Summary
Denna metod beskriver användningen av en ny metod med hög genomströmning, baserad på droppkemiska reaktioner, för snabb och ekonomisk optimering av radioaktiva läkemedel med hjälp av nanomolmängder av reagenser.
Abstract
Nuvarande automatiserade radiosynteser är utformade för att producera stora kliniska partier av radioaktiva läkemedel. De är inte väl lämpade för reaktionsoptimering eller ny radiofarmaceutisk utveckling eftersom varje datapunkt innebär betydande reagensförbrukning, och kontaminering av apparaten kräver tid för radioaktivt sönderfall före nästa användning. För att hantera dessa begränsningar utvecklades en plattform för att utföra matriser av miniatyr droppbaserade reaktioner parallellt, var och en begränsad i en ytspänningsfälla på ett mönstrat polytetrafluoretylenbelagt kisel "chip". Dessa chips möjliggör snabba och praktiska studier av reaktionsparametrar inklusive reagenskoncentrationer, reaktionsmedel, reaktionstemperatur och tid. Denna plattform tillåter slutförandet av hundratals reaktioner på några dagar med minimal reagensförbrukning, istället för att ta månader med en konventionell radiosyntes.
Introduction
Positron-emission tomography (PET) radiofarmaceutiska läkemedel används ofta som forskningsverktyg för att övervaka specifika in vivo biokemiska processer och studera sjukdomar, och för utveckling av nya läkemedel och terapier. Dessutom är PET ett kritiskt verktyg för att diagnostisera eller iscensätta sjukdom och övervaka en patients svar på terapi1,2,3. På grund av pet-radioisotopers korta halveringstid (t.ex. 110 min för fluor-18-märkta radioaktiva läkemedel) och strålningsrisken bereds dessa föreningar med hjälp av specialiserade automatiserade system som arbetar bakom strålskärmning och måste beredas strax före användning.
Nuvarande system som används för att syntetisera radioaktiva läkemedel är utformade för att producera stora partier som är uppdelade i många enskilda doser för att dela produktionskostnaden. Medan nuvarande system är lämpliga för produktion av allmänt använda radiotracers som [18F]FDG (eftersom flera patientskanningar och forskningsexperiment kan schemaläggas på en enda dag), kan dessa system vara slösaktiga för produktion av nya radiotracers under tidig utveckling, eller mindre vanliga radiotracers. Volymer som konventionella system använder ligger vanligtvis inom intervallet 1-5 ml, och reaktionerna kräver prekursormängder i intervallet 1-10 mg. Dessutom är användning av konventionella radiosynteser i allmänhet besvärlig under optimeringsstudier eftersom apparaten blir förorenad efter användning och användaren måste vänta på att radioaktiviteten sönderfaller innan nästa experiment utförs. Bortsett från utrustningskostnader kan kostnaden för radioisotope och reagenser därför bli mycket betydande för studier som kräver produktion av flera partier. Detta kan till exempel inträffa under optimeringen av syntesprotokoll för nya radiotracers för att uppnå tillräcklig avkastning och tillförlitlighet för inledande in vivo-avbildningsstudier.
Mikrofluidisk teknik har i allt högre grad använts inom radiokemi för att dra nytta av flera fördelar jämfört med konventionella system4,5,6. Mikrofluidiska plattformar, inklusive de som baseras på 1-10 μLreaktionsvolymer 7,8,9, har visat en betydande minskning av reagensvolymer och förbrukning av dyra prekursorer, liksom korta reaktionstider. Dessa minskningar leder till lägre kostnader, snabbare uppvärmnings- och avdunstningssteg, kortare och enklare nedströmsrening, en övergripande "grönare"kemiprocess 10och högre molaktivitet hos de producerade radiotracersna11. Dessa förbättringar gör det mer praktiskt att utföra mer omfattande optimeringsstudier genom att sänka reagenskostnaden för varje syntes. Ytterligare fördelar kan uppnås genom att utföra flera experiment från en enda sats radioisotope på en enda dag. Till exempel kan mikrofluidiska flödeskemiska radiosynteser som arbetar i "upptäcktsläge" i tur och med sekventiellt utföra dussintals reaktioner, var och en med endast 10s μLreaktionsvolym 12.
Inspirerad av dessa fördelar utvecklades ett flerreaktionsdroppar där mikrovolumreaktioner är begränsade till en rad ytspänningsfällor på en kiselyta, skapad med hjälp av en mönstrad Teflon-beläggning. Dessa chips gör det möjligt att utföra flera reaktioner på 1-20 μL-skalan samtidigt, vilket öppnar möjligheten att utforska 10-tal olika reaktionsförhållanden per dag, var och en med flera replikat. I det här dokumentet demonstreras nyttan av denna nya hög genomströmningsmetod för att utföra snabba och billiga radiokemioptimeringar. Användning av droppchips med flera reaktioner möjliggör bekväm utforskning av effekten av reagenskoncentrationer och reaktionsmedel, och användning av flera chips kan möjliggöra studier av reaktionstemperatur och reaktionstid, samtidigt som mycket låga mängder prekursor konsumeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
VARNING: Detta protokoll omfattar hantering av radioaktiva material. Experiment bör inte utföras utan nödvändig utbildning och personlig skyddsutrustning och godkännande från strålsäkerhetskontoret i din organisation. Experiment bör utföras bakom strålskärmning, helst i en ventilerad varmcellig
1. Tillverkning av multireaktionschips
OBS: Partier av mikrodropletchips med flera reaktioner tillverkas av 4"-kiselplattor med hjälp av standardfotolitografitekniker, som tidigare decribed10 (Figur 1). Denna procedur kommer att producera 7 chips vardera med 4 x 4 matris av reaktionsplatser.
- Placera silikonskivan på spin-coater chucken och se till att den är centrerad. Deponera 3 ml polytetrafluoretylenlösning i mitten av skivan med en överföringspipett och täckplattor vid 1000 varv/min i 30 s (500 varv/s ramp).
- För att stelna beläggningen, placera skivan på en 160 °C kokplatta i 10 min och överför sedan till en 245 °C kokplatta i 10 min.
- Glödg beläggningen i en högtemperaturugn vid 340 °C i 3,5 timmar under kväveatmosfär, följt av kylning till 70 °C vid en ramp på 10 °C/min.
- Placera silikonskivan på spin-coater chucken och se till att den är centrerad. Häll 2 ml positiv fotoresist i mitten av skivan med en överföringspipett och utför sedan beläggning vid 3000 varv/min i 30 s (1000 varv/s ramp).
- Stelna fotoresisten genom att utföra en mjuk bakning av skivan på en 115 °C värmeplatta i 3 min.
- Installera skivan och fotomasken i en maskjusterare och utför en exponering på 14 s vid 12 mW/cm2 lampintensitet och 356 nm våglängd i hårt kontaktläge. Detta steg använder en genomskinlighetsmask som innehåller det negativa slutliga polytetrafluoreetylenmönstret, dvs. ett 4" diametermönster på 4 kopior av 16-reaktionschipet, med reaktionsplatser transparenta och alla andra regioner i ogenomskinlig färg.
- Sänk ned skivan med 20 ml fotoresistutvecklare i en glasbehållare i 3 min med liten agitation för att utveckla det exponerade mönstret.
- Skölj bort utvecklingslösningen genom att dränka skivan i en glasbehållare med 20 ml DI-vatten i 3 min med liten omrörning. Torka skivan med en kvävepistol.
- Avlägsna de exponerade polytetrafluoretylenregionerna via reaktiv jonetsning (RIE) med syreplasma under följande förhållanden: 30 s exponering, 100 mTorrtryck, 200 W effekt och 50 sccm syreflöde.
- Tärna skivan i enskilda spån (7 totalt per skiva) med en kiselskiva.
- Sänk ner varje chip i aceton i 1 minut för att ta bort fotoresisten och isopropanol i 1 min. Torka slutligen varje chip med en kvävepistol.
- Placera torra spån i en glasbehållare och täck med aluminiumfolie för förvaring tills de används.
2. Planering av optimeringsstudien
OBS: I detta protokoll används syntes av radiofarmaceutiska [18F]fallypride som ett exempel för att illustrera optimering med hög genomströmning (figur 2). Med ett enda chip kan 16 samtidiga reaktioner utföras, till exempel med varierad prekursorkoncentration (8 olika koncentrationer, n =2 replikerar var och en). Villkoren är mappade till reaktionsplatser i figur 3A. Justeringar kan göras i detta protokoll för att optimera andra reaktionsparametrar (t.ex. reaktionsmedel, reaktionsvolym, mängd TBAHCO3etc.) eller andra radioaktiva läkemedel.
- Välj de reaktionsparametrar som ska varieras, de specifika värden som ska användas och antalet replikat.
- Beräkna antalet marker som behövs för att utföra experimentet.
- För varje chip, förbered en karta över vilka reaktionsförhållanden som kommer att användas på varje reaktionsplats för att hjälpa till med reagensberedning och utföra droppreaktionerna.
3. Beredning av reagenser och material för optimering av radiosyntesen av [18F]fallypride
OBS: Den droppbaserade radiosyntesen av [18F]fallypride (figur 2) börjar med tillsats av [18F]fluor och fasöverföringskatalysator (TBAHCO3)till reaktionsstället, följt av uppvärmning för att avdunsta vatten och lämna en torkad rest. Därefter tillsätts och upphettas en droppe prekursor (tosyl-fallypride) i reaktionsmedel (thexylalkohol och acetonitril) för att utföra radiofluorinationsreaktionen. Slutligen samlas råprodukten in från chipet för analys. Reagensberednings- och syntesprocedurerna bör anpassas om optimering av en annan spårämne.
- Bered en stamlösning av reaktionslösningen, bestående av thexylalkohol och acetonitril i en blandning med 1:1 i volym. Se till att volymen är tillräcklig för att skapa den planerade utspädningsserien. I det här exemplet är optimeringen ~30 μL tillräcklig.
- Bered en 30 μL stamlösning av prekursor (tosylfallypride) i reaktionslösningen med den maximala koncentration som ska utforskas (77 mM). Kontrollera att volymen är tillräcklig för att utföra det planerade experimentet. I det här exemplet är optimeringen ~30 μL tillräcklig.
- Från prekursorlagerlösningen och reaktionslösningen, utför 2x seriella utspädningar för att förbereda de olika koncentrationerna av prekursorlösningen. Se till att volymen för varje utspädning är tillräcklig för att utföra önskat antal replikat för varje villkor. I det här exemplet är optimeringen ~ 15 μL av varje koncentration tillräcklig.
- Förbered mikrocentrifugrör för att samla varje råreaktionsprodukt med hjälp av en permanent markör för att märka varje rör med ett unikt nummer. Se till att det totala antalet mikrocentrifugrör matchar antalet villkor multiplicerat med antalet replikat (8 x 2 = 16).
- Bered ett lager av uppsamlingslösning (10 ml) bestående av 9:1 metanol:DI-vatten (v/v). Alikvot 50 μL i vart och ett av ytterligare 16 märkta mikrocentrifugrör (ett per reaktionsställe på chipet).
- Bered en [18F]fluorlagerlösning i ett 500 μL mikrocentrifugrör genom att blanda [18F]fluor/[18O]H2O (~260 MBq [7 mCi]) med 75 mM TBAHCO3-lösning (56 μL) och spädning med DI-vatten upp till 140 μL. 8 μL av denna lösning kommer att lastas på varje reaktionsställe (innehållande ~15 MBq [0,40 mCi] aktivitet och 240 nmol TBAHCO3).
4. Parallell syntes av [18F]fallypride med olika prekursorkoncentrationer
OBS: Chippet drivs ovanpå en värmeplattform (konstruerad enligt tidigarebeskrivna 13) bestående av en 25 mm x 25 mm keramisk värmare, styrd med en on-off temperaturregulator med den interna termoelementsignalen för återkoppling. Värmarens yttemperaturer kalibrerades med hjälp av värmeavbildning. Om en sådan plattform inte är tillgänglig kan ett par kokplattor användas (en vid 105 °C och en vid 110 °C).
- Last [18F]fluorlagerlösning (med fasöverföringskatalysator).
- Använd en mikropipett och ladda en 8 μL droppe [18F] fluorlagerlösning på den första reaktionsplatsen för ett multireaktionschip. Mät chippets aktivitet genom att placera det i en doskalibrator och registrera vid vilken tidpunkt mätningen utförs.
- Ta bort chipet från doskalibratorn och ladda sedan en 8 μL droppe [18F] fluorlagerlösning på den andra reaktionsplatsen. Mät aktiviteten på chippet genom att placera det igen i doskalibratorn och registrera vid vilken tidpunkt mätningen utförs.
- Upprepa för alla andra reaktionsplatser på chippet.
- Beräkna aktiviteten som lastas per reaktionsplats genom att ta aktivitetsmätningen efter att ha laddat radioisotopen och subtraherat den tidigare mätningen (sönderfallskorrigerad) innan platsen laddades.
- Rikta in multireaktionschipet på värmaren.
- Tillsätt ett tunt lager termisk pasta ovanpå keramikvärmaren.
- Placera försiktigt chippet ovanpå värmaren med pincett för att undvika spill av dropparna och rikta in chipets referenshörn mot värmarens referenshörn (som visas i figur 3B). Chippet kommer att överhänga värmaren med en liten mängd.
- Torka fluor- och fasöverföringskatalysatorn [18F].
- Värm chippet i 1 min genom att ställa in värmaren på 105 °C i kontrollprogrammet för att avdunsta dropparna till torrhet och lämna en torkad rest av [18F]fluor och TBHACO3. Efter 1 min kyler du chippet genom att stänga av värmaren och slå på kylfläkten med styrprogrammet.
- Lägg till prekursorlösningen.
- Tillsätt en 6 μL-lösning av fallypridprekursor ovanpå de torkade resterna på den första reaktionsplatsen med hjälp av en mikropipett.
- Upprepa för alla andra reaktionsplatser på chippet. Använd optimeringsplanen för att avgöra vilken koncentration av utspädningsserien som används för varje reaktionsställe.
- Utför fluoreringsreaktion.
- Värm varje chip till 110 °C i 7 minuter med hjälp av styrprogrammet för att utföra radiofluorinationsreaktion. Efteråt kyler du chippet genom att stänga av värmaren och slå på kylfläkten med styrprogrammet.
- Samla råprodukterna från reaktionsplatserna.
- Samla råprodukten på den första reaktionsplatsen genom att tillsätta 10 μL uppsamlingslösning från det angivna mikrocentrifugröret via mikropipett. Efter att ha väntat i 5 s, använd mikropipette (med samma spets installerad) för att aspirera den utspädda råprodukten och överföra till motsvarande märkta samlingsmikrocentrifugerör.
- Upprepa den här processen totalt 4 gånger med samma pipettspets för alla operationer.
- Upprepa insamlingsprocessen för alla andra reaktionsplatser på chippet.
5. Syntesanalys för att bestämma reaktionsprestanda och optimala förhållanden
- Bestäm "insamlingseffektiviteten" för den första reaktionen på chipet.
- Placera mikrocentrifugröret med den insamlade råprodukten från den första reaktionsfläcken i doskalibratorn för att mäta aktiviteten. Registrera mätning och tid för mätningen.
- Beräkna insamlingseffektiviteten genom att dividera aktiviteten hos den insamlade råprodukten med den startaktivitet som mäts för samma reaktionsställe (sönderfallskorrigerande aktivitetsvärden till samma tidpunkt).
- Upprepa för alla andra reaktionsplatser på chippet.
- Analysera sammansättningen (fluoreringseffektiviteten) för varje insamlad råprodukt.
OBS: För att göra analysen av alla prover praktisk på kort tid analyseras fluoreringseffektiviteten med hjälp av en tidigare beskriven radiotunn skiktkromatografi (radio-TLC)14. Denna teknik gör det möjligt att bearbeta upp till åtta prover parallellt genom att upptäcka sedan sida vid sida (5 mm tonhöjd, 0,5 μL per punkt) på en enda TLC-platta, sedan utvecklas tillsammans och utföra avläsning tillsammans med Cerenkov imaging14,15. För exempeloptimering med 16 parallella reaktioner behövs 2 TLC-plattor. Ett annat alternativ är att använda radio-högpresterande flytande kromatografi (radio-HPLC) för analys, även om tiden för separation, rengöring och jämvikt kan begränsa antalet prover som kan analyseras.- För varje TLC-platta (50 mm x 60 mm), med en penna, rita en linje på 15 mm från en 50 mm kant (botten) och en annan linje 50 mm från samma kant. Den första raden är ursprungslinjen. den andra är lösningsmedlets frontlinje. Rita 8 små "X" längs ursprungslinjen vid 5 mm avstånd för att definiera provfläckningspositionen för vart och ett av 8 "körfält".
- Använd en mikropipett och överför 0,5 μL av den första råprodukten till TLC-plattan vid "X" för det första körfältet. Upprepa för ytterligare råprodukter (upp till 8 per TLC-platta). Vänta tills råproduktfläckarna torkar på TLC-plattan.
- För varje TLC-platta, utveckla med en mobil fas på 60% MeCN i 25 mM NH4HCO2 med 1% TEA (v/v) tills lösningsmedelsfronten når lösningsmedlets frontlinje. Vänta tills lösningsmedlet på TLC-plattan torkar och täck sedan med ett glasmikroskopsutschbana (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm tjock).
- Få en radioaktivitetsbild av varje TLC-platta genom att placera plattan i ett Cerenkov-bildsystem för 5 minuters exponering. Utför standardbildkorrigeringar (mörkströmssubtraktion, platt fältkorrigering, medianfiltrering och bakgrundssubtraktion).
- Använd analys av intresseområde (ROI) för det första körfältet på den första TLC-plattan. Rita områden runt varje band som syns i körfältet. Programvaran beräknar fraktionen av integrerad intensitet i varje region (band) jämfört med den totala integrerade intensiteten i alla regioner (band).
- Med denna mobila fas förväntas följande band vid de angivna retentionsfaktorerna: Rf = 0,0: Unreacted [18F]fluor; Rf = 0,9: [18F]fallypride; Rf = 0,94: Sidoprodukt. Bestäm fluoreringseffektiviteten som en del av aktiviteten i [18F]fallypride-bandet.
- Upprepa denna analys för alla andra körfält på alla TLC-plattor.
OBS: Om en Cerenkov-bildkammare inte är tillgänglig kan ett litet djur (prekliniskt) optiskt bildsystem in vivo användas för att avbilda TLC-plattorna. Alternativt kan en 2-dimensionell TLC-skanner användas. Alternativt, om endast en 1-dimensionell TLC-skanner finns tillgänglig, kan TLC-plattorna analyseras genom att skära i remsor med sax (1 per körfält) och skanna varje remsa individuellt.
- Bestäm den råa radiokemiska avkastningen (rå RCY) för varje reaktionsställe.
- Bestäm rå RCY för den första råprodukten genom att multiplicera insamlingseffektiviteten med fluoreringseffektiviteten.
- Upprepa för alla andra reaktionsplatser.
- Analysera resultaten
- Aggregerade värden för alla replikerade experiment till en genomsnittlig och standardavvikelse.
- Rita upp insamlingseffektiviteten, fluoreringseffektiviteten och rå RCY som en funktion av parametern som varierades (prekursorkoncentration i detta exempel).
- Välj de optimala villkoren baserat på önskade kriterier. Vanligtvis är detta den maximala råa RCY. Dessutom väljs punkten ofta i en region där diagrammets lutning är relativt platt, vilket indikerar att den är okänslig för små förändringar i parametern, vilket ger ett mer robust protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt experiment utfördes för att illustrera denna metod. Med hjälp av 16 reaktioner utfördes optimeringsstudier av radiofarmaceutiska [18F]fallypride genom varierande prekursorkoncentration (77, 39, 19, 9, 6, 4, 8, 2, 4, 1, 2 och 0, 6 mM) i thexylalkohol: MeCN (1:1, v/v) som reaktionslösningsmedel. Reaktioner utfördes vid 110 °C i 7 min. Insamlingseffektivitet, provsammansättning (dvs. proportioner av [18F]fallyprideprodukt, oredovisad [18F]fluor och sidoprodukt) är tabell 1 och sammanfattas grafiskt i figur 4.
Studien visade att fluoreringseffektiviteten (andel [18F]fallypride) ökar med ökande prekursorkoncentration och att den återstående oreageradefluorhalten varierade omvänt ( figur4A). Det fanns en liten mängd radioaktiv sidoprodukt vid låga prekursorkoncentrationer, men andelen minskade till nära noll vid de högre prekursorkoncentrationerna (figur 4A). Insamlingseffektiviteten var nästan kvantitativ under de flesta förhållanden, även om den sjönk något vid låga prekursorkoncentrationer.
Från dessa resultat kan den högsta RCY uppnås med ~ 230 nmol prekursor (dvs. 39 mM koncentration i en 6 μL droppe). Vid detta villkor var fluoreringseffektiviteten 96,0 ± 0,5% (n=2) och rå RCY var 87, 0 ± 2, 7 (n=2), och det fanns ingen observerad radioaktiv sidoproduktbildning. Medan användningen av 77 mM föregångare visade liknande resultat, i allmänhet är det önskvärt att använda en lägre mängd föregångare för att minska kostnaderna och förenkla nedströms rening steg.
Figur 1:Tillverkning av mikrodropletchips med flera reaktioner via fotolitografi. (A) Fotografi av mikrodropletchip med flera reaktioner med 4 x 4 olika reaktionsplatser. Chipet består av polytetrafluoretylenbelagd kisel med cirkulära regioner av polytetrafluoreten etsat bort för att skapa de hydrofila reaktionsplatserna. B)Schematiskt för tillverkningsförfarandet. En kiselskiva är spin-coated med Teflon lösning och bakas för att stelna beläggningen. Därefter är fotoresisten spin-coated och mönstrad via fotolitografi för att producera en etch mask. Fotoresisten är utvecklad med en fotoresistisk utvecklingslösning. Den exponerade Teflon avlägsnas sedan via torr etsning med syreplasma. Wafern är tärnad i enskilda chips, och fotoresisten är avskalad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Förfarande för parallella reaktioner. Experimentellt förfarande för att utföra 16 parallella synteser av radiofarmaceutiska [18F]fallypride på ett multireaktionschip. I det här exemplet varierar prekursorkoncentrationen för varje reaktion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Karta över förhållandena på reaktionsplatser. (A) Experimentell design för att utforska påverkan av prekursorkoncentration på radiofluorinationen av tosylfallypride med hjälp av ett enda 16-reaktionschip (ovanifrån). Åtta olika koncentrationer undersöktes, var och en med n = 2 replikat. Andra reaktionsförhållanden hölls konstanta (temperatur: 110 °C; tid: 7 min; lösningsmedel: thexylalkohol:MeCN; mängden TBAHCO3: 240 nmol). Varje reaktion utfördes med ~14 MBq aktivitet. B)Fotografi av ett 16-reaktionschip installerat på värmeplattformen under försöket. Röda linjer representerar referenshörnan på chipet som används för justering med värmarens referenshörn. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Inverkan av prekursorkoncentrationen på mikrodropletsyntesen av [18F]fallypride. (A) Andelradioaktiva arter som finns i den insamladeråreaktionsprodukten, dvs. B)Syntesprestanda. Insamlingseffektivitet, fluoreringseffektivitet och rå RCY ritas som en funktion av prekursorkoncentrationen. I båda diagrammen representerar datapunkter genomsnittet av n=2 replikat och felstaplar representerar standardavvikelsen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Prekursorkonsert (mM) | Insamlingseffektivitet (%) | Fluoreringseffektivitet (%) | Rå RCY (%) | Oredovisad [18F]fluor (%) | Sidoprodukt (%) |
| 77 | 91,8 ± 2,1 | 96.7 ± 2.0 | 88,8 ± 3,9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96.0 ± 0,5 | 87,0 ± 2,7 | 4.0 ± 0.5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91.1 ± 0,5 | 81.1 ± 0.3 | 73,9 ± 0,7 | 8.4 ± 1.2 | 10.5 ± 2.0 |
| 9.6 | 90,9 ± 0,6 | 62,7 ± 0,9 | 57.0 ± 0,5 | 23.3 ± 2.1 | 14.0 ± 0,9 |
| 4.8 | 88,4 ± 0,8 | 37.0 ± 1.5 | 32,8 ± 1,6 | 47.3 ± 0.8 | 15.7 ± 1.0 |
| 2.4 | 87.6 ± 2.0 | 21.0 ± 2.1 | 18.4 ± 2.2 | 67.4 ± 2.1 | 11.6 ± 1.0 |
| 1.2 | 82,3 ± 1,6 | 12.7 ± 0.3 | 10.4 ± 0.1 | 72,8 ± 0,7 | 14.5 ± 1.0 |
| 0.6 | 81,2 ± 3,7 | 6.3 ± 0.8 | 5.1 ± 0.5 | 84.3 ± 0.2 | 9.4 ± 1.0 |
Tabell 1: Uppgifter från studier av prekursorkoncentration. Alla värden är medelvärden ± standardavvikelser som beräknas från n=2 replikat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av begränsningar i konventionella radiokemisystem som endast tillåter en eller ett litet antal reaktioner per dag och förbrukar en betydande mängd reagenser per datapunkt kan endast en liten del av det totala reaktionsparameterutrymmet utforskas i praktiken, och många gånger rapporteras resultat utan upprepningar (n =1). Jämfört med konventionella system gör denna multireaktions droppradie radiosyntesplattform det praktiskt att utföra mer omfattande och rigorösa studier av radiosyntesförhållanden samtidigt som den förbrukar mycket lite tid och mängd prekursor, vilket potentiellt möjliggör nya insikter om parametrar som påverkar produktutbyte och sidoproduktbildning. Informationen kan användas för att välja de förhållanden som resulterar i högsta produktutbyte eller den mest robusta syntesen. Den låga prekursorförbrukningen kan vara särskilt användbar i den tidiga utvecklingen av nya radiotracers när endast en liten mängd prekursor kan vara tillgänglig eller när föregångaren är dyr. Medan chipsens öppna natur bidrar till snabb syntestid och enkel åtkomst via pipett, kan det leda till betydande förluster av flyktiga molekyler och kanske inte vara praktiskt när man optimerar syntesen av radioaktiva läkemedel som har flyktiga prekursorer, intermediärer eller produkter.
På grund av risken för strålningsexponering bör det upprepas att dessa experiment endast bör utföras med lämplig utbildning och godkännanden och bör utföras bakom strålskärmning, helst i en ventilerad varmcell. På grund av radioisotopers korta halveringstid är det viktigt att utföra experimenten snabbt och effektivt. Rörreagenser till chippet och uppsamling av produkter från chipet bör övas under icke-radioaktiva förhållanden för att bekanta sig med nedsatt åtkomst och synlighet i en varm cell. På samma sätt bör installation och borttagning av chipet och mätningar av chipet med doskalibratorn också övas. Dessutom är det viktigt att vara organiserad, med en detaljerad experimentkarta (dvs. specifika reaktionsförhållanden på varje plats på chipet). Det är också bra att i förväg förbereda en resultattabell som ska fyllas i när mätningar görs. För att säkerställa reproducerbarhet, särskilt med möjlighet till mänskliga fel, bör flera replikat av varje uppsättning villkor utföras. Det är viktigt att vara särskilt försiktig under steget att samla in råproverna från chipet för att undvika att spilla vätska utanför reaktionsstället och orsaka korskontaminering med intilliggande reaktionsplatser. Om några fel märks är det viktigt att flagga dessa reaktionsplatser så att data kan uteslutas från den slutliga analysen.
I denna exempelstudie var mängden prekursor som förbrukades för 16 datapunkter 1, 1 mg (~ 70 μg vardera), jämfört med 4 mg per datapunkt med hjälp av en konventionell radiosyntes. Dessutom avslutades alla 16 reaktioner på 25 minuter i ett enda experiment. I jämförelse kräver syntesen av rå [18F]fallypride på en konventionell radiosyntes ~15-20 min per reaktion16,17.
Detta representativa experiment visade nyttan av ett mikrodropletchip med flera reaktioner med 16 reaktioner för att optimera villkoren för radiosyntesen av radiofarmaceutiska [18F]fallypride genom att utforska 8 olika prekursorkoncentrationer (n=2 replikat för varje tillstånd) på ett snabbt och ekonomiskt sätt. Andra variabler som bekvämt kan optimeras med hjälp av ett multireaktionschip inkluderar mängden radioaktivitet, typ av fasöverföringskatalysator, mängd fasöverföringskatalysator, avdunstnings- / torkförhållanden (t.ex. antal azeotropa torksteg), reaktionsmedel etc. Genom att använda flera multireaktionschips är det också möjligt att utforska påverkan av reaktionstemperatur och reaktionstid, förutom förhållanden som avdunstning / torkningstemperatur och tid. Sådana studier skulle behöva utföras sekventiellt med hjälp av den enda värmaren eller skulle kunna parallelliseras genom att använda flera värmare samtidigt.
Den underliggande droppsyntesmetoden har visat sig vara kompatibel med ett brett spektrum av 18F-märkta radioaktiva läkemedel. såsom [18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F]FBB20 och det kan användas för optimering av majoriteten av andra 18F-märkta föreningar och föreningar märkta med andra isotoper. Dessutom utnyttjar de resulterande optimerade droppbaserade reaktionerna i sig fördelarna med mikrovolumradiokemi, inklusive minskad prekursorförbrukning, snabbare processtider och kompakt instrumentering, och kan erbjuda samma fördelar för rutinmässig produktion av stora partier. Större batchar kräver helt enkelt att du skalar upp mängden aktivitet som ursprungligen laddades i början av reaktionen. För att förbereda en spårämne som är lämplig för användning i in vitro- eller in vivo-analyser måste råprodukten renas (t.ex. med hjälp av HPLC i analytisk skala) och formuleras (t.ex. genom utbyte av lösningsmedel i avdunstning eller fastfas 21) Alternativt kan det vara möjligt att anpassa de optimala förhållandena från droppskala till en konventionell injektionsflaskabaserad radiosyntes. En utredning av denna möjlighet pågår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Regents of the University of California har licensierat teknik till Sofie, Inc. som uppfanns av Dr. van Dam och har tagit kapital i Sofie, Inc. som en del av licenstransaktionen. Dr. van Dam är grundare och konsult för Sofie, Inc. De återstående författarna förklarar inga intressekonflikter. Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute (R33 240201).
Acknowledgments
Vi tackar UCLA Biomedical Cyclotron Facility och Dr. Roger Slavik och Dr. Giuseppe Carlucci för att generöst tillhandahålla [18F] fluor för dessa studier och UCLA NanoLab för stöd med utrustning för chiptillverkning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
