Summary
ハエに対する2選択給餌アッセイのプロトコルを提示します。この給餌アッセイは、高速かつ簡単に実行でき、小規模な実験室の研究だけでなく、ハエの高スループットの行動スクリーンにも適しています。
Abstract
有害な薬剤の消費を避けながら栄養価を持つ食品を選択するには、動物は、彼らの食品環境を評価するために洗練された、堅牢な味覚システムが必要です。フルーツフライ、 ショウジョウバエメラノガスターは、食物好みの分子、細胞、および神経基盤を解読するために広く使用されている遺伝的に難解なモデル生物です。フライ食品の嗜好を分析するには、堅牢な給餌方法が必要です。ここでは、厳格でコスト削減、高速な2つの選択肢の給餌アッセイを説明します。アッセイはペトリ皿ベースで、料理の2つの半分に青または赤の染料を補った2つの異なる食品を追加することを含みます。その後、約70個の飢餓、2〜4日齢のハエを皿に入れ、約90分間暗闇の中で青と赤の食べ物を選ばるようにします。各ハエの腹部の検査は、優先指数の計算に続きます。マルチウェルプレートとは対照的に、各ペトリ皿は充填するのに〜20 sしかかからなく、時間と労力を節約します。この給餌アッセイは、ハエが特定の食物を好きか嫌いかを迅速に判断するために使用することができる。
Introduction
ハエと哺乳類の間の味覚器官の解剖学的構造の劇的な違いにもかかわらず、多くのタスタント物質に対するハエの行動応答は哺乳類の行動と顕著に似ています。例えば、ハエは砂糖1、2、3、4、5、6、7、8、アミノ酸9、10、低塩11を好むが、苦味食品12、13、14、15は好ましくないか毒性である苦味食品を拒絶する。過去20年間、ハエは、味覚検出、味の伝達、味の可塑性、摂食規則16、17、18、19、20など、味覚や食品消費に関する多くの基本的な質問の理解を進める非常に価値のあるモデル生物であることが証明されています。驚くべきことに、多くの研究は、味覚の基礎となる味の伝達および神経回路機構がフルーツハエと哺乳類の間に類似していることを実証している。したがって、フルーツフライは理想的な実験生物として機能し、研究者は動物界の食物検出と消費を支配する進化的に保存された概念と原則を明らかにすることを可能にする。
ハエの味覚を調べるには、食品の嗜好を客観的に測定するための迅速かつ厳格なアッセイを確立することが重要です。長年にわたり、様々な給餌方法、 色素ベースのアッセイ11、12、13、21、22、23、フライプロボシス拡張応答アッセイ24、キャピラリーフィーダー(CAFE)アッセイ25、26フライ液体-食品相互作用カウンター(FLIC)アッセイ27、および他のコンビナトリアル法は、フルーツハエ28、29、30、31の食品嗜好および/または食物摂取量を定量的に測定するために開発された。一般的な供給パラダイムの1つは、マルチウェルマイクロチタープレート12、21、32、またはここで説明するとおり、小さなペトリ皿11、22を給餌室として用いた色素ベースの2選択給餌アッセイである。このアッセイは、ハエの腹部の透明度に基づいて設計されています。このアッセイの間、ハエは供給室に入れられ、赤い染料または青い染料と混合された2つの食糧選択を提示する。アッセイが完了すると、フライ腹部は消費した食品に応じて赤または青に見えます。
ペトリ皿とマルチウェルプレート染料ベースの給餌アッセイは、いずれも非常に堅牢で、ほぼ同じ結果をもたらします。これら2つのアッセイを用いて、食品の味や食感を感知する細胞や高度に多様化した受容体や細胞の解読に向けて数多くの重要な発見とブレークスルーがなされている。染料ベースのアッセイでは、かなりの時間と労力を要する実験ステップの1つが、給餌室に食品を準備してロードすることです。食品の調製およびローディング時間を短縮するために、このアッセイは、マルチウェルマイクロタイタープレートを小さなペトリ皿に置き換えることによって、2つの等しいコンパートメントに分割して修正した。ペトリ皿ベースのアッセイでは、青または赤の染料を補った2つの異なる食品が皿の2つの半分に加えられます。その後、約70個の飢餓、2〜4日齢のハエを皿に入れ、約90分間暗闇の中で青と赤の食べ物を選ばるようにします。次に、各ハエの腹部を調べ、好み指数(PI)を計算します。
このペトリ皿ベースの2選択供給アッセイは、手頃な価格、シンプル、および高速です。1つのマルチウェルプレートは約110 sを充填するのに必要ですが、各ペトリ皿は〜20 sしかかかりません。さらに、マルチウェルプレートは、かなりの精度と注意を必要とする多数の小さな井戸(例えば、プレート当たり60以上の井戸)に少量の食品をピペット化する必要があります。逆に、ペトリ皿ベースのアッセイは、プレートあたり2つのアクションしか必要とします。供給アッセイは多数の複製を伴うことができるので、ペトリ皿ベースのアッセイは、時間と労力の些細な量を節約します。このアッセイは、マルチウェルベースのアッセイと同等の結果を与え、塩味コード11、食品体験22によって修飾された味覚可塑性、及び食品食感感覚33の分子ベースを含む味覚における多くの基本的な質問に対処することに成功したことを証明している。要約すると、このペトリ皿ベースの2選択アッセイは、ハエが適切な摂食行動を引き出すために外部および内部の栄養ミリウスをどのように認識するかを調査するための強力なツールです。
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Protocol
1. アッセイチャンバーの組み立て
注:このプロトコルは35 mmペトリ皿(図1A)の使用を説明していますが、望ましい効果は、二分して覆うことができる水密で滑らかな底の容器を使用して達成することができます。
- まず、プラスチックの長さ(幅5mm、高さ3mm)を防水接着剤で正中線に固定し、2つの水密コンパートメントを形成して、蓋付きの35mmペトリ皿を二分します。シールが完全であることを確認して、2つの食品基質の混合をアッセイする可能性のある漏れを避けてください。
メモ:組み立て後、シールが保持されている限り、この装置を再利用してください。
2. 飢餓バイアルの準備
- 空のプラスチックフライバイアルの十分な数を準備します。その後、下部にあるティッシュペーパーをゆるやかに圧縮します。ティッシュペーパーを十分に圧縮してスペースを埋めますが、密な塊を形成するほどではありません。
注:これはハエが閉じ込められる可能性があるので、組織に深い裂け目や折り目がないことを確認してください。 - バイアルに約3mLの純水を加え、組織が完全に飽和するようにしますが、立っている水はありません。バイアルの壁に余分な水の大きな液滴がないことを確認してください。あるいは、1%w/v寒天溶液(ショ糖なし)を調製し、各空のバイアルに1%アガロースの5mLを加え、アガロースを室温で固化させることによって、浸した紙に代用する。
3. 実験前のハエの濡れた飢餓
- 実験の時間の24時間前に飢餓を開始します。CO2麻酔の下では、〜70、2〜4日齢の種別群は、調製された飢餓バイアルにハエを飛び、各バイアルに遺伝子型と飢餓の時間を標識する。
4. 試薬のセットアップ
- 染料の調製
注: 実験を行う前に、予備制御アッセイを実行して、使用する赤と青の色素の正しい濃度を決定することが重要です。- 対照アッセイのために、各染料に対して希釈剤の範囲を調製し、異なる色の色の異なる色の同じ食品で摂食アッセイを行う。実験化合物を添加しない場合にPIを生じる2色濃度(赤1、青1)を同定するためにその結果を用いる(セクション7参照)。
注:例えば、最終的な青色染料濃度は50μMに固定され、一連の赤色染料濃度に対して試験されました。赤色色素の投薬曲線に基づいて、最適な赤色色素濃度は210μMであり、色素バイアスを最小限に抑えた(図1B)。赤い染料濃度が高いほど、赤い食べ物を好むハエが動き、低濃度のドライブは青い食べ物を好むハエを駆動します。この大きさと大きい値の違いが実験結果に影響を与える可能性があるため、青または赤の染料濃度を1 μM単位で慎重に調整します。
- 対照アッセイのために、各染料に対して希釈剤の範囲を調製し、異なる色の色の異なる色の同じ食品で摂食アッセイを行う。実験化合物を添加しない場合にPIを生じる2色濃度(赤1、青1)を同定するためにその結果を用いる(セクション7参照)。
- 1%アガロースの調製
- マイクロ波安全容器に0.5gのアガロースと50mLの純水(またはその倍数)を組み合わせます。アガロース溶液を溶解するまで電子レンジし、必要に応じて攪拌する。
- その他の食品成分の調製
- スクロースおよび実験化合物を含む各食品成分を、最終試験濃度の100倍以上以上の濃度で水中に溶解する。
注:1%寒天に添加された各食品成分の総量は、10 mLの溶融寒天あたり1 mLを超えてはならない。さもなければ、アガロースは希薄になりすぎて、適切に固化しない。
- スクロースおよび実験化合物を含む各食品成分を、最終試験濃度の100倍以上以上の濃度で水中に溶解する。
- 食品メディアの準備
- 円錐型ポリプロピレン遠心分離管(15または50 mL)で寒天、色素、および所望の実験化合物を混合する。コントロール食品の実験タスタントの代わりに水を使用してください。寒天がまだ完全に液体である間にこれを行い、渦ミキサーを使用して完全に混合します。60°Cの水浴にチューブを保管しながら、アガロースが固まるのを防ぎ、皿に配ります。
- 実験用の料理の準備
注: すべての食器が完全に乾いてから始められるようにしてください。- アッセイ皿の片側に赤い実験用食品培地のピペット1 mL(図1A);希望する料理の数を繰り返します。アガロースをしっかりするまで冷ましてから(3〜5分)、そして皿の反対側に青いコントロール食品のピペット1 mLを入れる(図1A)。コントロール赤/実験青のペアでこのプロセスを繰り返します。
注: 実験を始める前に、すべての料理が完全に設定されていることを確認してください。30分以内に使用してください。
- アッセイ皿の片側に赤い実験用食品培地のピペット1 mL(図1A);希望する料理の数を繰り返します。アガロースをしっかりするまで冷ましてから(3〜5分)、そして皿の反対側に青いコントロール食品のピペット1 mLを入れる(図1A)。コントロール赤/実験青のペアでこのプロセスを繰り返します。
5. 双方向給餌アッセイの実行
- 飛行や登山などの明白な運動活動が観察されないまで、氷上の実験的なフライラインを一時的に麻痺させます。ハエが固定化されたら、バイアルを穏やかに反転し、すべてのハエをアッセイチャンバーに移します。
注:コールドショックは~3~5分かかります。寒さに長時間さらされると、ハエの生理や健康に影響を与える可能性があるため、避けるべきです。 - すぐにカバーをチャンバーに置き、脇に置きます。すべてのハエが転送されたら、暗い、密閉された空間にすべてのチャンバーを移動します。アッセイを90分間実行します。
注:暗い環境では、ハエの視覚的な経路が摂食行動に及ぼす影響を最小限に抑え、皿の外から環境の手掛かりを取り除きます。
6. 双方向給餌アッセイの終了
- 90分経過した後、チャンバーを-20°C冷凍庫に移してハエを犠牲にします。〜1時間後、ハエを数える。
注:冷凍庫に皿を置く前に、各ペトリ皿を反転して、ハエが食べ物に冷凍されないようにします。
7. 食の好みの決定に優先指標(PI)を割り当てる
- 標準的な解剖顕微鏡の下で、個々の皿のハエの腹部の色を調べなさい。ハエを、腹部の色に応じて赤、青、または紫として数えます(図2A)。腹部が50%以上着色されている場合は、ハエを数え、強い供給を示す(図2B)。腹部に食べ物が少ない場所しか含めておらず、食べ物が悪いことを示している場合は、そのハエを除外する(図2C)。
- 青、赤、または青と赤の両方の食品を食べるハエの数がカウントされた後、各ペトリ皿に好みインデックス(PI)を割り当てるには、次の式を使用します。
PI=(実験的食べ物を食べるハエの数) - (コントロール食品を食べるハエの数)/(実験的な食べ物を食べるハエの数)+(コントロールフードを食べるハエの数)+(両方を食べるハエの数)
PI>0は実験化合物の好みを示し、PI<0は実験化合物に対する嫌悪感を示し、PI=0は供給挙動に対する化合物の効果がないことを示す。
8. アッセイチャンバーの洗浄
- 食品基板を掻き出し、無香りの石鹸と水で洗い流すことによって、ペトリ皿を速やかにきれいにします。ペトリ皿を蒸留水に一晩浸します。各皿の分割シールがまだ水密であることを確認し、皿を乾燥させます。
注:残留アガロースまたは染料染色がないことを確認した後、ペトリ皿は再び使用する準備ができています。
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Representative Results
このアッセイでは、35mmの皿を2つの等しい給餌コンパートメントに分け、その皿の半分が青または赤の染料と結合したアガロース食品を含んでいた(図1A)。色素バイアスを排除するために、青色および赤色の染料濃度を慎重に精製し、これら2つの色素のみを添加した場合に、近似的な「0」PIを得た(図1B)。ペトリ皿にテストされた食べ物が積み込まれると、〜70匹の濡れた、2〜4日齢の大人のハエが皿に移され、暗闇の中で2つの食べ物の選択肢の中から選択することができました。90分後、ハエの腹部の色を解剖顕微鏡で調べた。典型的には、動物が主に青または赤の食物(図2A)をそれぞれ消費する場合、ハエ腹部は青または赤に見える。フライが青と赤の両方を消費する場合、その腹部は紫色に変わります(図2A)。
食物の摂取量が不足しているハエを飛ばしながら、かなりの量の食物を摂取するハエを採点した(図2B)。このペトリ皿ベースのアッセイは、マルチウェルプレートベースのアッセイと比較した。結果は、これら2つの摂食方法が野生型ハエの甘い、苦い、または塩辛い食物に対する摂食応答をアッセイする点で本質的に同じ結果を与えることを示している(図3A-C)。特に、60の井戸を含むマルチウェルプレートよりも、ペトリ皿に食品を準備して配布する方がはるかに速いです(図3D)。全体として、ペトリ皿ベースのアッセイは、ハエの食品の好みを迅速に決定するために使用できる堅牢で高速な給餌方法です。
図1:二選択アッセイ装置と染料量曲線(A)ペトリ皿の2つの半分を使用して、2つの異なる食品オプションを提示する。料理の半分は青染めの食品で、残りの半分は赤染めの食品が含まれています。飢えたハエは、彼らが好む食べ物を消費できるように料理に置かれます。(B)アガロース1%のアガロースと2mMショ糖の間で選択した野生型ハエの食品好み(50μMブルー染料または様々な濃度の赤染料を含む)。最適な赤染料濃度は210μM ±です。各データポイントに対して、n = 6試行回数。各試験で約70個のハエが試験された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:青、赤、または青と赤の両方の食品を食べた後に腹部の色を飛ぶ。(A)青い食べ物(右上)、赤い食べ物(左上)、またはその両方を摂取した後のハエの代表的な画像、または腹部を紫色(下)に見せかけます。(B)青い食物の十分な消費を示すハエ。(C)少量の青い食物を摂取した後のハエ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:野生型ハエの異なるタスタントに対するフィードバック応答と、60ウェルプレート対ペトリ皿ベースの給餌装置の食品負荷時間(A)2mSUCと10mMスクロースの間で選択した野生型ハエの食品嗜好。n = 12 の試行、未ペアの学生のt-テスト。(B)10mMカフェインの有無にかかわらず2mMスクロースを含む食品用の野生型ハエの食品好み。n = 10 試行、未ペアの学生のt-テスト。(C)20mM NaClの有無にかかわらず2mMスクロースを含む食品用の野生型ハエの食品好み。n = 10 試行、未ペアの学生のt-テスト。(D) 食べ物を60ウェルプレートとペトリ皿に充填するのに費やした時間。n = 12プレートまたは皿、 *p < 0.0001、未ペアの学生のt-テスト。データはSEM±略語を表します: n.s. = 統計的に有意ではありません。SEM = 平均の標準誤差。NaCl = 塩化ナトリウム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法には、問題が発生する可能性のあるいくつかの重要な手順が含まれます。まず、ハエが安定したデータを提供するのに十分な量の食物を摂取していることを確認します。ハエの食べ物が少なくとも24時間は湿っていて、実験メディアに少なくとも最小限のショ糖濃度(2 mM)が含まれていることを確認してください。さらに食物消費を刺激するために、ハエの生理学的状態に応じて、24時間を超えて湿潤飢餓期間を延長する。あまりにも多くのハエが長期の飢餓を生き残ることができない場合は、バイアルで湿潤飢餓を行うときにティッシュペーパーに十分な水が加えられるようにしてください。ハエを溺死させる可能性のある過度の水を避けてください。第二に、ハエは、濃度が慎重にバランスが取れていない場合、青または赤の染料に対する摂食バイアスを示す傾向があります。染料濃度の小さな変動は、深い摂食効果を有することができる(図1B)。したがって、色素バイアスを防ぐために、染料濃度は正確でなければならない。もしハエが色素の影響を受ける場合は、1μM単位で色素濃度を慎重に調整し、低濃度のショ糖(例えば2mM)を除く実験化合物を除く実験化合物が添加されていない場合にPI= 0をもたらす赤/青色染料濃度ペアを同定するために異なる色素の組み合わせをテストします。新しいフライラインをテストするとき、または新しい染料ストックを作った後に最適な赤または青の色素の協奏を再調整する必要があります。第三に、アッセイが90分に拘束されていることを確認してください。以前の研究22によると、長時間の摂食は味の適応または脱感作につながる可能性がある。
FLIC27やCAFE25アッセイなどの他の給餌技術と比較して、このペトリ皿ベースの2選択アッセイには次の特長と利点があります:(1)シンプルさ:このデバイスはプラスチック仕切りで二分された小さなペトリ皿のみを含みます。食器やプラスチック製の仕切りは安価で組み立てやすいので、実験全体で必要な投資は最小限に抑えられます。(2) 便宜: ペトリ皿ベースの装置は、給餌アッセイをかなりスピードアップする(図3D)。色のスコアリングプロセスはまた規則的な解剖の顕微鏡を使用して速く、簡単である。この方法を使用すると、特定の食品成分に対するハエの好みの好みをすばやくテストすることができます。したがって、小規模な研究と大規模な遺伝子スクリーンの両方に適しています。(3)安定性:各装置のハエを数個しか分析する他の摂食方法とは対照的に、この方法は、一度に多数の成体ハエに対する摂食応答を定量化することを可能にし、個々のハエ間の摂食変動の影響を大幅に最小限に抑える。この色素ベースの2選択給餌アッセイは、厳格かつ再現性があることが証明されており、食品の味および食感11、22、33を知覚する際に欠陥を有する重要なフライ変異体を単離するために使用されてきた。
これらの結果によって示されるように、ペトリ皿ベースのアッセイは、甘い、苦い、および塩味応答のためのマルチウェルベースの摂食アッセイと本質的に同じ結果を生み出すが、ペトリ皿ベースのアッセイは、より小さなバリエーションを有する傾向がある(図3A-C)。染料ベースの給餌アッセイの時間がかかるステップの1つは、給餌室への食品の排出です。60以上の井戸を含むマルチウェルプレートは、溶かしたアガロース食品をプレートあたり60以上の井戸に正確にロードする必要があるため、セットアップに手間がかかります。ペトリ皿には2つの別々のコンパートメントしか含まれないので、ペトリ皿に食べ物を準備してロードする方が、マルチウェルプレートよりもずっと速いです(図3D)。従って、このペトリ皿ベースの方法は、色素ベースのアッセイの堅牢性を維持するだけでなく、アッセイ調製に費やされる時間と労力を大幅に削減し、それによって供給アッセイの容量と速度を大幅に拡大します。その結果、遺伝的スクリーンプロジェクトなどで多数のフライラインを解析するために容易に採用することができる。
染料ベースのアッセイは、そのシンプルさとスピードのためにハイスループットの研究手段を提供しますが、持続時間や体積などの供給のより詳細な定量的側面に関する情報をキャプチャすることはできません。この問題を克服するために、高速カメラを皿の上に設置することができ、各チャンバの給餌時間や周波数などの供給プロセスのより詳細な情報を明らかにする。さらに、他のいくつかの供給パラダイムを使用して、色素ベースの実験から収集したデータを補完することができます。FLIC27やフライプロボシスおよび活動検出器(FlyPAD)34などの自動給餌装置は、給餌の時間的ダイナミクスを記録することができる。CAFEアッセイ25または手動給餌アッセイ35は、消費される食物の量を測定することができる。それにもかかわらず、これらのアプローチには独自の注意点があります。例えば、ペトリ皿やマルチウェルプレートと比較して、自動給餌装置は実験室で設定するために非常に高価です。さらに、各デバイスは一度にわずか数匹のハエをアッセイするので、個々の動物の変動に対してより脆弱になります。CAFEアッセイは、給餌室の中にぶら下がっている毛細管の端まで体を操縦するハエの能力に依存しているため、味覚とは無関係の運動障害によって結果が混乱する可能性があります。
他のアプローチはそれ自体が強力ですが、色素ベースのアッセイは、ハエの食品の好みを迅速に発見し、分析するためのより効率的なツールとなり得ます。さらに、2つの選択肢のセットアップは、光遺伝学36 のような最先端の技術と統合することができ、ハエの摂食行動を選択的かつ鋭的に操作することができる。これは、光の活性化のための皿の半分を使用して行われ、他の半分は、光非アクティブコントロールとして行うことができます。特定のニューロンの直接の活性化または不活性化は、彼らが摂食行動を調節する役割を持っているかどうかを判断するのに役立ちます.要約すると、これらの結果は、ペトリ皿ベースの2選択供給アッセイが、研究者が異なる生理学的および代謝状態下での摂食行動を分析するのに役立つ迅速かつ堅牢な給餌方法であることを示している。
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Disclosures
著者らは、利益相反や競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、2つの選択肢の摂食アッセイを最適化するのを助けてくれたTingwei Mi博士に感謝したいと考えています。彼らはまた、原稿に関する彼らのコメントのためにサミュエル・チャンとワイアット・クールミーズに感謝したいと思います。このプロジェクトは、国立衛生研究所補助金R03 DC014787(Y.V.Z.)およびR01 DC018592(Y.V.Z.)とアンブローズ・モネル財団によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
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