Summary
Este método describe el uso de una nueva metodología de alto rendimiento, basada en reacciones químicas de gotitas, para la optimización rápida y económica de radiofármacos utilizando cantidades de nanomoles de reactivos.
Abstract
Los radiosíntesis automatizados actuales están diseñados para producir grandes lotes clínicos de radiofármacos. No son adecuados para la optimización de la reacción o el desarrollo de nuevos radiofármacos, ya que cada punto de datos implica un consumo significativo de reactivos, y la contaminación del aparato requiere tiempo para la desintegración radiactiva antes del siguiente uso. Para abordar estas limitaciones, se desarrolló una plataforma para realizar matrices de reacciones en miniatura basadas en gotas en paralelo, cada una confinada dentro de una trampa de tensión superficial en un "chip" de silicio recubierto de politetrafluoroetileno estampado. Estos chips permiten estudios rápidos y convenientes de los parámetros de reacción, incluidas las concentraciones de reactivos, el disolvente de reacción, la temperatura y el tiempo de reacción. Esta plataforma permite completar cientos de reacciones en pocos días con un consumo mínimo de reactivos, en lugar de tomar meses utilizando un radiosíntesis convencional.
Introduction
Los radiofármacos de tomografía por emisión de positrones (PET) se utilizan ampliamente como herramientas de investigación para monitorear procesos bioquímicos específicos in vivo y estudiar enfermedades, y para el desarrollo de nuevos fármacos y terapias. Además, la TEP es una herramienta crítica para diagnosticar o estadificar la enfermedad y monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia1,2,3. Debido a la corta vida media de los radioisótopos PET (por ejemplo, 110 min para radiofármacos marcados con flúor-18) y al peligro de radiación, estos compuestos se preparan utilizando sistemas automatizados especializados que operan detrás del blindaje contra la radiación y deben prepararse justo antes de su uso.
Los sistemas actuales utilizados para sintetizar radiofármacos están diseñados para producir grandes lotes que se dividen en muchas dosis individuales para compartir el costo de producción. Mientras que los sistemas actuales son adecuados para la producción de radiosondas ampliamente utilizadas como [18F] FDG (porque se pueden programar múltiples exploraciones de pacientes y experimentos de investigación en un solo día), estos sistemas pueden ser un desperdicio para la producción de nuevos radiosondas durante el desarrollo en etapas tempranas, o radiosondas menos comúnmente utilizadas. Los volúmenes que utilizan los sistemas convencionales están típicamente en la gama de 1-5 mL, y las reacciones requieren cantidades del precursor en la gama del magnesio 1-10. Además, el uso de radiosíntesis convencionales es generalmente engorroso durante los estudios de optimización, ya que el aparato se contamina después de su uso y el usuario debe esperar a que la radiactividad se descomponga antes de realizar el siguiente experimento. Aparte del costo del equipo, el costo del radioisótopo y los reactivos puede, por lo tanto, llegar a ser muy sustancial para los estudios que requieren la producción de múltiples lotes. Esto puede ocurrir, por ejemplo, durante la optimización de los protocolos de síntesis para nuevos radiosondas para lograr un rendimiento y una fiabilidad suficientes para los estudios iniciales de imágenes in vivo.
Las tecnologías microfluídicas se han utilizado cada vez más en radioquímica para capitalizar varias ventajas sobre los sistemas convencionales4,5,6. Las plataformas microfluídicas, incluidas las basadas en volúmenes de reacción de 1-10 μL7,8,9,han mostrado una reducción significativa de los volúmenes de reactivos y el consumo de precursores costosos, así como tiempos de reacción cortos. Estas reducciones conducen a costos más bajos, pasos de calentamiento y evaporación más rápidos, una purificación más corta y directa aguas abajo, un proceso químico general "más verde"10,y una mayor actividad molar de los radiosondadores producidos11. Estas mejoras hacen que sea más práctico realizar estudios de optimización más extensos al reducir el costo del reactivo de cada síntesis. Se pueden lograr otros beneficios mediante la realización de múltiples experimentos a partir de un solo lote de radioisótopos en un solo día. Por ejemplo, los radiosíntesis de química de flujo microfluídico que operan en "modo de descubrimiento" pueden realizar secuencialmente docenas de reacciones, cada una utilizando solo 10s de volumen de reacción de μL12.
Inspirado por estas ventajas, se desarrolló un chip de matriz de gotas multirrea reacción en el que las reacciones de microvolúmenes se limitan a una matriz de trampas de tensión superficial en una superficie de silicio, creadas con un recubrimiento de teflón estampado. Estos chips permiten realizar múltiples reacciones en la escala de 1-20 μL simultáneamente, abriendo la posibilidad de explorar 10s de diferentes condiciones de reacción por día, cada una con múltiples réplicas. En este documento, se demuestra la utilidad de este nuevo enfoque de alto rendimiento para realizar optimizaciones de radioquímica rápidas y de bajo costo. El uso de chips de gotas multirrea reacción permite una exploración conveniente del impacto de las concentraciones de reactivos y el disolvente de reacción, y el uso de múltiples chips podría permitir el estudio de la temperatura y el tiempo de reacción, todo mientras se consumen cantidades muy bajas de precursor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PRECAUCIÓN: Este protocolo implica la manipulación de materiales radiactivos. Los experimentos no deben llevarse a cabo sin la capacitación necesaria y el equipo de protección personal y la aprobación de la oficina de seguridad radiológica de su organización. Los experimentos deben realizarse detrás del blindaje contra la radiación, preferiblemente en una célula caliente ventilada
1. Fabricación de chips multirreaplicación
NOTA: Los lotes de chips de microgotas multirrea reacción se fabrican a partir de obleas de silicio de 4" utilizando técnicas de fotolitografía estándar, como se describió anteriormente10 (Figura 1). Este procedimiento producirá 7 chips cada uno con una matriz de 4 x 4 de sitios de reacción.
- Coloque la oblea de silicio en el mandril de la recubridora girada, asegurándose de que esté centrado. Deposite 3 mL de solución de politetrafluoroetileno en el centro de la oblea con una pipeta de transferencia y una oblea de recubrimiento a 1000 rpm durante 30 s (rampa de 500 rpm/s).
- Para solidificar el recubrimiento, coloque la oblea en una placa caliente de 160 °C durante 10 min y luego transfiera a una placa caliente de 245 °C durante 10 min.
- Recocido el recubrimiento en un horno de alta temperatura a 340 °C durante 3,5 h bajo atmósfera de nitrógeno, seguido de enfriamiento a 70 °C a una rampa de 10 °C/min.
- Coloque la oblea de silicio en el mandril de la recubridora girada, asegurándose de que esté centrada. Vierta 2 mL de fotorresistente positivo en el centro de la oblea usando una pipeta de transferencia, y luego realice el recubrimiento a 3000 rpm durante 30 s (rampa de 1000 rpm/s).
- Solidifique el fotorresister realizando un horneado suave de la oblea en una placa caliente de 115 ° C durante 3 min.
- Instale la oblea y la fotomáscara en un alineador de máscaras y realice una exposición de 14 s a 12 mW/cm de intensidad de lámpara2 y longitud de onda de 356 nm en modo de contacto duro. Este paso utiliza una máscara de transparencia que contiene el patrón de politetrafluoroetileno final negativo, es decir, un patrón de 4 " de diámetro de 4 copias del chip de 16 reacciones, con sitios de reacción transparentes y todas las demás regiones en color opaco.
- Sumerja la oblea utilizando 20 mL de solución reveladora de fotorresistido en un recipiente de vidrio durante 3 min con ligera agitación para desarrollar el patrón expuesto.
- Enjuague la solución en desarrollo sumergiendo la oblea en un recipiente de vidrio con 20 mL de agua di durante 3 minutos con una ligera agitación. Seque la oblea con una pistola de nitrógeno.
- Retire las regiones expuestas del politetrafluoroetileno vía el aguafuerte del reactivo-ion (RIE) con el plasma del oxígeno bajo condiciones siguientes: exposición de 30 s, presión de 100 mTorr, potencia de 200 W, y flujo de oxígeno de 50 sccm.
- Corta la oblea en chips individuales (7 en total por oblea) utilizando un cortador de oblea de silicio.
- Sumerja cada chip en acetona durante 1 min para eliminar el fotorresistido, luego isopropanol durante 1 min. Finalmente, seque cada chip con una pistola de nitrógeno.
- Coloque las virutas secas en un recipiente de vidrio y cubra con papel de aluminio para su almacenamiento hasta su uso.
2. Planificación del estudio de optimización
NOTA: En este protocolo, la síntesis del falypride radiofármaco[18F]se utiliza como ejemplo para ilustrar la optimización de alto rendimiento (Figura 2). Con un solo chip, se pueden realizar 16 reacciones simultáneas, por ejemplo, con concentración de precursor variada (8 concentraciones diferentes, n=2 réplicas cada una). Las condiciones se asignan a los sitios de reacción en la Figura 3A. Se pueden realizar ajustes en este protocolo para optimizar otros parámetros de reacción (por ejemplo, disolvente de reacción, volumen de reacción, cantidad de TBAHCO3,etc.) u otros radiofármacos.
- Seleccione los parámetros de reacción que se variarán, los valores específicos que se utilizarán y el número de réplicas.
- Calcule el número de chips necesarios para realizar el experimento.
- Para cada chip, prepare un mapa de las condiciones de reacción que se utilizarán en cada sitio de reacción para ayudar con la preparación del reactivo y la realización de las reacciones de gotitas.
3. Preparación de reactivos y materiales para optimizar la radiosíntesis de[18F]falpóruro
NOTA: La radiosíntesis basada en gotitas de[18F]falpuro(Figura 2)comienza con la adición de[18F]fluoruro y catalizador de transferencia de fase (TBAHCO3)al sitio de reacción, seguido de calentamiento para evaporar el agua y dejar un residuo seco. A continuación, se añade una gotita de precursor (tosil-falpílido) en el disolvente de reacción (alcohol por xil y acetonitrilo) y se calienta para realizar la reacción de radiofluorinación. Finalmente, el producto crudo se recoge del chip para su análisis. Los procedimientos de preparación y síntesis de reactivos deben adaptarse si se realiza la optimización de un marcador diferente.
- Preparar una solución común del disolvente de reacción, que consiste en alcohol de xil y acetonitrilo en una mezcla de 1:1 por volumen. Asegúrese de que el volumen es suficiente para crear la serie de dilución planificada. En este ejemplo de optimización, ~30 μL es suficiente.
- Preparar una solución común de 30 μL de precursor (tosil-falpárida) en el disolvente de reacción con la concentración máxima a explorar (77 mM). Asegúrese de que el volumen es suficiente para realizar el experimento planificado. En este ejemplo de optimización, ~30 μL es suficiente.
- A partir de la solución de stock precursor y disolvente de reacción, realizar 2x diluciones en serie para preparar las diferentes concentraciones de la solución precursora. Asegúrese de que el volumen de cada dilución es suficiente para realizar el número deseado de réplicas para cada condición. En este ejemplo de optimización, ~15 μL de cada concentración es suficiente.
- Prepare tubos de microcentrífuga para recoger cada producto de reacción cruda utilizando un marcador permanente para etiquetar cada tubo con un número único. Asegúrese de que el número total de tubos de microcentrífuga coincide con el número de condiciones multiplicado por el número de réplicas (8 x 2 = 16).
- Preparar un stock de solución de recolección (10 mL) que comprenda metanol 9:1:DI agua (v/v). Alícuota 50 μL en cada uno de los 16 tubos de microcentrífuga etiquetados adicionales (uno por sitio de reacción en el chip).
- Prepare una solución común de[18F]fluoruro en un tubo de microcentrífuga de 500 μL mezclando[18F]fluoruro/[18 O]H2O (~260 MBq [7 mCi]) con una solución de TBAHCO 3 de75 mM (56 μL) y diluyendo con agua DI hasta 140 μL. 8 μL de esta solución se cargarán en cada sitio de reacción (conteniendo ~15 MBq [0,40 mCi] de actividad, y 240 nmol de TBAHCO3).
4. Síntesis paralela de[18F]falpuro con diferentes concentraciones de precursores
NOTA: El chip se opera sobre una plataforma de calefacción (construida como se describió anteriormente13)que consiste en un calentador de cerámica de 25 mm x 25 mm, controlado mediante un controlador de temperatura de encendido y apagado utilizando la señal de termopar interno para la retroalimentación. Las temperaturas superficiales del calentador fueron calibradas usando proyección de imagen termal. Si dicha plataforma no está disponible, se puede utilizar un par de placas calientes (una a 105 °C y otra a 110 °C).
- Solución de culata de flúor de carga[18F](con catalizador de transferencia de fase).
- Usando una micropipeta, cargue una gota de 8 μL de solución de material de[18F]fluoruro en el primer punto de reacción de un chip de reacción múltiple. Mida la actividad del chip colocándolo en un calibrador de dosis y registre el momento en que se realiza la medición.
- Retire el chip del calibrador de dosis y luego cargue una gota de 8 μL de solución de stock de[18F]fluoruro en el segundo punto de reacción. Mida la actividad en el chip colocándolo una vez más en el calibrador de dosis y registre el momento en que se realiza la medición.
- Repita el artículo para todos los demás sitios de reacción del chip.
- Calcule la actividad cargada por punto de reacción tomando la medición de actividad después de cargar el radioisótopo y restando la medición anterior (corregida por decaimiento) antes de que se cargara ese sitio.
- Alinee el chip multirrea reacción en el calentador.
- Agregue una capa delgada de pasta térmica encima del calentador de cerámica.
- Coloque cuidadosamente el chip en la parte superior del calentador utilizando pinzas para evitar el derrame de las gotas, alineando la esquina de referencia del chip con la esquina de referencia del calentador (como se muestra en la Figura 3B). El chip sobrevolará el calentador por una pequeña cantidad.
- Seque el[18F]fluoruro y el catalizador de transferencia de fase.
- Calentar el chip durante 1 min poniendo el calentador a 105 °C en el programa de control para evaporar las gotas a sequedad dejando un residuo seco de[18F]fluoruro y TBHACO3. Después de 1 minuto, enfríe el chip apagando el calentador y encendiendo el ventilador de refrigeración con el programa de control.
- Agregue la solución precursora.
- Usando una micropipeta, agregue una solución de 6 μL de precursor de falypride encima del residuo seco en el primer sitio de reacción.
- Repita el artículo para todos los demás sitios de reacción del chip. Utilice el plan de optimización para determinar qué concentración de la serie de dilución se utiliza para cada sitio de reacción.
- Realizar la reacción de fluoración.
- Calentar cada chip a 110 °C durante 7 min utilizando el programa de control para realizar la reacción de radiofluoración. Después, enfríe el chip apagando el calentador y encendiendo el ventilador de refrigeración con el programa de control.
- Recoger los productos crudos de los sitios de reacción.
- Recoja el producto crudo en el primer sitio de reacción añadiendo 10 μL de solución de recolección del tubo de microcentrífuga designado a través de micropipeta. Después de esperar 5 s, utilice la micropipeta (con la misma punta instalada) para aspirar el producto crudo diluido y transferir a su correspondiente tubo de microcentrífuga de recolección etiquetado.
- Repita este proceso un total de 4 veces utilizando la misma punta de pipeta para todas las operaciones.
- Repita el proceso de recolección para todos los demás sitios de reacción en el chip.
5. Análisis de síntesis para determinar el rendimiento de la reacción y las condiciones óptimas
- Determine la "eficiencia de recolección" para la primera reacción en el chip.
- Coloque el tubo de microcentrífuga con el producto crudo recogido del primer punto de reacción en el calibrador de dosis para medir la actividad. Registre la medición y el tiempo de la medición.
- Calcule la eficiencia de recolección dividiendo la actividad del producto crudo recolectado por la actividad inicial medida para el mismo sitio de reacción (corrección de decaimiento de los valores de actividad al mismo punto de tiempo).
- Repita el artículo para todos los demás sitios de reacción del chip.
- Analizar la composición (eficiencia de fluoración) de cada producto crudo recolectado.
NOTA: Para hacer práctico el análisis de todas las muestras en poco tiempo, la eficiencia de fluoración se analiza utilizando un enfoque de cromatografía de capa radiodelgada (radio-TLC) de alto rendimiento previamente descrito14. Esta técnica permite procesar hasta ocho muestras en paralelo mediante la detección de lado a lado (5 mm de paso, 0,5 μL por punto) en una sola placa TLC, luego se desarrollan juntas, y se realizan la lectura juntos utilizando imágenes Cerenkov14,15. Para la optimización de ejemplo con 16 reacciones paralelas, se necesitan 2 placas TLC. Otra opción es utilizar cromatografía líquida de radio de alto rendimiento (radio-HPLC) para el análisis, aunque el tiempo de separación, limpieza y equilibrio puede limitar el número de muestras que se pueden analizar.- Para cada placa TLC (50 mm x 60 mm), con un lápiz, dibuje una línea a 15 mm de distancia de un borde de 50 mm (inferior) y otra línea a 50 mm del mismo borde. La primera línea es la línea de origen; el segundo es la primera línea solvente. Dibuje 8 pequeñas "X" a lo largo de la línea de origen con un espaciado de 5 mm para definir la posición de detección de la muestra para cada uno de los 8 "carriles".
- Usando una micropipeta, transfiera 0.5 μL del primer producto crudo a la placa TLC en la "X" para el primer carril. Repita para productos crudos adicionales (hasta 8 por placa TLC). Espere a que las manchas de producto crudo se sequen en la placa TLC.
- Para cada placa TLC, desarrollar utilizando una fase móvil de 60% De MeCN en 25 mM NH4HCO2 con 1% DE TEA (v/v) hasta que el frente del solvente llegue a la línea frontal del solvente. Espere a que el disolvente de la placa TLC se seque y luego cubra con un portaobjetos de microscopio de vidrio (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm de espesor).
- Obtenga una imagen de radiactividad de cada placa TLC colocando la placa en un sistema de imágenes Cerenkov para una exposición de 5 minutos. Realice correcciones de imagen estándar (resta de corriente oscura, corrección de campo plano, filtrado mediano y resta de fondo).
- Utilice el análisis de región de interés (ROI) para el primer carril de la primera placa TLC. Dibuje regiones alrededor de cada banda visible en el carril. El software calculará la fracción de intensidad integrada de cada región (banda) en comparación con la intensidad integrada total de todas las regiones (bandas).
- Con esta fase móvil, se esperan las siguientes bandas en los factores de retención indicados: Rf = 0,0: Fluoruro sin reaccionar[18F]; Rf = 0,9: [18F]falpuro; Rf = 0.94: Producto lateral. Determinar la eficiencia de fluoración como la fracción de actividad en la banda de[18F]falpuro.
- Repita este análisis para todos los demás carriles en todas las placas TLC.
NOTA: Si una cámara de imágenes Cerenkov no está disponible, se puede utilizar un sistema de imágenes ópticas in vivo para animales pequeños (preclínicos) para obtener imágenes de las placas TLC. Alternativamente, se puede utilizar un escáner TLC de 2 dimensiones. Alternativamente, si solo hay disponible un escáner TLC de 1 dimensión, las placas TLC se pueden analizar cortando en tiras con tijeras (1 por carril) y escaneando cada tira individualmente.
- Determinar el rendimiento radioquímico crudo (RCY crudo) para cada sitio de reacción.
- Determine el RCY crudo para el primer producto crudo multiplicando la eficiencia de recolección por la eficiencia de fluoración.
- Repita para todos los demás sitios de reacción.
- Analizar los resultados
- Valores agregados para cualquier experimento de réplica en un promedio y una desviación estándar.
- Graficar la eficiencia de recolección, la eficiencia de fluoración y el RCY crudo en función del parámetro que se varió (concentración de precursores en este ejemplo).
- Seleccione las condiciones óptimas en función de los criterios deseados. Por lo general, este es el RCY crudo máximo. Además, el punto a menudo se elige en una región donde la pendiente del gráfico es relativamente plana, lo que indica que es insensible a pequeños cambios en el parámetro, lo que proporciona un protocolo más robusto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un experimento representativo fue realizado para ilustrar este método. Usando 16 reacciones, los estudios de optimización del radiofármaco[18F]fallypride fueron realizados por la concentración variable del precursor (77, 39, 19, 9.6, 4.8, 2.4, 1.2, y 0.6 milímetros) en el alcohol delxyl: MeCN (1:1, v/v) como el solvente de la reacción. Las reacciones se realizaron a 110 °C durante 7 min. La eficiencia de la recolección, la composición de la muestra (es decir, las proporciones del producto[18F]fallypride, el[18F]fluoruro sin reaccionar y el producto lateral) se tabulan en la Tabla 1 y se resumen gráficamente en la Figura 4.
El estudio mostró que la eficiencia de fluoración (proporción de[18F]falpíride) aumenta con el aumento de la concentración de precursores, y que el resto sin reaccionar[18F]fluoruro variaba inversamente(Figura 4A). Había una pequeña cantidad de un producto secundario radiactivo a bajas concentraciones de precursores, pero la proporción disminuyó a casi cero en las concentraciones más altas de precursores (Figura 4A). La eficiencia de la recolección fue casi cuantitativa para la mayoría de las condiciones, aunque disminuyó ligeramente a bajas concentraciones de precursores.
A partir de estos resultados, el RCY más alto se puede lograr con ~ 230 nmol de precursor (es decir, 39 mM de concentración en una gota de 6 μL). En esta condición, la eficacia de la fluoración era 96,0 ± 0,5% (n=2) y el RCY crudo era 87,0 ± 2,7 (n=2), y no había formación radiactiva observada del producto del lado. Si bien el uso de precursores de 77 mM mostró resultados similares, en general es deseable utilizar una menor cantidad de precursor para reducir el costo y simplificar los pasos de purificación aguas abajo.
Figura 1:Fabricación de chips de microgotas multirrea reacción mediante fotolitografía. (A) Fotografía del chip de microgotas multirrea reacción con una matriz de 4 x 4 de sitios de reacción. El chip consiste en silicio recubierto de politetrafluoroetileno con regiones circulares de politetrafluoroetileno grabadas para crear los sitios de reacción hidrofílicos. (B) Esquema del procedimiento de fabricación. Una oblea de silicio se recubre con solución de teflón y se hornea para solidificar el recubrimiento. A continuación, el fotorresistido está recubierto de espín y modelado a través de fotolitografía para producir una máscara de grabado. El fotorresist se desarrolla con una solución de desarrollo de fotorresist. El teflón expuesto se elimina a través de grabado seco con plasma de oxígeno. La oblea se corta en dados en chips individuales, y el fotorresistido se despoja. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Procedimiento para reacciones paralelas. Procedimiento experimental para la realización de 16 síntesis paralelas del falypride radiofármaco[18F]en un chip multirreactor. En este ejemplo, la concentración del precursor se varía para cada reacción. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Mapa de las condiciones en los lugares de reacción. (A) Diseño experimental para explorar la influencia de la concentración de precursores en la radiofluoración de falpuro de tosil utilizando un solo chip de 16 reacciones (vista superior). Se exploraron ocho concentraciones diferentes, cada una con n=2 réplicas. Otras condiciones de reacción se mantuvieron constantes (temperatura: 110 °C; tiempo: 7 min; disolvente: alcohol por xil:MeCN; la cantidad de TBAHCO3:240 nmol). Cada reacción se realizó con ~14 MBq de actividad. (B) Fotografía de un chip de 16 reacciones instalado en la plataforma del calentador durante el experimento. Las líneas rojas representan la esquina de referencia del chip utilizado para la alineación con la esquina de referencia del calentador. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:Influencia de la concentración de precursores en la síntesis de microgotas de[18F]falpápido. (A) Proporción de especies radiactivas presentes en el producto de reacción bruta recogido, es decir,[18F]falpílrido, producto secundario, o fluoruro sin reaccionar[18F].. (B)Rendimiento de síntesis. La eficiencia de recolección, la eficiencia de fluoración y el RCY crudo se trazan en función de la concentración de precursores. En ambas gráficas, los puntos de datos representan el promedio de n=2 réplicas, y las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| Concertación precursora (mM) | Eficiencia de la recolección (%) | Eficiencia de fluoración (%) | RCY bruto (%) | Fluoruro [18F] sin reaccionar (%) | Producto secundario (%) |
| 77 | 91,8 ± 2,1 | 96,7 ± 2,0 | 88,8 ± 3,9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96,0 ± 0,5 | 87,0 ± 2,7 | 4,0 ± 0,5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91,1 ± 0,5 | 81,1 ± 0,3 | 73,9 ± 0,7 | 8.4 ± 1.2 | 10,5 ± 2,0 |
| 9.6 | 90,9 ± 0,6 | 62,7 ± 0,9 | 57,0 ± 0,5 | 23.3 ± 2.1 | 14,0 ± 0,9 |
| 4.8 | 88,4 ± 0,8 | 37,0 ± 1,5 | 32,8 ± 1,6 | 47,3 ± 0,8 | 15,7 ± 1,0 |
| 2.4 | 87,6 ± 2,0 | 21,0 ± 2,1 | 18,4 ± 2,2 | 67,4 ± 2,1 | 11,6 ± 1,0 |
| 1.2 | 82,3 ± 1,6 | 12,7 ± 0,3 | 10,4 ± 0,1 | 72,8 ± 0,7 | 14,5 ± 1,0 |
| 0.6 | 81,2 ± 3,7 | 6.3 ± 0.8 | 5.1 ± 0.5 | 84,3 ± 0,2 | 9.4 ± 1.0 |
Tabla 1: Datos obtenidos del estudio de la concentración de precursores. Todos los valores son promedios ± desviaciones estándar calculadas a partir de n=2 réplicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Debido a las limitaciones de los sistemas de radioquímica convencionales que permiten solo una o un pequeño número de reacciones por día y consumen una cantidad significativa de reactivos por punto de datos, solo se puede explorar en la práctica una pequeña porción del espacio total de parámetros de reacción, y muchas veces los resultados se informan sin repeticiones (n = 1). En comparación con los sistemas convencionales, esta plataforma de radiosíntesis de gotas multirrea reacción hace que sea práctico realizar estudios más completos y rigurosos de las condiciones de radiosíntesis mientras consume muy poco tiempo y cantidad de precursores, lo que potencialmente permite nuevos conocimientos sobre los parámetros que afectan el rendimiento del producto y la formación de productos secundarios. La información se puede utilizar para elegir las condiciones que resultan en el mayor rendimiento del producto o la síntesis más robusta. El bajo consumo de precursores puede ser especialmente útil en el desarrollo temprano de nuevos radiosondas cuando sólo una pequeña cantidad de precursor puede estar disponible o cuando el precursor es caro. Si bien la naturaleza abierta de los chips contribuye al tiempo de síntesis rápido y la facilidad de acceso a través de pipeta, puede conducir a pérdidas sustanciales de moléculas volátiles y puede no ser práctico al optimizar la síntesis de radiofármacos que tienen precursores volátiles, intermedios o productos.
Debido al peligro de exposición a la radiación, debe reiterarse que estos experimentos deben realizarse únicamente con la formación y las aprobaciones adecuadas y deben llevarse a cabo detrás del blindaje contra la radiación, preferiblemente en una célula caliente ventilada. Debido a la corta vida media de los radioisótopos, es importante realizar los experimentos de forma rápida y eficiente. El pipeteo de reactivos al chip y la recolección de productos del chip deben practicarse en condiciones no radiactivas para familiarizarse con el acceso y la visibilidad reducidos en una celda caliente. Del mismo modo, también se debe practicar la instalación y extracción del chip, y la realización de mediciones del chip con el calibrador de dosis. Además, es fundamental organizarse, con un mapa de experimento detallado (es decir, condiciones de reacción específicas en cada sitio en el chip). También es útil preparar con anticipación una tabla de resultados que se completará a medida que se realicen las mediciones. Para garantizar la reproducibilidad, especialmente con la posibilidad de error humano, se deben realizar múltiples réplicas de cada conjunto de condiciones. Es importante tener especial cuidado durante la etapa de recolección de las muestras crudas del chip para evitar derramar líquido fuera del sitio de reacción y causar contaminación cruzada con los sitios de reacción adyacentes. Si se observa algún error, es importante marcar estos sitios de reacción para que los datos se puedan excluir del análisis final.
En este estudio de ejemplo, la cantidad de precursor consumido para 16 puntos de datos fue de 1,1 mg (~ 70 μg cada uno), en comparación con 4 mg por punto de datos utilizando un radiosíntesis convencional. Además, las 16 reacciones se completaron en 25 minutos, todo en un solo experimento. En comparación, la síntesis de falpuro crudo[18F]en un radiosíntesis convencional requiere ~ 15-20 min por reacción16,17.
Este experimento representativo demostró la utilidad de un chip de microgotas multirreacción con 16 reacciones para optimizar las condiciones para la radiosíntesis del falypride radiofármaco[18F] explorando 8 concentraciones de precursores diferentes (n = 2 réplicas para cada condición) de una manera rápida y económica. Otras variables que se pueden optimizar convenientemente utilizando un chip de reacción múltiple incluyen la cantidad de radiactividad, el tipo de catalizador de transferencia de fase, la cantidad de catalizador de transferencia de fase, las condiciones de evaporación / secado (por ejemplo, el número de pasos de secado azeotrópico), el disolvente de reacción, etc. Mediante el uso de múltiples chips de reacción múltiple, también es posible explorar la influencia de la temperatura de reacción y el tiempo de reacción, además de condiciones como la temperatura y el tiempo de evaporación / secado. Tales estudios tendrían que realizarse secuencialmente usando el solo calentador o podrían ser paralelizados operando múltiples calentadores al mismo tiempo.
El método de síntesis de gotas subyacente ha demostrado ser compatible con una amplia gama de 18radiofármacos etiquetados con F, como[18F]falpuro10,[18F]FET18,[18F]FDOPA19,[18F]FBB20 y se puede utilizar para la optimización de la mayoría de otros 18compuestos marcados con F y compuestos etiquetados con otros isótopos. Además, las reacciones optimizadas resultantes basadas en gotas aprovechan intrínsecamente las ventajas de la radioquímica de microvolúmenes, incluido el consumo reducido de precursores, los tiempos de proceso más rápidos y la instrumentación compacta, y pueden ofrecer estas mismas ventajas para la producción rutinaria de lotes grandes. Los lotes más grandes simplemente requieren escalar la cantidad de actividad cargada inicialmente al inicio de la reacción. Para preparar un marcador adecuado para su uso en ensayos in vitro o in vivo, el producto crudo debe purificarse (por ejemplo, utilizando HPLC a escala analítica) y formularse (por ejemplo, mediante el intercambio de disolventes evaporativo o en fase sólida21)Alternativamente, puede ser posible adaptar las condiciones óptimas de la escala de gotitas a un radiosintizador convencional basado en viales. La investigación de esta posibilidad está en curso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los Regentes de la Universidad de California han licenciado tecnología a Sofie, Inc. que fue inventada por el Dr. van Dam, y han tomado acciones en Sofie, Inc. como parte de la transacción de licencia. El Dr. van Dam es fundador y consultor de Sofie, Inc. Los autores restantes declaran no tener conflictos de intereses. Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del Cáncer (R33 240201).
Acknowledgments
Agradecemos a la Instalación de Ciclotrón Biomédico de UCLA y al Dr. Roger Slavik y al Dr. Giuseppe Carlucci por proporcionar generosamente[18F]fluoruro para estos estudios y al NanoLab de UCLA por el apoyo con equipos para la fabricación de chips.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
