Summary
El presente artículo detalla un protocolo paso a paso para electroantennogramas exitosos y de bajo ruido en varios géneros de mosquitos, incluyendo hembras y machos.
Abstract
Los mosquitos hembra son los animales más mortales de la tierra, cobrando la vida de más de 1 millón de personas cada año debido a los patógenos que transmiten al adquirir una harina de sangre. Para localizar un huésped del que alimentarse, los mosquitos dependen de una amplia gama de señales sensoriales, incluidas visuales, mecánicas, térmicas y olfativas. El estudio detalla una técnica, la electroantenografía (EAG), que permite a los investigadores evaluar si los mosquitos pueden detectar sustancias químicas individuales y mezclas de sustancias químicas de una manera dependiente de la concentración. Cuando se combina con cromatografía de gases (GC-EAG), esta técnica permite exponer las antenas a una mezcla completa de espacio de cabeza / complejo y determina qué productos químicos presentes en la muestra de interés, el mosquito puede detectar. Esto es aplicable a los olores corporales del huésped, así como a los ramos florales de plantas u otros olores ecológicamente relevantes (por ejemplo, odorantes de sitios de oviposición). Aquí, describimos un protocolo que permite largas duraciones de tiempo de respuesta de preparación y es aplicable tanto a mosquitos hembras como machos de múltiples géneros, incluidos los mosquitos Aedes, Culex, Anopheles y Toxorhynchites . Como el olfato juega un papel importante en las interacciones mosquito-huésped y la biología del mosquito en general, los EAG y GC-EAG pueden revelar compuestos de interés para el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores de enfermedades (por ejemplo, cebos). Complementado con ensayos de comportamiento, se puede determinar la valencia (por ejemplo, atrayente, repelente) de cada sustancia química.
Introduction
Los mosquitos son los organismos más mortales de la tierra, cobran la vida de más de un millón de personas por año y ponen a más de la mitad de la población mundial en riesgo de exposición a los patógenos que transmiten, mientras pican1. Estos insectos dependen de una amplia gama de señales (es decir, térmicas, visuales, mecánicas, olfativas, auditivas) para localizar un huésped del que alimentarse (tanto vegetal como animal), para aparearse y oviponerse, así como para evitar depredadores tanto en la etapa larvaria como en la adulta 2,3. Entre estos sentidos, el olfato juega un papel crítico en los comportamientos antes mencionados, en particular para la detección de moléculas odoríferas de mediano a largo alcance 2,3. Los olores emitidos por un huésped o un sitio de oviposición son detectados por varios receptores olfativos específicos (por ejemplo, GRs, ORs, IRs) localizados en los palpos del mosquito probóscide, tarso y antenas 2,3.
Como el olfato es un componente clave de sus comportamientos de búsqueda de huéspedes (plantas y animales), apareamiento y oviposición, constituye un objetivo ideal para estudiar el desarrollo de nuevas herramientas para el control de mosquitos4. La investigación sobre repelentes (por ejemplo, DEET, IR3535, picaridina) y cebos (por ejemplo, señuelo humano centinela BG) es extremadamente prolífica5, pero debido a los desafíos actuales en el control de mosquitos (por ejemplo, resistencia a insecticidas, especies invasoras), es esencial desarrollar nuevos métodos de control eficientes informados por la biología del mosquito.
Se han utilizado muchas técnicas (por ejemplo, olfatómetro, ensayos de aterrizaje, electrofisiología) para evaluar la bioactividad de compuestos o mezclas de compuestos en mosquitos. Entre ellos, la electroantennografía (o electroantennogramas (EAG)) se puede utilizar para determinar si los olores son detectados por las antenas del mosquito. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por Schneider6 y se ha utilizado en muchos géneros de insectos diferentes desde entonces, incluidas las polillas 7,8,9, los abejorros 10,11, las abejas melíferas 12,13 y las moscas de la fruta 14,15, por nombrar algunas. La electroantennografía también se ha empleado utilizando varios protocolos, incluyendo antenas únicas o múltiples en mosquitos 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Los mosquitos son insectos relativamente pequeños y delicados con antenas bastante delgadas. Si bien realizar EAG en insectos más grandes como polillas o abejorros es relativamente fácil debido a su mayor tamaño y antenas más gruesas, la realización de EAG en mosquitos puede ser un desafío. En particular, mantener una buena relación señal-ruido y una preparación receptiva duradera son dos requisitos principales para la reproducibilidad y fiabilidad de los datos.
La guía paso a paso para los EAG de bajo ruido propuesta aquí ofrece directamente soluciones a estas limitaciones y hace que este protocolo sea aplicable a varias especies de mosquitos de varios géneros, incluidos Aedes, Anopheles, Culex y Toxorhynchites, y describe la técnica tanto para hembras como para machos. La electroantennografía ofrece una forma rápida pero confiable de detectar y determinar compuestos bioactivos que luego pueden aprovecharse en el desarrollo del cebo después de que se haya determinado la valencia con ensayos de comportamiento.
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Protocol
1. Preparación de la solución salina
- Preparar la solución salina con antelación y guardar en la nevera.
- Siga a Beyenbach y Masia26 para preparar la solución.
NOTA: Receta salina en mM: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 glucosa, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl 2 y 1.0 MgCl2. El pH se ajusta a 7,1 con 1 M NaOH. No agregue glucosa o sacarosa a la preparación en este momento para aumentar el almacenamiento en el estante. Agregue la cantidad necesaria a la solución salina justo antes de ejecutar los EAG (alrededor de 50 ml por experimento).
2. Preparación y almacenamiento de olores
- Preparar las mezclas odorantes o diluciones de un solo compuesto por adelantado en viales de 1,5 ml de ámbar y almacenar a -20 °C para evitar la degradación del compuesto.
NOTA: Las concentraciones dependerán de la prueba a realizar. 0.1% o 1% se usan comúnmente para determinar si un compuesto puede ser detectado o no. Para una curva dosis-respuesta, prepare diluciones seriadas de una sustancia química determinada y pruébelas desde las concentraciones más bajas hasta las más altas. - Prepare las diluciones en agua, etanol, hexano, aceite de parafina o aceite mineral, dependiendo de la solubilidad del producto químico probado.
- Asegúrese de preparar un control de disolvente (un vial que contenga sólo el disolvente) para el experimento.
- Retire los odorantes del congelador 30 minutos antes de comenzar los experimentos para permitir que se descongelen. Vortex cada vial antes de usarlo para mezclar bien el producto químico y el solvente.
- Pipetear 10 μL de solución en un trozo de papel de filtro (0,5 cm x 2 cm) cargado dentro de una jeringa de vidrio etiquetada o pipeta Pasteur.
- Cargue cada compuesto o mezcla en una pipeta o jeringa Pasteur específica para evitar la contaminación.
NOTA: Cargue 10 minutos antes de comenzar el experimento para que el olor pueda difundirse en la jeringa, pero no por más tiempo para evitar la degradación. Deje que la pipeta o jeringa Pasteur permanezca tapada en este momento para permitir una buena difusión del producto químico antes de que comience el experimento. - Después de cada ejecución de EAG, deseche el trozo de papel de filtro y reemplácelo por uno nuevo para evitar que el papel se empape demasiado y corra el riesgo de bloqueo de la aguja. Reemplace las agujas regularmente (cada 10 corridas).
3. Separación de mosquitos
- Aislar a los mosquitos el día de los experimentos.
- Use mosquitos que tengan al menos 6 días de edad el día de los experimentos para aumentar las posibilidades de que las hembras se apareen para mejorar su respuesta a los olores relacionados con el huésped.
NOTA: Ajuste la edad del mosquito en el momento de la prueba dependiendo del proyecto. Verificar y armonizar el estado fisiológico (por ejemplo, alimentado con sangre, hambriento, nunca alimentado previamente, etc.). - Matar de hambre a los mosquitos hasta 12 h (es decir, sin acceso al azúcar) para aumentar su motivación y sensibilidad.
- Coloque el recipiente para mosquitos en la nevera (4 °C) hasta que deje de volar para que las personas puedan transferirse fácilmente a tazas individuales con fórceps.
NOTA: Las especies con una mayor tolerancia al frío se pueden sacrificar utilizando una almohadilla deCO2 . Asegúrese de que los mosquitos no permanezcan en él durante mucho tiempo para evitar la desecación, lo que disminuiría la capacidad de respuesta de la preparación de EAG del mosquito. - Guarde las tazas que contienen mosquitos individuales a temperatura ambiente antes de realizar los EAG y deseche cualquier mosquito que no se pueda usar durante el día.
4. Soporte de electrodo y preparación capilar
- Tracción, preparación y almacenamiento capilar
- Utilizar capilares de borosilicato con filamentos (I.D: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Tire de ellos dependiendo del equipo27.
NOTA: Almacene los capilares extraídos en una placa de Petri. Coloque la placa de Petri sobre trozos de cera o arcilla de modelar sin perfume para evitar que se muevan y se rompan. - Antes de ejecutar el experimento EAG, rompa suavemente la punta de 2 capilares con un par de pinzas bajo el microscopio.
NOTA: Asegúrese de que uno sea ligeramente más grande que el otro para adaptarse al cuello (capilar más grande) o a las puntas de las antenas (capilar más pequeño). Asegúrese de que el corte esté limpio sin grietas presentes en la pared capilar. Esto requiere paciencia y práctica. - Si aún están intactos, reutilice estos capilares después de enjuagar con agua desionizada (DI) después de que termine el experimento. Retire el exceso de agua aplicando suavemente una toallita limpiadora contra la punta. Vuelva a colocar en la placa de Petri almacenada. Si la punta está torcida, deseche el capilar.
- Utilizar capilares de borosilicato con filamentos (I.D: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Tire de ellos dependiendo del equipo27.
- Soporte de electrodo y montaje capilar
- Etiquete los dos soportes de electrodos como "grabación" y "referencia" utilizando trozos de cinta de laboratorio de diferentes colores. Esto ayudará a guiar el montaje de la cabeza del mosquito y los electrodos.
- Asegúrese de que los soportes de electrodos estén limpios en el interior y que no haya restos de borosilicato.
- Clordidización: Remoje los cables plateados de los soportes de electrodos en lejía pura durante unos 5 minutos. Los cables cambian de gris claro brillante a gris oscuro mate.
- Afloje el tapón de goma y llene el interior del capilar con solución salina al 10% con una aguja de 20 G.
- Llene el capilar de borosilicato con la solución salina usando una jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas ni en el soporte del electrodo ni en el capilar extraído.
NOTA: Para reducir las posibilidades de tener burbujas en el capilar, siga empujando la solución salina en el capilar mientras tira suavemente de la aguja y use capilares con un filamento. Es posible cargar los capilares con una solución compuesta de gel de electrodo 1:3 y solución salina. Esto puede ayudar a prevenir la evaporación de la solución salina y puede ser particularmente útil cuando se aprenden y practican EAG, ya que el experimentador necesitará más tiempo para completar los diferentes pasos. - Después de remojar, enjuague los alambres plateados con agua DI e insértelos en los dos capilares. Asegúrese de que la punta del cable esté a menos de 1 mm de la punta del capilar. Asegúrese de que el capilar pase el anillo de goma dentro del soporte del electrodo sin romperse. Apriete suavemente el tapón de goma. Verifique que no haya burbujas de aire.
- Utilice el capilar con la abertura más ancha en el soporte del electrodo de referencia (cuello) y la abertura más pequeña en el soporte del electrodo de grabación (antenas).
- Deje los dos portaelectrodos montados en una toallita de limpieza húmeda para evitar que la punta se seque hasta que esté lista para montar el cabezal.
5. Preparación de la plataforma EAG (Figura 1)
- Asegúrese de que la mesa de aire esté arriba, que no haya bloqueo en la aerolínea. Asegúrese de que el tanque de aire medicinal todavía esté lleno para evitar cambiarlo en medio del experimento. Asegúrese de que haya burbujas en el humidificador.
- Sistema de suministro de aire y pulso
- Encienda el tanque de gas de aire medicinal.
- Compruebe el nivel de los dos caudalímetros.
NOTA: El caudalímetro que controla la corriente de aire principal que baña la preparación durante todo el experimento debe estar a 140 ml / min y el otro relacionado con el pulso de olor debe leer 15 ml / min.
- Si realiza GC-EAD, encienda la máquina, los tanques de gas y cree / cargue el archivo / método.
- Encienda las computadoras, las aplicaciones de software, la fuente de alimentación de la válvula y verifique la conexión a Internet para que la aplicación de software funcione.
- Aplicación de software: Se puede escribir un breve guión para entregar el pulso.
- Software EAG: utilice cualquier software de electrofisiología.
- Implemente los parámetros en el software (por ejemplo, amplificador, duración de la grabación, duración de los pulsos, etc.).
- Entregar un pulso de control para verificar que la válvula que emite los pulsos es funcional.
- Ajuste la fuente de alimentación a 5,2 V. Verifique los parámetros del amplificador.
NOTA: Los parámetros utilizados para los datos presentados aquí son: filtro de corte bajo de 0.1 Hz; filtro de corte alto de 500 Hz; Ganancia de x100.
6. Preparación y montaje de la cabeza del mosquito (Figura 2)
- Coloque una placa de aluminio sobre hielo y coloque un trozo de toallita de limpieza húmeda sobre ella.
- Coloque una pequeña cucharada de gel de electrodo en una esquina.
- Coloque una taza para mosquitos en hielo y deje que el mosquito se enfríe durante un par de minutos, o hasta que deje de volar.
NOTA: Algunas especies son resistentes al frío y pueden requerir una anestesia rápida sobre una almohadilla deCO2 para bajar. Cuanto menos permanezca el mosquito, mejor. - Coloque el mosquito en su espalda y recorte la punta de cada antena (solo una pequeña porción del último segmento) con micro tijeras.
- Use pinzas para arrastrar el mosquito junto a la cucharada de gel del electrodo y sumerja suavemente la punta de cada antena en el gel. Evite sumergir más que solo el último segmento en el gel del electrodo.
- Usando fórceps, saque las antenas de mosquitos mientras las mantiene una al lado de la otra. Deja que salgan juntos del gel. Asegúrese de que las antenas no toquen la superficie de la toallita de limpieza, o podrían separarse.
- Coloque el mosquito de lado y corte la cabeza con micro tijeras o una hoja de afeitar.
NOTA: Una vez cortado el cabezal, proceda rápidamente a los siguientes pasos y al equipo EAG para iniciar las grabaciones. La preparación debe permanecer receptiva durante unos 30 minutos. - Tome el electrodo de referencia y profundice suavemente la punta en el gel. Manténgase en contacto con los tejidos del cuello y deje que la cabeza se pegue sobre él.
- Mueva los soportes de electrodos bajo el microscopio EAG y vea a través del microscopio para colocar el electrodo de cabeza (es decir, de referencia) en un micromanipulador. Asegúrese de que las antenas estén en el centro.
- Agarre el electrodo de grabación, colóquelo frente a las puntas de las antenas. Muévelo y alinearlo lo más cerca posible de las puntas usando el micromanipulador. Usando el microscopio, mueva la punta del electrodo de grabación hacia las antenas.
- Conecte ambos soportes de electrodos al amplificador antes de insertar las puntas para evitar que se muevan después de la inserción.
- Inserte las puntas de las antenas en el electrodo de grabación. Asegúrese de que solo entren en contacto con la solución salina y el gel del electrodo y que sean visibles por transparencia a través del capilar. La antena entra por el "efecto de succión".
- Ajuste la posición de la cabeza y las puntas con fórceps bajo el microscopio, si es necesario.
- Coloque el tubo de la aerolínea cerca de la preparación de la cabeza del mosquito (distancia: 1 cm).
NOTA: Si la cabeza se cae, regrese a la estación de disección y vuelva a montar la cabeza o prepare una nueva si se ha perdido o si han pasado más de 5 minutos desde que se cortó la cabeza. Una buena conexión entre el capilar y el cuello / antenas es esencial para un bajo nivel de ruido y una grabación confiable. Idealmente, las puntas de las antenas estarán a menos de 1 mm del cable del electrodo de grabación una vez insertado. - Apague la fuente de luz, si la utiliza.
- Coloque la línea de vacío cerca de la preparación de la cabeza del mosquito (distancia: 20 cm) y alinee con la aerolínea principal.
NOTA: El vacío ayudará a eliminar los productos químicos que rodean la preparación de la cabeza después del estímulo, lo que podría conducir a respuestas EAG después de que se aplicaron los pulsos.
7. Grabaciones
- Después de insertar las puntas de las antenas, encienda el amplificador y el reductor de ruido. Observe la señal de referencia y asegúrese de que no sea ruidosa.
NOTA: Observe si hay grandes oscilaciones en la señal eléctrica. Ajuste la posición de la cabeza y las puntas de las antenas según sea necesario hasta que la señal esté limpia. Use pinzas de cocodrilo para conectar a tierra cualquier cosa que introduzca ruido en la jaula de Faraday o en la mesa de aire. Una señal de referencia de menos de 0,01 mV de amplitud es ideal para detectar y discriminar respuestas EAG diminutas. - Una vez que el nivel de ruido sea satisfactorio, inserte la primera jeringa de olor para probar en el orificio de la aerolínea.
- Cierre la jaula de Faraday. No se quede delante de la preparación, para reducir el ruido.
- Haga clic en Grabar en el software EAG.
- Entregue el pulso (s) utilizando la aplicación de software.
NOTA: El número y la duración de los pulsos variarán dependiendo de los experimentos. Aquí, se han utilizado pulsos individuales de 1 s. por odorante. Los odorantes estaban separados por 45 s. - Tenga en cuenta la respuesta de las antenas de mosquitos en el cuaderno de laboratorio.
NOTA: Si las antenas del mosquito detectan el olor, se observa una clara desviación en la señal (ver Figura 3A). - Proceda con el siguiente olor o concentración. No olvide aleatorizar la presentación de los odorantes a menos que se realice una curva dosis-respuesta.
NOTA: En los experimentos se debe utilizar un control negativo y un control positivo. Esto asegurará que las respuestas observadas sean realmente respuestas olfativas y no debidas a ruido mecánico o eléctrico. - Al final de la grabación, aplique un control positivo para verificar que las antenas aún responden.
NOTA: Use benzaldehído al 0.1% o 1% ya que todas las especies de mosquitos analizadas hasta ahora han respondido a este compuesto. - Proceda con la siguiente preparación del mosquito.
8. Limpieza
- Apague el amplificador, el reductor de ruido, la aerolínea y la computadora.
- Devuelva los odorantes al congelador.
- Retire los papeles de filtro de las jeringas de vidrio y limpie con etanol al 100% si hay residuos visibles en las paredes. Deje secar en una toallita de limpieza durante la noche.
- Limpie los portaelectrodos con agua DI para eliminar cualquier posible rastro de sal. Secar aplicando suavemente contra un trozo de toallita limpiadora.
- Coloque los restos de mosquitos en el congelador y deséchelos 24 h después.
NOTA: Si trabaja con mosquitos infectados, siga los requisitos de seguridad de su institución.
9. Análisis de datos
- Mida manual o automáticamente las respuestas del EAG.
NOTA: La amplitud EAG (-mV) se mide aquí. Promedia si se han aplicado múltiples pulsos para cada compuesto. Dependiendo del software utilizado, los EAG se pueden detectar y medir automáticamente. Sin embargo, es esencial inspeccionar cada respuesta individualmente para verificar la forma de la respuesta y evaluar el posible arrastre, la respuesta tardía, etc. La respuesta EAG ideal está alineada con el pulso, muestra una clara desviación y es repetible entre las preparaciones de mosquitos (Figura 3). - Presente los datos sin procesar para mostrar una variabilidad mínima, una señal de bajo ruido y respuestas claras (Figura 3B).
NOTA: Los datos también se pueden normalizar (por ejemplo, puntuación Z). El valor de control negativo (por ejemplo, aceite mineral) (es decir, la línea de base) se puede restar de la respuesta y, si no, debe presentarse en las figuras. También se debe presentar un control positivo. - Realizar análisis estadísticos utilizando cualquier software de estadística28.
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Representative Results
La electroantennografía es una herramienta poderosa para determinar si una antena de insectos detecta un producto químico o una mezcla de productos químicos. También se puede utilizar para determinar el umbral de detección para una sustancia química determinada utilizando un aumento gradual de la concentración (es decir, respuesta de la curva de dosis, Figura 4B). Además, es útil probar los efectos del repelente en la respuesta a los olores relacionados con el huésped29.
Los controles positivos y negativos siempre deben utilizarse en los EAG. Aquí, se utilizó benzaldehído como control positivo (Figura 3B, 3C, 4A). Se ha encontrado que este compuesto provoca una respuesta antenal en todas las especies de mosquitos analizadas hasta ahora24,25,29. También se debe utilizar un control negativo que puede consistir en el disolvente utilizado para diluir los productos químicos (por ejemplo, aceites minerales o de parafina, hexano, etc.) y no debe provocar una respuesta (Figura 3B, 3C, 4A).
De hecho, cuando se realizan EAG, no se debe observar una desviación al aplicar el control (Figura 3B, 3C, 4A). Si se observa una respuesta, es probable que la jeringa, el control de disolvente y/o la línea de olor estén contaminados. Si es el caso, se debe preparar una nueva solución, limpiar la jeringa con etanol al 100% y secarse y/o descontaminar la aerolínea enjuagándola con etanol al 100% y secarla. Si el control elegido provoca una respuesta (por ejemplo, etanol), el valor obtenido en -mV para el control debe restar del valor obtenido para el etanol y el producto químico probado combinado para evaluar el impacto del producto químico probado en las antenas.
Las especies de mosquitos varían en su capacidad para responder a varios compuestos, así como en la magnitud de su respuesta. Por ejemplo, los mosquitos Toxorhynchites producen EAG muy grandes en comparación con Ae. aegypti, An. stephensi y Cx. quinquefasciatus (Figura 3C, Figura 4A).
En los EAG, el segundo pulso y el siguiente generalmente conducen a respuestas EAG más pequeñas. La presentación de un odorante también puede afectar la respuesta a lo siguiente, por lo que es importante aleatorizar el orden del odorante y múltiples ensayos para probar eficientemente un panel de odorantes (a menos que se realice una curva dosis-respuesta). Además, separar la presentación de pulsos (por ejemplo, 5 s) y odorantes (por ejemplo, 45 s) ayudará a optimizar las respuestas de EAG.
La volatilidad de los productos químicos probados varía y puede afectar la respuesta olfativa y potencialmente conducir a una respuesta retardada si el producto químico probado tiene una volatilidad muy baja. La volatilidad química y la solubilidad deben conocerse antes de realizar EAG para optimizar el ensayo. El solvente utilizado para preparar las diluciones también debe seleccionarse cuidadosamente (por ejemplo, etanol, hexano, mineral o aceite de parafina). Además, las concentraciones deben elegirse sabiamente e idealmente deben ser ecológicamente relevantes. A menudo se usa una concentración de 1% o 0.1%, pero es relativamente alta y no necesariamente representativa de lo que los insectos pueden experimentar en la naturaleza. Sin embargo, es útil examinar compuestos con concentraciones relativamente altas en algunos casos (por ejemplo, para el desarrollo de cebos). Los repelentes se pueden probar a su concentración disponible comercialmente (por ejemplo, el DEET generalmente se vende a una concentración del 40%).
Si se combinan con cromatografía de gases (es decir, GC-EADs)25, los compuestos que provocan una respuesta pueden identificarse con un GC-MS y luego probarse individualmente a varias concentraciones o en mezclas con EAG. Vale la pena mencionar que la valencia de los productos químicos probados no se puede determinar con EAG. Solo un experimento conductual complementario (por ejemplo, olfatómetro, ensayo de alimentación) puede evaluar si el químico detectado por las antenas es atractivo, repelente o neutral para el mosquito. Finalmente, los experimentos de EAG solo muestran respuestas del sistema nervioso periférico.
Figura 1: Configuración del electroantennograma compuesta por: A) Microscopio: el microscopio utilizado debe permitir al experimentador ver claramente la preparación para permitir que las puntas de las antenas de mosquito se inserten en los electrodos de registro. B) Lámpara de luz fría: la lámpara debe apagarse cuando comiencen las grabaciones. C) Línea de vacío: esto reduce el riesgo de acumulación de los odorantes alrededor de la preparación de la cabeza del mosquito, lo que podría resultar en respuestas antenales desacopladas de la estimulación real. D) Micromanipuladores (x2): permiten movimientos muy finos de los portaelectrodos, que son necesarios para insertar las antenas de mosquito en el capilar del electrodo registrador. E) Soporte de electrodo de grabación. F) Soporte de electrodo de referencia. G) Etapa de cabeza: ambos electrodos se conectan en la etapa de cabeza que luego se conecta al amplificador. H) Aerolínea principal: un flujo de aire limpio constante bañaba la cabeza del mosquito. El caudal está regulado por un caudalímetro. I) Jeringa para la entrega de olores conectada a la válvula solenoide y al caudalímetro; J) Mesa de aire: la mesa de aire reducirá el ruido. K) Jaula de Faraday: La jaula de Faraday evitará el ruido eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación paso a paso de la cabeza del mosquito Aedes albopictus para las grabaciones de EAG. A) Mosquito hembra en su espalda sobre una placa helada para verificar que ambas antenas estén intactas. B) Último segmento de la escisión de antenas con micro tijeras. C) Las antenas se sumergen en gel de electrodo. D) Las antenas se pegan después de sacarlas. Solo un segmento de cada antena debe estar en el gel del electrodo. E) Escisión de cabeza de mosquito. F) Cabezal montado en el electrodo de referencia. Debe ser lo suficientemente estable como para ser trasladado a la plataforma EAG. A'-F'. Los mismos pasos que se presentaron anteriormente para los EAG masculinos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema del EAG del mosquito y trazas de EAG sin procesar. A ) Esquema del EAG (izquierda) y características de la respuesta del EAG (derecha). (Izquierda) La cabeza de mosquito está montada entre un electrodo de referencia y un electrodo de registro conectado a un amplificador. Las antenas están bañadas en un flujo de aire constante en el que se pulsan estímulos odorantes. La detección de una sustancia química conduce a una desviación (en mV) en la señal. (derecha) La detección química conduce a la despolarización celular (DPR) seguida de la repolarización celular (RPR) hasta el retorno a la línea de base. El pulso odorante está representado por el rectángulo gris. La línea roja indica la amplitud de la respuesta EAG. B) Captura de pantalla del software WinEDR que destaca un rastro completo de registro EAG de un mosquito hembra Culex quinquefasciatus . Arriba: señal sin filtrar (es decir, sin procesar). Medio: 1 s los pulsos de olor se indican con números. Abajo: señal filtrada (es decir, paso bajo de 1,5 Hz) a 3 odorantes y un control (aceite mineral). Tenga en cuenta las desviaciones en respuesta al 1% de 1-hexanol (1), 1% de benzaldehído (2) y 1% de ácido butírico (3). Nótese la ausencia de respuesta al control negativo, aceite mineral (4). C) De izquierda a derecha: Respuestas representativas de EAG (en mV) al 1% de benzaldehído (arriba) y un control de aceite mineral (abajo) en hembras Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus, y Toxorhynchites rutilus septentrionalis. El pulso de un segundo está representado por el rectángulo coloreado sobre la traza EAG. Tenga en cuenta la gran desviación en respuesta al benzaldehído y la falta de respuesta al aceite mineral. Además, tenga en cuenta la escala diferente en Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de representación de los resultados del EAG y sus análisis estadísticos. A. Respuestas promedio de EAG de Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) y Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) hembras al 1% 1-hexanol (verde), 1% ácido butírico (naranja), 1% benzaldehído (amarillo) y aceite mineral (azul). B. Culex quinquefasciatus hembras EAG curva dosis-respuesta para 1-hexanol (izquierda) (N = 9) y benzaldehído (derecha) (N = 8). Las barras representan el error estándar de la media. Las letras sobre las barras de error indican diferencias estadísticas (prueba de suma de rango de Wilcoxon por pares con una corrección de Bonferroni). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los comportamientos mediados olfativos se ven afectados por muchos factores, incluidos los fisiológicos (por ejemplo, edad, hora del día) y ambientales (por ejemplo, temperatura, humedad relativa)30. Por lo tanto, al realizar EAGs, es esencial utilizar insectos que se encuentren en el mismo estado fisiológico (es decir, monitorear la edad, morir de hambre, aparearse)31 y también mantener un ambiente cálido y húmedo alrededor de la preparación para evitar la desecación. Una temperatura alrededor de 25 ° C es ideal y 60% a 80% de humedad para la aerolínea principal. Esto se puede lograr fácilmente colocando un burbujeador en el circuito principal de la aerolínea.
Además, es importante considerar la ecología de cada especie para obtener resultados que sean relevantes para la biología del insecto. Por ejemplo, si usa una especie nocturna, considere invertir su ciclo de luz para probar su respuesta durante su noche subjetiva. La elección de realizar EAG en momentos específicos del día (es decir, cuando el insecto está activo) también es importante. Por ejemplo, si usa mosquitos Ae. aegypti, considere hacer los experimentos durante los picos de actividad de esta especie (es decir, temprano en el día y más tarde en la tarde). Una vez más, el ciclo de luz se puede cambiar fácilmente para mayor comodidad utilizando cámaras climáticas o cajas de luz con un programa de luz invertido utilizando un temporizador programable32. Eilerts et al.33 y Krishnan et al.34, han demostrado que la sensibilidad a olores específicos varía a lo largo del día. Por lo tanto, un buen conocimiento de la ecología y biología del insecto garantizará resultados más precisos.
El ruido (ya sea eléctrico o mecánico) se puede introducir fácilmente en los EAG. Por ejemplo, las perturbaciones mecánicas pueden ser creadas por un sistema de CA que sopla aire hacia una preparación EAG. El ruido eléctrico se puede reducir con el Humbug, pero, si persiste, se puede rastrear conectando elementos y conectándolos a tierra a la jaula de Faraday usando pinzas de cocodrilo (Figura 3B). Esto se aplica a todos los elementos presentes alrededor de la preparación (es decir, microscopio, lámpara, micromanipuladores). Algunos equipos de la jaula de Faraday deben desenchufarse antes de grabar, ya que aún pueden producir ruido eléctrico (por ejemplo, fuente de luz fría) o colocarse fuera de la jaula. Otro tipo de "ruido" es de naturaleza olfativa. El experimentador debe evitar usar perfume o usar champú o detergente fuertemente perfumado. De hecho, muchos compuestos que se encuentran en estos pueden ser detectados por mosquitos (por ejemplo, linalool, citronelol, geraniol, eugenol) y pueden interferir y afectar los resultados de los experimentos. Usar una bata de laboratorio y guantes también es esencial para limitar la contaminación no deseada de la aerolínea, jeringas y electrodos.
El protocolo presentado tiene la ventaja de ser fácilmente aplicable a todas las especies de mosquitos, tanto en machos como en hembras, al tiempo que extiende la longevidad de la preparación (> 30 min) y con una variabilidad limitada entre las preparaciones. Este método conduce a un ruido muy mínimo en la señal EAG, lo que permite probar productos químicos a concentraciones muy bajas. Una vez que se han dominado los pasos de disección y montaje, esta técnica puede producir datos confiables en un período de tiempo relativamente corto y análisis de datos sencillos.
La electroantennografía solo permite al experimentador evaluar si el mosquito puede detectar una sustancia química o no. Sin embargo, para determinar la valencia de este producto químico, los ensayos de comportamiento complementarios, como los ensayos de olfatómetro, son críticos para determinar si un olor o mezcla específica es atractivo, repelente o neutro con el fin de desarrollar herramientas eficientes para el control de mosquitos35.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Agradezco al Dr. Clément Vinauger y al Dr. Jeffrey Riffell por sus útiles discusiones. Los siguientes reactivos se obtuvieron a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, contribución de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribución de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, cepa JHB, huevos, NR-43025. El autor agradece al Dr. Jake Tu, a la Dra. Nisha Duggal, al Dr. James Weger y a Jeffrey Marano por proporcionar huevos de mosquito Culex quinquefasciatus y Anopheles stephensi (cepa: Liston). Aedes albopictus y Toxorhynchites rutilus septentrionalis se derivan de mosquitos de campo recolectados por el autor en el área de New River Valley (VA, EUA). Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Bioquímica y el Instituto de Ciencias de la Vida Fralin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
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