Summary
We presenteren een protocol voor een tweekeuze voertest voor vliegen. Deze voertest is snel en gemakkelijk te uitvoeren en is niet alleen geschikt voor kleinschalig laboratoriumonderzoek, maar ook voor gedragsschermen met hoge doorvoer bij vliegen.
Abstract
Om voedsel met voedingswaarde te selecteren en tegelijkertijd de consumptie van schadelijke stoffen te vermijden, hebben dieren een geavanceerd en robuust smaaksysteem nodig om hun voedselomgeving te evalueren. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster,is een genetisch verhandelbaar modelorganisme dat veel wordt gebruikt om de moleculaire, cellulaire en neurale onderbouwing van voedselvoorkeur te ontcijferen. Om de voorkeur voor vliegvoedsel te analyseren, is een robuuste voedingsmethode nodig. Hier beschreven is een twee-keuze voedingstest, die rigoureus, kostenbesparend en snel is. De test is op basis van Petrischaal en omvat de toevoeging van twee verschillende voedingsmiddelen aangevuld met blauwe of rode kleurstof aan de twee helften van het gerecht. Vervolgens worden ~ 70 voorsterren, 2-4 dagen oude vliegen in het gerecht geplaatst en mogen ze ongeveer 90 minuten kiezen tussen blauw en rood voedsel in het donker. Onderzoek van de buik van elke vlieg wordt gevolgd door de berekening van de voorkeursindex. In tegenstelling tot multiwell-borden duurt elke Petrischaal slechts ~ 20 s om te vullen en bespaart het tijd en moeite. Deze voedingstest kan worden gebruikt om snel te bepalen of vliegen een bepaald voedsel leuk vinden of niet.
Introduction
Ondanks dramatische verschillen in de anatomische structuur van smaakorganen tussen vliegen en zoogdieren, lijken de gedragsreacties van de vliegen op veel smakelijke stoffen opvallend veel op die van zoogdieren. Vliegen geven bijvoorbeeld de voorkeur aan suiker1,2,3,4,5,6,7,8, aminozuren9,10en zoutarm11, die wijzen op voedingsstoffen, maar bitterevoedingsmiddelen 12,13,14,15 afwijzen die onaantrekkelijk of giftig zijn. In de afgelopen twee decennia hebben vliegen bewezen een zeer waardevol modelorganisme te zijn om het begrip van veel fundamentele vragen met betrekking tot smaaksensatie en voedselconsumptie te bevorderen, waaronder detectie van smaak, smaaktransductie, smaakplasticiteit en voedingsregelgeving16,17,18,19,20. Opmerkelijk genoeg hebben een aantal studies aangetoond dat de smaaktransductie- en neurale circuitmechanismen die ten grondslag liggen aan smaakperceptie analoog zijn tussen fruitvliegen en zoogdieren. Daarom dient de fruitvlieg als een ideaal experimenteel organisme, waardoor onderzoekers evolutionair geconserveerde concepten en principes kunnen ontdekken die voedseldetectie en -consumptie in het dierenrijk regelen.
Om smaaksensatie bij vliegen te onderzoeken, is het van cruciaal belang om een snelle en rigoureuze test vast te stellen om de voedselvoorkeur objectief te meten. In de loop der jaren zijn verschillende voermethoden, zoals op kleurstof gebaseerde tests11,12,13,21,22,23,de fly proboscis extension response assay24, de Capillary Feeder (CAFE) assay25,26, de Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) assay27, en andere combinatorische methoden zijn ontwikkeld om de voedselvoorkeur en/of voedselinname voor fruitvliegen kwantitatief te meten28,29,30,31. Een van de populaire voedingsparadigma's is de op kleurstof gebaseerde tweekeuzevoedingstest met behulp van een multiwell microtiterplaat12,21,32 of, zoals hier beschreven, een kleine Petrischaal11,22 als voedingskamer. Deze test is ontworpen op basis van de transparantie van de buik van de vlieg. Tijdens deze test worden vliegen in de voerkamer geplaatst en gepresenteerd met twee voedselopties gemengd met rode kleurstof of blauwe kleurstof. Zodra de test is voltooid, lijken vliegbuiken rood of blauw, afhankelijk van welk voedsel ze hebben geconsumeerd.
Zowel de Petri-schaal als de multiwell-plate voedingstests op basis van kleurstof zijn zeer robuust en leveren ongeveer dezelfde resultaten op. Met behulp van deze twee tests zijn talrijke belangrijke ontdekkingen en doorbraken gedaan in de richting van het ontcijferen van de sterk gediversifieerde receptoren en cellen die verantwoordelijk zijn voor het detecteren van voedselsmaken en voedseltextuur11,12,21,22,32,33. In de op kleurstoffen gebaseerde test is een experimentele stap die veel tijd en moeite vereist, het bereiden en laden van voedsel in de voedingskamer. Om de voedselbereiding en laadtijd te verkorten, werd deze test gewijzigd door de multiwell microtiterplaat te vervangen door een kleine Petrischaal, die is verdeeld in twee gelijke compartimenten. In de petri-schotel-gebaseerde test worden twee verschillende voedingsmiddelen aangevuld met blauwe of rode kleurstof toegevoegd aan de twee helften van het gerecht. Vervolgens worden ~ 70 voorsterren, 2-4 dagen oude vliegen in het gerecht geplaatst en mogen ze ongeveer 90 minuten kiezen tussen blauw en rood voedsel in het donker. De buik van elke vlieg wordt vervolgens onderzocht en de voorkeursindex (PI) wordt berekend.
Deze tweekeuzevoedingstest op basis van petri-gerechten is betaalbaar, eenvoudig en snel. Een multiwell plaat heeft ongeveer 110 s nodig om te vullen, terwijl elke Petrischaal slechts ~ 20 s duurt. Bovendien vereist de multiwell-plaat het pipetten van kleine hoeveelheden voedsel in een groot aantal kleine putten (bijv. 60 of meer putten per bord), wat aanzienlijke precisie en aandacht vereist. Omgekeerd vereist de petri-schotel-gebaseerde test slechts twee acties per bord. Omdat de voedingstest een groot aantal replica's kan omvatten, bespaart de petri-schotel-gebaseerde test een niet-triviale hoeveelheid tijd en moeite. Deze test geeft resultaten die gelijkwaardig zijn aan die van de op multiwell gebaseerde test en is succesvol gebleken in het aanpakken van veel fundamentele vragen in smaaksensatie, waaronder zoutsmaakcodering11, smaakplasticiteit gewijzigd door voedselervaring22, en de moleculaire basis van voedseltextuursensatie33. Kortom, deze op Petri-schotel gebaseerde tweekeuzetest is een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken hoe vliegen externe en interne voedingsomgevingen waarnemen om passend voedingsgedrag uit te lokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montage van de testkamers
OPMERKING: Hoewel dit protocol het gebruik van een 35 mm Petrischaal beschrijft(figuur 1A),kan het gewenste effect worden bereikt met elk waterdicht, gladbodemvat dat kan worden doorsneden en bedekt.
- Snijdt eerst een petrischaal met deksel van 35 mm door een lengte van kunststof (5 mm breed en 3 mm hoog) in de middellijn te bevestigen met waterdichte lijm, waardoor twee waterdichte compartimenten ontstaan. Controleer of de afdichting compleet is om lekkage te voorkomen die kan leiden tot het mengen van de twee voedselsubstraten die worden onderzocht.
OPMERKING: Gebruik dit apparaat na montage opnieuw zolang de afdichting het vasthoudt.
2. Het voorbereiden van hongerflacons
- Bereid een voldoende aantal lege plastic vliegenflacons voor; verdicht vervolgens losjes een stuk tissuepapier aan de onderkant. Comprimeer het tissuepapier voldoende dat het de ruimte vult, maar niet zozeer dat het een dichte massa vormt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen diepe spleten of plooien in het weefsel zitten, omdat dit ertoe kan leiden dat vliegen vast komen te zitten. - Voeg ~3 ml zuiver water toe aan de flacon zodat het weefsel volledig verzadigd is, maar er is geen stilstaand water. Zorg ervoor dat er geen grote druppels overtollig water op de wand van de flacon zitten. U kunt ook agarose vervangen door het geweekte papier door een 1% w/v agar-oplossing (zonder sacharose) te bereiden door 5 ml van 1% agarose aan elke lege flacon toe te voegen en de agarose op kamertemperatuur te laten stollen.
3. Natte verhongering van vliegen voorafgaand aan het experiment
- Start de honger 24 uur voor de tijd van het experiment. Sorteer onder CO2-anesthesie groepen van ~70, 2-4 dagen oude vliegen in de voorbereide hongerflacons en labelen elke flacon met het genotype en het tijdstip van verhongering.
4. Reagens setup
- Bereiding van kleurstoffen
OPMERKING: Voordat u experimenten uitvoert, is het belangrijk om een voorlopige controletest uit te voeren om de juiste concentraties rode en blauwe kleurstoffen te bepalen.- Bereid voor de controletest een reeks verdunningen voor elke kleurstof en voer de voedingstest uit met hetzelfde voedsel met een andere kleurstofkleur. Gebruik de resultaten om concentraties van twee kleurstoffen (één rood, één blauw) te identificeren die een PI van ~0 opleveren wanneer er geen experimentele verbinding wordt toegevoegd (zie rubriek 7).
OPMERKING: De uiteindelijke blauwe kleurstofconcentratie werd bijvoorbeeld vastgesteld op 50 μM en getest op een reeks rode kleurstofconcentraties. Op basis van de rode kleurstofdoseringscurve was de optimale rode kleurstofconcentratie 210 μM, wat minimale kleurstofbias gaf(figuur 1B). Een hogere rode kleurstofconcentratie drijft vliegen om de voorkeur te geven aan rood voedsel, terwijl een lagere concentratie vliegen drijft om de voorkeur te geven aan blauw voedsel. Verfijn de blauwe of rode kleurstofconcentraties zorgvuldig in stappen van 1 μM, omdat verschillen van deze omvang en grotere experimentele uitkomsten kunnen beïnvloeden.
- Bereid voor de controletest een reeks verdunningen voor elke kleurstof en voer de voedingstest uit met hetzelfde voedsel met een andere kleurstofkleur. Gebruik de resultaten om concentraties van twee kleurstoffen (één rood, één blauw) te identificeren die een PI van ~0 opleveren wanneer er geen experimentele verbinding wordt toegevoegd (zie rubriek 7).
- Bereiding van 1% agarose
- Combineer 0,5 g agarose en 50 ml zuiver water (of een veelvoud daarvan) in een magnetronveilig vat. Magnetron de agarose oplossing tot opgelost, roeren indien nodig.
- Bereiding van andere voedingscomponenten
- Los elk voedingsonderdeel, met inbegrip van sacharose en eventuele experimentele verbindingen, op in water in een 100-voudige of hogere concentratie van de uiteindelijke geteste concentratie.
OPMERKING: Het totale volume van elk voedselingrediënt dat aan 1% agar wordt toegevoegd, mag niet groter zijn dan 1 ml per gesmolten agar van 10 ml. Anders kan de agarose te verdunnen zijn en niet op de juiste manier stollen.
- Los elk voedingsonderdeel, met inbegrip van sacharose en eventuele experimentele verbindingen, op in water in een 100-voudige of hogere concentratie van de uiteindelijke geteste concentratie.
- Bereiding van voedselmedia
- Meng agar, kleurstof en de gewenste experimentele verbinding in conische polypropyleen centrifugebuizen (15 of 50 ml); gebruik water in plaats van het experimentele tastant in het controlevoedsel. Doe dit terwijl de agar nog volledig vloeibaar is en meng grondig met behulp van een vortexmixer. Bewaar de buizen in een waterbad van 60 °C terwijl u het niet gebruikt om te voorkomen dat de agarose uithard voordat het in gerechten wordt verdeeld.
- Gerechten bereiden voor het experiment
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle gerechten volledig droog zijn voordat u begint.- Pipet 1 ml rood experimenteel voedingsmedium in één zijde van de testschaal (figuur 1A); herhaal dit voor het gewenste aantal gerechten. Laat de agarose afkoelen tot ze stevig zijn (3-5 min), en pipetteer vervolgens 1 ml blauw controlevoedsel in de andere kant van de gerechten (figuur 1A). Herhaal dit proces met het rode/experimentele blauwe paar.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle gerechten volledig zijn ingesteld voordat u met het experiment begint. Gebruik de gerechten binnen 30 minuten.
- Pipet 1 ml rood experimenteel voedingsmedium in één zijde van de testschaal (figuur 1A); herhaal dit voor het gewenste aantal gerechten. Laat de agarose afkoelen tot ze stevig zijn (3-5 min), en pipetteer vervolgens 1 ml blauw controlevoedsel in de andere kant van de gerechten (figuur 1A). Herhaal dit proces met het rode/experimentele blauwe paar.
5. Het initiëren van de tweerichtingsvoedingstest
- Verlam tijdelijk experimentele vlieglijnen op ijs totdat er geen voor de hand liggende motorische activiteiten zoals vliegen en klimmen worden waargenomen. Zodra de vliegen zijn geïmmobiliseerd, draai je de injectieflacon voorzichtig om en tik je om alle vliegen in de testkamer over te brengen.
OPMERKING: Koude schok duurt ~ 3-5 minuten. Langdurige blootstelling aan kou kan de fysiologie en gezondheid van de vlieg beïnvloeden en moet daarom worden vermeden. - Plaats de hoes snel op de kamer en zet deze opzij. Zodra alle vliegen zijn overgebracht, verplaatst u alle kamers naar een donkere, afgesloten ruimte. Laat de test 90 minuten lopen.
OPMERKING: Een donkere omgeving minimaliseert de invloed van de visuele route van de vlieg op het voedingsgedrag en verwijdert eventuele omgevingssignalen van buiten de schotel.
6. Het beëindigen van de tweerichtingsvoedingstest
- Nadat 90 minuten zijn verstreken, breng je de kamers over naar een vriezer van -20 °C om de vliegen op te offeren. Na ~1 uur, tel de vliegen.
OPMERKING: Zet elke Petrischaal om voordat u de schaal in de vriezer plaatst om ervoor te zorgen dat er geen vliegen op het voedsel worden ingevroren.
7. Een voorkeursindex (PI) toewijzen om de voedselvoorkeur te bepalen
- Onderzoek onder een standaard dissectiemicroscoop de buikkleur van de vliegen in elk afzonderlijk gerecht. Tel de vliegen als rood, blauw of paars volgens de kleur van hun buik (figuur 2A). Tel de vlieg als zijn buik meer dan 50% gekleurd is, wat wijst op robuuste voeding(figuur 2B). Sluit de vlieg uit als zijn buik slechts een kleine voedselvlek bevat, wat wijst op slecht eten (figuur 2C).
- Nadat het aantal vliegen dat blauw, rood of zowel blauw als rood voedsel eet is geteld, gebruikt u de volgende vergelijking om elk Petrischaal een voorkeursindex (PI) toe te wijzen:
PI = (Aantal vliegen dat experimenteel voedsel eet) - (Aantal vliegen dat controlevoedsel eet) / (Aantal vliegen dat experimenteel voedsel eet) + (Aantal vliegen dat controlevoedsel eet) + (Aantal vliegen dat beide eet)
PI > 0 geeft een voorkeur aan voor de experimentele verbinding, PI < 0 duidt op een afkeer van de experimentele verbinding en PI = 0 geeft geen effect van de verbinding op het voedingsgedrag aan.
8. Schoonmaken van de testkamers
- Maak de Petri-gerechten onmiddellijk schoon door het voedselsubstraat eruit te schrapen en te spoelen met ongeparfumeerde zeep en water. Week de Petri gerechten 's nachts in gedestilleerd water. Controleer of de scheidingsafdichting in elke schaal nog waterdicht is en laat de schotel vervolgens aan de lucht drogen.
OPMERKING: Nadat u ervoor hebt gezorgd dat er geen resterende agarose of kleurstofkleuring is, zijn de Petri-gerechten weer klaar voor gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze test werd een schaal van 35 mm verdeeld in twee gelijke voedingscompartimenten, waarbij elke helft van de schaal agarosevoedsel bevat in combinatie met blauwe of rode kleurstof (figuur 1A). Om kleurstofbias uit te sluiten, werden de blauwe en rode kleurstofconcentraties zorgvuldig verfijnd om een geschatte "0" PI op te leveren wanneer alleen deze twee kleurstoffen werden toegevoegd (figuur 1B). Zodra de Petrischaal was geladen met getest voedsel, werden ~ 70 nat uitgehongerde, 2-4 dagen oude volwassen vliegen overgebracht naar het gerecht, waardoor ze in het donker konden kiezen tussen de twee voedselopties. Na 90 minuten werd de buikkleur van de vliegen onderzocht met een dissectiemicroscoop. Meestal lijkt de vliegbuik blauw of rood als het dier voornamelijk blauw of rood voedsel consumeert(figuur 2A). Als de vlieg zowel blauw als rood verbruikt, wordt de buik paars (figuur 2A).
De vliegen die aanzienlijke hoeveelheden voedsel innamen werden gescoord (figuur 2B), terwijl de vliegen werden overgeslagen met onvoldoende voedselinname (figuur 2C). Deze petri-schotel-gebaseerde assay werd vergeleken met de multiwell-plate-based assay. De resultaten tonen aan dat deze twee voedingsmethoden in wezen dezelfde resultaten geven bij het testen van voedingsreacties op zoet, bitter of zout voedsel bij wilde vliegen (figuur 3A-C). Met name is het veel sneller om voedsel in de Petrischaal te bereiden en te distribueren dan in de multiwell-plaat met 60 putten (figuur 3D). Al met al is de petri-schotel-gebaseerde test een robuuste en snelle voedingsmethode die kan worden gebruikt om snel de voedselvoorkeur voor vliegen te bepalen.
Figuur 1: Tweekeuzetestapparaat en kleurstofdoseringscurve. (A) Twee helften van een Petrischaal worden gebruikt om twee verschillende voedselopties te presenteren. De ene helft van het gerecht bevat blauw geverfd voedsel en de andere helft bevat rood geverfd voedsel. Voorgestarveerde vliegen worden in het gerecht geplaatst om ze in staat te stellen het voedsel te consumeren dat ze verkiezen. (B) Voedselvoorkeur voor wilde vliegen die kiezen tussen 1% agarose plus 2 mM sacharose die ofwel 50 μM blauwe kleurstof of verschillende concentraties rode kleurstof bevat. De optimale rode kleurstofconcentratie is 210 μM. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. Voor elk gegevenspunt, n = 6 proeven. Ongeveer 70 vliegen werden getest in elke proef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vlieg buikkleur na het eten vanblauw, rood of zowel blauw als rood voedsel. (A) Representatieve afbeeldingen van vliegen na inname van blauw voedsel (rechtsboven), rood voedsel (linksboven) of beide, waardoor de buik paars lijkt (onder). (B) Een vlieg die voldoende consumptie van blauw voedsel vertoont. (C) Een vlieg na inname van een kleine hoeveelheid blauw voedsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voedingsreacties op verschillende smaakstoffen bij wilde vliegen, en de voedselbelastingstijd voor de 60-well-plate vs Petri-dish-based feeding device. (A) Voedselvoorkeur voor wilde vliegen die kiezen tussen 2 mM sucrose en 10 mM sacharose. n = 12 proeven, ongepaarde Student'st-toetsen. (B) Voedselvoorkeur bij in het wild levende vliegen voor levensmiddelen die 2 mM sacharose bevatten met of zonder 10 mM cafeïne. n = 10 proeven, ongepaarde Student'st-toetsen. (C) Voedselvoorkeur bij in het wild levende vliegen voor levensmiddelen die 2 mM sacharose bevatten met of zonder 20 mM NaCl. n = 10 proeven, ongepaarde Student'st-toetsen. (D) Tijd besteed aan het vullen van voedsel in een 60-put bord en een Petrischaal. n = 12 borden of borden, *p < 0,0001, ongepaarde student t-toetsen. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Afkortingen: n.s. = niet statistisch significant; SEM = standaardfout van het gemiddelde; NaCl = natriumchloride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode omvat verschillende cruciale stappen waar problemen kunnen optreden. Zorg er eerst voor dat vliegen voldoende voedsel binnenkrijgen om stabiele gegevens te verstrekken. Als vliegen slecht eten, zorg er dan voor dat de vliegen minstens 24 uur nat zijn uitgehongerd en dat de experimentele media ten minste een minimale sacharoseconcentratie (2 mM) bevatten. Om de voedselconsumptie verder te stimuleren, verlengt u de natte hongerperiode na 24 uur, afhankelijk van de fysiologische toestand van de vliegen. Als te veel vliegen de langdurige honger niet overleven, zorg er dan voor dat er voldoende water aan het tissuepapier wordt toegevoegd bij het uitvoeren van natte honger in flesjes. Vermijd overmatig water dat de vliegen kan verdrinken. Ten tweede hebben vliegen de neiging om voedingsbias te vertonen ten opzichte van blauwe of rode kleurstof als hun concentraties niet zorgvuldig in evenwicht zijn. Kleine variaties in kleurstofconcentratie kunnen diepgaande voedingseffecten hebben (figuur 1B). Om kleurstofbias te voorkomen, moet de kleurstofconcentratie dus nauwkeurig zijn. Als vliegen worden beïnvloed door de kleurstof, verfijn dan zorgvuldig de kleurstofconcentratie in een toename van 1 μM en test vervolgens verschillende kleurstofcombinaties om het rood/blauwe kleurstofconcentratiepaar te identificeren dat een PI = 0 oplevert wanneer er geen experimentele verbinding wordt toegevoegd, behalve een lage concentratie sacharose (bijv. 2 mM). De optimale rode of blauwe kleurstof moet worden aangepast bij het testen van nieuwe vlieglijnen of bij het maken van nieuwe kleurstofvoorraden. Zorg er ten derde voor dat de test beperkt is tot 90 minuten. Volgens een eerdere studie22kan langdurige voeding leiden tot smaakaanpassing of desensibilisatie.
In vergelijking met andere voedingstechnieken, zoals FLIC27 of CAFE25-tests, heeft deze op Petri-schotel gebaseerde tweekeuzetest de volgende kenmerken en voordelen: (1) Eenvoud: dit apparaat bestaat uit slechts een kleine Petrischaal doorsneden met een plastic verdeler. Omdat de vaat en kunststof verdelers goedkoop en eenvoudig te monteren zijn, vergt een heel experiment slechts minimale investering. (2) Opportuniteit: het apparaat op basis van petrischaaltjes versnelt de voedingstest aanzienlijk (figuur 3D). Het kleurscoreproces is ook snel en eenvoudig met behulp van een gewone dissectiemicroscoop. Met deze methode kan de smaakvoorkeur van de vliegen ten opzichte van een bepaald voedselingrediënt snel worden getest. Het is dus geschikt voor zowel kleinschalig onderzoek als grootschalige genetische schermen. (3) Stabiliteit: in tegenstelling tot andere voedermethoden die slechts enkele vliegen in elk hulpmiddel analyseren, maakt deze methode de kwantificering van voedingsreacties voor een groot aantal volwassen vliegen tegelijk mogelijk, waardoor de effecten van voedingsvariaties tussen individuele vliegen aanzienlijk worden geminimaliseerd. Deze op kleurstof gebaseerde tweekeuzevoedingstest is rigoureus en reproduceerbaar gebleken en is gebruikt om belangrijke vliegmutanten te isoleren met gebreken in de smaak en texturen van levensmiddelen11,22,33.
Zoals uit deze resultaten blijkt, produceert de op petrischaal gebaseerde test in wezen dezelfde resultaten als de meerwel gebaseerde voedingstest voor zoete, bittere en zoute smaakreacties, hoewel de op petri-gerechten gebaseerde test meestal kleinere variaties heeft (figuur 3A-C). Een tijdrovende stap van de voedingstest op basis van kleurstof is het lozen van voedsel in de voedingskamer. De multiwell plaat, die 60 of meer putten bevat, kan bewerkelijk zijn om op te zetten vanwege de vereiste van het nauwkeurig laden van gesmolten agarose voedsel in 60 of meer putten per bord. Het is veel sneller om voedsel in de Petrischaal te bereiden en te laden dan in de multiwell-plaat, omdat de Petri-schaal slechts twee afzonderlijke compartimenten bevat(figuur 3D). Deze methode op basis van Petrischaal behoudt dus niet alleen de robuustheid van de op kleurstof gebaseerde test, maar vermindert ook aanzienlijk de tijd en moeite die wordt besteed aan de voorbereiding van de test, waardoor de capaciteit en snelheid van de voedingstest aanzienlijk worden opgeschaald. Bijgevolg kan het gemakkelijk worden gebruikt om een groot aantal vlieglijnen te analyseren, zoals in een genetisch schermproject.
Hoewel op kleurstof gebaseerde tests een studieweg met een hoge doorvoer bieden vanwege hun eenvoud en snelheid, kunnen ze geen informatie vastleggen over meer gedetailleerde kwantitatieve aspecten van voeding, zoals duur of volume. Om dit probleem op te lossen, kan een hogesnelheidscamera boven de schotel worden geïnstalleerd, die meer gedetailleerde informatie over het voerproces onthult, zoals de voedingsduur en -frequentie in elke kamer. Bovendien kunnen verschillende andere voedingsparadigma's worden gebruikt om gegevens aan te vullen die zijn verzameld uit de op kleurstoffen gebaseerde experimenten. Automatische voedingsapparaten, zoals de FLIC27 en de fly proboscis en activity detector (FlyPAD)34, kunnen de temporele dynamiek van het voeren registreren. De CAFE-test25 of handmatige voedingstests35 kunnen het volume van het geconsumeerde voedsel meten. Toch hebben deze benaderingen hun eigen kanttekeningen. In vergelijking met de Petrischaal of de multiwell-plaat zijn automatische voedingsapparaten bijvoorbeeld erg duur om in het lab op te zetten. Bovendien test elk apparaat slechts een paar vliegen tegelijk, waardoor het kwetsbaarder is voor variabiliteit bij individuele dieren. Terwijl de CAFE-test vertrouwt op het vermogen van de vliegen om hun lichaam te manoeuvreren tot het einde van de capillaire buis die in de voedingskamer hangt, kunnen de resultaten worden verward door motorische beperkingen die geen verband houden met smaaksensatie.
Hoewel andere benaderingen op zichzelf krachtig zijn, kunnen op kleurstof gebaseerde tests een efficiënter hulpmiddel zijn om voedselvoorkeur bij vliegen snel te ontdekken en te analyseren. Bovendien kan de tweekeuzeopstelling worden geïntegreerd met geavanceerde technieken zoals optogenetica36 om selectief en acuut het voedingsgedrag van de vlieg te manipuleren. Dit kan worden gedaan met behulp van de ene helft van de schaal voor lichtactivering en de andere helft als een lichtinactieve controle. Directe activering of inactivatie van specifieke neuronen helpt bepalen of ze een rol spelen bij het reguleren van voedingsgedrag. Samengevat tonen deze resultaten aan dat de op schotel gebaseerde tweekeuzevoedingstest op basis van petri een snelle en robuuste voedingsmethode is die onderzoekers kan helpen bij het analyseren van voedingsgedrag onder verschillende fysiologische en metabole toestanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten of concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Tingwei Mi bedanken voor het helpen optimaliseren van de tweekeuze voertest. Ze willen ook Samuel Chan en Wyatt Koolmees bedanken voor hun commentaar op het manuscript. Dit project werd gefinancierd door de National Institutes of Health grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) en R01 DC018592 (Y.V.Z.) en door de Ambrose Monell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K.
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H.
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Scott, K.
- Freeman, E. G., Dahanukar, A.
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
