Summary
وتصف هذه الطريقة استخدام منهجية جديدة عالية الإنتاجية، تستند إلى التفاعلات الكيميائية القطيرة، للتحسين السريع والاقتصادي للمستحضرات الصيدلانية الإشعاعية باستخدام كميات نانومول من الكواشف.
Abstract
تم تصميم التمثيل الإشعاعي الآلي الحالي لإنتاج دفعات سريرية كبيرة من الأدوية الإشعاعية. فهي ليست مناسبة تماما لتحسين رد الفعل أو تطوير الأدوية الإشعاعية الجديدة لأن كل نقطة بيانات تنطوي على استهلاك كاشف كبير ، ويتطلب تلوث الجهاز وقتا للاضمحلال الإشعاعي قبل الاستخدام التالي. ولمعالجة هذه القيود، تم تطوير منصة لأداء صفائف من التفاعلات المصغرة القائمة على القطرات بالتوازي، كل منها محصور في فخ التوتر السطحي على "رقاقة" سيليكون منقوشة مغلفة بالبوليتيترافلوروفلور الإيثيلين. هذه الرقائق تمكين الدراسات السريعة والمريحة من المعلمات رد فعل بما في ذلك تركيزات الكاشف، رد فعل المذيبات، ودرجة حرارة رد الفعل والوقت. تسمح هذه المنصة بإكمال مئات ردود الفعل في غضون أيام قليلة مع الحد الأدنى من استهلاك الكاشف ، بدلا من أخذ أشهر باستخدام جهاز التمثيل الإشعاعي التقليدي.
Introduction
تستخدم المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية البوزيترونية الانبعاثات على نطاق واسع كأدوات بحثية لرصد عمليات كيميائية بيولوجية حية ودراسة الأمراض، وتطوير أدوية وعلاجات جديدة. وعلاوة على ذلك، PET هو أداة حاسمة لتشخيص أو تنظيم المرض ورصد استجابة المريض للعلاج1،2،3. ونظرا لقصر عمر النظائر المشعة PET (على سبيل المثال، 110 دقيقة للمستحضرات الصيدلانية المشعة المسماة بالفلور-18) ومخاطر الإشعاع، يتم إعداد هذه المركبات باستخدام أنظمة آلية متخصصة تعمل خلف التدريع الإشعاعي ويجب إعدادها قبل الاستخدام مباشرة.
تم تصميم الأنظمة الحالية المستخدمة لتجميع الأدوية الإشعاعية لإنتاج دفعات كبيرة تنقسم إلى العديد من الجرعات الفردية لتقاسم تكلفة الإنتاج. في حين أن الأنظمة الحالية مناسبة لإنتاج أجهزة تتبع إشعاعية تستخدم على نطاق واسع مثل [18F]FDG (لأنه يمكن جدولة العديد من فحوصات المرضى والتجارب البحثية في يوم واحد) ، يمكن أن تكون هذه الأنظمة مضيعة لإنتاج أجهزة تتبع إشعاعية جديدة أثناء التطوير في المراحل المبكرة ، أو أقل استخداما للمتتبعين الإشعاعيين. الأحجام التي تستخدمها النظم التقليدية عادة ما تكون في نطاق 1-5 مل، وردود الفعل تتطلب كميات السلائف في نطاق 1-10 ملغ. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام أجهزة التمثيل الإشعاعي التقليدية مرهق بشكل عام أثناء دراسات التحسين لأن الجهاز يصبح ملوثا بعد الاستخدام ويجب على المستخدم الانتظار حتى يتحلل النشاط الإشعاعي قبل إجراء التجربة التالية. وبصرف النظر عن تكلفة المعدات، يمكن أن تصبح تكلفة النظائر المشعة والكواشف، بالتالي، كبيرة جدا للدراسات التي تتطلب إنتاج دفعات متعددة. ويمكن أن يحدث هذا، على سبيل المثال، أثناء تحسين بروتوكولات التوليف للمتتبعين الإشعاعيين نوفيلا لتحقيق ما يكفي من الغلة والموثوقية للدراسات الأولية في التصوير الحي.
وقد استخدمت تقنيات Microfluidic على نحو متزايد في الكيمياء الإشعاعية للاستفادة من العديد من المزايا على النظم التقليدية4،5،6. وقد أظهرت منصات Microfluidic ، بما في ذلك تلك التي تستند إلى أحجام تفاعل 1-10 ميكرولتر7و8و9، انخفاضا كبيرا في أحجام الكاشف واستهلاك السلائف باهظة الثمن ، وكذلك أوقات رد الفعل القصيرة. هذه التخفيضات تؤدي إلى انخفاض التكاليف، وسرعة التدفئة والتبخر الخطوات، وأقصر وأكثر مباشرة تنقية المصب، وعموما "أكثر اخضرارا" عملية الكيمياء10،وارتفاع نشاط الضرس من radiotracers المنتجة11. هذه التحسينات تجعل من العملي أكثر لإجراء دراسات التحسين أكثر شمولا عن طريق خفض تكلفة الكاشف من كل توليفة. ويمكن تحقيق المزيد من الفوائد من خلال إجراء تجارب متعددة من دفعة واحدة من النظائر المشعة في يوم واحد. على سبيل المثال، يمكن للمايديو فلويديك الكيمياء المشعة العاملة في "وضع الاكتشاف" أداء عشرات من ردود الفعل بشكل متسلسل، كل باستخدام فقط 10s من حجم رد فعل μL12.
مستوحاة من هذه المزايا، تم تطوير رقاقة صفيف قطرة متعددة التفاعل تقتصر فيها ردود فعل الميكروفولوم على مجموعة من مصائد التوتر السطحي على سطح السيليكون، والتي تم إنشاؤها باستخدام طلاء تفلون منقوش. تمكن هذه الرقائق من إجراء ردود فعل متعددة على مقياس 1-20 ميكرولتر في وقت واحد ، مما يفتح إمكانية استكشاف 10s من ظروف رد الفعل المختلفة في اليوم الواحد ، مع تكرارات متعددة. في هذه الورقة، يتم توضيح فائدة هذا النهج الإنتاجي العالي الجديد لأداء تحسينات الكيمياء الراديوية السريعة والمنخفضة التكلفة. استخدام رقائق قطرات متعددة التفاعل يسمح لاستكشاف مريحة لتأثير تركيزات الكاشف والمذيبات رد فعل، واستخدام رقائق متعددة يمكن أن تمكن من دراسة درجة حرارة التفاعل والوقت، في حين أن جميع تستهلك كميات منخفضة جدا من السلائف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبيه: ينطوي هذا البروتوكول على التعامل مع المواد المشعة. لا ينبغي إجراء التجارب دون التدريب اللازم ومعدات الحماية الشخصية وموافقة مكتب السلامة الإشعاعية في مؤسستك. يجب إجراء التجارب خلف التدريع الإشعاعي، ويفضل أن تكون في خلية ساخنة مهوية
1. تصنيع رقائق متعددة ردود الفعل
ملاحظة: يتم تصنيع دفعات من رقائق ميكرودروبليت متعددة ردود الفعل من رقائق السيليكون 4 "باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية، كما سبق شجب10 (الشكل 1). هذا الإجراء سوف تنتج 7 رقائق مع كل 4 × 4 مجموعة من مواقع رد الفعل.
- ضع رقاقة السيليكون على تشاك الدوار ، مما يضمن أن يتمركز. إيداع 3 مل من محلول البوليتيترافلوروإيثيلين في وسط الرقاقة مع ماصة نقل ورقائق معطف في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (500 دورة في الدقيقة / ثانية المنحدر).
- لترسيخ الطلاء، ضع الرقاقة على لوحة ساخنة 160 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم نقلها إلى لوحة ساخنة 245 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- أنال الطلاء في فرن درجة حرارة عالية في 340 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة تحت الغلاف الجوي النيتروجين، تليها التبريد إلى 70 درجة مئوية في منحدر 10 درجة مئوية / دقيقة.
- ضع رقاقة السيليكون على تشاك الدوار ، مما يضمن أن يتمركز. صب 2 مل من الكواتر الضوئي الإيجابي في وسط رقاقة باستخدام ماصة نقل، ومن ثم أداء الطلاء في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (1000 دورة في الدقيقة / ثانية المنحدر).
- ترسيخ الكواتر الضوئي من خلال أداء خبز لينة من رقاقة على hotplate 115 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- تثبيت رقاقة وقناع ضوئي في قناع المحاذاة وأداء التعرض 14 ق في 12 كيلوواط / سم2 كثافة مصباح وطول الموجة 356 نانومتر في وضع الاتصال الثابت. تستخدم هذه الخطوة قناع شفافية يحتوي على نمط البوليتيترافلوروإيثيلين النهائي السلبي ، أي نمط قطره 4 بوصات من 4 نسخ من رقاقة التفاعل 16 ، مع مواقع تفاعل شفافة وجميع المناطق الأخرى بلون معتم.
- غمر رقاقة باستخدام 20 مل من محلول المطور الضوئي في حاوية زجاجية لمدة 3 دقائق مع تحريض طفيف لتطوير نمط يتعرض.
- شطف بعيدا الحل النامية عن طريق غمر رقاقة في وعاء زجاجي مع 20 مل من المياه DI لمدة 3 دقائق مع التحريض طفيف. جفف الرقاقة بمسدس النيتروجين
- إزالة مناطق البوليتيترافلوروإيثيلين المكشوفة عن طريق النقش التفاعلي أيون (RIE) مع بلازما الأكسجين في ظل الظروف التالية: التعرض 30 s، 100 ضغط mTorr، 200 واط السلطة، وتدفق الأكسجين 50 sccm.
- الزهر رقاقة في رقائق الفردية (7 المجموع لكل رقاقة) باستخدام قاطع رقاقة السيليكون.
- غمر كل رقاقة في الأسيتون لمدة دقيقة واحدة لإزالة مزيل الصور، ثم isopropanol لمدة 1 دقيقة. وأخيرا، جفف كل رقاقة بمسدس النيتروجين.
- وضع رقائق جافة في وعاء زجاجي وتغطية مع رقائق الألومنيوم للتخزين حتى الاستخدام.
2. التخطيط لدراسة التحسين
ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم استخدام توليف المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية [18F] fallypride كمثال لتوضيح التحسين عالي الإنتاجية (الشكل 2). مع رقاقة واحدة، يمكن إجراء 16 ردود فعل متزامنة، على سبيل المثال، مع تركيز السلائف المتنوعة (8 تركيزات مختلفة، ن = 2 يكرر كل منهما). يتم تعيين الشروط لمواقع رد الفعل في الشكل 3A. يمكن إجراء تعديلات على هذا البروتوكول لتحسين معلمات التفاعل الأخرى (مثل مذيبات التفاعل أو حجم التفاعل أو كمية TBAHCO3، وما إلى ذلك) أو الأدوية الإشعاعية الأخرى.
- حدد معلمة (معلمات) التفاعل التي سيتم تنوعها والقيم المحددة التي سيتم استخدامها وعدد النسخ المتماثلة.
- حساب عدد الرقائق اللازمة لإجراء التجربة.
- لكل رقاقة، وإعداد خريطة للظروف رد الفعل الذي سيتم استخدامها في كل موقع رد فعل للمساعدة في إعداد كاشف وأداء ردود الفعل قطرة.
3. إعداد الكواشف والمواد لتحسين التمثيل الإشعاعي من [18F ] fallypride
ملاحظة: يبدأ التمثيل الإشعاعي القائم على القطيرات من [18F] fallypride (الشكل 2) بإضافة [18F] فلوريد ومحفز نقل المرحلة (TBAHCO3) إلى موقع التفاعل ، يليه التدفئة لتتبخر المياه وتترك بقايا مجففة. بعد ذلك ، يتم إضافة قطرة من السلائف (التوليل فاليبريد) في مذيب التفاعل (كحول الثيل والأسيتونيتريل) وتسخينها لأداء رد فعل السائل الإشعاعي. وأخيرا، يتم جمع المنتج الخام من رقاقة للتحليل. وينبغي تكييف إعداد الكاشف وإجراءات التوليف إذا كان أداء الأمثل من التتبع مختلفة.
- إعداد محلول الأسهم من المذيبات رد فعل, تتكون من الكحول الثيل والأسيتونيتريل في 1:1 من قبل خليط حجم. تأكد من أن حجم كافية لإنشاء سلسلة التخفيف المخطط لها. في هذا المثال الأمثل ، ~ 30 ميكرولتر كافية.
- إعداد محلول مخزون 30 ميكرولتر من السلائف (التوليل فاليبريد) في مذيب التفاعل مع الحد الأقصى للتركيز الذي سيتم استكشافه (77 mM). تأكد من أن وحدة التخزين كافية لإجراء التجربة المخطط لها. في هذا المثال الأمثل ، ~ 30 ميكرولتر كافية.
- من محلول مخزون السلائف ومذيب التفاعل ، قم بإجراء تخفيفات متسلسلة 2x لإعداد التركيزات المختلفة لمحلول السلائف. تأكد من أن حجم كل تخفيف يكفي لأداء العدد المطلوب من النسخ المتماثلة لكل حالة. في هذا المثال الأمثل، ~ 15 ميكرولتر من كل تركيز كافية.
- إعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيق لجمع كل منتج رد فعل الخام باستخدام علامة دائمة لتسمية كل أنبوب مع عدد فريد من نوعه. تأكد من أن العدد الإجمالي لأنابيب الطرد المركزي الدقيق يطابق عدد الشروط مضروبا في عدد النسخ المتماثلة (8 × 2 = 16).
- إعداد مخزون من محلول التجميع (10 مل) يتكون من 9:1 الميثانول: مياه DI (v/v). Aliquot 50 ميكرولتر في كل من 16 أنابيب إضافية وصفت الطرد المركزي الدقيق (واحد لكل موقع رد فعل على رقاقة).
- إعداد [18F] محلول مخزون الفلورايد في أنبوب ميكروسينتريف 500 ميكرولتر عن طريق خلط [18F] فلوريد / [18O] H2O (~ 260 MBq [7 mCi]) مع 75 mM TBAHCO3 حل (56 ميكرولتر) وتمييع مع مياه DI تصل إلى 140 ميكرولتر. سيتم تحميل 8 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل موقع رد فعل (يحتوي على ~ 15 MBq [0.40 mCi] من النشاط، و 240 نانومول من TBAHCO3).
4. توليف متوازي من [18F] فاليبريد مع تركيزات السلائف المختلفة
ملاحظة: يتم تشغيل الشريحة فوق منصة تدفئة (تم بناؤها كما هو موضح سابقا13)تتكون من سخان خزفي 25 مم × 25 مم ، يتم التحكم فيه باستخدام وحدة تحكم في درجة الحرارة عند الخروج باستخدام إشارة الحرارية الداخلية للحصول على تعليقات. تم معايرة درجات حرارة سطح المدفأة باستخدام التصوير الحراري. إذا لم تتوفر مثل هذه المنصة، يمكن استخدام زوج من الأطباق الساخنة (واحدة عند 105 درجة مئوية وواحدة عند 110 درجة مئوية).
- تحميل [18F] محلول مخزون الفلورايد (مع محفز نقل المرحلة).
- باستخدام ميكروباينيت، قم بتحميل قطرة 8 ميكرولتر من محلول مخزون الفلورايد[18F] على أول بقعة تفاعل لشريحة متعددة التفاعل. قياس نشاط الرقاقة عن طريق وضعها في معايرة الجرعة وتسجيل الوقت الذي يتم فيه إجراء القياس.
- إزالة رقاقة من معايرة الجرعة ومن ثم تحميل قطرة 8 ميكرولتر من [18F] محلول الأسهم الفلوريد على بقعة رد الفعل الثاني. قياس النشاط على رقاقة عن طريق وضعه مرة أخرى في معايرة الجرعة وتسجيل الوقت الذي يتم إجراء القياس.
- كرر لجميع مواقع رد الفعل الأخرى على الشريحة.
- حساب النشاط المحمل لكل بقعة تفاعل عن طريق أخذ قياس النشاط بعد تحميل النظائر المشعة وطرح القياس السابق (تصحيح الاضمحلال) قبل تحميل ذلك الموقع.
- محاذاة رقاقة متعددة ردود الفعل على سخان.
- إضافة طبقة رقيقة من عجينة الحرارية على رأس سخان السيراميك.
- ضع الرقاقة بعناية فوق المدفأة باستخدام ملاقط لتجنب تسرب القطرات ، ومحاذاة الزاوية المرجعية للرقاقة مع الزاوية المرجعية للسخان (كما هو موضح في الشكل 3B). سوف رقاقة تخيم على سخان بكمية صغيرة.
- جفف[18F] فلوريد ومحفز نقل المرحلة.
- سخني الشريحة لمدة دقيقة واحدة عن طريق ضبط المدفأة على 105 درجة مئوية في برنامج التحكم لتتبخر القطرات إلى الجفاف تاركة بقايا مجففة من [18F] فلوريد و TBHACO3. بعد دقيقة واحدة، تبرد الشريحة عن طريق إيقاف تشغيل المدفأة و تشغيل مروحة التبريد مع برنامج التحكم.
- إضافة الحل السلائف.
- باستخدام micropipette، إضافة محلول 6 ميكرولتر من السلائف فاليبريد على رأس بقايا المجففة على موقع رد الفعل الأول.
- كرر لجميع مواقع رد الفعل الأخرى على الشريحة. استخدم خطة التحسين لتحديد تركيز سلسلة التخفيف المستخدمة لكل موقع تفاعل.
- إجراء رد فعل الفلورة.
- سخني كل رقاقة إلى 110 درجة مئوية لمدة 7 دقائق باستخدام برنامج التحكم لأداء تفاعل الفلوروينيشن الراديوي. بعد ذلك، تبريد رقاقة عن طريق إيقاف تشغيل سخان وتحول على مروحة التبريد مع برنامج التحكم.
- جمع المنتجات الخام من مواقع رد الفعل.
- جمع المنتج الخام في موقع رد الفعل الأول عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من حل جمع من أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعينة عبر micropipette. بعد انتظار 5 ق، استخدم micropipette (مع نفس الطرف المثبتة) لتنشق المنتج الخام المخفف ونقلها إلى أنبوب الطرد الدقيق جمع المسمى المقابلة لها.
- كرر هذه العملية ما مجموعه 4 مرات باستخدام نفس تلميح ماصة لجميع العمليات.
- كرر عملية جمع لجميع مواقع رد الفعل الأخرى على رقاقة.
5. تحليل توليف لتحديد أداء رد الفعل والظروف المثلى
- تحديد "كفاءة جمع" لرد الفعل الأول على رقاقة.
- ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع المنتج الخام المجمع من نقطة التفاعل الأولى في معايرة الجرعة لقياس النشاط. تسجيل قياس ووقت القياس.
- حساب كفاءة التحصيل عن طريق تقسيم نشاط المنتج الخام المجمع حسب نشاط البدء الذي تم قياسه لنفس موقع التفاعل (تصحيح قيم النشاط إلى نفس النقطة الزمنية).
- كرر لجميع مواقع رد الفعل الأخرى على الشريحة.
- تحليل تركيبة (كفاءة الفلورة) لكل منتج من المنتجات الخام التي تم جمعها.
ملاحظة: لجعل عملية تحليل جميع العينات في وقت قصير، يتم تحليل كفاءة الفلورة باستخدام وصفها سابقا عالية الإنتاجية طبقة رقيقة الراديو الكروماتوغرافيا (راديو TLC) نهج14. تسمح هذه التقنية بمعالجة ما يصل إلى ثماني عينات بالتوازي عن طريق اكتشاف ثم جنبا إلى جنب (5 مم الملعب، 0.5 ميكرولتر لكل بقعة) على لوحة TLC واحدة، ثم تطوير معا، وأداء قراءات معا باستخدام التصوير سيرينكوف14،15. على سبيل المثال الأمثل مع 16 ردود الفعل الموازية ، وهناك حاجة إلى 2 لوحات TLC. وثمة خيار آخر هو استخدام التصوير اللوني السائل عالي الأداء الراديوي (راديو HPLC) للتحليل، على الرغم من أن وقت الفصل والتنظيف والاعتدال قد يحد من عدد العينات التي يمكن تحليلها.- لكل لوحة TLC (50 ملم × 60 ملم)، مع قلم رصاص، رسم خط في 15 ملم بعيدا عن حافة واحدة 50 ملم (أسفل)، وخط آخر 50 ملم بعيدا عن الحافة نفسها. السطر الأول هو خط الأصل؛ أما السطر الأول فهو خط الأصل. والثاني هو خط الجبهة المذيبات. رسم 8 صغيرة "X" ق على طول خط المنشأ في تباعد 5 ملم لتحديد موقف اكتشاف العينة لكل من 8 "الممرات".
- باستخدام ميكروبايت، نقل 0.5 ميكرولتر من أول منتج الخام على لوحة TLC في "X" للممر الأول. كرر للحصول على منتجات النفط الخام إضافية (تصل إلى 8 لكل لوحة TLC). انتظر حتى تجف بقع المنتج الخام على لوحة TLC.
- لكل لوحة TLC، وتطوير باستخدام مرحلة متنقلة من 60٪ MeCN في 25 MM NH4HCO2 مع 1٪ TEA (v/v) حتى الجبهة المذيبات تصل إلى خط الجبهة المذيبات. انتظر حتى يجف المذيب على لوحة TLC ثم يغطى بشريحة مجهر زجاجي (76.2 مم × 50.8 مم، سمك 1 مم).
- الحصول على صورة النشاط الإشعاعي لكل لوحة TLC عن طريق وضع لوحة في نظام التصوير Cerenkov لمدة 5 دقائق التعرض. إجراء تصحيحات الصورة القياسية (الطرح الحالي الداكن وتصحيح الحقل المسطح والتصفية المتوسطة وطرح الخلفية).
- استخدام تحليل منطقة الاهتمام (ROI) للممر الأول من لوحة TLC الأولى. رسم المناطق حول كل نطاق مرئية في حارة. وسيحسب البرنامج جزء من الكثافة المتكاملة لكل منطقة (نطاق) مقارنة بالكثافة المتكاملة الإجمالية لجميع المناطق (النطاقات).
- مع هذه المرحلة المتنقلة، من المتوقع أن النطاقات التالية في عوامل الاحتفاظ المشار إليها: Rf = 0.0: غير منقحة [18F] فلوريد; Rf = 0.9: [18F] fallypride; Rf = 0.94: المنتج الجانبي. تحديد كفاءة الفلورة كجزء من النشاط في نطاق[18F]fallypride.
- كرر هذا التحليل لجميع الممرات الأخرى على جميع لوحات TLC.
ملاحظة: إذا كانت غرفة التصوير Cerenkov غير متوفرة، يمكن استخدام صغير (قبل السريرية) في نظام التصوير البصري في الجسم الحي لتصوير لوحات TLC. بدلا من ذلك، يمكن استخدام ماسح ضوئي TLC ثنائي الأبعاد. بدلا من ذلك ، إذا كان فقط 1 الأبعاد TLC الماسح الضوئي المتاحة ، لوحات TLC يمكن تحليلها عن طريق قطع إلى شرائح مع مقص (1 لكل حارة) ، ومسح كل قطاع على حدة.
- تحديد العائد الكيميائي الإشعاعي الخام (RCY الخام) لكل موقع رد فعل.
- تحديد RCY الخام للمنتج الخام الأول عن طريق ضرب كفاءة جمع بكفاءة الفلورة.
- كرر لجميع مواقع رد الفعل الأخرى.
- تحليل النتائج
- تجميع القيم لأي تجارب النسخ المتماثل في انحراف متوسط ومعياري.
- رسم كفاءة جمع، وكفاءة الفلور، وRCY الخام كدالة للمعلمة التي كانت متنوعة (تركيز السلائف في هذا المثال).
- حدد الظروف المثلى بناء على المعايير المطلوبة. عادة، هذا هو الحد الأقصى الخام RCY. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما يتم اختيار النقطة في منطقة حيث يكون منحدر الرسم البياني مسطحا نسبيا، مما يشير إلى أنه غير حساس للتغييرات الصغيرة في المعلمة، مما يوفر بروتوكولا أكثر قوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء تجربة تمثيلية لتوضيح هذه الطريقة. باستخدام 16 ردود الفعل، أجريت دراسات التحسين من المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية [18F]fallypride بتركيز السلائف متفاوتة (77، 39، 19، 9.6، 4.8، 2.4، 1.2، و 0.6 mM) في الكحول الثيل: MeCN (1:1، v/v) كما رد فعل المذيبات. تم إجراء ردود الفعل في 110 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. يتم جدولة كفاءة جمع وتكوين العينة (أي نسب من [18F] fallypride المنتج ، غير منقحة [18F ] الفلوريد ، والمنتج الجانبي) في الجدول 1 ويتم تلخيصها بيانيا في الشكل 4.
وأظهرت الدراسة أن كفاءة الفلور(نسبة [ 18F] فاليبريد) تزداد مع زيادة تركيز السلائف، وأن المتبقية غير المنقحة [18F] الفلوريد تختلف عكسيا (الشكل 4A). وكانت هناك كمية صغيرة من منتج جانبي مشع بتركيزات سلائف منخفضة، ولكن النسبة انخفضت إلى ما يقرب من الصفر عند تركيزات السلائف الأعلى(الشكل 4 ألف). وكانت كفاءة الجمع كمية تقريبا بالنسبة لمعظم الظروف، وإن كانت قد انخفضت انخفاضا طفيفا بتركيزات السلائف المنخفضة.
من هذه النتائج، يمكن تحقيق أعلى RCY مع ~ 230 نانومول من السلائف (أي تركيز 39 mM في قطرة 6 ميكرولتر). وفي هذه الحالة، كانت كفاءة الفلورة 96.0 ± 0.5 في المائة (ن= 2) وكان سعر كلور البنزين الخام 87.0 ± 2.7 (ن= 2)، ولم يلاحظ وجود تكوين للمنتجات الجانبية المشعة. وفي حين أن استخدام سلائف 77 مليون متر في المتر أظهرت نتائج مماثلة، فمن المستصوب عموما استخدام كمية أقل من السلائف لخفض التكلفة وتبسيط خطوات تنقية المصب.
الشكل 1: تصنيع رقائق ميكرودروبليت متعددة ردود الفعل عبر التصوير الضوئي. (أ) صورة لشريحة ميكرودروبليت متعددة ردود الفعل مع 4 × 4 مجموعة من مواقع التفاعل. تتكون الشريحة من السيليكون المغلف بالبوليتيترافلوروإيثيلين مع مناطق دائرية من البوليتيترافلوروإيثيلين المحفورة بعيدا لإنشاء مواقع التفاعل الهيدروفيلي. (ب) تخطيطي لإجراء التصنيع. رقاقة السيليكون هي تدور المغلفة مع حل تفلون وخبز لترسيخ الطلاء. بعد ذلك ، يتم طلاء جهاز التصوير الضوئي ومنقوش عبر التصوير الضوئي لإنتاج قناع الحفر. تم تطوير جهاز التصوير الضوئي مع محلول تطوير ناسخ ضوئي. ثم تتم إزالة تفلون المكشوفة عن طريق النقش الجاف مع بلازما الأكسجين. يتم تقسيم الرقاقة إلى رقائق فردية ، ويتم تجريدها من وازالة الضوئيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراء ردود الفعل المتوازية. إجراء تجريبي لأداء 16 قشطه متوازية من المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية [18F] fallypride على رقاقة متعددة التفاعل. في هذا المثال، يختلف تركيز السلائف لكل رد فعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خريطة الظروف في مواقع التفاعل. (أ) تصميم تجريبي لاستكشاف تأثير تركيز السلائف على الفلوروريشن من فاليبريد تسيل باستخدام رقاقة واحدة 16 رد فعل (أعلى عرض). تم استكشاف ثمانية تركيزات مختلفة، كل منها مع n = 2 يكرر. وعقدت ظروف رد فعل أخرى ثابتة (درجة الحرارة: 110 درجة مئوية; الوقت: 7 دقيقة; المذيبات: الكحول الثيكسيل:MeCN; كمية TBAHCO3: 240 نامول). تم تنفيذ كل رد فعل مع ~ 14 MBq من النشاط. (ب) صورة لشريحة 16 رد فعل مثبتة على منصة سخان خلال التجربة. تمثل الخطوط الحمراء الزاوية المرجعية للشريحة المستخدمة للمحاذاة مع الزاوية المرجعية للسخان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:تأثير تركيز السلائف على تركيب الميكروبوليت ل [18F] fallypride. (A) نسبة الأنواع المشعة الموجودة في منتج التفاعل الخام المجمع، أي [18F] fallypride، المنتج الجانبي، أو غير المتفاعلة [18F] فلوريد. (ب) الأداء التوليفي. يتم رسم كفاءة جمع وكفاءة الفلورة، والخام RCY كدالة لتركيز السلائف. في كلا الرسمين البيانيين، تمثل نقاط البيانات متوسط النسخ المتماثلة n=2، وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حفلة السلائف (mM) | كفاءة التحصيل (٪) | كفاءة الفلور (٪) | الخام RCY (٪) | الفلوريد [18F] غير المتفاعل (٪) | المنتج الجانبي (٪) |
| 77 | 91.8 ± 2.1 | 96.7 ± 2.0 | 88.8 ± 3.9 | 3.3 ± 2.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 39 | 90.6 ± 2.4 | 96.0 ± 0.5 | 87.0 ± 2.7 | 4.0 ± 0.5 | 0.0 ± 0.0 |
| 19 | 91.1 ± 0.5 | 81.1 ± 0.3 | 73.9 ± 0.7 | 8.4 ± 1.2 | 10.5 ± 2.0 |
| 9.6 | 90.9 ± 0.6 | 62.7 ± 0.9 | 57.0 ± 0.5 | 23.3 ± 2.1 | 14.0 ± 0.9 |
| 4.8 | 88.4 ± 0.8 | 37.0 ± 1.5 | 32.8 ± 1.6 | 47.3 ± 0.8 | 15.7 ± 1.0 |
| 2.4 | 87.6 ± 2.0 | 21.0 ± 2.1 | 18.4 ± 2.2 | 67.4 ± 2.1 | 11.6 ± 1.0 |
| 1.2 | 82.3 ± 1.6 | 12.7 ± 0.3 | 10.4 ± 0.1 | 72.8 ± 0.7 | 14.5 ± 1.0 |
| 0.6 | 81.2 ± 3.7 | 6.3 ± 0.8 | 5.1 ± 0.5 | 84.3 ± 0.2 | 9.4 ± 1.0 |
الجدول 1: البيانات المستقاة من دراسة تركيز السلائف. كافة القيم هي متوسطات ± الانحرافات المعيارية المحسوبة من نسخ n=2 المتماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظرا للقيود المفروضة على أنظمة الكيمياء الراديوية التقليدية التي تسمح فقط واحد أو عدد قليل من ردود الفعل يوميا وتستهلك كمية كبيرة من الكواشف لكل نقطة بيانات، يمكن استكشاف جزء صغير فقط من مساحة المعلمة رد الفعل العام في الممارسة العملية، ويتم الإبلاغ عن النتائج مرات عديدة مع عدم تكرار (ن = 1). وبالمقارنة مع النظم التقليدية، فإن منصة التمثيل الإشعاعي المتعددة التفاعلات تجعل من العملي إنجاز دراسات أكثر شمولا وصرامة لظروف التمثيل الإشعاعي مع استهلاك القليل جدا من الوقت وكمية السلائف، مما قد يمكن من رؤية جديدة بشأن المعلمات التي تؤثر على إنتاج المنتج وتكوين المنتجات الجانبية. يمكن استخدام المعلومات لاختيار الشروط التي تؤدي إلى أعلى إنتاج المنتج أو التوليف أقوى. وقد يكون انخفاض استهلاك السلائف مفيدا بصفة خاصة في التطوير المبكر للمتتبعين الإشعاعيين متى لم تتوفر سوى كمية صغيرة من السلائف أو عندما تكون السلائف باهظة الثمن. في حين أن الطبيعة المفتوحة للرقائق تساهم في وقت التوليف السريع وسهولة الوصول عبر ماصة ، فإنه يمكن أن يؤدي إلى خسائر كبيرة من الجزيئات المتطايرة وقد لا يكون عمليا عند تحسين توليف الأدوية الإشعاعية التي تحتوي على سلائف أو وسيطات أو منتجات متقلبة.
ونظرا لخطر التعرض للإشعاع، ينبغي التأكيد مجددا على أن هذه التجارب ينبغي ألا تجرى إلا بالتدريب والموافقات المناسبة، وأن تجرى خلف التدريع الإشعاعي، ويفضل أن تجرى في خلية ساخنة مهوية التهوية. ونظرا لقصر عمر النظائر المشعة، من المهم إجراء التجارب بسرعة وكفاءة. وينبغي ممارسة كواشف الأنابيب إلى الشريحة وجمع المنتجات من الشريحة في ظل ظروف غير مشعة لتصبح مألوفة مع انخفاض الوصول والرؤية في خلية ساخنة. وبالمثل، ينبغي أيضا تثبيت وإزالة رقاقة، وإجراء قياسات للرقاقة مع معايرة الجرعة أن تمارس. بالإضافة إلى ذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم تنظيمها ، مع خريطة تجربة مفصلة (أي ظروف رد فعل محددة في كل موقع على الشريحة). ومن المفيد أيضا إعداد جدول مسبق للنتائج التي يتعين ملؤها عند إجراء القياسات. ولضمان إمكانية إعادة الإنتاج، ولا سيما مع احتمال وقوع خطأ بشري، ينبغي إجراء نسخ متماثلة متعددة لكل مجموعة من الشروط. من المهم أن نكون حذرين بشكل خاص خلال خطوة جمع عينات الخام من الشريحة لتجنب تسرب السائل خارج موقع التفاعل والتسبب في التلوث المتبادل مع مواقع التفاعل المجاورة. إذا لاحظت أي أخطاء، فمن المهم وضع علامة على مواقع التفاعل هذه بحيث يمكن استبعاد البيانات من التحليل النهائي.
في هذه الدراسة المثال, وكان كمية السلائف المستهلكة ل16 نقاط البيانات 1.1 ملغ (~ 70 ميكروغرام لكل منهما), مقارنة مع 4 ملغ لكل نقطة بيانات باستخدام مطهر الراديو التقليدية. وعلاوة على ذلك، تم الانتهاء من جميع ردود الفعل 16 في 25 دقيقة كل ذلك في تجربة واحدة. وبالمقارنة، فإن تركيب الخام [18F] fallypride على مطهر راديوي تقليدي يتطلب ~ 15-20 دقيقة لكل رد فعل16،17.
أظهرت هذه التجربة التمثيلية فائدة رقاقة ميكرودروبليت متعددة التفاعل مع 16 رد فعل لتحسين الظروف والإعجاب بالتمثيل الإشعاعي للمستحضرات الصيدلانية الإشعاعية [18F] fallypride من خلال استكشاف 8 تركيزات سلائف مختلفة (n = 2 يكرر لكل حالة) بطريقة سريعة واقتصادية. المتغيرات الأخرى التي يمكن تحسينها بشكل ملائم باستخدام رقاقة متعددة التفاعل تشمل كمية النشاط الإشعاعي ، ونوع محفز نقل المرحلة ، وكمية محفز نقل المرحلة ، وظروف التبخر / التجفيف (على سبيل المثال ، عدد خطوات التجفيف azeotropic) ، ومذيب التفاعل ، وما إلى ذلك. باستخدام رقائق متعددة ردود الفعل المتعددة، فمن الممكن أيضا لاستكشاف تأثير درجة حرارة رد الفعل ووقت رد الفعل، بالإضافة إلى ظروف مثل درجة حرارة التبخر / التجفيف والوقت. وينبغي إجراء هذه الدراسات بالتتابع باستخدام المدفأة المفردة أو يمكن موازاتها بتشغيل سخانات متعددة في نفس الوقت.
وقد ثبت أن طريقة توليف القطيرات الأساسية متوافقة مع مجموعة واسعة من 18صيدلية مشعة تحمل علامة F، مثل [18F] fallypride10، [18F] FET18، [18F] FDOPA19، [18F] FBB20 ويمكن استخدامه لتحسين غالبية المركبات والمركبات الأخرى ذات العلامات F ال 18المسماة مع النظائر الأخرى. وعلاوة على ذلك، فإن ردود الفعل القائمة على القطيرات المحسنة الناتجة عن ذلك تستفيد في جوهرها من مزايا الكيمياء الإشعاعية microvolume، بما في ذلك انخفاض استهلاك السلائف، وأوقات عملية أسرع، والأجهزة المدمجة، ويمكن أن توفر هذه المزايا نفسها للإنتاج الروتيني للدفعات الكبيرة. دفعات أكبر تتطلب ببساطة زيادة مقدار النشاط تحميلها في البداية في بداية رد الفعل. لإعداد متتبع مناسب للاستخدام في المختبر أو في المقايسات الحية ، يجب تنقية المنتج الخام (على سبيل المثال ، باستخدام HPLC التحليلي) وصياغته (على سبيل المثال عن طريق تبادل المذيبات التبخرية أو الصلبة المرحلة21)بدلا من ذلك ، قد يكون من الممكن تكييف الظروف المثلى من مقياس القطيرات إلى المزيل الإشعاعي التقليدي القائم على القارورة. ولا يزال التحقيق جاريا في هذا الاحتمال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد رخص الحكام من جامعة كاليفورنيا التكنولوجيا لشركة صوفي، التي اخترعها الدكتور فان دام، واتخذت الإنصاف في شركة صوفي كجزء من صفقة الترخيص. الدكتور فان دام هو مؤسس ومستشار لشركة صوفي ولا يعلن المؤلفون الباقون عن أي تضارب في المصالح. وقد دعم هذا العمل جزئيا المعهد الوطني للسرطان (R33 240201).
Acknowledgments
نشكر مرفق سيكلوترون الطبي الحيوي في جامعة كاليفورنيا والدكتور روجر سلافيك والدكتور جوزيبي كارلوتشي على توفير[18F] فلوريد لهذه الدراسات وNanoLab جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس لدعمها مع معدات لتصنيع الرقائق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
