 안테나 반응을 이끌어내는 것으로 밝혀졌습니다24,25,29. 음성 대조군도 사용해야 하며 화학 물질(예: 미네랄 또는 파라핀 오일, 헥산 등)을 희석하는 데 사용되는 용매로 구성될 수 있으며 반응을 이끌어내지 않아야 합니다(그림 3B, 3C, 4A).
실제로, EAG를 수행 할 때, 제어를 적용 할 때 처짐이 주목되어서는 안된다 (그림 3B, 3C, 4A). 반응이 관찰되면 주사기, 용매 제어 및/또는 냄새 라인이 오염되었을 가능성이 있습니다. 이 경우 새로운 용액을 준비하고 주사기를 100% 에탄올로 세척하고 건조하거나 100% 에탄올로 헹구어 오염을 제거한 에어라인을 건조시켜야 합니다. 선택한 대조군이 반응(예: 에탄올)을 유도하는 경우 대조군에 대해 -mV로 얻은 값을 에탄올과 테스트된 화학 물질 조합에 대해 얻은 값에서 빼서 테스트된 화학 물질이 안테나에 미치는 영향을 평가해야 합니다.
모기 종은 다양한 화합물에 반응하는 능력과 반응의 크기가 다릅니다. 예를 들어, Toxorhynchites 모기는 Ae에 비해 매우 큰 EAG를 생산합니다. aegypti, An. Stephensi 및 Cx. quinquefasciatus (그림 3C, 그림 4A).
EAG에서 두 번째 펄스와 다음은 일반적으로 더 작은 EAG 응답으로 이어집니다. 하나의 냄새 물질의 제시는 또한 다음에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 냄새 물질 패널을 효율적으로 테스트하기 위해 냄새 물질 순서와 여러 분석을 무작위화하는 것이 중요합니다 (용량-반응 곡선이 수행되지 않는 한). 또한, 펄스 (예 : 5 초)와 냄새 물질 (예 : 45 초)을 분리하면 EAG 반응을 최적화하는 데 도움이됩니다.
테스트된 화학 물질의 휘발성은 다양하며 후각 반응에 영향을 미칠 수 있으며 테스트된 화학 물질의 휘발성이 매우 낮은 경우 잠재적으로 반응이 지연될 수 있습니다. 분석을 최적화하기 위해 EAG를 수행하기 전에 화학적 휘발성과 용해도를 알아야합니다. 희석액을 제조하는 데 사용되는 용매(예: 에탄올, 헥산, 미네랄 또는 파라핀 오일)도 신중하게 선택해야 합니다. 또한 농도는 현명하게 선택되어야하며 이상적으로는 생태 학적으로 관련이 있어야합니다. 1% 또는 0.1% 농도가 자주 사용되지만 상대적으로 높으며 곤충이 자연에서 경험할 수 있는 것을 반드시 나타내는 것은 아닙니다. 그러나 일부 경우(예: 미끼 개발용)에 비교적 높은 농도의 화합물을 스크리닝하는 것이 유용합니다. 기피제는 시판되는 농도에서 시험할 수 있다(예를 들어, DEET는 전형적으로 40% 농도로 판매된다).
가스 크로마토 그래피 (즉, GC-EADs) 25와 결합하면, 반응을 유도하는 화합물은 GC-MS로 식별 된 다음 다양한 농도 또는 EAG와 혼합하여 개별적으로 테스트 할 수 있습니다. 테스트 된 화학 물질의 원자가는 EAG로 결정할 수 없다는 점을 언급 할 가치가 있습니다. 보완적인 행동 실험(예: 후각계, 섭식 분석)만이 더듬이에 의해 감지된 화학 물질이 모기에게 매력적인지, 혐오스럽거나 중립적인지 여부를 평가할 수 있습니다. 마지막으로, EAG 실험은 말초 신경계의 반응만을 보여줍니다.
그림 1 : 다음으로 구성된 Electroantennogram 설정 : A) 현미경 : 사용 된 현미경은 실험자가 모기 안테나 팁이 기록 전극에 삽입 될 수 있도록 준비를 명확하게 볼 수 있도록해야합니다. B) 콜드 라이트 lamp: 녹음이 시작되면 램프를 꺼야 합니다. C) 진공 라인: 이것은 모기 머리 준비 주위에 냄새 물질이 축적될 위험을 줄여 더듬이 반응이 실제 자극과 분리될 수 있습니다. D) 미세 매니퓰레이터 (x2) : 이것은 기록 전극의 모세관에 모기 안테나를 삽입하는 데 필요한 매우 미세한 전극 홀더 움직임을 허용합니다. E) 녹음 전극 홀더. F) 기준 전극 홀더. G) 헤드 스테이지: 두 전극 모두 헤드 스테이지에 꽂힌 다음 앰프에 연결됩니다. H) 주요 항공사 : 일정한 깨끗한 공기 흐름이 모기 머리를 목욕 시켰습니다. 유량은 유량계에 의해 조절됩니다. I) 솔레노이드 밸브 및 유량계에 연결된 악취 전달용 주사기; J) 에어 테이블: 에어 테이블은 소음을 줄입니다. K) 패러데이 케이지: 패러데이 케이지는 전기 노이즈를 방지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : EAG 기록을위한 단계별 Aedes albopictus 모기 머리 준비. A) 두 안테나가 손상되지 않았는지 확인하기 위해 얼음판에 등을 대고 있는 암컷 모기. B) 마이크로 가위로 안테나 절제의 마지막 부분. C) 안테나를 전극 젤에 담근다. D) 안테나를 빼낸 후 서로 붙습니다. 각 안테나의 한 부분만 전극 젤에 있어야 합니다. E) 모기 머리 절제. F) 기준 전극에 장착된 헤드. EAG 장비로 이동할 수있을만큼 안정적이어야합니다. A'-F'입니다. 남성 EAG에 대해 위에 제시된 것과 동일한 단계입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 모기 EAG 및 원시 EAG 흔적의 개략도. A) EAG 개략도 (왼쪽)와 EAG 응답의 특성 (오른쪽). (왼쪽) 상기 모기 헤드는 기준 전극과 증폭기에 연결된 기록 전극 사이에 장착된다. 안테나는 냄새 자극이 펄스되는 일정한 공기 흐름에 휩싸여 있습니다. 화학 물질을 감지하면 신호의 편향(mV 단위)이 발생합니다. (오른쪽) 화학적 검출은 세포 탈분극(DPR)에 이어 기준선으로 돌아올 때까지 세포 재분극(RPR)으로 이어집니다. 냄새 펄스는 회색 직사각형으로 표시됩니다. 빨간색 선은 EAG 응답의 진폭을 나타냅니다. B) Culex quinquefasciatus 암컷 모기의 전체 EAG 기록 흔적을 강조하는 WinEDR 소프트웨어의 스크린 샷. 상단: 필터링되지 않은(즉, 원시) 신호입니다. 중간: 1초 냄새 펄스는 숫자로 표시됩니다. 하단: 3가지 냄새 유발 물질 및 대조군(미네랄 오일)에 여과된(즉, 1.5 Hz 저역 통과) 신호. 1% 1-헥산올(1), 1% 벤즈알데히드(2) 및 1% 부티르산(3)에 대한 반응의 편향에 유의하십시오. 음성 대조군인 미네랄 오일(4)에 대한 반응이 없음을 주목하십시오. C) 왼쪽에서 오른쪽으로 : 암컷 Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus 및 Toxorhynchites rutilus septentrionalis에서 1 % 벤즈 알데히드 (위) 및 미네랄 오일 대조군 (아래)에 대한 대표적인 EAG 반응 (mV). 1 초 펄스는 EAG 트레이스 위의 컬러 사각형으로 표시됩니다. 벤즈알데히드에 대한 반응의 큰 편향과 미네랄 오일에 대한 반응의 부족에 주목하십시오. 또한 Toxorhynchites rutilus septentrionalis의 다른 척도에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : EAG 결과 및 통계 분석의 예 표현. A. 아니요. Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) 및 Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) 암컷의 평균 EAG 반응은 1 % 1- 헥산 올 (녹색), 1 % 부티르산 (주황색), 1 % 벤즈 알데히드 (노란색) 및 미네랄 오일 (파란색). B. Culex quinquefasciatus 암컷 1- 헥산 올 (왼쪽) (N = 9) 및 벤즈 알데히드 (오른쪽) (N = 8)에 대한 EAG 용량 반응 곡선. 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 오차 막대 위의 문자는 통계적 차이를 나타냅니다(Bonferroni 보정을 사용한 쌍별 Wilcoxon 순위 합계 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
후각 매개 행동은 생리적(예: 연령, 시간) 및 환경(예: 온도, 상대 습도)을 포함한 많은 요인의 영향을 받습니다30. 따라서 EAG를 수행 할 때 동일한 생리적 상태 (즉, 연령 모니터링, 굶주림, 짝짓기)에있는 곤충을 사용하는 것이 필수적입니다 31 건조를 피하기 위해 준비 주변에 따뜻하고 습한 환경을 유지하는 것이 필수적입니다. 약 25 °C의 온도가 이상적이며 주요 항공사의 습도는 60%에서 80%입니다. 이것은 주 항공사 회로에 버블러를 배치하여 쉽게 달성할 수 있습니다.
또한 곤충의 생물학과 관련된 결과를 얻기 위해 각 종의 생태를 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 야행성 종을 사용하는 경우 주관적인 밤 동안 반응을 테스트하기 위해 빛의 주기를 반대로 하는 것을 고려하십시오. 하루 중 특정 순간 (즉, 곤충이 활동할 때)에 EAG를 수행하도록 선택하는 것도 중요합니다. 예를 들어, Ae. aegypti 모기, 이 종의 활동이 최고조에 달하는 동안(즉, 이른 오후와 늦은 오후) 실험을 수행하는 것을 고려하십시오. 다시, 광 사이클은 프로그램가능 타이머(32)를 사용하는 역광 프로그램을 갖는 기후 챔버 또는 라이트 박스를 사용하여 편의를 위해 용이하게 시프트될 수 있다. Eilerts et al.33 및 Krishnan et al.34는 특정 냄새 물질에 대한 민감도가 하루 종일 변한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 곤충의 생태와 생물학에 대한 좋은 지식은 더 정확한 결과를 보장합니다.
소음 (전기적 또는 기계적)은 EAG에 쉽게 도입 될 수 있습니다. 예를 들어, 기계적 섭동은 EAG 준비쪽으로 공기를 불어 넣는 AC 시스템에 의해 생성 될 수 있습니다. Humbug를 사용하면 전기적 노이즈를 줄일 수 있지만, 지속될 경우 요소를 연결하고 악어 클립을 사용하여 패러데이 케이지에 접지하여 추적할 수 있습니다(그림 3B). 이것은 제제 주변에 존재하는 모든 요소 (즉, 현미경, 램프, 미세 조작기)에 적용됩니다. 패러데이 케이지의 일부 장비는 여전히 전기적 노이즈(예: 차가운 광원)를 생성하거나 케이지 외부에 배치할 수 있으므로 녹음 전에 플러그를 뽑아야 합니다. 또 다른 유형의 "소음"은 후각성입니다. 실험자는 향수를 사용하지 않거나 향이 강한 샴푸 또는 세제를 사용해야합니다. 실제로, 이들에서 발견되는 많은 화합물은 모기 (예 : 리 날룰, 시트로 넬올, 게라 니올, 유제 놀)에 의해 검출 될 수 있으며 실험 결과를 방해하고 영향을 미칠 수 있습니다. 실험복과 장갑을 착용하는 것도 항공사, 주사기 및 전극의 원치 않는 오염을 제한하는 데 필수적입니다.
제시된 프로토콜은 수컷과 암컷 모두에서 모든 모기 종에 쉽게 적용 할 수 있다는 장점이 있으며, 제제의 수명을 연장 (> 30 분)하고 제제 간의 변동성이 제한적입니다. 이 방법은 EAG 신호에서 노이즈를 최소화하여 매우 낮은 농도의 화학 물질을 테스트 할 수 있습니다. 해부 및 장착 단계를 마스터하면 이 기술은 비교적 짧은 시간 내에 신뢰할 수 있는 데이터와 간단한 데이터 분석을 생성할 수 있습니다.
Electroantennography는 실험자가 모기가 화학 물질을 탐지 할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다. 그러나, 이러한 화학물질의 원자가를 결정하기 위해서는, 모기 방제를 위한 효율적인 도구를 개발하기 위해 특정 냄새 물질 또는 혼합물이 매력적인지, 혐오스럽거나, 중성인지를 결정하는 데 후각 분석과 같은 보완적 행동 분석법이 중요하다35.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
도움이 되는 토론을 해주신 클레망 비나거(Clément Vinauger) 박사와 제프리 리프펠(Jeffrey Riffell) 박사에게 감사드립니다. 다음의 시약은 BEI Resources, NIAID, NIH를 통해 입수하였다: Anopheles stephensi, 균주 STE2, MRA-128, Mark Q. Benedict에 의해 기여됨; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, David W. Severson 제공; Culex quinquefasciatus, 균주 JHB, 계란, NR-43025. 저자는 Culex quinquefasciatus 및 Anopheles stephensi (균주 : Liston) 모기 알을 제공 한 Jake Tu 박사, Nisha Duggal 박사, James Weger 박사 및 Jeffrey Marano에게 감사드립니다. Aedes albopictus 와 Toxorhynchites rutilus septentrionalis 는 저자가 New River Valley 지역 (VA, USA)에서 수집 한 들판 모기에서 파생됩니다. 이 연구는 생화학과와 Fralin Life Science Institute의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
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