Summary
Vi presenterer en protokoll for en to-valg fôring analyse for fluer. Denne fôringsanalysen er rask og enkel å kjøre og er egnet ikke bare for småskala laboratorieforskning, men også for høy gjennomstrømningsatferdsskjermer i fluer.
Abstract
For å velge mat med næringsverdi samtidig som de unngår forbruket av skadelige stoffer, trenger dyr et sofistikert og robust smakssystem for å evaluere matmiljøet. Fruktfluen, Drosophila melanogaster, er en genetisk tractable modell organisme som er mye brukt til å tyde molekylær, cellulær og nevrale understøtte av matpreferanser. For å analysere flymatpreferanser er det nødvendig med en robust fôringsmetode. Beskrevet her er en to-valg fôring analyse, som er streng, kostnadsbesparende, og rask. Analysen er Petri-parabolbasert og innebærer tillegg av to forskjellige matvarer supplert med blått eller rødt fargestoff til de to halvdelene av parabolen. Deretter plasseres ~ 70 prestarved, 2-4-dagers gamle fluer i parabolen og får lov til å velge mellom blå og rød mat i mørket i ca 90 min. Undersøkelse av magen til hver fly etterfølges av beregningen av preferanseindeksen. I motsetning til multiwell plater, tar hver Petri skål bare ~ 20 s å fylle og sparer tid og krefter. Denne fôringsanalysen kan brukes til raskt å avgjøre om fluer liker eller misliker en bestemt mat.
Introduction
Til tross for dramatiske forskjeller i den anatomiske strukturen av smaksorganer mellom fluer og pattedyr, er fluenes atferdsresponser på mange tastantstoffer påfallende lik pattedyrenes. For eksempel foretrekker fluer sukker1,2,3,4,5,6,7,8, aminosyrer9,10og lavt salt11, som indikerer næringsstoffer, men avviser bitter mat12,13,14,15 som er uspiselige eller giftige. I løpet av de siste to tiårene har fluer vist seg å være en svært verdifull modellorganisme for å fremme forståelsen av mange grunnleggende spørsmål knyttet til smaksfølelse og matforbruk, inkludert tastantdeteksjon, smakstransduksjon, smaksplastisitet og fôringsregulering16,17,18,19,20. Bemerkelsesverdig, en rekke studier har vist at smaktransduksjon og nevrale krets mekanismer underliggende smaksoppfatning er analoge mellom fruktfluer og pattedyr. Derfor fungerer fruktfluen som en ideell eksperimentell organisme, slik at forskere kan avdekke evolusjonære bevarte konsepter og prinsipper som styrer matdeteksjon og forbruk i dyreriket.
For å undersøke smaksfølelse i fluer, er det viktig å etablere en rask og streng analyse for objektivt å måle matpreferanser. Gjennom årene har ulike fôringsmetoder, som fargestoffbaserte analyser11,12,13,21,22,23, fly proboscis forlengelse respons analyse24, Capillary Feeder (CAFE) analyse25,26, Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) analyse27, og andre kombinatoriske metoder er utviklet for å kvantitativt måle matpreferanser og / eller matinntak for fruktfluer28,29,30,31. En av de populære fôring paradigmer er fargestoff-baserte to-valg fôring analyse ved hjelp av enten en multiwell mikrotiter plate12,21,32 eller, som beskrevet her, en liten Petri skål11,22 som fôring kammeret. Denne analysen er designet basert på gjennomsiktigheten av flyets mage. Under denne analysen plasseres fluer i fôringskammeret og presenteres med to matalternativer blandet med enten rødt fargestoff eller blått fargestoff. Når analysen er fullført, vises flymagene røde eller blå avhengig av hvilken mat de har konsumert.
Både petriskålen og multiwell-plate fargestoff-baserte fôringanalyser er svært robuste og gir omtrent de samme resultatene. Ved hjelp av disse to analysene har det blitt gjort mange viktige funn og gjennombrudd mot å tyde de svært diversifiserte reseptorene og cellene som er ansvarlige for å føle matsmak og mattekstur11,12,21,22,32,33. I den fargebaserte analysen er et eksperimentelt skritt som krever betydelig tid og krefter, å forberede og laste mat inn i fôringskammeret. For å redusere matforberedelsen og lastetiden ble denne analysen endret ved å erstatte multivelmikrotiterplaten med en liten petriskål, som er delt inn i to like rom. I petriskålbasert analyse legges to forskjellige matvarer supplert med blått eller rødt fargestoff til de to halvdelene av parabolen. Deretter plasseres ~ 70 prestarved, 2-4-dagers gamle fluer i parabolen og får lov til å velge mellom blå og rød mat i mørket i ca 90 min. Magen til hver flue undersøkes deretter, og preferanseindeksen (PI) beregnes.
Denne Petri-parabolbaserte tovalgs fôringsanalysen er rimelig, enkel og rask. En multiwell plate krever ca 110 s å fylle, mens hver Petri parabolen tar bare ~ 20 s. I tillegg krever multibrønnplaten pipettering av små mengder mat i et stort antall små brønner (f.eks. 60 eller flere brønner per plate), noe som krever betydelig presisjon og oppmerksomhet. Omvendt krever petriskålbasert analyse bare to handlinger per plate. Som fôring analyse kan innebære et stort antall repliker, petri-parabol-basert analyse sparer en ikke-triviell mengde tid og krefter. Denne analysen gir resultater tilsvarende de fra multiwell-basert analyse og har vist seg vellykket i å løse mange grunnleggende spørsmål i smaksfølelse, inkludert salt smak koding11, smak plastisitet modifisert av matopplevelse22, og molekylært grunnlag for mat tekstur følelse33. Oppsummert er denne Petri-parabolbaserte tovalgsanalysen et kraftig verktøy for å undersøke hvordan fluer oppfatter ytre og interne næringsmiljøer for å fremkalle passende fôringsatferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering av analysekamrene
MERK: Selv om denne protokollen beskriver bruken av en 35 mm petriskål (figur 1A),kan ønsket effekt oppnås ved hjelp av ethvert vanntett, glattbunnet fartøy som kan bisected og dekkes.
- Først bisect en lokket 35 mm Petri skål ved å feste en lengde av plast (5 mm i bredde og 3 mm i høyden) ned midtlinjen med vanntett lim, danner to vanntette rom. Kontroller at forseglingen er fullført for å unngå lekkasje som kan føre til blanding av de to matsnedstrene som analyseres.
MERK: Etter montering må apparatet på nytt brukes så lenge tetningen holder.
2. Klargjøre sulte ampuller
- Forbered et tilstrekkelig antall tomme plastflyaleblader; deretter, løst komprimere et stykke vev papir nederst. Komprimer vevspapiret nok til at det fyller rommet, men ikke så mye at det danner en tett masse.
MERK: Pass på at det ikke er dype sprekker eller folder i vevet, da dette kan føre til at fluer blir fanget. - Tilsett ~ 3 ml rent vann til hetteglasset slik at vevet er helt mettet, men det er ikke stående vann. Pass på at det ikke er store dråper overflødig vann på veggen av hetteglasset. Alternativt oppsto erstatning for gjennomvåt papir ved å forberede en 1% w / v agar løsning (uten sukrose) ved å legge til 5 ml 1% agarose til hvert tomt hetteglass og la agarose å stivne ved romtemperatur.
3. Våt sult av fluer før eksperimentet
- Initier sult 24 timer før eksperimentets tid. Under CO2 anestesi flyr sorter grupper på ~ 70, 2-4-dagers-gamle inn i de forberedte sultehets hetteglassene, og merker hvert hetteglass med genotype og sultetid.
4. Reagensoppsett
- Tilberedning av fargestoffer
MERK: Før du utfører eksperimenter, er det viktig å utføre en foreløpig kontrollanalyse for å bestemme de riktige konsentrasjonene av røde og blå fargestoffer som skal brukes.- For kontrollanalysen, lag en rekke fortynninger for hvert fargestoff, og utfør fôringsanalysen med samme mat med en annen fargefarge. Bruk resultatene til å identifisere tofargekonsentrasjoner (en rød, en blå) som gir en PI på ~0 når ingen eksperimentell forbindelse legges til (se avsnitt 7).
MERK: For eksempel ble den endelige blå fargestoffkonsentrasjonen festet ved 50 μM og testet mot en rekke røde fargekonsentrasjoner. Basert på den røde fargedoseringskurven var den optimale røde fargekonsentrasjonen 210 μM, noe som ga minimal fargebias (figur 1B). En høyere rød fargestoffkonsentrasjon driver fluer for å foretrekke rød mat, mens en lavere konsentrasjon driver fluer for å foretrekke blå mat. Finjuster forsiktig blå eller røde fargekonsentrasjoner i trinn på 1 μM, da forskjeller i denne størrelsen og større kan påvirke eksperimentelle resultater.
- For kontrollanalysen, lag en rekke fortynninger for hvert fargestoff, og utfør fôringsanalysen med samme mat med en annen fargefarge. Bruk resultatene til å identifisere tofargekonsentrasjoner (en rød, en blå) som gir en PI på ~0 når ingen eksperimentell forbindelse legges til (se avsnitt 7).
- Tilberedning av 1% agarose
- Kombiner 0,5 g agarose og 50 ml rent vann (eller noen flere av disse) i et mikrobølgeovnsikkert fartøy. Mikrobølgeovn agarose løsningen til oppløst, rør den etter behov.
- Tilberedning av andre matkomponenter
- Oppløs hver matkomponent, inkludert sukrose og eventuelle eksperimentelle forbindelser, i vann ved en 100 ganger eller høyere konsentrasjon av den endelige testede konsentrasjonen.
MERK: Det totale volumet av hver matingrediens som tilsettes til 1% agar bør ikke overstige 1 ml per 10 ml smeltet agar. Ellers kan agarose være for fortynnet og vil ikke stivne på riktig måte.
- Oppløs hver matkomponent, inkludert sukrose og eventuelle eksperimentelle forbindelser, i vann ved en 100 ganger eller høyere konsentrasjon av den endelige testede konsentrasjonen.
- Utarbeidelse av matmedier
- Bland agar, fargestoff og ønsket eksperimentell forbindelse i koniske polypropylen sentrifuge rør (15 eller 50 ml); bruke vann i stedet for den eksperimentelle tastant i kontrollmat. Gjør dette mens agaren fortsatt er helt flytende og bland godt ved hjelp av en vortex mikser. Oppbevar rørene i et 60 °C vannbad mens de ikke er i bruk for å hindre at agarose fra herding før de distribueres til retter.
- Forbereder retter til eksperimentet
MERK: Sørg for at alle rettene er helt tørre før du starter.- Pipette 1 ml rød eksperimentell mat medium i den ene siden av analysefatet (Figur 1A); gjenta for ønsket antall retter. La agarose avkjøles til fast (3-5 min), og deretter pipette 1 ml blå kontroll mat inn i den andre siden av oppvasken (Figur 1A). Gjenta denne prosessen med kontroll rødt/eksperimentelt blått par.
MERK: Kontroller at alle rettene er helt angitt før eksperimentet startes. Bruk oppvasken innen 30 min.
- Pipette 1 ml rød eksperimentell mat medium i den ene siden av analysefatet (Figur 1A); gjenta for ønsket antall retter. La agarose avkjøles til fast (3-5 min), og deretter pipette 1 ml blå kontroll mat inn i den andre siden av oppvasken (Figur 1A). Gjenta denne prosessen med kontroll rødt/eksperimentelt blått par.
5. Initiere toveis fôringsanalyse
- Midlertidig lammer eksperimentelle flylinjer på is til ingen åpenbare motoraktiviteter som flyging og klatring observeres. Når fluene er immobilisert, snu forsiktig hetteglasset, og trykk for å overføre alle fluene inn i analysekammeret.
MERK: Kald støt tar ~ 3-5 min. Langvarig eksponering for kulde kan påvirke fluens fysiologi og helse og bør derfor unngås. - Plasser dekselet raskt på kammeret og sett det til side. Når alle fluene er overført, flytt alle kamrene til et mørkt, lukket rom. La analysen løpe i 90 min.
MERK: Et mørkt miljø minimerer påvirkningen av fluens visuelle vei på fôringsatferd og fjerner eventuelle miljøsignaler fra utsiden av parabolen.
6. Avslutte toveis fôringsanalysen
- Etter 90 min har gått, overføre kamrene til en -20 ° C fryser for å ofre fluene. Etter ~ 1 t, telle fluene.
MERK: Inverter hver petriskål før du plasserer fatet i fryseren for å sikre at ingen fluer blir frosset på maten.
7. Tilordne en preferanseindeks (PI) for å bestemme matpreferanser
- Under et standard disseksjonsmikroskop må du undersøke fluenes bukfarge i hver enkelt tallerken. Tell fluene som enten røde, blå eller lilla i henhold til fargen på magen (figur 2A). Tell fluen hvis magen er mer enn 50% farget, noe som indikerer robust fôring (figur 2B). Ekskluder flyet hvis magen bare inneholder et lite matsted, noe som indikerer dårlig spising (figur 2C).
- Etter at antall fluer som spiser blå, rød eller både blå og rød mat er talt, bruk følgende ligning til å tildele hver Petri-tallerken en preferanseindeks (PI):
PI = (Antall fluer spiser eksperimentell mat) - (Antall fluer spiser kontroll mat) / (Antall fluer spiser eksperimentell mat) + (Antall fluer spise kontroll mat) + (Antall fluer spiser begge)
PI > 0 indikerer en preferanse for eksperimentell sammensatte, PI < 0 indikerer en aversjon mot eksperimentell sammensatte, og PI = 0 indikerer ingen effekt av forbindelsen på fôring atferd.
8. Rengjøring av analysekamrene
- Rengjør Petri-rettene umiddelbart ved å skrape ut matsubstratet og skylle dem med upcented såpe og vann. Bløtlegg Petri-rettene over natten i destillert vann. Kontroller at deleforseglingen i hver tallerken fortsatt er vanntett, og la deretter parabolen tørke.
MERK: Etter å ha sørget for at det ikke er rester av agarose eller fargestofffarging, er Petri-rettene klare til bruk igjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne analysen ble en 35 mm tallerken delt inn i to like fôringsrom, med hver halvdel av fatet som inneholder agarosemat kombinert med enten blått eller rødt fargestoff (figur 1A). For å utelukke fargestoffbias ble de blå og røde fargekonsentrasjonene nøye raffinert for å gi en omtrentlig "0" PI når bare disse to fargestoffene ble lagt til (figur 1B). Når petriskålen var lastet med testet mat, ~ 70 våtsultne, ble 2-4-dagers gamle voksne fluer overført til parabolen, slik at de kunne velge mellom de to matalternativene i mørket. Etter 90 min ble fluenes magefarge undersøkt med et disseksjonsmikroskop. Vanligvis vises fly abdomen blå eller rød hvis dyret hovedsakelig bruker blå eller rød mat (henholdsvis figur 2A). Hvis flyet bruker både blått og rødt, blir magen lilla (figur 2A).
Fluene som inndeler betydelige mengder mat ble scoret (figur 2B), mens de hoppet over fluene med utilstrekkelig matinntak (figur 2C). Denne Petri-parabolbaserte analysen ble sammenlignet med den multiwell-platebaserte analysen. Resultatene viser at disse to fôringsmetodene i hovedsak gir de samme resultatene i å analysere fôringsresponser på søt, bitter eller salt mat i villtypefluer (figur 3A-C). Spesielt er det mye raskere å tilberede og distribuere mat i petriskålen enn i multiwell platen som inneholder 60 brønner (figur 3D). Til sammen er petriskålbasert analyse en robust og rask fôringsmetode som raskt kan brukes til å bestemme matpreferansen for fluer.
Figur 1:Tovalgsanalyseapparat og fargestoffdoseringskurve. (A) To halvdeler av en petriskål brukes til å presentere to forskjellige matalternativer. Den ene halvdelen av retten inneholder blåfarget mat, og den andre halvparten inneholder rødfarget mat. Prestarved fluer er plassert i parabolen for å tillate dem å konsumere den maten de foretrekker. (B)Matpreferanse for vill-type fluer velge mellom 1% agarose pluss 2 mM sukrose som inneholder enten 50 μM blå fargestoff eller varierende konsentrasjoner av rødt fargestoff. Den optimale røde fargekonsentrasjonen er 210 μM. Data representerer ± standardfeil av gjennomsnittet. For hvert datapunkt, n = 6 studier. Omtrent 70 fluer ble testet i hver studie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fly abdominal farge etter å ha spist blå, rød eller både blå og rød mat. (A) Representative bilder av fluer etter å ha innstå blå mat (øverst til høyre), rød mat (øverst til venstre), eller begge deler, slik at magen ser lilla (nederst). (B) En flue som viser tilstrekkelig forbruk av blå mat. (C) En flue etter inntak av en liten mengde blå mat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fôring svar på ulike tastanter i vill-type fluer, og mat-lasting tid for 60-brønn-plate vs Petri-parabolen-basert fôring enhet. (A) Mat preferanse for vill-type fluer velge mellom 2 mM sukrose og 10 mM sukrose. n = 12 studier, umalte studentens t-tester. (B) Mat preferanse i vill-type fluer for mat som inneholder 2 mM sukrose med eller uten 10 mM koffein. n = 10 forsøk, umalte studentens t-tester. (C) Matpreferanse i villtype fluer for mat som inneholder 2 mM sukrose med eller uten 20 mM NaCl. n = 10 forsøk, umalte studentens t-tester. (D) Tid brukt på å fylle mat i en 60-brønns tallerken og en petriskål. n = 12 tallerkener eller retter, *p < 0,0001, unpaired Student'st-tester. Data representerer ± SEM. Forkortelser: n.s. = ikke statistisk signifikant; SEM = standard feil i gjennomsnitt; NaCl = natriumklorid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden innebærer flere viktige trinn der problemer kan oppstå. Først må du sørge for at fluer innkaller en tilstrekkelig mengde mat til å gi stabile data. Hvis fluer spiser dårlig, sørg for at fluene har vært våtsultet i minst 24 timer, og at det eksperimentelle mediet inneholder minst en minimal sukrosekonsentrasjon (2 mM). For ytterligere å stimulere matforbruket, forlenge våtsultperioden utover 24 timer, avhengig av fluenes fysiologiske tilstand. Hvis for mange fluer ikke overlever den langvarige sulten, må du sørge for at nok vann tilsettes vevspapiret når du utfører våtsult i hetteglass. Unngå for mye vann som kan drukne fluene. For det andre har fluer en tendens til å vise fôring bias mot enten blå eller rødt fargestoff hvis konsentrasjonene ikke er nøye balansert. Små variasjoner i fargekonsentrasjon kan ha dype fôringseffekter (figur 1B). Dermed, for å forhindre fargestoffbias, bør fargekonsentrasjon være presis. Hvis fluer påvirkes av fargestoffet, avgrenser fargestoffkonsentrasjonen forsiktig med en økning på 1 μM, og deretter tester du forskjellige fargekombinasjoner for å identifisere det røde / blå fargestoffkonsentrasjonsparet som gir en PI = 0 når ingen eksperimentell forbindelse unntatt en lav konsentrasjon av sukrose (f.eks. 2 mM) legges til. Den optimale røde eller blå fargestoffkonserten bør justeres ved testing av nye flylinjer eller etter å ha laget nye fargestoffaksjer. For det tredje må du sørge for at analysen er begrenset til 90 min. Ifølge en tidligere studie22 kanlangvarig fôring føre til smakstilpasning eller desensibilisering.
Sammenlignet med andre fôringsteknikker, for eksempel FLIC27 eller CAFE25-analyser, har denne Petri-parabolbaserte tovalgsanalysen følgende funksjoner og fordeler: (1) Enkelhet: denne enheten består bare av en liten petriskål bisected med en plastdeler. Fordi retter og plast skillevegger er billig og lett å montere, krever et helt eksperiment bare minimal investering. (2) Hensiktsmessighet: Den Petri-parabolbaserte enheten øker hastigheten på fôringsanalysen (figur 3D). Fargescoringsprosessen er også rask og grei ved hjelp av et vanlig disseksjonsmikroskop. Med denne metoden kan fluenes smakspreferanse mot en bestemt matingrediens raskt testes. Dermed er det egnet for både småskala forskning og store genetiske skjermer. (3) Stabilitet: i motsetning til andre fôringsmetoder som analyserer bare noen få fluer i hver enhet, tillater denne metoden kvantifisering av fôringsresponser for et stort antall voksne fluer på en gang, noe som betydelig minimerer effekten av fôringsvariasjoner blant individuelle fluer. Denne fargebaserte tovalgs fôringsanalysen har vist seg å være streng og reproduserbar og har blitt brukt til å isolere viktige flymutanter med defekter i å oppfatte matsmakog teksturer 11,22,33.
Som demonstrert av disse resultatene, produserer Petri-parabolbasert analyse i hovedsak de samme resultatene som den multivelbaserte fôringsanalysen for søte, bittere og salte smaksresponser, selv om petriskålbasert analyse har en tendens til å ha mindre variasjoner (figur 3A-C). Et tidkrevende trinn i den fargebaserte fôringsanalysen er utslipp av mat i fôringskammeret. Multiwell platen, som inneholder 60 eller flere brønner, kan være arbeidskrevende å sette opp på grunn av kravet om nøyaktig lasting smeltet agarose mat i 60 eller flere brønner per plate. Det er mye raskere å tilberede og laste mat i petriskålen enn i multiwell platen, da petriskålen inneholder bare to separate rom (figur 3D). Dermed opprettholder denne Petri-parabolbaserte metoden ikke bare robustheten til den fargebaserte analysen, men reduserer også tiden og innsatsen som brukes i analyseforberedelsen betydelig, og dermed betydelig skalering opp kapasiteten og hastigheten på fôringsanalysen. Følgelig kan det lett brukes til å analysere et stort antall flylinjer, for eksempel i et genetisk skjermprosjekt.
Mens fargebaserte analyser gir en høy gjennomstrømningsvei av studier på grunn av deres enkelhet og hastighet, kan de ikke fange opp informasjon om mer detaljerte kvantitative aspekter ved fôring som varighet eller volum. For å overvinne dette problemet kan et høyhastighetskamera installeres over parabolen, noe som avslører mer detaljert informasjon om fôringsprosessen, for eksempel fôringsvarighet og frekvens i hvert kammer. Videre kan flere andre fôringsparadigmer brukes til å supplere data samlet inn fra fargebaserte eksperimenter. Automatiske fôringsenheter, som FLIC27 og flyproboscis og aktivitetsdetektor (FlyPAD)34,kan registrere den timelige dynamikken i fôring. CAFE-analysen25 eller manuell fôringsanalyser35 kan måle volumet av mat som forbrukes. Likevel har disse tilnærmingene sine egne advarsler. For eksempel, sammenlignet med petriskålen eller multiwell-platen, er automatiske fôringsenheter svært dyre å sette opp i laboratoriet. I tillegg sier hver enhet bare noen få fluer om gangen, noe som gjør den mer sårbar for variasjon hos individuelle dyr. Siden CAFE-analysen er avhengig av fluenes evne til å manøvrere kroppene sine opp til enden av kapillærrøret som henger inne i fôringskammeret, kan resultatene bli forvirret av motoriske forringelser som ikke er relatert til smaksfølelse.
Selv om andre tilnærminger er kraftige i seg selv, kan fargebaserte analyser være et mer effektivt verktøy for raskt å oppdage og analysere matpreferanser i fluer. Videre kan tovalgsoppsettet integreres med banebrytende teknikker som optogenetikk36 for å selektivt og akutt manipulere fluens fôringsatferd. Dette kan gjøres ved hjelp av den ene halvdelen av parabolen for lysaktivering og den andre halvparten som en lys inaktiv kontroll. Direkte aktivering eller inaktivering av spesifikke nevroner bidrar til å avgjøre om de har en rolle i å regulere fôring atferd. Oppsummert viser disse resultatene at Petri-dish-basert to-valg fôring analyse er en rask og robust fôring metode som kan hjelpe forskere analysere fôring atferd under ulike fysiologiske og metabolske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter eller konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Tingwei Mi for å hjelpe dem med å optimalisere tovalgsfôringsanalysen. De vil også takke Samuel Chan og Wyatt Koolmees for deres kommentarer til manuskriptet. Dette prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health tilskudd R03 DC014787 (Y.V.Z.) og R01 DC018592 (Y.V.Z.) og av Ambrose Monell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K.
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H.
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Scott, K.
- Freeman, E. G., Dahanukar, A.
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
