Summary
שיטה זו מתארת את השימוש במתודולוגיית תפוקה גבוהה חדשנית, המבוססת על תגובות כימיות טיפות, לאופטימיזציה מהירה וחסכונית של רדיופארמה באמצעות כמויות ננו-מול של ריאגנטים.
Abstract
מכשירי רדיו אוטומטיים נוכחיים מתוכננים לייצר אצוות קליניות גדולות של רדיופארמה. הם אינם מתאימים היטב לאופטימיזציה של התגובה או להתפתחות רדיופארמה חדשנית מכיוון שכל נקודת נתונים כרוכה בצריכה ריאגנטית משמעותית, וזיהום המנגנון דורש זמן לריקבון רדיואקטיבי לפני השימוש הבא. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פלטפורמה לביצוע מערכים של תגובות מבוססות טיפה מיניאטורית במקביל, כל אחד מוגבל בתוך מלכודת מתח פני השטח על "שבב" סיליקון מצופה פוליטרה-פלואוראתילן בדוגמת, פותח. שבבים אלה מאפשרים מחקרים מהירים ונוחים של פרמטרי תגובה כולל ריכוזי ריאגנט, ממס תגובה, טמפרטורת תגובה וזמן. פלטפורמה זו מאפשרת השלמה של מאות תגובות בכמה ימים עם צריכת ריאגנט מינימלית, במקום לקחת חודשים באמצעות radiosynthesizer קונבנציונלי.
Introduction
טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) רדיופארמה נמצאים בשימוש נרחב ככלי מחקר לניטור תהליכים ביוכימיים ספציפיים ב- vivo ומחלות מחקר, ולפיתוח תרופות וטיפולים חדשים. יתר על כן, PET הוא כלי קריטי לאבחון או בימוי המחלה וניטור תגובת המטופל לטיפול1,2,3. בשל זמן מחצית החיים הקצר של רדיואיזוטופים PET (למשל, 110 דקות עבור רדיופארמה פלואור-18 שכותרתו) וסיכון קרינה, תרכובות אלה מוכנים באמצעות מערכות אוטומטיות מיוחדות הפועלות מאחורי מיגון קרינה ויש להכין ממש לפני השימוש.
המערכות הנוכחיות המשמשות לסנתז radiopharmaceuticals נועדו לייצר אצוות גדולות המחולקות לתוך מינונים בודדים רבים לחלוק את עלות הייצור. בעוד שהמערכות הנוכחיות מתאימות לייצור מכשירי רדיו נפוצים כמו [18F]FDG (מכיוון שניתן לתזמן סריקות מטופלים מרובים וניסויי מחקר ביום אחד), מערכות אלה יכולות להיות בזבזניות לייצור מכשירי רדיו חדשניים במהלך פיתוח בשלב מוקדם, או פחות נפוץ radiotracers. כמויות שמערכות קונבנציונליות משתמשות בהן נמצאות בדרך כלל בטווח של 1-5 מ"ל, והתגובות דורשות כמויות מבשר בטווח של 1-10 מ"ג. יתר על כן, באמצעות radiosynthesizers קונבנציונאלי הוא בדרך כלל מסורבל במהלך מחקרי אופטימיזציה מאז המנגנון הופך מזוהם לאחר השימוש ואת המשתמש חייב לחכות רדיואקטיביות להתנוון לפני ביצוע הניסוי הבא. מלבד עלות הציוד, העלות של radioisotope ריאגנטים יכול, אם כן, להיות משמעותי מאוד עבור מחקרים הדורשים ייצור של קבוצות מרובות. זה יכול להתרחש, למשל, במהלך אופטימיזציה של פרוטוקולי סינתזה עבור radiotracers הרומן כדי להשיג תשואה מספיקה ואמינות למחקרים ראשוניים הדמיה vivo.
טכנולוגיות מיקרופלואידיות שימשו יותרויותרברדיוכימיה כדי לנצל מספר יתרונות על פני מערכות קונבנציונליות 4,5,6. פלטפורמות מיקרופלואידיות, כולל אלה המבוססות על נפחי תגובה μL 1-107,8,9 , הראו הפחתה משמעותית של נפחי ריאגנט וצריכת סימנים מקדימים יקרים, כמו גם זמניתגובהקצרים. הפחתות אלה מובילות לעלויות נמוכות יותר, שלבי חימום ואידוי מהירים יותר, טיהור קצר וישיר יותר במורד הזרם, תהליך כימיה "ירוק" הכולל10, ופעילות טוחנת גבוהה יותר של מכשירי הרדיו המיוצרים11. שיפורים אלה עושים את זה מעשי יותר לבצע מחקרי אופטימיזציה נרחבים יותר על ידי הפחתת העלות ריאגנט של כל סינתזה. יתרונות נוספים ניתן להשיג על ידי ביצוע ניסויים מרובים מקבוצה אחת של radioisotope ביום אחד. לדוגמה, רדיוסינתיסייזרים של כימיית זרימה מיקרופלואידית הפועלים ב"מצב גילוי "יכולים לבצע ברצף עשרות תגובות, כל אחת באמצעות 10s בלבד של נפח תגובת μL12.
בהשראת יתרונות אלה, פותח שבב מערך טיפות רב-תגובה שבו תגובות מיקרו-וולומיות מוגבלות למערך של מלכודות מתח-פנים על משטח סיליקון, שנוצרו באמצעות ציפוי טפלון בדוגמת. שבבים אלה מאפשרים תגובות מרובות בסולם 1-20 μL להתבצע בו זמנית, פתיחת האפשרות לחקור 10s של תנאי תגובה שונים ליום, כל אחד עם עותקים משוכפלים מרובים. במאמר זה, התועלת של גישה חדשה זו תפוקה גבוהה לביצוע אופטימיזציות רדיוכימיה מהירה וזולה מודגם. שימוש בשבבי טיפה מרובי תגובה מאפשר חקירה נוחה של ההשפעה של ריכוזי ריאגנטים וממס תגובה, ושימוש בשבבים מרובים יכול לאפשר חקר טמפרטורת התגובה והזמן, כל זאת תוך צריכת כמויות נמוכות מאוד של מבשר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
התראה: פרוטוקול זה כרוך בטיפול בחומרים רדיואקטיביים. אין לבצע ניסויים ללא ההכשרה הדרושה וציוד מגן אישי ואישור ממשרד בטיחות הקרינה בארגון שלך. ניסויים צריכים להתבצע מאחורי מיגון קרינה, רצוי בתא חם מאוורר
1. ייצור שבבים מרובי תגובות
הערה: אצוות של שבבי מיקרו-דרופלט רב-תכליתיים מיוצרות מוופלים סיליקון בגודל 4 אינץ' בטכניקות פוטוליטוגרפיה סטנדרטיות, כפי שנוקע בעבר10 (איור 1). הליך זה יפיק 7 שבבים כל אחד עם מערך של 4 x 4 אתרי תגובה.
- מניחים רקיק סיליקון על צ'אק מעיל ספין, להבטיח כי הוא מרוכז. הפקדה 3 מ"ל של פתרון polytetrafluoroethylene במרכז הוופל עם פיפטה העברה וופל מעיל ב 1000 סל"ד עבור 30 s (500 סל"ד / s רמפה).
- כדי לחזק את הציפוי, מניחים את הוופל על פלטה חמה של 160 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן מעבירים לפלטה חמה של 245 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- אנאל את הציפוי בתנור בטמפרטורה גבוהה ב 340 מעלות צלזיוס עבור 3.5 שעות תחת אווירת חנקן, ואחריו קירור ל 70 מעלות צלזיוס ברמפה 10 °C /min.
- מניחים את רקיק הסיליקון על צ'אק מעיל ספין, להבטיח כי הוא מרוכז. יוצקים 2 מ"ל של פוטורסיסט חיובי במרכז הוופל באמצעות פיפטה העברה, ולאחר מכן לבצע ציפוי ב 3000 סל"ד עבור 30 s (1000 סל"ד / s רמפה).
- לחזק את photoresist על ידי ביצוע אפייה רכה של הוופל על 115 מעלות צלזיוס כיריים במשך 3 דקות.
- התקן את הוופל ואת מסכת הפוטו-מסיכה במיישר מסכות ובצע חשיפה של 14 שניות בעוצמה של 12 מגה-ואט/ס"מ2 מנורה ואורך גל של 356 ננומטר במצב מגע קשיח. שלב זה משתמש במסכת שקיפות המכילה את תבנית הפוליטרפלואורואתילן הסופית השלילית, כלומר תבנית בקוטר 4 אינץ' של 4 עותקים של שבב 16 התגובות, עם אתרי תגובה שקופים וכל האזורים האחרים בצבע אטום.
- לטבול את הוופל באמצעות 20 מ"ל של פתרון מפתח photoresist במיכל זכוכית במשך 3 דקות עם תסיסה קלה לפתח את התבנית החשופה.
- לשטוף את הפתרון המתפתח על ידי שקיעת הוופל במיכל זכוכית עם 20 מ"ל של מים DI במשך 3 דקות עם תסיסה קלה. יבש את הוופל עם אקדח חנקן.
- הסר את אזורי polytetrafluoroethylene חשופים באמצעות תחריט תגובתי-יון (RIE) עם פלזמת חמצן בתנאים הבאים: 30 s חשיפה, 100 mTorr לחץ, 200 W כוח, ו 50 sccm זרימת חמצן.
- קוצצים את הוופל לשבבים בודדים (7 סה"כ לכל וופל) באמצעות חותך רקיק סיליקון.
- לטבול כל שבב אצטון במשך 1 דקות כדי להסיר את photoresist, ואז isopropanol במשך 1 דקות. לבסוף, יבש כל שבב עם אקדח חנקן.
- מניחים שבבים יבשים במיכל זכוכית ומכסים בנייר אלומיניום לאחסון עד לשימוש.
2. תכנון מחקר האופטימיזציה
הערה: בפרוטוקול זה, סינתזה של הרדיופארמה [18F]fallypride משמשת כדוגמה להמחשת מיטוב תפוקה גבוהה (איור 2). עם שבב אחד, 16 תגובות בו זמנית ניתן לבצע, למשל, עם ריכוז מבשר מגוון (8 ריכוזים שונים, n = 2 משכפל כל אחד). התנאים ממופים לאתרי תגובה באיור 3A. ניתן לבצע התאמות בפרוטוקול זה כדי למטב פרמטרי תגובה אחרים (למשל ממס תגובה, נפח תגובה, כמות TBAHCO3וכו ') או radiopharmaceuticals אחרים.
- בחר את פרמטרי התגובה שברצונך לגוון, את הערכים הספציפיים בהם יש להשתמש ואת מספר השכפולים.
- חשב את מספר השבבים הדרושים לביצוע הניסוי.
- עבור כל שבב, להכין מפה של אילו תנאי תגובה ישמשו בכל אתר תגובה כדי לסייע בהכנה ריאגנט וביצוע תגובות טיפה.
3. הכנת ריאגנטים וחומרים לאופטימיזציה של הרדיוסינתזה של [18F]fallypride
הערה: הרדיוסינתזה המבוססת על טיפה של [18F]fallypride (איור 2) מתחילה בתוספת של [18F]fluoride] וזרז העברת פאזה (TBAHCO3)לאתר התגובה, ואחריו חימום כדי לאדות מים ולהשאיר שאריות מיובשות. לאחר מכן, טיפה של הקדמה (tosyl-fallypride) בממס תגובה (אלכוהול תקסיל ואצטוניטריל) מתווסף ומחומם לבצע את תגובת radiofluorination. לבסוף, המוצר הגולמי נאסף מהשבב לניתוח. יש להתאים את הליכי ההכנה והסינתזה של ריאגנטים אם מבצעים אופטימיזציה של מכשיר מעקב אחר.
- הכן פתרון מלאי של ממס התגובה, המורכב אלכוהול קסיל ואצטוניטריל ב 1:1 על ידי תערובת נפח. ודא שאמצעי האחסון מספיק כדי ליצור את סידרת הדילול המתוכננת. בדוגמה זו מיטוב, ~ 30 μL מספיק.
- הכן פתרון מלאי μL 30 של הקדמה (tosyl-fallypride) בממס התגובה עם הריכוז המרבי שיש לחקור (77 מ"מ). ודא שעוצמת הקול מספיקה כדי לבצע את הניסוי המתוכנן. בדוגמה זו מיטוב, ~ 30 μL מספיק.
- מפתרון מלאי מבשר ממס תגובה, לבצע דילול סדרתי 2x כדי להכין את הריכוזים השונים של פתרון מבשר. ודא שאמצעי האחסון של כל דילול מספיק כדי לבצע את מספר השכפולים הרצוי עבור כל תנאי. בדוגמה זו אופטימיזציה, ~ 15 μL של כל ריכוז מספיק.
- הכן צינורות microcentrifuge כדי לאסוף כל מוצר תגובה גולמי באמצעות סמן קבוע כדי לסמן כל צינור עם מספר ייחודי. ודא שהמספר הכולל של צינורות מיקרוצנטריפוגה תואם למספר התנאים כפול מספר השכפולים (8 x 2 = 16).
- הכן מלאי של פתרון איסוף (10 מ"ל) הכולל 9:1 מתנול:DI מים (v / v). Aliquot 50 μL לתוך כל אחד 16 צינורות microcentrifuge נוספים שכותרתו (אחד לכל אתר תגובה על השבב).
- הכינו [18F]fluoride stock פתרון בצינור microcentrifuge 500 μL על ידי ערבוב [18F ]פלואוריד /[18O]H2O (~ 260 MBq [7 mCi]) עם 75 מ"מ TBAHCO3 פתרון (56 μL) ודילול עם מים DI עד 140 μL. 8 μL של פתרון זה ייטען לכל אתר תגובה (המכיל ~ 15 MBq [0.40 mCi] של פעילות, ו 240 nmol של TBAHCO3).
4. סינתזה מקבילה של [18F]fallypride עם ריכוזי קודמן שונים
הערה: השבב מופעל על גבי פלטפורמת חימום (שנבנתה כאמור13) המורכבת מתנור קרמי 25 מ"מ x 25 מ"מ, הנשלט באמצעות בקר טמפרטורה כבוי באמצעות אות התרמוקופל הפנימי למשוב. טמפרטורות פני השטח של התנור כוילו באמצעות הדמיה תרמית. אם פלטפורמה כזו אינה זמינה, ניתן להשתמש בזוג צלחות חמות (אחת ב-105 מעלות צלזיוס ואחת ב-110 מעלות צלזיוס).
- טען [18F]פתרון מלאי פלואוריד (עם זרז העברת פאזה).
- באמצעות micropipette, לטעון טיפה 8 μL של [18F ]פתרון מלאי פלואוריד על נקודת התגובה הראשונה של שבב רב תגובה. למדוד את הפעילות של השבב על ידי הצבתו במינון calibrator ולתעד את הזמן שבו המדידה מתבצעת.
- הסר את השבב מן calibrator מינון ולאחר מכן לטעון טיפה 8 μL של [18F]פלואוריד פתרון מלאי על נקודת התגובה השנייה. למדוד את הפעילות על השבב על ידי הצבתו שוב במינון calibrator ולתעד את הזמן שבו המדידה מתבצעת.
- חזור על הפעולה עבור כל אתרי התגובה האחרים בשבב.
- חשב את הפעילות שנטענה לכל נקודת תגובה על-ידי מדידת הפעילות לאחר טעינת הרדיואיסוטופה וחיסור המדידה הקודמת (תוקנה על-ידי ריקבון) לפני טעינת האתר.
- יישר את השבב מרובה התגובות על התנור.
- מוסיפים שכבה דקה של משחה תרמית על גבי תנור הקרמיקה.
- הנח בזהירות את השבב על גבי התנור באמצעות פינצטה כדי למנוע את שפיכת הטיפות, תוך יישור פינת הייחוס של השבב לפינת הייחוס של התנור (כפי שמוצג באיור 3B). השבב יתחמם בכמות קטנה.
- יבש את הזרז [18F]פלואוריד והעברת פאזה.
- מחממים את השבב במשך דקה על ידי הגדרת התנור ל 105 מעלות צלזיוס בתוכנית הבקרה כדי לאדות את הטיפות ליובש משאיר שאריות מיובשות של [18F ]פלואוריד ו TBHACO3. לאחר דקה, מצננים את השבב על ידי כיבוי התנור והפעלת מאוורר הקירור באמצעות תוכנית הבקרה.
- הוסף את פתרון קודמן.
- באמצעות micropipette, להוסיף פתרון 6 μL של מבשר fallypride על גבי שאריות מיובשות באתר התגובה הראשון.
- חזור על הפעולה עבור כל אתרי התגובה האחרים בשבב. השתמש בתוכנית המיטוב כדי לקבוע באיזה ריכוז של סדרת הדילול נעשה שימוש עבור כל אתר תגובה.
- בצע תגובת פלואורינציה.
- מחממים כל שבב ל 110 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות באמצעות תוכנית הבקרה כדי לבצע תגובת radiofluorination. לאחר מכן, לקרר את השבב על ידי כיבוי התנור והפעלת מאוורר קירור עם תוכנית הבקרה.
- לאסוף את המוצרים הגולמיים מאתרי התגובה.
- לאסוף את המוצר הגולמי באתר התגובה הראשון על ידי הוספת 10 μL של פתרון איסוף מצינור microcentrifuge המיועד באמצעות micropipette. לאחר המתנה של 5 שניות, השתמש במיקרופיפט (עם אותו קצה מותקן) כדי לשאוף את המוצר הגולמי המדולל ולהעביר לצינור המיקרוצנטריפוגה המסומן המתאים שלו.
- חזור על תהליך זה בסך הכל 4 פעמים באמצעות אותו קצה פיפטה עבור כל הפעולות.
- חזור על תהליך האיסוף עבור כל אתרי התגובה האחרים בשבב.
5. ניתוח סינתזה כדי לקבוע את ביצועי התגובה ואת התנאים האופטימליים
- קבע את "יעילות האיסוף" עבור התגובה הראשונה בשבב.
- מניחים את הצינור microcentrifuge עם המוצר הגולמי שנאסף של נקודת התגובה הראשונה בקליברטור המינון כדי למדוד את הפעילות. רשום את המדידה ואת השעה של המדידה.
- חשב את יעילות האיסוף על-ידי חלוקת הפעילות של המוצר הגולמי שנאסף על-ידי הפעילות ההתחלתית הנמדדת עבור אותו אתר תגובה (תיקון ערכי הפעילות לאותה נקודת זמן).
- חזור על הפעולה עבור כל אתרי התגובה האחרים בשבב.
- לנתח את הרכב (יעילות פלואורינציה) של כל מוצר גולמי שנאסף.
הערה: כדי להפוך את הניתוח המעשי של כל הדגימות בתוך זמן קצר, יעילות פלואורינציה מנותחת באמצעות כרומטוגרפיה שכבה רדיו-דק תפוקה גבוהה שתוארה בעבר (רדיו-TLC)גישה 14. טכניקה זו מאפשרת עד שמונה דגימות להיות מעובד במקביל על ידי איתור אז זה לצד זה (5 מ"מ המגרש, 0.5 μL לכל נקודה) על צלחת TLC אחת, לאחר מכן לפתח יחד, וביצוע קריאה יחד באמצעות Cerenkov הדמיה14,15. לדוגמה אופטימיזציה עם 16 תגובות מקבילות, 2 לוחות TLC נדרשים. אפשרות נוספת היא להשתמש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (רדיו-HPLC) לניתוח, אם כי הזמן להפרדה, ניקוי ושיווי משקל עשוי להגביל את מספר הדגימות שניתן לנתח.- עבור כל צלחת TLC (50 מ"מ x 60 מ"מ), עם עיפרון, צייר קו במרחק של 15 מ"מ מקצה אחד של 50 מ"מ (למטה), וקו נוסף במרחק של 50 מ"מ מאותו קצה. השורה הראשונה היא קו המקור; השני הוא הקו הקדמי ממס. צייר 8 "X" קטנים לאורך קו המקור בריווח של 5 מ"מ כדי להגדיר את מיקום איתור הדגימה עבור כל אחד מ-8 "נתיבים".
- באמצעות micropipette, להעביר 0.5 μL של המוצר הגולמי הראשון על צלחת TLC ב "X" עבור הנתיב הראשון. יש לחזור על הפעולה לקבלת מוצרים גולמיים נוספים (עד 8 לכל צלחת TLC). המתן עד שנקודות המוצר הגולמי יתייבשו על צלחת ה- TLC.
- עבור כל צלחת TLC, לפתח באמצעות שלב נייד של 60% MeCN ב 25 mM NH4HCO2 עם 1% תה (v / v) עד חזית הממס מגיע לקו הקדמי ממס. המתן עד שהממס בצלחת TLC יתייבש ולאחר מכן יכסה במגלשת מיקרוסקופ זכוכית (76.2 מ"מ x 50.8 מ"מ, בעובי 1 מ"מ).
- השג תמונת רדיואקטיביות של כל לוח TLC על ידי הנחת הצלחת במערכת הדמיה Cerenkov לחשיפה של 5 דקות. ביצוע תיקוני תמונה סטנדרטיים (חיסור זרם כהה, תיקון שדה שטוח, סינון חציוני וחיסור רקע).
- השתמש באזור עניין (ROI) ניתוח עבור הנתיב הראשון של צלחת TLC הראשונה. צייר אזורים סביב כל רצועה הנראית בנתיב. התוכנה ת לחשב את השבר של אינטנסיביות משולבת של כל אזור (הלהקה) לעומת העוצמה המשולבת הכוללת של כל האזורים (להקות).
- בשלב נייד זה, הרצועות הבאות צפויות להיות בגורמי השמירה שצוינו: Rf = 0.0: Unreacted [18F]פלואוריד; Rf = 0.9: [18F]fallypride; Rf = 0.94: מוצר צדדי. קבע את יעילות הפלואורינציה כשבר הפעילות ברצועה [18F]fallypride.
- חזור על ניתוח זה עבור כל הנתיבים האחרים על כל לוחות TLC.
הערה: אם תא הדמיה Cerenkov אינו זמין, חיה קטנה (פרה-קולינית) במערכת הדמיה אופטית vivo יכול לשמש כדי לדמיין את לוחות TLC. לחלופין, ניתן להשתמש בסורק TLC דו-ממדי. לחלופין, אם רק סורק TLC חד מימדי זמין, ניתן לנתח את לוחות TLC על ידי חיתוך לרצועות עם מספריים (1 לנתיב), וסריקת כל רצועה בנפרד.
- קבע את התשואה הרדיוכימית הגולמית (RCY גולמי) עבור כל אתר תגובה.
- קבע את ה- RCY הגולמי עבור המוצר הגולמי הראשון על-ידי הכפלת יעילות האיסוף ביעילות הפלואורינציה.
- חזור על הפעולה עבור כל אתרי התגובה האחרים.
- ניתוח התוצאות
- ערכי צבירה עבור כל ניסויי שכפול לסטיית ממוצע וסטנדרט.
- התווה את יעילות האיסוף, יעילות הפלורציה ו- RCY הגולמי כפונקציה של הפרמטר שהיה מגוון (ריכוז קודמן בדוגמה זו).
- בחר את התנאים האופטימליים בהתבסס על הקריטריונים הרצויים. בדרך כלל, זהו RCY הגולמי המרבי. בנוסף, הנקודה נבחרת לעתים קרובות באזור שבו השיפוע של הגרף שטוח יחסית, המציין שהוא חסר רגישות לשינויים קטנים בפרמטר, ומספק פרוטוקול חזק יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בוצע ניסוי מייצג להמחשת שיטה זו. באמצעות 16 תגובות, מחקרי אופטימיזציה של הרדיופארמה [18F]fallypride בוצעו על ידי ריכוז מבשר משתנה (77, 39, 19, 9.6, 4.8, 2.4, 1.2, ו 0.6 מ"מ) באלכוהול קסיל:MeCN (1:1, v / v) כממס התגובה. התגובות בוצעו ב 110 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות. יעילות איסוף, קומפוזיציה לדוגמה (כלומר, פרופורציות של [18F]fallypride, unreacted [18F]fluoride, ומוצר צדדי) מסומנים בטבלה 1 ומסוכמים גרפית באיור 4.
המחקר הראה כי יעילות הפלואורינציה (שיעור של [18F]fallypride) עולה עם הגדלת ריכוז מבשר, וכי הנותרים unreacted [18F ]פלואוריד השתנה הפוך (איור 4A). הייתה כמות קטנה של מוצר צד רדיואקטיבי בריכוזי קודמן נמוכים, אך השיעור ירד לכמעט אפס בריכוזי המבשר הגבוהים יותר (איור 4A). יעילות הגבייה הייתה כמעט כמותית עבור רוב התנאים, אם כי היא ירדה מעט בריכוזי סימנים מקדימים נמוכים.
מתוצאות אלה, RCY הגבוה ביותר ניתן להשיג עם ~ 230 nmol של הקדמה (כלומר, 39 mM ריכוז טיפה 6 μL). במצב זה, יעילות הפלואורינציה הייתה 96.0 ± 0.5% (n = 2) ואת RCY הגולמי היה 87.0 ± 2.7 (n = 2), ולא היה נצפה היווצרות מוצר צד רדיואקטיבי. בעוד שהשימוש במבשר 77 מ"מ הראה תוצאות דומות, באופן כללי רצוי להשתמש בכמות נמוכה יותר של קודמן כדי להפחית את העלות ולפשט את צעדי הטיהור במורד הזרם.
איור 1: ייצור שבבי מיקרו-דרופלט מרובי תגובות באמצעות פוטוליטוגרפיה. (A) תצלום של שבב מיקרו-דרופלט רב-תכליתי עם מערך של 4 x 4 אתרי תגובה. השבב מורכב מסיליקון מצופה פוליטרה-פלואוראתילן עם אזורים מעגליים של פוליטרה-פלואורותילן חרוטים כדי ליצור את אתרי התגובה ההידרופילית. (B) סכמטי של הליך הייצור. רקיק סיליקון מצופה ספין בתמיסת טפלון ואפוי כדי לחזק את הציפוי. לאחר מכן, הפוטורסיסט מצופה ספין בדוגמת באמצעות פוטוליטוגרפיה כדי לייצר מסכת תחריט. הפוטוארסיסט מפותח עם פתרון פיתוח פוטורסיסטי. הטפלון החשוף מוסר לאחר מכן באמצעות תחריט יבש עם פלזמת חמצן. הוופל חתוך לקוביות שבבים בודדים, והפוטורסיסט מופשט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נוהל לתגובות מקבילות. הליך ניסיוני לביצוע 16 סינתזות מקבילות של הרדיופארמה [18F]fallypride על שבב מרובה תגובות. בדוגמה זו, ריכוז המבשר מגוון עבור כל תגובה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מפת התנאים באתרי התגובה. (A) עיצוב ניסיוני כדי לחקור את ההשפעה של ריכוז מבשר על radiofluorination של טסיל fallypride באמצעות שבב יחיד 16 תגובה (תצוגה עליונה). שמונה ריכוזים שונים נחקרו, כל אחד עם n = 2 משכפלים. תנאי תגובה אחרים נערכו קבוע (טמפרטורה: 110 מעלות צלזיוס; זמן: 7 דקות; ממס: אלכוהול תקסיל:MeCN; כמות TBAHCO3: 240 נמול). כל תגובה בוצעה עם ~ 14 MBq של פעילות. (B)תצלום של שבב בעל 16 תגובות המותקן על פלטפורמת התנור במהלך הניסוי. קווים אדומים מייצגים את פינת הייחוס של השבב המשמש ליישור עם פינת הייחוס של התנור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השפעת ריכוז קודמן על סינתזת המיקרו-דרופלט של [18F]fallypride. (A) חלקם של מינים רדיואקטיביים הנמצאים במוצר התגובה הגולמי שנאסף, כלומר [18F]fallypride, תוצר צדדי או לא פעיל [18F]fluoride. (B)ביצועי סינתזה. יעילות איסוף, יעילות פלואורינציה, ו RCY גולמי מותווים כפונקציה של ריכוז מבשר. בשני הגרפים, נקודות נתונים מייצגות את הממוצע של n = 2 שכפולים, ופסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| קונצרט מבשר (mM) | יעילות גבייה (%) | יעילות פלואורינציה (%) | RCY גולמי (%) | פלואוריד [18F] לא פעיל (%) | מוצר צדדי (%) |
| 77 | 91.8 ± 2.1 | 96.7 ± 2.0 | 88.8 ± 3.9 | 3.3 ± 2.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 39 | 90.6 ± 2.4 | 96.0 ± 0.5 | 87.0 ± 2.7 | 4.0 ± 0.5 | 0.0 ± 0.0 |
| 19 | 91.1 ± 0.5 | 81.1 ± 0.3 | 73.9 ± 0.7 | 8.4 ± 1.2 | 10.5 ± 2.0 |
| 9.6 | 90.9 ± 0.6 | 62.7 ± 0.9 | 57.0 ± 0.5 | 23.3 ± 2.1 | 14.0 ± 0.9 |
| 4.8 | 88.4 ± 0.8 | 37.0 ± 1.5 | 32.8 ± 1.6 | 47.3 ± 0.8 | 15.7 ± 1.0 |
| 2.4 | 87.6 ± 2.0 | 21.0 ± 2.1 | 18.4 ± 2.2 | 67.4 ± 2.1 | 11.6 ± 1.0 |
| 1.2 | 82.3 ± 1.6 | 12.7 ± 0.3 | 10.4 ± 0.1 | 72.8 ± 0.7 | 14.5 ± 1.0 |
| 0.6 | 81.2 ± 3.7 | 6.3 ± 0.8 | 5.1 ± 0.5 | 84.3 ± 0.2 | 9.4 ± 1.0 |
טבלה 1: נתונים שהתקבלו ממחקר של ריכוז מבשר. כל הערכים הם ממוצעים ± סטיות תקן שחושבו מ- n = 2 שכפולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל מגבלות של מערכות רדיוכימיה קונבנציונליות המאפשרות רק מספר קטן של תגובות ביום וצורכות כמות משמעותית של ריאגנטים לכל נקודת נתונים, ניתן לחקור רק חלק זעיר משטח הפרמטרים של התגובה הכוללת בפועל, ופעמים רבות התוצאות מדווחות ללא חזרות (n = 1). בהשוואה למערכות קונבנציונליות, פלטפורמת רדיוסינתזה מרובת תגובה זו הופכת את ביצוע מחקרים מקיפים וקפדניים יותר של תנאי רדיוסינתזה תוך צריכת מעט מאוד זמן וכמות של קודמן, מה שעשוי לאפשר תובנות חדשות על פרמטרים המשפיעים על תפוקת המוצר ועל היווצרות המוצר הצדדי. ניתן להשתמש במידע כדי לבחור את התנאים שתוצאת המוצר הגבוהה ביותר או הסינתזה החזקה ביותר. צריכת קודמן נמוכה עשויה להיות שימושית במיוחד בפיתוח מוקדם של מכשירי רדיו חדשניים כאשר רק כמות קטנה של קודמן עשויה להיות זמינה או כאשר המבשר יקר. בעוד האופי הפתוח של השבבים תורם זמן סינתזה מהירה וקלות הגישה באמצעות פיפטה, זה יכול להוביל להפסדים משמעותיים של מולקולות נדיפות ולא יכול להיות מעשי בעת אופטימיזציה של סינתזה של radiopharmaceuticals כי יש סימנים מקדימים נדיפים, ביניים, או מוצרים.
בשל הסכנה של חשיפה לקרינה, יש לחזור ולהדגיש כי ניסויים אלה צריכים להתבצע רק עם אימונים ואישורים מתאימים ויש לבצע אותם מאחורי מיגון קרינה, רצוי בתא חם מאוורר. בשל זמן מחצית החיים הקצר של הרדיואיזוטופים, חשוב לבצע את הניסויים במהירות וביעילות. צנרת ריאגנטים לשבב ואיסוף מוצרים מהשבב צריך להיות מתורגל בתנאים שאינם רדיואקטיביים כדי להכיר את הגישה המופחתת ונראות בתא חם. באופן דומה, התקנה והסרה של השבב, ביצוע מדידות של השבב עם calibrator המינון צריך גם להיות מתורגל. בנוסף, זה קריטי להיות מאורגן, עם מפת ניסוי מפורטת (כלומר, תנאי תגובה ספציפיים בכל אתר על השבב). כמו כן, מומלץ להכין מראש טבלת תוצאות למילוי עם מילוי המדידות. כדי להבטיח רבייה, במיוחד עם האפשרות של טעות אנוש, יש לבצע העתקים מרובים של כל קבוצת תנאים. חשוב להיות זהיר במיוחד במהלך השלב של איסוף הדגימות הגולמיות מהשבב, כדי למנוע שפיכת נוזל מחוץ לאתר התגובה וגרימת זיהום צולב עם אתרי תגובה סמוכים. אם יש תשומת לב לשגיאות כלשהן, חשוב לסמן אתרי תגובה אלה בדגל כדי שניתן יהיה להוציא את הנתונים מהניתוח הסופי.
במחקר דוגמה זו, קודמן הכמות הנצרכת עבור 16 נקודות נתונים היה 1.1 מ"ג (~ 70 מיקרוגרם כל אחד), לעומת 4 מ"ג לכל נקודת נתונים באמצעות radiosynthesizer קונבנציונלי. יתר על כן, כל 16 התגובות הושלמו תוך 25 דקות, כולן בניסוי אחד. לשם השוואה, הסינתזה של גולמי [18F ]fallypride על radiosynthesizer קונבנציונאלי דורש ~ 15-20 דקות לכלתגובה 16,17.
ניסוי מייצג זה הדגים את התועלת של שבב microdroplet מרובה תגובות עם 16 תגובות כדי לייעל את התנאים עבור radiosynthesis של radiopharmaceutical [18F ]fallypride על ידי חקירת 8 ריכוזי קודמן שונים (n = 2 שכפולים עבור כל תנאי) באופן מהיר וחסכוני. משתנים אחרים שניתן לייעל בנוחות באמצעות שבב מרובה תגובה כוללים את כמות הרדיואקטיביות, סוג של זרז העברת פאזה, כמות זרז העברת פאזה, תנאי אידוי /ייבוש (למשל, מספר שלבי ייבוש אזוטרופיים), ממס תגובה וכו '. באמצעות שבבים מרובי תגובות מרובים, ניתן גם לחקור את ההשפעה של טמפרטורת התגובה וזמן התגובה, בנוסף לתנאים כגון אידוי / ייבוש טמפרטורה וזמן. מחקרים כאלה יצטרכו להתבצע ברצף באמצעות תנור יחיד או יכול להיות מקביל על ידי הפעלת תנורי חימום מרובים בו זמנית.
שיטת סינתזת הטיפות הבסיסית הוכחה כמתאימה למגוון רחב של 18רדיופארמה עם תווית F, כגון [18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F]FBB20 וניתן להשתמש בו לאופטימיזציה של רוב 18תרכובות ותרכובות אחרות המסומנים בתווי F המסומנים עם איזוטופים אחרים. יתר על כן, התגובות המבוססות על טיפה ממוטבת וכתוצאה מכך למנף באופן מהותי את היתרונות של רדיוכימיה microvolume, כולל צריכת קודמן מופחתת, זמני תהליך מהירים יותר, מכשור קומפקטי, והוא יכול להציע את אותם יתרונות לייצור שגרתי של אצוות גדולות. אצוות גדולות יותר פשוט דורשות שינוי קנה מידה של כמות הפעילות שנטענה בתחילה בתחילת התגובה. כדי להכין tracer מתאים לשימוש במבחנה או במבחנה, המוצר הגולמי חייב להיות מטוהר (למשל, באמצעות HPLC בקנה מידה אנליטי) ונוסח (למשל באמצעות חילופי ממס אידוי או מוצק פאזה21) לחילופין, ייתכן שניתן יהיה להתאים את התנאים האופטימליים מקנה מידה טיפה ל radiosynthesizer מבוסס בקבוקון קונבנציונלי. חקירת האפשרות הזו נמשכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
חברי ההנהלה של אוניברסיטת קליפורניה העניקו רישיון לטכנולוגיה לסופי בע"מ שהומצאה על ידי ד"ר ואן דאם, ולקחו הון עצמי בסופי בע"מ כחלק מעסקת הרישוי. ד"ר ואן דאם הוא מייסד ויועץ של סופי בע"מ. שאר המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לסרטן (R33 240201).
Acknowledgments
אנו מודים למתקן הקיקלוטרון הביו-רפואי של UCLA ודר' רוג'ר סלביק וד"ר ג'וזפה קרלוצ'י על שסיפקו בנדיבות [18F]פלואוריד למחקרים אלה ול- UCLA NanoLab על תמיכה בציוד לייצור שבבים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
