Summary
Denne metoden beskriver bruken av en ny høygjennomstrømningsmetodikk, basert på dråpekjemiske reaksjoner, for rask og økonomisk optimalisering av radiofarmaka ved hjelp av nanomole mengder reagenser.
Abstract
Nåværende automatiserte radiosynthesizere er designet for å produsere store kliniske partier av radiofarmaka. De er ikke godt egnet for reaksjonsoptimalisering eller ny radiofarmasøytisk utvikling siden hvert datapunkt innebærer betydelig reagensforbruk, og forurensning av apparatet krever tid for radioaktivt forfall før neste bruk. For å løse disse begrensningene ble det utviklet en plattform for å utføre matriser med miniatyrdråpebaserte reaksjoner parallelt, hver innenfor en overflatespenningsfelle på en mønstret polytetrafluoretylenbelagt silisium "chip". Disse sjetongene muliggjør raske og praktiske studier av reaksjonsparametere, inkludert reagenskonsentrasjoner, reaksjonsløsningsmiddel, reaksjonstemperatur og tid. Denne plattformen tillater ferdigstillelse av hundrevis av reaksjoner på noen dager med minimalt reagensforbruk, i stedet for å ta måneder ved hjelp av en konvensjonell radiosynthesizer.
Introduction
Positron-utslipp tomografi (PET) radiofarmaka er mye brukt som forskningsverktøy for å overvåke spesifikke in vivo biokjemiske prosesser og studie sykdommer, og for utvikling av nye legemidler og terapier. Videre er PET et kritisk verktøy for diagnostisering eller iscenesettelse av sykdom og overvåking av pasientens respons på terapi1,2,3. På grunn av den korte halveringstiden til PET-radioisotopper (f.eks. 110 min for fluor-18-merkede radiofarmaka) og strålingsfare, fremstilles disse forbindelsene ved hjelp av spesialiserte automatiserte systemer som opererer bak strålingsskjerming og må tilberedes like før bruk.
Dagens systemer som brukes til å syntetisere radiofarmaka er designet for å produsere store partier som er delt opp i mange individuelle doser for å dele produksjonskostnadene. Mens dagens systemer er egnet for produksjon av mye brukte radiotracers som [18F]FDG (fordi flere pasientskanninger og forskningseksperimenter kan planlegges på en enkelt dag), kan disse systemene være bortkastet for produksjon av nye radiotracers under tidlig utvikling, eller mindre vanlige radiotracers. Volumer som konvensjonelle systemer bruker er vanligvis i 1-5 ml-området, og reaksjonene krever forløpermengder i 1-10 mg-området. Videre er bruk av konvensjonelle radiosynthesizere generelt tungvint under optimaliseringsstudier siden apparatet blir forurenset etter bruk, og brukeren må vente på at radioaktiviteten forfaller før du utfører neste eksperiment. Bortsett fra utstyrskostnader, kan kostnaden for radioisotopen og reagensene derfor bli svært betydelig for studier som krever produksjon av flere partier. Dette kan for eksempel skje under optimalisering av synteseprotokoller for nye radiotracere for å oppnå tilstrekkelig utbytte og pålitelighet for innledende in vivo-avbildningsstudier.
Mikrofluidiske teknologier har i økende grad blitt brukt i radiokjemi for å utnytte flere fordeler i forhold til konvensjonelle systemer4,5,6. Mikrofluidiske plattformer, inkludert de som er basert på 1-10 μL reaksjonsvolumer7,8,9, har vist en betydelig reduksjon av reagensvolumer og forbruk av dyre forløpere, samt korte reaksjonstider. Disse reduksjonene fører til lavere kostnader, raskere oppvarming og fordampningstrinn, kortere og enklere nedstrøms rensing, en samlet "grønnere" kjemiprosess10, og høyere molar aktivitet av de produserte radiotracers11. Disse forbedringene gjør det mer praktisk å utføre mer omfattende optimaliseringsstudier ved å senke reagenskostnadene for hver syntese. Ytterligere fordeler kan oppnås ved å utføre flere eksperimenter fra en enkelt batch radioisotope på en enkelt dag. For eksempel kan mikrofluidisk strømningskjemi radiosynthesizere som opererer i "oppdagelsesmodus" sekvensielt utføre dusinvis av reaksjoner, som hver bare bruker 10s μL reaksjonsvolum12.
Inspirert av disse fordelene ble det utviklet en multireaksjonsdråpematrisebrikke der mikrovolumreaksjoner er begrenset til en rekke overflatespenningsfeller på en silisiumoverflate, opprettet ved hjelp av et mønstret Teflon-belegg. Disse sjetongene gjør det mulig å utføre flere reaksjoner på 1-20 μL-skalaen samtidig, noe som åpner muligheten for å utforske 10-tallet av forskjellige reaksjonsforhold per dag, hver med flere replikeringer. I dette dokumentet demonstreres nytten av denne nye høygjennomstrømningsmetoden for å utføre raske og rimelige radiokjemioptimaliseringer. Ved hjelp av multireaksjonsdråpeflis muliggjør du praktisk utforskning av virkningen av reagenskonsentrasjoner og reaksjonsløsningsmiddel, og bruk av flere sjetonger kan muliggjøre studiet av reaksjonstemperatur og tid, samtidig som de bruker svært lave mengder forløper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FORSIKTIG: Denne protokollen innebærer håndtering av radioaktive materialer. Eksperimenter bør ikke utføres uten nødvendig opplæring og personlig verneutstyr og godkjenning fra strålingssikkerhetskontoret i organisasjonen. Eksperimenter bør utføres bak strålingsskjerming, helst i en ventilert varm celle
1. Fabrikasjon av multireaksjonsbrikker
MERK: Grupper av mikrodråpebrikker med flere reaksjoner fremstilles fra 4" silisiumskiver ved hjelp av standard fotolittografiteknikker, som tidligere avskrevet10 (figur 1). Denne prosedyren vil produsere 7 sjetonger hver med 4 x 4 utvalg av reaksjonssteder.
- Plasser silisiumskiven på spin-coater chucken, og sørg for at den er sentrert. Deponer 3 ml polytetrafluoretylenoppløsning i midten av skiven med en overføringspipette og frakkskive ved en 1000 rpm for 30 s (500 rpm / s rampe).
- For å størkne belegget, plasser skiven på en 160 °C kokeplate i 10 minutter og overfør deretter til en 245 °C kokeplate i 10 minutter.
- Anneal belegget i en høytemperaturovn ved 340 °C i 3,5 timer under nitrogenatmosfære, etterfulgt av kjøling til 70 °C ved en rampe på 10 °C/min.
- Plasser silisiumskiven på spin-coater chucken, og sørg for at den er sentrert. Hell 2 ml positiv fotoresist i midten av skiven ved hjelp av en overføringspipette, og utfør deretter belegg ved 3000 rpm i 30 s (1000 rpm / s rampe).
- Størk fotoresisten ved å utføre en myk bake av skiven på en 115 °C kokeplate i 3 min.
- Monter skiven og fotomasken i en maskejustering og utfør en 14 s eksponering ved 12 mW/cm2 lampeintensitet og 356 nm bølgelengde i hard kontaktmodus. Dette trinnet bruker en gjennomsiktighetsmaske som inneholder det negative endelige polytetrafluoretylenmønsteret, det vil si et 4" diametermønster på 4 kopier av 16-reaksjonsbrikken, med reaksjonssteder gjennomsiktige og alle andre regioner i ugjennomsiktig farge.
- Senk skiven ned ved hjelp av 20 ml fotoresistutviklerløsning i en glassbeholder i 3 minutter med liten agitasjon for å utvikle det eksponerte mønsteret.
- Skyll bort utviklingsløsningen ved å senke skiven ned i en glassbeholder med 20 ml DI-vann i 3 minutter med liten agitasjon. Tørk skiven med en nitrogenpistol.
- Fjern de eksponerte polytetrafluoretylenområdene via reaktiv-ion-etsning (RIE) med oksygenplasma under følgende forhold: 30 s eksponering, 100 mTorrtrykk, 200 W effekt og 50 sccm oksygenstrøm.
- Terning waferen i individuelle sjetonger (7 totalt per wafer) ved hjelp av en silisiumskivekutter.
- Senk hver brikke i aceton i 1 min for å fjerne fotoresisten, deretter isopropanol i 1 min. Til slutt tørker du hver chip med en nitrogenpistol.
- Legg tørrflis i en glassbeholder og dekk med aluminiumsfolie til oppbevaring til bruk.
2. Planlegging av optimaliseringsstudien
MERK: I denne protokollen brukes syntese av radiofarmasøytisk[18F]fallyprid som et eksempel for å illustrere optimalisering av høy gjennomstrømning (figur 2). Med en enkelt brikke kan 16 samtidige reaksjoner utføres, for eksempel med variert forløperkonsentrasjon (8 forskjellige konsentrasjoner, n = 2 replikerer hver). Forholdene er kartlagt til reaksjonssteder i figur 3A. Justeringer kan gjøres i denne protokollen for å optimalisere andre reaksjonsparametere (f.eks. reaksjonsløsningsmiddel, reaksjonsvolum, mengde TBAHCO3osv.) eller andre radiofarmaka.
- Velg reaksjonsparameteren(e) som skal varieres, de spesifikke verdiene som skal brukes, og antall replikeringer.
- Beregn antall sjetonger som trengs for å utføre eksperimentet.
- For hver brikke, lag et kart over hvilke reaksjonsforhold som skal brukes på hvert reaksjonssted for å hjelpe med reagensforberedelse og utføre dråpereaksjonene.
3. Fremstilling av reagenser og materialer for optimalisering av radiosyntesen av [18F]fallypride
MERK: Den dråpebaserte radiosyntesen av [18F]fallyprid (Figur 2) begynner med tilsetning avfluoridog faseoverføringskatalysator (TBAHCO3) til reaksjonsstedet, etterfulgt av oppvarming for å fordampe vann og etterlate en tørket rest. Deretter tilsettes en dråpe forløper (tosyl-fallyprid) i reaksjonsløsningsmiddel (theksylalkohol og acetonitril) og oppvarmes for å utføre radiofluoreringsreaksjonen. Til slutt samles råproduktet fra brikken for analyse. Reagensforberedelses- og synteseprosedyrene bør tilpasses ved optimalisering av en annen tracer.
- Forbered en lagerløsning av reaksjonsløsningsmidlet, bestående av aksylalkohol og acetonitril i en 1:1 ved volumblanding. Forsikre deg om at volumet er nok til å lage den planlagte fortynningsserien. I dette eksemplet er optimalisering av ~30 μL tilstrekkelig.
- Forbered en 30 μL lagerløsning av forløper (tosyl-fallyprid) i reaksjonsløsningsmidlet med maksimal konsentrasjon som skal utforskes (77 mM). Forsikre deg om at volumet er nok til å utføre det planlagte eksperimentet. I dette eksemplet er optimalisering av ~30 μL tilstrekkelig.
- Fra forløperens lagerløsning og reaksjonsløsningsmiddel, utfør 2x serielle fortynninger for å forberede de forskjellige konsentrasjonene av forløperløsningen. Forsikre deg om at volumet av hver fortynning er nok til å utføre ønsket antall replikeringer for hver tilstand. I dette eksemplet er optimalisering av ~15 μL av hver konsentrasjon tilstrekkelig.
- Forbered mikrosenterrør for å samle hvert råreaksjonsprodukt ved hjelp av en permanent markør for å merke hvert rør med et unikt nummer. Forsikre deg om at det totale antallet mikrocentrifuge rør samsvarer med antall forhold multiplisert med antall replikeringer (8 x 2 = 16).
- Forbered et lager av oppsamlingsløsning (10 ml) som består av 9:1 metanol:DI vann (v/v). Aliquot 50 μL i hver av 16 ekstra merkede mikrocentrifuge rør (en per reaksjonssted på brikken).
- Forbered en [18F]fluord lagerløsning i et 500 μL mikrosentrifugerør ved å blande [18F]fluorid/[18O]H2O (~260 MBq [7 mCi]) med 75 mM TBAHCO3-oppløsning (56 μL) og fortynning med DI-vann opp til 140 μL. 8 μL av denne løsningen vil bli lastet til hvert reaksjonssted (som inneholder ~15 MBq [0,40 mCi] aktivitet, og 240 nmol TBAHCO3).
4. Parallell syntese av [18F]fallyprid med forskjellige forløperkonsentrasjoner
MERK: Brikken betjenes på toppen av en varmeplattform (konstruert som tidligere beskrevet13) som består av en keramisk varmeapparat på 25 mm x 25 mm, styrt ved hjelp av en av-og-på temperaturregulator ved hjelp av det interne termokoblingssignalet for tilbakemelding. Varmerens overflatetemperaturer ble kalibrert ved hjelp av termisk bildebehandling. Hvis en slik plattform ikke er tilgjengelig, kan et par varme plater brukes (en ved 105 °C og en ved 110 °C).
- Last[18F]fluord lagerløsning (med faseoverføringskatalysator).
- Bruk en mikropipette til å laste en 8 μL dråpe[18F]fluord lagerløsning på det første reaksjonspunktet på en multireaksjonsbrikke. Mål aktiviteten til brikken ved å plassere den i en dosekalibrator og registrer tidspunktet da målingen utføres.
- Fjern brikken fra dosekalibratoren og last deretter en 8 μL dråpe[18F]fluorid lagerløsning på det andre reaksjonspunktet. Mål aktiviteten på brikken ved å plassere den igjen i dosekalibratoren og registrere tidspunktet da målingen utføres.
- Gjenta for alle andre reaksjonssteder på brikken.
- Beregn aktiviteten lastet per reaksjonspunkt ved å ta aktivitetsmålingen etter lasting av radioisotopen og trekk fra forrige måling (forfallskorrigert) før det stedet ble lastet inn.
- Juster multireaksjonsbrikken på varmeren.
- Tilsett et tynt lag med termisk pasta på toppen av keramisk varmeapparat.
- Plasser brikken forsiktig på toppen av varmeren ved hjelp av pinsett for å unngå søl av dråpene, og juster referansehjørnet på brikken etter varmerens referansehjørne (som vist på figur 3B). Brikken vil overhenge varmeren med en liten mengde.
- Tørk [18F]fluor og faseoverføringskatalysator.
- Varm opp brikken i 1 min ved å sette varmeren til 105 °C i kontrollprogrammet for å fordampe dråpene til tørrhet og etterlate en tørket rest på [18F]fluor og TBHACO3. Etter 1 min, avkjøl brikken ved å slå av varmeren og slå på kjøleviften med kontrollprogrammet.
- Legg til forløperløsningen.
- Bruk en mikropipette, legg til en 6 μL løsning av fallypride forløper på toppen av de tørkede rester på det første reaksjonsstedet.
- Gjenta for alle andre reaksjonssteder på brikken. Bruk optimaliseringsplanen til å bestemme hvilken konsentrasjon av fortynningsserien som brukes for hvert reaksjonssted.
- Utfør fluorinasjonsreaksjon.
- Varm hver brikke til 110 °C i 7 minutter ved hjelp av kontrollprogrammet for å utføre radiofluoreringsreaksjon. Deretter avkjøler du brikken ved å slå av varmeren og slå på kjøleviften med kontrollprogrammet.
- Samle råproduktene fra reaksjonsstedene.
- Samle råproduktet på det første reaksjonsstedet ved å tilsette 10 μL oppsamlingsløsning fra det angitte mikrocentrifugerøret via mikropipette. Etter å ha ventet i 5 s, bruk mikropipetten (med samme spiss installert) for å aspirere det fortynnede råproduktet og overføre til det tilsvarende merkede oppsamlingsmikrocentrifugerøret.
- Gjenta denne prosessen totalt 4 ganger ved hjelp av samme pipettespiss for alle operasjoner.
- Gjenta innsamlingsprosessen for alle andre reaksjonssteder på brikken.
5. Synteseanalyse for å bestemme reaksjonsytelse og optimale forhold
- Bestem "innsamlingseffektiviteten" for den første reaksjonen på brikken.
- Plasser mikrocentrifugerøret med det oppsamlede råproduktet til det første reaksjonspunktet i dosekalibratoren for å måle aktiviteten. Registrer måling og tid for målingen.
- Beregn innsamlingseffektiviteten ved å dele aktiviteten til det innsamlede råoljeproduktet ved startaktiviteten målt for samme reaksjonssted (forfallskorrigere aktivitetsverdiene til samme tidspunkt).
- Gjenta for alle andre reaksjonssteder på brikken.
- Analyser sammensetningen (fluoriseringseffektivitet) til hvert oppsamlede råprodukt.
MERK: For å gjøre praktisk analyse av alle prøver på kort tid, analyseres fluoriseringseffektivitet ved hjelp av en tidligere beskrevet radiotynn lagkromatografi (radio-TLC) tilnærming14. Denne teknikken gjør det mulig å behandle opptil åtte prøver parallelt ved å oppdage deretter side ved side (5 mm tonehøyde, 0,5 μL per punkt) på en enkelt TLC-plate, deretter utvikle seg sammen og utføre avlesning sammen ved hjelp av Cerenkov-bildebehandling14,15. For eksempeloptimalisering med 16 parallelle reaksjoner er det nødvendig med 2 TLC-plater. Et annet alternativ er å bruke radio- høyytelses væskekromatografi (radio-HPLC) til analyse, selv om tiden for separasjon, rengjøring og likevekt kan begrense antall prøver som kan analyseres.- For hver TLC-plate (50 mm x 60 mm), med en blyant, tegn en linje på 15 mm fra en 50 mm kant (bunn), og en annen linje 50 mm fra samme kant. Den første linjen er opprinnelseslinjen. den andre er løsningsmidlets frontlinje. Tegn 8 små "X"-er langs opprinnelseslinjen med 5 mm avstand for å definere prøvepunktposisjonen for hver av 8 "baner".
- Bruk en mikropipette og overfør 0,5 μL av det første råproduktet til TLC-platen ved "X" for den første banen. Gjenta for ekstra råprodukter (opptil 8 per TLC-plate). Vent til de rå produktflekkene tørker på TLC-platen.
- For hver TLC-plate utvikles ved hjelp av en mobil fase på 60% MeCN i 25 mM NH4HCO2 med 1% TEA (v / v) til løsningsmiddelfronten når løsningsmidlets frontlinje. Vent til løsningsmidlet på TLC-platen tørker og dekk deretter med et glassmikroskopsklie (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm tykt).
- Få et radioaktivitetsbilde av hver TLC-plate ved å plassere platen i et Cerenkov-bildebehandlingssystem for en 5 min eksponering. Utfør standard bildekorrigeringer (mørk gjeldende subtraksjon, flat feltkorrigering, medianfiltrering og bakgrunnsdeldetraksjon).
- Bruk interesseområdeanalyse (ROI) for den første banen til den første TLC-platen. Tegn områder rundt hvert felt som er synlige i banen. Programvaren vil beregne brøkdelen av integrert intensitet i hver region (bånd) sammenlignet med den totale integrerte intensiteten i alle regioner (bånd).
- Med denne mobile fasen forventes følgende bånd ved de angitte oppbevaringsfaktorene: Rf = 0,0: Unreacted [18F]fluorid; Rf = 0,9: [18F]fallypride; Rf = 0,94: Sideprodukt. Bestem fluorinasjonseffektiviteten som brøkdelen av aktiviteten i[18F]fallypride-båndet.
- Gjenta denne analysen for alle andre baner på alle TLC-plater.
MERK: Hvis et Cerenkov-bildekammer ikke er tilgjengelig, kan et lite dyr (preklinisk) in vivo optisk bildebehandlingssystem brukes til å avbilde TLC-platene. Alternativt kan en 2-dimensjonal TLC-skanner brukes. Alternativt, hvis bare en 1-dimensjonal TLC-skanner er tilgjengelig, kan TLC-platene analyseres ved å kutte i strimler med saks (1 per bane), og skanne hver stripe individuelt.
- Bestem det rå radiokjemiske utbyttet (rå RCY) for hvert reaksjonssted.
- Bestem rå RCY for det første råproduktet ved å multiplisere innsamlingseffektiviteten med fluoriseringseffektiviteten.
- Gjenta for alle andre reaksjonssteder.
- Analysere resultatene
- Aggregerte verdier for eventuelle replikeringsforsøk til et gjennomsnitt og standardavvik.
- Plott inn innsamlingseffektivitet, fluoriseringseffektivitet og rå RCY som en funksjon av parameteren som var variert (forløperkonsentrasjon i dette eksemplet).
- Velg de optimale betingelsene basert på de ønskede kriteriene. Vanligvis er dette maksimal råolje RCY. I tillegg velges punktet ofte i et område der stigningstallet til grafen er relativt flatt, noe som indikerer at det er ufølsomt for små endringer i parameteren, noe som gir en mer robust protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt eksperiment ble utført for å illustrere denne metoden. Ved hjelp av 16 reaksjoner ble optimaliseringsstudier av radiofarmaka[18F]fallyprid utført av varierende forløperkonsentrasjon (77, 39, 19, 9,6, 4,8, 2,4, 1,2 og 0,6 mM) i thexylalkohol:MeCN (1:1, v/v) som reaksjon. Reaksjoner ble utført ved 110 °C i 7 minutter. Innsamlingseffektivitet, prøvesammensetning (dvs. proporsjoner av [18F]fallypridprodukt, ikke-acted [18F]fluorid og sideprodukt) er tabulert i tabell 1 og oppsummeres grafisk i figur 4.
Studien viste at fluoriseringseffektiviteten (andel av [18F]fallyprid) øker med økende forløperkonsentrasjon, og at den gjenværende ikke-utførtefluorenvarierte omvendt (figur 4A). Det var en liten mengde radioaktivt sideprodukt ved lave forløperkonsentrasjoner, men andelen gikk ned til nær null ved høyere forløperkonsentrasjoner (figur 4A). Innsamlingseffektiviteten var nesten kvantitativ for de fleste forhold, selv om den falt litt ved lave forløperkonsentrasjoner.
Fra disse resultatene kan den høyeste RCY oppnås med ~ 230 nmol forløper (dvs. 39 mM konsentrasjon i en 6 μL dråpe). Ved denne tilstanden var fluoriseringseffektiviteten 96,0 ± 0,5% (n = 2) og råoljen RCY var 87,0 ± 2,7 (n = 2), og det var ingen observert radioaktiv sideproduktdannelse. Mens bruken av 77 mM forløper viste lignende resultater, er det generelt ønskelig å bruke en lavere mengde forløper for å redusere kostnadene og forenkle nedstrøms rensetrinn.
Figur 1: Fabrikasjon av mikrodråpebrikker med flere reaksjoner via fotolitografi. (A) Fotografi av mikrodropletbrikke med flere reaksjoner og 4 x 4 utvalg av reaksjonssteder. Brikken består av polytetrafluoretylenbelagt silisium med sirkulære områder av polytetrafluoretylen etset bort for å skape hydrofile reaksjonssteder. (B) Skjematisk for fabrikasjonsprosedyren. En silisiumskive er spin-belagt med Teflon-løsning og bakt for å størkne belegget. Deretter er fotoresisten spin-belagt og mønstret via fotolitografi for å produsere en etsemaske. Fotoresisten er utviklet med en fotoresistutviklingsløsning. Den eksponerte Teflon fjernes deretter via tørr etsning med oksygenplasma. Skiven er terninger i individuelle sjetonger, og fotoresisten er strippet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prosedyre for parallelle reaksjoner. Eksperimentell prosedyre for å utføre 16 parallelle synteser av radiofarmasøytisk [18F]fallypride på en multireaksjonsbrikke. I dette eksemplet er forløperkonsentrasjonen variert for hver reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kart over forhold på reaksjonssteder. (A) Eksperimentell design for å utforske påvirkningen av forløperkonsentrasjon på radiofluorering av tosyl fallyprid ved hjelp av en enkelt 16-reaksjonsbrikke (sett ovenfra). Åtte forskjellige konsentrasjoner ble utforsket, hver med n = 2 replikerer. Andre reaksjonsforhold ble holdt konstant (temperatur: 110 °C; tid: 7 min; løsningsmiddel: teksylalkohol:MeCN; mengden TBAHCO3: 240 nmol). Hver reaksjon ble utført med ~ 14 MBq aktivitet. (B) Fotografi av en 16-reaksjonsbrikke installert på varmeplattformen under eksperimentet. Røde linjer representerer referansehjørnet til brikken som brukes til justering med varmerens referansehjørne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påvirkning av forløperkonsentrasjon på mikrodropletsyntesen av [18F]fallypride. (A) Andel radioaktive arter som finnes i det innsamlede råreaksjonsproduktet, det vil si [18F]fallyprid, sideprodukt eller ikke vedtatt [18F]fluorid. (B) Syntese ytelse. Innsamlingseffektivitet, fluoriseringseffektivitet og rå RCY er plottet inn som en funksjon av forløperkonsentrasjon. I begge grafene representerer datapunkt gjennomsnittet av n=2 replikeringer, og feilfelt representerer standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Forløperkonsert (mM) | Innsamlingseffektivitet (%) | Fluorinasjon effektivitet (%) | Rå RCY (%) | Ikke vedtatt [18F]fluorid (%) | Sideprodukt (%) |
| 77 | 91.8 ± 2.1 | 96.7 ± 2.0 | 88,8 ± 3,9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96.0 ± 0,5 | 87.0 ± 2.7 | 4.0 ± 0,5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91.1 ± 0,5 | 81.1 ± 0,3 | 73,9 ± 0,7 | 8.4 ± 1.2 | 10.5 ± 2.0 |
| 9.6 | 90,9 ± 0,6 | 62.7 ± 0,9 | 57.0 ± 0,5 | 23.3 ± 2.1 | 14.0 ± 0,9 |
| 4.8 | 88.4 ± 0,8 | 37.0 ± 1.5 | 32.8 ± 1.6 | 47.3 ± 0,8 | 15.7 ± 1.0 |
| 2.4 | 87.6 ± 2.0 | 21.0 ± 2.1 | 18.4 ± 2.2 | 67.4 ± 2.1 | 11.6 ± 1.0 |
| 1.2 | 82.3 ± 1.6 | 12.7 ± 0,3 | 10.4 ± 0.1 | 72.8 ± 0,7 | 14.5 ± 1.0 |
| 0.6 | 81.2 ± 3.7 | 6.3 ± 0,8 | 5.1 ± 0,5 | 84.3 ± 0,2 | 9.4 ± 1.0 |
Tabell 1: Data innhentet fra studiet av forløperkonsentrasjon. Alle verdier er gjennomsnitt ± standardavvik beregnet fra n=2 replikeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av begrensninger i konvensjonelle radiokjemisystemer som bare tillater en eller et lite antall reaksjoner per dag og bruker en betydelig mengde reagenser per datapunkt, kan bare en liten del av det totale reaksjonsparameterområdet utforskes i praksis, og mange ganger rapporteres resultatene uten gjentakelser (n = 1). Sammenlignet med konvensjonelle systemer, gjør denne multireaksjonsdråperadiosynteseplattformen det praktisk å oppnå mer omfattende og strenge studier av radiosynteseforhold samtidig som den bruker svært lite tid og mengde forløper, noe som potensielt muliggjør ny innsikt i parametere som påvirker produktutbyttet og sideproduktdannelsen. Informasjonen kan brukes til å velge betingelsene som resulterer i høyeste produktutbytte eller den mest robuste syntesen. Det lave forløperforbruket kan være spesielt nyttig i den tidlige utviklingen av nye radiotracers når bare en liten mengde forløper kan være tilgjengelig eller når forløperen er dyr. Mens sjetongenes åpne natur bidrar til rask syntesetid og enkel tilgang via pipette, kan det føre til betydelige tap av flyktige molekyler og kan ikke være praktisk når du optimaliserer syntesen av radiofarmaka som har flyktige forløpere, mellomprodukter eller produkter.
På grunn av faren for strålingseksponering, bør det gjentas at disse eksperimentene bare skal utføres med passende opplæring og godkjenninger og bør utføres bak strålingsskjerming, helst i en ventilert varm celle. På grunn av radioisotopers korte halveringstid er det viktig å utføre forsøkene raskt og effektivt. Pipetteringsreagenser til brikken og innsamling av produkter fra brikken bør praktiseres under ikke-radioaktive forhold for å bli kjent med redusert tilgang og synlighet i en varm celle. På samme måte bør det også praktiseres å installere og fjerne brikken, og gjøre målinger av brikken med dosekalibratoren. I tillegg er det viktig å organiseres, med et detaljert eksperimentkart (dvs. spesifikke reaksjonsforhold på hvert sted på brikken). Det er også nyttig å forberede på forhånd en tabell med resultater som skal fylles ut etter hvert som målinger gjøres. For å sikre reproduserbarhet, spesielt med mulighet for menneskelig feil, bør flere replikeringer av hvert sett med forhold utføres. Det er viktig å være spesielt forsiktig i løpet av trinnet med å samle råprøvene fra brikken for å unngå å søle væske utenfor reaksjonsstedet og forårsake krysskontaminering med tilstøtende reaksjonssteder. Hvis det blir lagt merke til feil, er det viktig å flagge disse reaksjonsstedene slik at dataene kan utelukkes fra den endelige analysen.
I denne eksempelstudien var mengden forløper som ble brukt for 16 datapunkter, 1,1 mg (~70 μg hver), sammenlignet med 4 mg per datapunkt ved hjelp av en konvensjonell radiosynthesizer. Videre ble alle de 16 reaksjonene fullført på 25 minutter alt i et enkelt eksperiment. Til sammenligning krever syntesen av råolje [18F]fallypride på en konvensjonell radiosynthesizer ~ 15-20 min per reaksjon16,17.
Dette representative eksperimentet demonstrerte nytten av en mikrodråpebrikke med flere reaksjoner med 16 reaksjoner for å optimalisere forholdene for radiosyntesen til radiofarmasøytisk [18F]fallyprid ved å utforske 8 forskjellige forløperkonsentrasjoner (n = 2 replikerer for hver tilstand) på en rask og økonomisk måte. Andre variabler som enkelt kan optimaliseres ved hjelp av en multireaksjonsbrikke inkluderer mengden radioaktivitet, type faseoverføringskatalysator, mengde faseoverføringskatalysator, fordampning / tørkeforhold (f.eks. antall azeotropiske tørketrinn), reaksjonsløsningsmiddel, etc. Ved å bruke flere multireaksjonsbrikker er det også mulig å utforske påvirkningen av reaksjonstemperatur og reaksjonstid, i tillegg til forhold som fordampning / tørketemperatur og tid. Slike studier må utføres sekvensielt ved hjelp av enkeltvarmeren eller kan parallelliseres ved å betjene flere varmeovner samtidig.
Den underliggende dråpesyntesemetoden har vist seg å være kompatibel med et bredt spekter av 18F-merkede radiofarmaka, som [18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F]FBB20 og den kan brukes til optimalisering av de fleste andre 18F-merkede forbindelser og forbindelser merket med andre isotoper. Videre utnytter de resulterende optimaliserte dråpebaserte reaksjonene iboende fordelene med mikrovolumradiokjemi, inkludert redusert forløperforbruk, raskere prosesstider og kompakt instrumentering, og kan tilby de samme fordelene for rutinemessig produksjon av store partier. Større partier krever ganske enkelt å skalere opp aktivitetsmengden som opprinnelig ble lastet inn ved starten av reaksjonen. For å klargjøre en tracer som er egnet for bruk i in vitro- eller in vivo-analyser, må råproduktet renses (f.eks. ved hjelp av analytisk HPLC) og formulert (f.eks. via fordampende eller fastfaset løsningsmiddelutveksling21) Alternativt kan det være mulig å tilpasse de optimale forholdene fra dråpeskala til en konvensjonell hetteglassbasert radiosynthesizer. Etterforskningen av denne muligheten pågår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Regents of the University of California har lisensiert teknologi til Sofie, Inc. som ble oppfunnet av Dr. van Dam, og har tatt egenkapital i Sofie, Inc. som en del av lisenstransaksjonen. Dr. van Dam er grunnlegger og konsulent av Sofie, Inc. De resterende forfatterne erklærer ingen interessekonflikter. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Cancer Institute (R33 240201).
Acknowledgments
Vi takker UCLA Biomedical Cyclotron Facility og Dr. Roger Slavik og Dr. Giuseppe Carlucci for sjenerøst å gi [18F]fluorid for disse studiene og UCLA NanoLab for støtte med utstyr for chip fabrikasjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
