Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Drosophila'da Hızlı Bir Yemek Tercihi Tahlil

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62051
Automatic Translation
1, 1,2
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

Sinekler için iki seçenekli bir besleme tahlilleri için bir protokol sunuyoruz. Bu besleme testini çalıştırmak hızlı ve kolaydır ve sadece küçük ölçekli laboratuvar araştırmaları için değil, aynı zamanda sineklerdeki yüksek verimli davranışsal ekranlar için de uygundur.

Abstract

Zararlı ajanların tüketiminden kaçınırken besin değeri olan yiyecekleri seçmek için, hayvanların yiyecek ortamlarını değerlendirmek için sofistike ve sağlam bir tat sistemine ihtiyaçları vardır. Meyve sineği, Drosophila melanogaster, gıda tercihinin moleküler, hücresel ve sinirsel temellerini çözmek için yaygın olarak kullanılan genetik olarak çekişli bir model organizmadır. Sinek yemi tercihlerini analiz etmek için sağlam bir beslenme yöntemine ihtiyaç vardır. Burada açıklanan, titiz, maliyet tasarrufu sağlayan ve hızlı olan iki seçenekli bir besleme tahlildir. Test Petri-dish bazlıdır ve yemeğin iki yarısına mavi veya kırmızı boya ile desteklenmiş iki farklı yiyeceğin eklenmesini içerir. Daha sonra, ~70 önceden tasarlanmış, 2-4 günlük sinekler yemeğe yerleştirilir ve yaklaşık 90 dakika boyunca karanlıkta mavi ve kırmızı yiyecekler arasında seçim yapmasına izin verilir. Her bir sineğin karnının incelenmesi, tercih indeksinin hesaplanması ile takip edilir. Çok katlı plakaların aksine, her Petri kabının doldurulması sadece ~ 20 s sürer ve zaman ve çaba tasarrufu sağlar. Bu besleme tahlili, sineklerin belirli bir yiyeceği sevip sevmediğini hızlı bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

Sinekler ve memeliler arasındaki tat organlarının anatomik yapısındaki dramatik farklılıklara rağmen, sineklerin birçok lezzetli maddeye davranışsal tepkileri memelilerinkine çarpıcı bir şekilde benzer. Örneğin, sinekler şeker1,2,3,4,5,6,7,8, amino asitler9,10ve besinleri gösteren düşük tuz11'i tercih eder, ancak acı yiyecekleri reddeder12,13,14,15 unpalatable veya toksiktir. Son yirmi yılda, sinekler, lezzetli algılama, tat transdüksiyon, tat plastisitesi ve besleme yönetmeliği 16 ,17,18 , 19,20dahil olmak üzere tat hissi ve gıda tüketimi ile ilgili birçok temel sorunun anlaşılmasını ilerletmek için son derece değerli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır. Dikkat çekici bir şekilde, bir dizi çalışma, tat algısının altında kalan tat transdüksiyonunun ve sinir devresi mekanizmalarının meyve sinekleri ve memeliler arasında benzer olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, meyve sineği, araştırmacıların hayvanlar aleminde gıda tespiti ve tüketimini yöneten evrimsel olarak korunmuş kavramları ve ilkeleri ortaya çıkarmalarını sağlayan ideal bir deneysel organizma olarak hizmet eder.

Sineklerde tat alma hissini araştırmak için, gıda tercihini objektif olarak ölçmek için hızlı ve titiz bir test oluşturmak önemlidir. Yıllar içinde, çeşitli beslenme yöntemleri, boya bazlı tahliller11,12,13,21,22,23, sinek hortumu uzatma yanıtı24, Kılcal Besleyici (CAFE) tahlil25,26, Sinek Sıvı-Gıda Etkileşim Sayacı (FLIC) tahlil27, ve diğer kombinatoryal yöntemler, meyve sinekleri için gıda tercihini ve / veya gıda alımını nicel olarak ölçmek için geliştirilmiştir28,29,30,31. Popüler beslenme paradigmalarından biri, çok katlı bir mikrotiter plakası12 , 21,32 veya burada açıklandığı gibi, besleme odası olarak küçük bir Petri kabı11,22 kullanan boya bazlı iki seçenekli besleme tahlilleridir. Bu test, sineğin karnının şeffaflığına göre tasarlanmıştır. Bu test sırasında, sinekler besleme odasına yerleştirilir ve kırmızı boya veya mavi boya ile karıştırılmış iki yiyecek seçeneği ile sunulur. Test tamamlandıktan sonra, sinek karınları hangi yiyeceği tükettiğine bağlı olarak kırmızı veya mavi görünür.

Hem Petri kabı hem de çok plakalı boya bazlı besleme testleri oldukça sağlamdır ve yaklaşık olarak aynı sonuçları verir. Bu iki tahlil kullanılarak, gıda zevklerini ve gıda dokusunu algılamaktan sorumlu son derece çeşitlendirilmiş reseptörleri ve hücreleri deşifre etmek için çok sayıda önemli keşif ve atılım yapılmıştır11,12,21,22,32,33. Boya bazlı testte, önemli ölçüde zaman ve çaba gerektiren deneysel bir adım, yiyeceklerin hazırlanması ve beslenme odasına yüklenmesidir. Yiyecek hazırlama ve yükleme süresini azaltmak için, bu test, çok katlı mikroter plakanın iki eşit bölmeye ayrılmış küçük bir Petri kabı ile değiştirilmesiyle değiştirildi. Petri-dish bazlı testte, yemeğin iki yarısına mavi veya kırmızı boya ile desteklenmiş iki farklı yiyecek eklenir. Daha sonra, ~70 önceden tasarlanmış, 2-4 günlük sinekler yemeğe yerleştirilir ve yaklaşık 90 dakika boyunca karanlıkta mavi ve kırmızı yiyecekler arasında seçim yapmasına izin verilir. Daha sonra her sineğin karnı incelenir ve tercih indeksi (PI) hesaplanır.

Bu Petri-dish tabanlı iki seçenekli besleme tahlili uygun fiyatlı, basit ve hızlıdır. Bir multiwell tabağının doldurulması yaklaşık 110 s gerekirken, her Petri kabı sadece ~ 20 s sürer. Ek olarak, multiwell plakası, çok sayıda küçük kuyuya (örneğin, tabak başına 60 veya daha fazla kuyu) küçük hacimlerde yiyecek pipetleme gerektirir, bu da önemli ölçüde hassasiyet ve dikkat gerektirir. Tersine, Petri-dish tabanlı test plaka başına sadece iki eylem gerektirir. Besleme tahlili çok sayıda çoğaltma içerebileceğinden, Petri-dish tabanlı test önemsiz miktarda zaman ve çaba tasarrufu sağlar. Bu tahlil, çok katlı testten elde edilenlere eşdeğer sonuçlar verir ve tuz tadıkodlaması 11, gıda deneyimi22ile değiştirilen tat plastisitesi ve gıda dokusu duyusunun moleküler temeli33dahil olmak üzere tat duyusunda birçok temel soruyu ele almada başarılı olduğunu kanıtlamıştır. Özetle, bu Petri-dish tabanlı iki seçenekli test, sineklerin uygun beslenme davranışını ortaya çıkarmak için dış ve iç besin milieusunu nasıl algılayıp algılamayacaklarını araştırmak için güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Test odalarının montajı

NOT: Bu protokol 35 mm Petri kabının kullanımını açıklarken (Şekil 1A), ikiye bölebilen ve kaplanabilen herhangi bir su geçirmez, pürüzsüz tabanlı kap kullanılarak istenen etki elde edilebilir.

  1. İlk olarak, kapaklı 35 mm Petri kabını, su geçirmez yapıştırıcı ile orta çizgiden aşağı doğru bir plastik uzunluğu (5 mm genişlik ve 3 mm yükseklik) sabitleyerek iki su geçirmez bölme oluşturarak ikiye ayırın. Test edilen iki gıda substratının karıştırılmasını önleyebilecek sızıntıyı önlemek için contanın tamamlandığını onaylayın.
    NOT: Montajdan sonra, conta tuttuğu sürece bu cihazı yeniden kullanın.

2. Açlık şişelerinin hazırlanması

  1. Yeterli sayıda boş plastik sinek şişesi hazırlayın; ardından, altta bir kağıt mendil parçasını gevşek bir şekilde sıkıştırın. Kağıt mendili alanı dolduracak kadar sıkıştırın, ancak yoğun bir kütle oluşturuyor olacak kadar değil.
    NOT: Dokuda derin çatlaklar veya kıvrımlar olmadığından emin olun, çünkü bu sineklerin sıkışmasına neden olabilir.
  2. Şişeye ~ 3 mL saf su ekleyin, böylece doku tamamen doygundur, ancak duran su yoktur. Şişenin duvarında büyük miktarda fazla su damlacıkları olmadığından emin olun. Alternatif olarak, her boş şişeye% 1 agarose 5 mL ekleyerek ve agarose'un oda sıcaklığında katılaşmasını sağlayarak% 1 w / v agar çözeltisi (sakkaroz olmadan) hazırlayarak ıslatılmış kağıt için agarose değiştirin.

3. Deneyden önce sineklerin ıslak açlığı

  1. Deney saatinden 24 saat önce açlığa başla. CO2 anestezisi altında, ~70, 2-4 günlük grupları hazırlanan açlık şişelerine uçar ve her şişeyi genotip ve açlık zamanı ile etiketler.

4. Reaktif kurulumu

  1. Boyaların hazırlanması
    NOT: Herhangi bir deney yapmadan önce, kullanılacak kırmızı ve mavi boyaların doğru konsantrasyonlarını belirlemek için bir ön kontrol tahlilinin yapılması önemlidir.
    1. Kontrol tahlilleri için, her boya için bir dizi seyreltme hazırlayın ve besleme testini farklı bir boya rengine sahip aynı yiyecekle gerçekleştirin. Deneysel bileşik eklenmediğinde ~0 PI veren iki boya konsantrasyonlarını (bir kırmızı, bir mavi) tanımlamak için sonuçları kullanın (bkz. bölüm 7).
      NOT: Örneğin, son mavi boya konsantrasyonu 50 μM'de sabitlendi ve bir dizi kırmızı boya konsantrasyonuna karşı test edildi. Kırmızı boya dozaj eğrisi temel alınarak, optimum kırmızı boya konsantrasyonu 210 μM idi ve bu da minimum boya önyargısı verdi (Şekil 1B). Daha yüksek bir kırmızı boya konsantrasyonu, kırmızı yiyecekleri tercih etmek için uçarken, daha düşük bir konsantrasyon mavi yiyecekleri tercih etmek için uçar. Mavi veya kırmızı boya konsantrasyonlarını 1 μM'lik artışlarla dikkatlice iyileştirin, çünkü bu büyüklükteki ve daha büyük farklılıklar deneysel sonuçları etkileyebilir.
  2. % 1 agarose hazırlanması
    1. Mikrodalga güvenli bir kapta 0,5 g agarose ve 50 mL saf suyu (veya bunların bir kısmını) birleştirin. Agarose çözeltisini çözünene kadar mikrodalgaya koyun, gerektiği gibi karıştırın.
  3. Diğer gıda bileşenlerinin hazırlanması
    1. Sakkaroz ve deneysel bileşikler de dahil olmak üzere her gıda bileşenini, test edilen son konsantrasyonun 100 kat veya daha yüksek konsantrasyonunda suda çözün.
      NOT: %1 ağar'a eklenen her bir gıda maddesinin toplam hacmi 10 mL erimiş agar başına 1 mL'yi geçmemelidir. Aksi takdirde, agarose çok seyreltilmiş olabilir ve uygun şekilde katılaşmaz.
  4. Gıda medyasının hazırlanması
    1. Konik polipropilen santrifüj tüplerinde (15 veya 50 mL) agar, boya ve istenen deneysel bileşiği karıştırın; kontrol gıdasında deneysel şok tabancası yerine su kullanın. Agar hala tamamen sıvıyken bunu yapın ve bir girdap karıştırıcısı kullanarak iyice karıştırın. Bulaşıklara dağıtılmadan önce agaroseun sertleşmesini önlemek için kullanılmazken tüpleri 60 °C'lik bir su banyosunda tutun.
  5. Deney için yemek hazırlama
    NOT: Başlamadan önce tüm yemeklerin tamamen kuru olduğundan emin olun.
    1. Pipet 1 mL kırmızı deneysel gıda ortamı tahlil kabının bir tarafına(Şekil 1A); istediğiniz sayıda yemek için tekrarlayın. Agarose'un sertleşene kadar soğumasına izin verin (3-5 dk) ve ardından pipet 1 mL mavi kontrol yemeği yemeklerin diğer tarafına (Şekil 1A). Bu işlemi kırmızı/deneysel mavi çift kontrolü ile tekrarlayın.
      NOT: Deneye başlamadan önce tüm yemeklerin tam olarak ayarlı olduğundan emin olun. Bulaşıkları 30 dakika içinde kullanın.

5. İki yönlü besleme testinin başlatılması

  1. Uçma ve tırmanma gibi belirgin motor aktiviteler gözlenene kadar buz üzerindeki deneysel sinek hatlarını geçici olarak felç edin. Sinekler hareketsiz hale geldikten sonra, şişeyi hafifçe ters çevirin ve tüm sinekleri test odasına aktarmak için dokunun.
    NOT: Soğuk şok ~ 3-5 dakika sürer. Uzun süre soğuğa maruz kalmak sineğin fizyolojisini ve sağlığını etkileyebilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır.
  2. Kapağı hızlı bir şekilde hazneye yerleştirin ve bir kenara koyun. Tüm sinekler transfer edildikten sonra, tüm odaları karanlık, kapalı bir alana taşıyın. Tahlillerin 90 dakika çalışmasına izin verin.
    NOT: Karanlık bir ortam, sineğin görsel yolunun beslenme davranışı üzerindeki etkisini en aza indirir ve yemeğin dışından gelen çevresel ipuçlarını kaldırır.

6. İki yönlü besleme testini sonlandırma

  1. 90 dakika geçtikten sonra, sinekleri feda etmek için odaları -20 ° C dondurucuya aktarın. ~1 saat sonra sinekleri sayın.
    NOT: Yemeği dondurucuya yerleştirmeden önce her Petri kabını ters çevirin ve yiyeceklerin üzerine sineklerin dondurulmamasını sağlayın.

7. Gıda tercihlerini belirlemek için bir tercih indeksi (PI) atama

  1. Standart bir diseksiyon mikroskobu altında, her bir tabakta sineklerin karın rengini inceleyin. Sinekleri karınlarının rengine göre kırmızı, mavi veya mor olarak sayın (Şekil 2A). Karnı% 50'den fazla renkliyse, sağlam beslenmeyi gösteren sineği sayın (Şekil 2B). Karnı sadece küçük bir yiyecek noktası içeriyorsa, zayıf yemeyi gösteren sineği hariç tutun (Şekil 2C).
  2. Mavi, kırmızı veya hem mavi hem de kırmızı yiyecekler yiyen sineklerin sayısı sayıldıktan sonra, her Petri kabına bir tercih indeksi (PI) atamak için aşağıdaki denklemi kullanın:

PI = (Deneysel yiyecek yiyen sinek sayısı) - (Kontrol gıdalarını yiyen sinek sayısı) / (Deneysel yiyecekleri yiyen sinek sayısı) + (Sineklerin sayısı yiyecek kontrolü yiyor) + (Her ikisini de yiyen sinek sayısı)

PI > 0 deneysel bileşik için bir tercih gösterir, PI < 0 deneysel bileşiğe karşı bir nefret gösterir ve PI = 0 bileşiğin beslenme davranışı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir.

8. Test odalarının temizlenmesi

  1. Petri tabakalarını gıda substratını kazıyarak ve kokusuz sabun ve suyla durulayarak derhal temizleyin. Petri tabaklarını bir gecede damıtılmış suda bekletin. Her tabaktaki bölme contasının hala su geçirmez olup olmadığını kontrol edin, ardından bulaşık havasını kurumaya bırakın.
    NOT: Artık agarose veya boya lekesi olmadığından emin olduktan sonra Petri tabakları tekrar kullanıma hazırdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu tahlilde, 35 mm'lik bir çanak, yemeğin her yarısı mavi veya kırmızı boya ile birleştirilmiş agarose yiyecekleri içeren iki eşit besleme bölmesine ayrılmıştır (Şekil 1A). Boya önyargısını dışlamak için, mavi ve kırmızı boya konsantrasyonları, sadece bu iki boya eklendiğinde yaklaşık "0" PI verecek şekilde dikkatlice rafine edilmiştir (Şekil 1B). Petri kabı test edilmiş yiyeceklerle yüklendikten sonra, ~70 ıslak aç, 2-4 günlük yetişkin sinekler yemeğe aktarıldı ve karanlıkta iki yiyecek seçeneği arasında seçim yapmalarını sağladı. 90 dk sonra sineklerin karın rengi diseksiyon mikroskobu ile incelendi. Tipik olarak, hayvan ağırlıklı olarak mavi veya kırmızı yiyecek tüketirse, sinek karnı mavi veya kırmızı görünür (Şekil 2A). Sinek hem mavi hem de kırmızı tüketirse, karnı morlaşır (Şekil 2A).

Önemli miktarda yiyecek yutturma sinekleri puanlandı (Şekil 2B), yetersiz gıda alımı olan sinekleri atlarken (Şekil 2C). Petri-dish tabanlı bu test, çok tabaklı testle karşılaştırıldı. Sonuçlar, bu iki besleme yönteminin, vahşi tip sineklerde tatlı, acı veya tuzlu yiyeceklere verilen beslenme yanıtlarını test etme konusunda temelde aynı sonuçları verdiğini göstermektedir (Şekil 3A-C). Özellikle, Petri kabında yiyecek hazırlamak ve dağıtmak, 60 kuyu içeren çok kuyulu plakaya göre çok daha hızlıdır (Şekil 3D). Tamamen, Petri-dish tabanlı test, sinekler için yiyecek tercihini hızlı bir şekilde belirlemek için kullanılabilecek sağlam ve hızlı bir besleme yöntemidir.

Figure 1
Şekil 1: İki seçenekli test cihazı ve boya dozaj eğrisi. (A) İki farklı yiyecek seçeneği sunmak için bir Petri kabının iki yarısı kullanılır. Yemeğin bir yarısı mavi boyalı yiyecek, diğer yarısı ise kırmızı boyalı yiyecekler içerir. Önceden başlatılan sinekler, tercih ettikleri yiyecekleri tüketmelerini sağlamak için yemeğe yerleştirilir. (B) 50 μM mavi boya veya değişen kırmızı boya konsantrasyonları içeren% 1 agarose artı 2 mM sakkaroz arasında seçim vahşi tip sinekler için gıda tercihi. Optimum kırmızı boya konsantrasyonu 210 μM'dir. Veriler ortalamanın standart ± hatasını temsil eder. Her veri noktası için n = 6 deneme. Her denemede yaklaşık 70 sinek test edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Mavi, kırmızı veya hem mavi hem de kırmızı yiyecekleri yedikten sonra karın rengini uçurun. (A) Mavi yiyecekleri (sağ üst), kırmızı yiyecekleri (sol üst) veya her ikisini de yutmuş olduktan sonra sineklerin temsili görüntüleri, karnın mor (altta) görünmesini sağlamak. (B) Yeterli mavi gıda tüketimini gösteren bir sinek. (C) Az miktarda mavi yiyecek yedikten sonra bir sinek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Vahşi tip sineklerde farklı uyarıcılara verilen besleme yanıtları ve 60 kuyu plakası vs Petri-dish bazlı besleme cihazı için yiyecek yükleme süresi. (A) 2 mM sakkaroz ile 10 mM sakkaroz arasında seçim yaparak vahşi tip sinekler için gıda tercihi. n = 12 deneme, eşleşmeyen Öğrenci t-testleri. (B) 10 mM kafeinli veya kafeinsiz 2 mM sakkaroz içeren yiyecekler için vahşi tip sineklerde yiyecek tercihi. n = 10 deneme, eşleşmeyen Öğrenci t-testleri. (C) 20 mM NaCl ile veya 20 mM NaCl olmadan 2 mM sakkaroz içeren yiyecekler için vahşi tip sineklerde yiyecek tercihi. n = 10 deneme, eşleşmeyen Öğrenci t-testleri. (D) Yiyecekleri 60 kuyu tabağına ve petri kabına doldurmak için harcanan zaman. n = 12 tabak veya tabak, *p < 0.0001, eşleşmeyen Öğrenci t-testleri. Veriler SEM± ortalamayı temsil eder. Kısaltmalar: n.s. = istatistiksel olarak anlamlı değildir; SEM = ortalamanın standart hatası; NaCl = sodyum klorür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntem, sorunların ortaya çıkabileceği birkaç önemli adımı içerir. İlk olarak, sineklerin istikrarlı veri sağlamak için yeterli miktarda yiyecek yuttmasını sağlayın. Sinekler zayıf beslenirse, sineklerin en az 24 saat boyunca ıslak aç olduğundan ve deneysel ortamın en az minimum sakkaroz konsantrasyonu (2 mM) içerdiğiden emin olun. Gıda tüketimini daha da teşvik etmek için, sineklerin fizyolojik durumuna bağlı olarak ıslak açlık süresini 24 saatin ötesine uzatın. Çok fazla sinek uzun süreli açlıktan kurtulamazsa, şişelerde ıslak açlık gerçekleştirirken kağıt mendile yeterli su ilave edildiğinden emin olun. Sinekleri boğabilecek aşırı sudan kaçının. İkincisi, sinekler konsantrasyonları dikkatlice dengelenmezse mavi veya kırmızı boyaya doğru beslenme önyargısı gösterme eğilimindedir. Boya konsantrasyonundaki küçük varyasyonlar derin beslenme etkilerine sahip olabilir (Şekil 1B). Bu nedenle, boya önyargısını önlemek için boya konsantrasyonu hassas olmalıdır. Sinekler boyadan etkilenirse, boya konsantrasyonu 1 μM'lik bir artışla dikkatlice iyileştirin ve daha sonra düşük bir sakkaroz konsantrasyonu (örneğin, 2 mM) dışında deneysel bir bileşik eklenmediğinde PI = 0 veren kırmızı / mavi boya konsantrasyon çiftini tanımlamak için farklı boya kombinasyonlarını test edin. En uygun kırmızı veya mavi boya konçertasyonu, yeni sinek hatlarını test ederken veya yeni boya stokları yaptıktan sonra yeniden ayarlanmalıdır. Üçüncüsü, testlerin 90 dakika ile sınırlandırıldığından emin olun. Önceki bir çalışmaya göre22Uzun süreli beslenme tat adaptasyonuna veya duyarsızlaşmaya yol açabilir.

FLIC27 veya CAFE25 tahlilleri gibi diğer besleme teknikleri ile karşılaştırıldığında, bu Petri-dish tabanlı iki seçenekli test aşağıdaki özelliklere ve avantajlara sahiptir: (1) Basitlik: Bu cihaz plastik bir bölücü ile ikiye bölünmüş sadece küçük bir Petri kabından oluşur. Bulaşıklar ve plastik bölücüler ucuz ve montajı kolay olduğundan, tüm bir deney sadece minimum yatırım gerektirir. (2) Uygunluk: Petri-dish tabanlı cihaz besleme testini önemli ölçüde hızlandırır (Şekil 3D). Renk puanlama işlemi de düzenli bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak hızlı ve basittir. Bu yöntemle, sineklerin belirli bir gıda maddesine yönelik tat tercihi hızlı bir şekilde test edilebilir. Bu nedenle, hem küçük ölçekli araştırmalar hem de büyük ölçekli genetik ekranlar için uygundur. (3) Kararlılık: Her cihazda sadece birkaç sinek analiz eden diğer besleme yöntemlerinin aksine, bu yöntem aynı anda çok sayıda yetişkin sinek için besleme yanıtlarının ölçülmesine izin verir ve bu da bireysel sinekler arasındaki beslenme varyasyonlarının etkilerini önemli ölçüde en aza indirir. Bu boya bazlı iki seçenekli besleme tahlili titiz ve tekrarlanabilir olduğu kanıtlanmıştır ve gıda tatlarını ve dokularını algılamada kusurları olan önemli sinek mutantlarını izole etmek için kullanılmıştır11,22,33.

Bu sonuçların gösterdiği gibi, Petri-çanak bazlı test, tatlı, acı ve tuzlu tat tepkileri için çok katlı besleme tahlili ile aynı sonuçları üretir, ancak Petri-çanak bazlı test daha küçük varyasyonlara sahip olma eğilimindedir (Şekil 3A-C). Boya bazlı besleme tahlilinin zaman alıcı bir adımı, yiyeceklerin besleme odasına boşaltılmasıdır. 60 veya daha fazla kuyu içeren çoklu kuyu plakası, erimiş agarose yiyeceklerin plaka başına 60 veya daha fazla kuyuya hassas bir şekilde yüklenmesi gereksinimi nedeniyle kurulması zahmetli olabilir. Petri kabına yiyecek hazırlamak ve yüklemek, çok katlı plakaya göre çok daha hızlıdır, çünkü Petri kabı sadece iki ayrı bölme içerir (Şekil 3D). Böylece, bu Petri-dish tabanlı yöntem sadece boya bazlı tahlilin sağlamlığını korumakla kalmaz, aynı zamanda tahlil hazırlamada harcanan zamanı ve çabayı önemli ölçüde azaltır, böylece besleme testinin kapasitesini ve hızını önemli ölçüde ölçeklendirir. Sonuç olarak, genetik ekran projesi gibi çok sayıda sinek hattını analiz etmek için kolayca kullanılabilir.

Boya bazlı tahliller basitlikleri ve hızları nedeniyle yüksek verimli bir çalışma yolu sağlarken, beslenmenin süre veya hacim gibi daha ayrıntılı nicel yönleri hakkında bilgi yakalayamazlar. Bu sorunun üstesinden gelmek için, yemeğin üzerine, her odadaki besleme süresi ve sıklığı gibi besleme işlemi hakkında daha ayrıntılı bilgi veren yüksek hızlı bir kamera monte edilebilir. Ayrıca, boya bazlı deneylerden toplanan verileri desteklemek için diğer birkaç besleme paradigması kullanılabilir. FLIC27 ve sinek hortumu ve aktivite dedektörü (FlyPAD)34gibi otomatik besleme cihazları, beslenmenin zamansal dinamiklerini kaydedebilir. CAFE tahlil25 veya manuel besleme tahlilleri35 tüketilen gıdaların hacmini ölçebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımların kendi uyarılarına sahiptir. Örneğin, Petri kabı veya çoklu servis plakası ile karşılaştırıldığında, otomatik besleme cihazlarının laboratuvarda kurulması çok pahalıdır. Ek olarak, her cihaz aynı anda sadece birkaç sinek tahlil eder ve bu da onu bireysel hayvanlarda değişkenliğe karşı daha savunmasız hale getirir. CAFE tahlili, sineklerin vücutlarını besleme odasının içinde asılı kılcal borunun sonuna kadar manevra yapma yeteneğine dayandığından, sonuçlar tat alma duyusuyla ilgisi olmayan motor bozukluklar tarafından altüst edilebilir.

Diğer yaklaşımlar kendi başlarına güçlü olsa da, boya bazlı tahliller sineklerde gıda tercihini hızlı bir şekilde keşfetmek ve analiz etmek için daha verimli bir araç olabilir. Ayrıca, iki seçenekli kurulum, sineğin beslenme davranışını seçici ve akut bir şekilde manipüle etmek için optogenetik36 gibi son teknoloji tekniklerle entegre edilebilir. Bu, çanağın bir yarısını ışık aktivasyonu için, diğer yarısını ise ışık etkin olmayan bir kontrol olarak kullanarak yapılabilir. Belirli nöronların doğrudan aktivasyonu veya inaktivasyonu, beslenme davranışlarını düzenlemede bir rolleri olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur. Özetle, bu sonuçlar Petri-dish tabanlı iki seçenekli besleme tahlilinin, araştırmacıların farklı fizyolojik ve metabolik durumlar altında beslenme davranışını analiz etmelerinde yardımcı olabilecek hızlı ve sağlam bir beslenme yöntemi olduğunu göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması veya rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Acknowledgments

Yazarlar, dr. Tingwei Mi'ye iki seçenekli beslenme testini optimize etmelerine yardımcı olduğu için teşekkür eder. Ayrıca Samuel Chan ve Wyatt Koolmees'e el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür etmek istiyorlar. Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri R03 DC014787 (Y.V.Z.) ve R01 DC018592 (Y.V.Z.) ve Ambrose Monell Vakfı tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dish Fisher Scientific 08-772E
Agarose Thomas Scientific C756P56
Clear adhesive Fisher Scientific NC9884114
Conical centrifuge tubes Fisher Scientific 05-527-90
Dissection microscope Amscope SM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant Blue Wako Chemical 3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setup Genesee Scientfic 59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cycle Powers Scientific Inc. IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A
Media storage bottle Fisher Scientific 50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vials Genesee Scientific 32-116
Sucrose Millipore Sigma S9378
Sulforhodamine B Millipore Sigma S9012
Tastant compound of interest
Vortex mixer Benchmark Scientific BV1000
Water bath Fisher Scientific FSGPD05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  2. Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
  3. Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
  4. Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
  5. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
  6. Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
  7. Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
  8. Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
  9. Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
  10. Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
  11. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  12. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  13. Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
  15. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  16. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
  17. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  18. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  19. Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
  20. Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
  21. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  22. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  23. Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
  24. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
  25. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  26. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
  27. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
  28. Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
  29. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  30. Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
  31. Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
  32. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
  33. Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
  34. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
  35. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
  36. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Tags

Nörobilim Sayı 168
<em>Drosophila&apos;da</em> Hızlı Bir Yemek Tercihi Tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid… More

Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (168), e62051, doi:10.3791/62051 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter