Summary
Deze methode beschrijft het gebruik van een nieuwe high-throughput methodologie, gebaseerd op druppelchemische reacties, voor de snelle en economische optimalisatie van radiofarmaceutica met nanomole hoeveelheden reagentia.
Abstract
De huidige geautomatiseerde radiosynthesizers zijn ontworpen om grote klinische partijen radiofarmaceutica te produceren. Ze zijn niet geschikt voor reactieoptimalisatie of nieuwe radiofarmaceutische ontwikkeling, omdat elk gegevenspunt een aanzienlijk reagensverbruik met zich meebrengt en besmetting van het apparaat tijd vereist voor radioactief verval vóór het volgende gebruik. Om deze beperkingen aan te pakken, werd een platform ontwikkeld voor het parallel uitvoeren van arrays van miniatuur reacties op basis van druppels, elk opgesloten in een oppervlaktespanningsval op een met polytetrafluorethyleen bedekte silicium "chip". Deze chips maken snelle en gemakkelijke studies van reactieparameters mogelijk, waaronder reagensconcentraties, reactieoplosmiddel, reactietemperatuur en -tijd. Dit platform maakt het mogelijk om honderden reacties in een paar dagen te voltooien met een minimaal reagensverbruik, in plaats van maanden te nemen met behulp van een conventionele radiosynthesizer.
Introduction
Positron-emissie tomografie (PET) radiofarmaceutica worden veel gebruikt als onderzoeksinstrumenten om specifieke in vivo biochemische processen te monitoren en ziekten te bestuderen, en voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en therapieën. Bovendien is PET een cruciaal hulpmiddel voor het diagnosticeren of ensceneren van ziekten en het monitoren van de respons van een patiënt op therapie1,2,3. Vanwege de korte halfwaardetijd van PET-radio-isotopen (bijv. 110 minuten voor fluor-18-gelabelde radiofarmaceutica) en stralingsgevaar, worden deze verbindingen bereid met behulp van gespecialiseerde geautomatiseerde systemen die achter stralingsafscherming werken en moeten ze vlak voor gebruik worden voorbereid.
De huidige systemen die worden gebruikt om radiofarmaceutica te synthetiseren, zijn ontworpen om grote batches te produceren die zijn verdeeld in veel individuele doses om de productiekosten te delen. Hoewel de huidige systemen geschikt zijn voor de productie van veelgebruikte radiotracers zoals [18F]FDG (omdat meerdere patiëntscans en onderzoeksexperimenten in één dag kunnen worden gepland), kunnen deze systemen verspillend zijn voor de productie van nieuwe radiotracers tijdens de vroege ontwikkeling, of minder vaak gebruikte radiotracers. Volumes die conventionele systemen gebruiken, bevinden zich meestal in het bereik van 1-5 ml en de reacties vereisen precursorhoeveelheden in het bereik van 1-10 mg. Bovendien is het gebruik van conventionele radiosynthesizers over het algemeen omslachtig tijdens optimalisatiestudies, omdat het apparaat na gebruik besmet raakt en de gebruiker moet wachten tot de radioactiviteit vergaat voordat het volgende experiment wordt uitgevoerd. Afgezien van de kosten van apparatuur kunnen de kosten van radio-isotoop en reagentia daarom zeer aanzienlijk worden voor studies die de productie van meerdere partijen vereisen. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren tijdens de optimalisatie van syntheseprotocollen voor nieuwe radiotracers om voldoende opbrengst en betrouwbaarheid te bereiken voor initiële in vivo beeldvormingsstudies.
Microfluïdische technologieën worden in de radiochemie steeds vaker gebruikt om te profiteren van verschillende voordelen ten opzichte van conventionele systemen4,5,6. Microfluïdische platforms, waaronder die gebaseerd op 1-10 μL-reactievolumes7,8,9, hebben een significante vermindering van reagensvolumes en consumptie van dure precursoren aangetoond, evenals korte reactietijden. Deze verlagingen leiden tot lagere kosten, snellere verwarmings - en verdampingsstappen, kortere en eenvoudigere downstreamzuivering, een algeheel "groener" chemieproces10, en een hogere molaire activiteit van de geproduceerde radiotracers11. Deze verbeteringen maken het praktischer om uitgebreidere optimalisatiestudies uit te voeren door de reagenskosten van elke synthese te verlagen. Verdere voordelen kunnen worden bereikt door meerdere experimenten uit te voeren vanuit één batch radio-isotoop op één dag. Microfluïdische stroomchemieradiosynthesizers die in de "detectiemodus" werken, kunnen bijvoorbeeld opeenvolgend tientallen reacties uitvoeren, elk met slechts 10s μL-reactievolume12.
Geïnspireerd door deze voordelen werd een multi-reaction droplet array chip ontwikkeld waarbij microvolumereacties beperkt blijven tot een array van oppervlaktespanningsvallen op een siliciumoppervlak, gemaakt met behulp van een Teflon-coating met patroon. Deze chips maken het mogelijk om meerdere reacties op de schaal van 1-20 μL tegelijkertijd uit te voeren, waardoor de mogelijkheid wordt geopend om 10s verschillende reactieomstandigheden per dag te verkennen, elk met meerdere replica's. In dit artikel wordt het nut van deze nieuwe high-throughput aanpak voor het uitvoeren van snelle en goedkope radiochemie optimalisaties aangetoond. Het gebruik van druppelchips met meerdere reacties maakt een gemakkelijke verkenning van de impact van reagensconcentraties en reactieoplosmiddel mogelijk, en het gebruik van meerdere chips kan de studie van reactietemperatuur en -tijd mogelijk maken, terwijl zeer lage hoeveelheden precursor worden verbruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Dit protocol omvat de behandeling van radioactieve stoffen. Experimenten mogen niet worden uitgevoerd zonder de nodige training en persoonlijke beschermingsmiddelen en goedkeuring van het stralingsveiligheidsbureau van uw organisatie. Experimenten moeten worden uitgevoerd achter stralingsafscherming, bij voorkeur in een geventileerde hete cel
1. Fabricage van multi-reactie chips
OPMERKING: Partijen multi-reaction microdroplet chips worden vervaardigd uit 4" silicium wafers met behulp van standaard fotolithografie technieken, zoals eerder beschreven10 (Figuur 1). Deze procedure produceert elk 7 chips met 4 x 4 array van reactieplaatsen.
- Plaats de siliconen wafer op de spin-coater chuck en zorg ervoor dat deze gecentreerd is. Deponeer 3 ml polytetrafluorethyleenoplossing in het midden van de wafer met een transferpipet en een laagwafel bij een 1000 tpm gedurende 30 s (500 tpm/s helling).
- Om de coating te stollen, plaatst u de wafer gedurende 10 minuten op een kookplaat van 160 °C en gaat u vervolgens gedurende 10 minuten over op een kookplaat van 245 °C.
- Gloei de coating in een oven op hoge temperatuur bij 340 °C gedurende 3,5 uur onder stikstofatmosfeer, gevolgd door koeling tot 70 °C bij een helling van 10 °C/min.
- Plaats de siliconen wafer op de spin-coater chuck en zorg ervoor dat deze gecentreerd is. Giet 2 ml positieve fotoresist in het midden van de wafer met behulp van een transferpipet en voer vervolgens een coating uit bij 3000 tpm gedurende 30 s (1000 tpm/s helling).
- Verstevig de fotoresist door het wafeltje gedurende 3 minuten zacht te bakken op een kookplaat van 115 °C.
- Installeer de wafer en het fotomasker in een maskeruitlijner en voer een belichting van 14 s uit bij een lampintensiteit van 12 mW/cm2 en een golflengte van 356 nm in de hardcontactmodus. Deze stap maakt gebruik van een transparantiemasker met het negatieve uiteindelijke polytetrafluorethyleenpatroon, d.w.z. een patroon met een diameter van 4" van 4 kopieën van de 16-reactiechip, met reactieplaatsen transparant en alle andere regio's in ondoorzichtige kleur.
- Dompel de wafer onder met 20 ml fotoresistische ontwikkelaarsoplossing in een glazen container gedurende 3 minuten met lichte agitatie om het blootgestelde patroon te ontwikkelen.
- Spoel de ontwikkelende oplossing weg door de wafer gedurende 3 minuten met lichte agitatie onder te dompelen in een glazen container met 20 ml DI-water. Droog de wafel met een stikstofpistool.
- Verwijder de blootgestelde polytetrafluorethyleengebieden via reactive-ion ets (RIE) met zuurstofplasma onder de volgende omstandigheden: 30 s blootstelling, 100 mTorr druk, 200 W vermogen en 50 sccm zuurstofstroom.
- Snijd de wafer in afzonderlijke chips (7 totaal per wafer) met behulp van een silicium wafer cutter.
- Dompel elke chip 1 minuut onder in aceton om de fotoresist te verwijderen en vervolgens 1 minuut isopropanol. Droog ten slotte elke chip met een stikstofpistool.
- Plaats droge chips in een glazen container en dek af met aluminiumfolie voor opslag tot gebruik.
2. Planning van de optimalisatiestudie
OPMERKING: In dit protocol wordt de synthese van de radiofarmaceutisch [18F]fallypride gebruikt als voorbeeld om optimalisatie met hoge doorvoer te illustreren (Figuur 2). Met een enkele chip kunnen 16 gelijktijdige reacties worden uitgevoerd, bijvoorbeeld met een gevarieerde voorloperconcentratie (8 verschillende concentraties, n = 2 repliceert elk). De omstandigheden worden in figuur 3Ain kaart gebracht op reactieplaatsen . Dit protocol kan worden aangepast om andere reactieparameters (bijv. reactieoplosmiddel, reactievolume, hoeveelheid TBAHCO3,enz.) of andere radiofarmaceutica te optimaliseren.
- Selecteer de te variëren reactieparameter(s), de te gebruiken specifieke waarden en het aantal repliceren.
- Bereken het aantal chips dat nodig is om het experiment uit te voeren.
- Maak voor elke chip een kaart van welke reactieomstandigheden op elke reactieplaats zullen worden gebruikt om te helpen bij de voorbereiding van reagentia en het uitvoeren van de druppelreacties.
3. Bereiding van reagentia en materialen voor het optimaliseren van de radiosynthese van [18F]fallypride
OPMERKING: De op druppels gebaseerde radiosynthese van [18F]fallypride (figuur 2) begint met de toevoeging van [18F]fluoride en faseoverdrachtskatalysator (TBAHCO3) aan de reactieplaats, gevolgd door verwarming om water te verdampen en een gedroogd residu achter te laten. Vervolgens wordt een druppel precursor (tosyl-fallypride) in reactieoplosmiddel (thexylalcohol en acetonitril) toegevoegd en verwarmd om de radiofluorinatiereactie uit te voeren. Ten slotte wordt het ruwe product uit de chip verzameld voor analyse. De voorbereidings- en syntheseprocedures voor reagentia moeten worden aangepast bij het uitvoeren van optimalisatie van een andere tracer.
- Bereid een stamoplossing van het reactiemiddel, bestaande uit thexylalcohol en acetonitril in een mengsel van 1:1 per volume. Zorg ervoor dat het volume voldoende is om de geplande verdunningsreeks te maken. In dit voorbeeld is optimalisatie van ~30 μL voldoende.
- Bereid een 30 μL stamoplossing van precursor (tosyl-fallypride) in het reactieoplosmiddel met de maximaal te onderzoeken concentratie (77 mM). Zorg ervoor dat het volume voldoende is om het geplande experiment uit te voeren. In dit voorbeeld is optimalisatie van ~30 μL voldoende.
- Voer vanuit de precursorvoorraadoplossing en het reactieoplosmiddel 2x seriële verdunningen uit om de verschillende concentraties van de precursoroplossing te bereiden. Zorg ervoor dat het volume van elke verdunning voldoende is om het gewenste aantal duplo's voor elke toestand uit te voeren. In dit voorbeeld is optimalisatie van ~15 μL van elke concentratie voldoende.
- Bereid microcentrifugebuizen voor om elk ruw reactieproduct te verzamelen met behulp van een permanente marker om elke buis met een uniek nummer te labelen. Zorg ervoor dat het totale aantal microcentrifugebuizen overeenkomt met het aantal omstandigheden vermenigvuldigd met het aantal replica's (8 x 2 = 16).
- Bereid een voorraad opvangoplossing (10 ml) voor die bestaat uit 9:1 methanol:DI-water (v/v). Aliquot 50 μL in elk van de 16 extra gelabelde microcentrifugebuizen (één per reactieplaats op de chip).
- Bereid een[18F]fluoridevoorraadoplossing in een microcentrifugebuis van 500 μL door [18F]fluoride/[18O]H2O (~260 MBq [7 mCi]) te mengen met 75 mM TBAHCO3-oplossing (56 μL) en te verdunnen met DI-water tot 140 μL. 8 μL van deze oplossing wordt op elke reactieplaats geladen (met ~15 MBq [0,40 mCi] activiteit en 240 nmol TBAHCO3).
4. Parallelle synthese van [18F]fallypride met verschillende precursorconcentraties
OPMERKING: De chip wordt bediend bovenop een verwarmingsplatform (gebouwd zoals eerder beschreven13)bestaande uit een keramische kachel van 25 mm x 25 mm, bestuurd met behulp van een aan-uit temperatuurregelaar met behulp van het interne thermokoppelsignaal voor feedback. De oppervlaktetemperaturen van de kachel werden gekalibreerd met behulp van thermische beeldvorming. Als een dergelijk platform niet beschikbaar is, kan een paar kookplaten worden gebruikt (één bij 105 °C en één bij 110 °C).
- Belasting [18F]fluoride stamoplossing (met faseoverdracht katalysator).
- Laad met behulp van een micropipet een druppel van 8 μL [18F]fluoridevoorraadoplossing op de eerste reactievlek van een chip met meerdere reacties. Meet de activiteit van de chip door deze in een dosiskalibrator te plaatsen en noteer het tijdstip waarop de meting wordt uitgevoerd.
- Verwijder de chip uit de dosiskalibrator en laad vervolgens een druppel van 8 μL [18F]fluoridevoorraadoplossing op de tweede reactievlek. Meet de activiteit op de chip door deze opnieuw in de dosiskalibrator te plaatsen en noteer het tijdstip waarop de meting wordt uitgevoerd.
- Herhaal dit voor alle andere reactieplaatsen op de chip.
- Bereken de activiteit die per reactievlek is geladen door de activiteitsmeting uit te voeren na het laden van de radio-isotoop en de vorige meting af te trekken (verval gecorrigeerd) voordat die locatie werd geladen.
- Lijn de multi-reactie chip op de kachel uit.
- Voeg een dun laagje thermische pasta toe bovenop de keramische kachel.
- Plaats de chip voorzichtig op de kachel met een pincet om het morsen van de druppels te voorkomen, waarbij de referentiehoek van de chip wordt uitgelijnd met de referentiehoek van de kachel (zoals weergegeven in figuur 3B). De chip zal de kachel met een kleine hoeveelheid overhangen.
- Droog de katalysator voor fluoride en faseoverdracht [18F]..
- Verwarm de chip gedurende 1 min door de kachel in het controleprogramma op 105 °C te zetten om de druppels te verdampen tot droogheid, waardoor een gedroogd residu van [18F]fluoride en TBHACO3overblijft. Koel na 1 minuut de chip af door de kachel uit te schakelen en de koelventilator in te schakelen met het besturingsprogramma.
- Voeg de voorloperoplossing toe.
- Voeg met behulp van een micropipet een 6 μL-oplossing van fallyprideprecursor toe bovenop het gedroogde residu op de eerste reactieplaats.
- Herhaal dit voor alle andere reactieplaatsen op de chip. Gebruik het optimalisatieplan om te bepalen welke concentratie van de verdunningsreeks voor elke reactieplaats wordt gebruikt.
- Voer een fluorinatiereactie uit.
- Verwarm elke chip gedurende 7 minuten tot 110 °C met behulp van het controleprogramma om een radiofluorinatiereactie uit te voeren. Koel daarna de chip af door de kachel uit te schakelen en de koelventilator in te schakelen met het besturingsprogramma.
- Verzamel de ruwe producten van de reactieplaatsen.
- Verzamel het ruwe product op de eerste reactieplaats door 10 μL opvangoplossing toe te voegen uit de aangewezen microcentrifugebuis via micropipet. Gebruik na 5 s wachten de micropipet (met dezelfde tip geïnstalleerd) om het verdunde ruwe product te aspireren en over te brengen naar de bijbehorende gelabelde verzamelmicrocentrifugebuis.
- Herhaal dit proces in totaal 4 keer met dezelfde pipettip voor alle bewerkingen.
- Herhaal het inzamelingsproces voor alle andere reactieplaatsen op de chip.
5. Syntheseanalyse om reactieprestaties en optimale omstandigheden te bepalen
- Bepaal de "opvangefficiëntie" voor de eerste reactie op de chip.
- Plaats de microcentrifugebuis met het verzamelde ruwe product van de eerste reactievlek in de dosiskalibrator om de activiteit te meten. Noteer de meting en het tijdstip van de meting.
- Bereken de inzamelingsefficiëntie door de activiteit van het verzamelde ruwe product te delen door de startactiviteit gemeten voor dezelfde reactieplaats (vervalcorrigering van de activiteitswaarden tot hetzelfde tijdspunt).
- Herhaal dit voor alle andere reactieplaatsen op de chip.
- Analyseer de samenstelling (fluorinatie-efficiëntie) van elk verzameld ruw product.
OPMERKING: Om de analyse van alle monsters in korte tijd praktisch te maken, wordt de fluorinatie-efficiëntie geanalyseerd met behulp van een eerder beschreven high-throughput radiodunne laagchromatografie (radio-TLC) benadering14. Met deze techniek kunnen maximaal acht monsters parallel worden verwerkt door vervolgens naast elkaar (5 mm pitch, 0,5 μL per spot) op één TLC-plaat te spotten, vervolgens samen te ontwikkelen en samen uit te lezen met Cerenkov imaging14,15. Voor de voorbeeldoptimalisatie met 16 parallelle reacties zijn 2 TLC-platen nodig. Een andere optie is om radio-high-performance vloeistofchromatografie (radio-HPLC) te gebruiken voor analyse, hoewel de tijd voor scheiding, reiniging en equilibratie het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd kan beperken.- Teken voor elke TLC-plaat (50 mm x 60 mm) met een potlood een lijn op 15 mm afstand van een rand van 50 mm (onder) en een andere lijn op 50 mm afstand van dezelfde rand. De eerste regel is de oorsprongslijn; de tweede is de oplosmiddel frontlinie. Teken 8 kleine "X"s langs de oorsprongslijn op een afstand van 5 mm om de monsterspotpositie voor elk van de 8 "rijstroken" te definiëren.
- Breng met behulp van een micropipet 0,5 μL van het eerste ruwe product over op de TLC-plaat bij de "X" voor de eerste rijstrook. Herhaal dit voor extra ruwe producten (tot 8 per TLC-plaat). Wacht tot de ruwe productvlekken op de TLC-plaat drogen.
- Ontwikkel u voor elke TLC-plaat met behulp van een mobiele fase van 60% MeCN in 25 mM NH4HCO2 met 1% TEA (v/v) totdat het oplosmiddelfront de oplosmiddelfrontlijn bereikt. Wacht tot het oplosmiddel op de TLC-plaat is droog en dek af met een glazen microscoopschuif (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm dik).
- Verkrijg een radioactiviteitsbeeld van elke TLC-plaat door de plaat in een Cerenkov-beeldvormingssysteem te plaatsen voor een belichting van 5 minuten. Voer standaard beeldcorrecties uit (donkere stroomaftrekking, vlakveldcorrectie, mediaanfiltering en achtergrondaftrekking).
- Gebruik een ROI-analyse (Region of Interest) voor de eerste rijstrook van de eerste TLC-plaat. Teken gebieden rond elke band die zichtbaar is in de rijstrook. De software berekent de fractie van de geïntegreerde intensiteit van elke regio (band) in vergelijking met de totale geïntegreerde intensiteit van alle regio's (banden).
- Bij deze mobiele fase worden de volgende banden verwacht bij de aangegeven retentiefactoren: Rf = 0,0: Niet-geactiveerd [18F]fluoride; Rf = 0,9: [18F]fallypride; Rf = 0,94: Bijproduct. Bepaal de fluorinatie-efficiëntie als de fractie van activiteit in de [18F]fallyprideband.
- Herhaal deze analyse voor alle andere rijstroken op alle TLC-platen.
OPMERKING: Als er geen Cerenkov-beeldvormingskamer beschikbaar is, kan een in vivo optisch beeldvormingssysteem voor kleine dieren (preklinisch) worden gebruikt om de TLC-platen in beeld te brengen. Als alternatief kan een 2-dimensionale TLC-scanner worden gebruikt. Als er alleen een 1-dimensionale TLC-scanner beschikbaar is, kunnen de TLC-platen ook worden geanalyseerd door in stroken met een schaar (1 per rijstrook) te snijden en elke strip afzonderlijk te scannen.
- Bepaal de ruwe radiochemische opbrengst (ruwe RCY) voor elke reactieplaats.
- Bepaal de ruwe RCY voor het eerste ruwe product door de inzamelingsefficiëntie te vermenigvuldigen met de fluorinatie-efficiëntie.
- Herhaal dit voor alle andere reactiesites.
- Analyseer de resultaten
- Geaggregeerde waarden voor repliceerexperimenten tot een gemiddelde en standaarddeviatie.
- Plot de inzamelingsefficiëntie, fluorinatie-efficiëntie en ruwe RCY als functie van de parameter die gevarieerd was (precursorconcentratie in dit voorbeeld).
- Selecteer de optimale omstandigheden op basis van de gewenste criteria. Meestal is dit de maximale ruwe RCY. Bovendien wordt het punt vaak gekozen in een regio waar de helling van de grafiek relatief vlak is, wat aangeeft dat het ongevoelig is voor kleine veranderingen in de parameter, wat een robuuster protocol biedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er werd een representatief experiment uitgevoerd om deze methode te illustreren. Met behulp van 16 reacties werden optimalisatiestudies van de radiofarmaceutica [18F]fallypride uitgevoerd door verschillende precursorconcentraties (77, 39, 19, 9,6, 4,8, 2,4, 1,2 en 0,6 mM) in thexylalcohol:MeCN (1:1, v/v) als reactieoplosmiddel. De reacties werden uitgevoerd bij 110 °C gedurende 7 min. De efficiëntie van de verzameling, de samenstelling van de monsters (d.w.z. de verhoudingen van het product [18F]fallypride, het niet-getacteerde fluoride [18F] en het nevenproduct) zijn in tabel 1 opgenomen en zijn grafisch samengevat in figuur 4.
De studie toonde aan dat de fluorinatie-efficiëntie (aandeel van [18F]fallypride) toeneemt met toenemende precursorconcentratie, en dat het resterende niet-geactiveerde [18F]fluoride omgekeerd varieerde (Figuur 4A). Er was een kleine hoeveelheid van een radioactief nevenproduct bij lage precursorconcentraties, maar het aandeel daalde tot bijna nul bij de hogere precursorconcentraties (figuur 4A). De inzamelingsefficiëntie was voor de meeste omstandigheden bijna kwantitatief, hoewel deze bij lage precursorconcentraties licht daalde.
Uit deze resultaten kan de hoogste RCY worden bereikt met ~230 nmol precursor (d.w.z. 39 mM concentratie in een druppel van 6 μL). Bij deze toestand was de fluorinatie-efficiëntie 96,0 ± 0,5% (n=2) en de ruwe RCY was 87,0 ± 2,7 (n=2), en er was geen waargenomen radioactieve zijproductvorming. Hoewel het gebruik van 77 mM precursor vergelijkbare resultaten liet zien, is het over het algemeen wenselijk om een lagere hoeveelheid precursor te gebruiken om de kosten te verlagen en downstream zuiveringsstappen te vereenvoudigen.
Figuur 1: Fabricage van multi-reaction microdroplet chips via fotolithografie. (A) Foto van multi-reaction microdroplet chip met 4 x 4 array van reactie sites. De chip bestaat uit polytetrafluorethyleen-gecoate silicium met cirkelvormige gebieden van polytetrafluorethyleen weggeëtste om de hydrofiele reactieplaatsen te creëren. (B) Schematisch van de fabricageprocedure. Een siliconen wafer is gespincoat met Teflon-oplossing en gebakken om de coating te stollen. Vervolgens is de fotoresist spin-coated en patroon via fotolithografie om een etsmasker te produceren. De fotoresist is ontwikkeld met een fotoresist die een oplossing ontwikkelt. De blootgestelde Teflon wordt vervolgens verwijderd via droge ets met zuurstofplasma. De wafer wordt in afzonderlijke chips gesneden en de fotoresist wordt gestript. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Procedure voor parallelle reacties. Experimentele procedure voor het uitvoeren van 16 parallelle syntheses van de radiofarmaceutisch [18F]fallypride op een multi-reactie chip. In dit voorbeeld wordt de voorloperconcentratie voor elke reactie gevarieerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Kaart van de omstandigheden op reactieplaatsen. (A) Experimenteel ontwerp om de invloed van de precursorconcentratie op de radiofluorering van tosyl fallypride te onderzoeken met behulp van een enkele 16-reactie chip (bovenaanzicht). Acht verschillende concentraties werden onderzocht, elk met n=2 duplo's. Andere reactieomstandigheden werden constant gehouden (temperatuur: 110 °C; tijd: 7 min; oplosmiddel: thexylalcohol:MeCN; de hoeveelheid TBAHCO3: 240 nmol). Elke reactie werd uitgevoerd met ~14 MBq activiteit. (B) Foto van een 16-reactie chip geïnstalleerd op het verwarmingsplatform tijdens het experiment. Rode lijnen vertegenwoordigen de referentiehoek van de chip die wordt gebruikt voor uitlijning met de referentiehoek van de kachel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Invloed van de precursorconcentratie op de microdropletsynthese van [18F]fallypride. (A) Aandeel radioactieve soorten aanwezig in het verzamelde ruwe reactieproduct, d.w.z. [18F]fallypride, nevenproduct of niet-geactiveerd [18F]fluoride. (B) Syntheseprestaties. De efficiëntie van de inzameling, de fluorinatieefficiency, en ruwe RCY worden uitgezet als functie van precursorconcentratie. In beide grafieken vertegenwoordigen gegevenspunten het gemiddelde van n=2-replica's en foutbalken de standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Voorloper overleg (mM) | Inzamelingsefficiëntie (%) | Fluorinatie-efficiëntie (%) | Ruwe RCY (%) | Niet-geactiveerd [18F]fluoride (%) | Bijproduct (%) |
| 77 | 91,8 ± 2,1 | 96,7 ± 2,0 | 88,8 ± 3,9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96,0 ± 0,5 | 87,0 ± 2,7 | 4,0 ± 0,5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91,1 ± 0,5 | 81,1 ± 0,3 | 73,9 ± 0,7 | 8,4 ± 1,2 | 10,5 ± 2,0 |
| 9.6 | 90,9 ± 0,6 | 62,7 ± 0,9 | 57,0 ± 0,5 | 23,3 ± 2,1 | 14,0 ± 0,9 |
| 4.8 | 88,4 ± 0,8 | 37,0 ± 1,5 | 32,8 ± 1,6 | 47,3 ± 0,8 | 15,7 ± 1,0 |
| 2.4 | 87,6 ± 2,0 | 21,0 ± 2,1 | 18,4 ± 2,2 | 67,4 ± 2,1 | 11,6 ± 1,0 |
| 1.2 | 82,3 ± 1,6 | 12,7 ± 0,3 | 10,4 ± 0,1 | 72,8 ± 0,7 | 14,5 ± 1,0 |
| 0.6 | 81,2 ± 3,7 | 6,3 ± 0,8 | 5.1 ± 0.5 | 84,3 ± 0,2 | 9,4 ± 1,0 |
Tabel 1: Gegevens verkregen uit onderzoek naar de precursorconcentratie. Alle waarden zijn gemiddelden ± standaardafwijkingen berekend op basis van n=2-replica's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege beperkingen van conventionele radiochemiesystemen die slechts één of een klein aantal reacties per dag toestaan en een aanzienlijke hoeveelheid reagentia per gegevenspunt verbruiken, kan slechts een klein deel van de totale reactieparameterruimte in de praktijk worden onderzocht en worden vaak resultaten gerapporteerd zonder herhalingen (n =1). In vergelijking met conventionele systemen maakt dit multi-reaction droplet radiosyntheseplatform het praktisch om uitgebreidere en rigoureuzere studies van radiosyntheseomstandigheden uit te voeren terwijl het zeer weinig tijd en hoeveelheid precursor verbruikt, waardoor mogelijk nieuwe inzichten mogelijk zijn over parameters die de productopbrengst en de vorming van nevenproducten beïnvloeden. De informatie kan worden gebruikt om de omstandigheden te kiezen die resulteren in de hoogste productopbrengst of de meest robuuste synthese. Het lage precursorverbruik kan vooral nuttig zijn bij de vroege ontwikkeling van nieuwe radiotracers wanneer slechts een kleine hoeveelheid precursor beschikbaar is of wanneer de precursor duur is. Hoewel de open aard van de chips bijdraagt aan een snelle synthesetijd en gemakkelijke toegang via pipet, kan dit leiden tot aanzienlijke verliezen van vluchtige moleculen en is het mogelijk niet praktisch bij het optimaliseren van de synthese van radiofarmaceutica met vluchtige precursoren, tussenproducten of producten.
Vanwege het gevaar van blootstelling aan straling moet worden herhaald dat deze experimenten alleen met geschikte training en goedkeuringen mogen worden uitgevoerd en achter stralingsafscherming moeten worden uitgevoerd, bij voorkeur in een geventileerde hete cel. Vanwege de korte halfwaardetijd van de radio-isotopen is het belangrijk om de experimenten snel en efficiënt uit te voeren. Pipeteringsreagentia naar de chip en het verzamelen van producten van de chip moeten onder niet-radioactieve omstandigheden worden geoefend om vertrouwd te raken met de verminderde toegang en zichtbaarheid in een hete cel. Evenzo moet ook worden geoefend met het installeren en verwijderen van de chip en het meten van de chip met de dosiskalibrator. Bovendien is het van cruciaal belang om te worden georganiseerd, met een gedetailleerde experimentkaart (d.w.z. specifieke reactieomstandigheden op elke locatie op de chip). Het is ook nuttig om van tevoren een tabel met in te vullen resultaten voor te bereiden terwijl metingen worden uitgevoerd. Om reproduceerbaarheid te garanderen, vooral met de mogelijkheid van menselijke fouten, moeten meerdere replica's van elke set voorwaarden worden uitgevoerd. Het is belangrijk om vooral voorzichtig te zijn tijdens de stap van het verzamelen van de ruwe monsters van de chip om te voorkomen dat vloeistof buiten de reactieplaats wordt gemorst en kruisbesmetting met aangrenzende reactielocaties wordt veroorzaakt. Als er fouten worden opgemerkt, is het belangrijk om deze reactiesites te markeren, zodat de gegevens kunnen worden uitgesloten van de uiteindelijke analyse.
In dit voorbeeldstudie was de hoeveelheid precursor die werd verbruikt voor 16 gegevenspunten 1,1 mg (~ 70 μg elk), vergeleken met 4 mg per gegevenspunt met behulp van een conventionele radiosynthese. Bovendien werden alle 16 reacties in 25 minuten voltooid, allemaal in één experiment. Ter vergelijking, de synthese van ruwe [18F]fallypride op een conventionele radiosynthesizer vereist ~ 15-20 min per reactie16,17.
Dit representatieve experiment toonde het nut aan van een multi-reaction microdroplet chip met 16 reacties om de omstandigheden voor de radiosynthese van het radiofarmaceutisch [18F]fallypride te optimaliseren door 8 verschillende precursorconcentraties (n=2 repliceert voor elke aandoening) op een snelle en economische manier te verkennen. Andere variabelen die gemakkelijk kunnen worden geoptimaliseerd met behulp van een multi-reactiechip zijn de hoeveelheid radioactiviteit, type faseoverdrachtkatalysator, hoeveelheid faseoverdrachtkatalysator, verdampings-/droogomstandigheden (bijv. aantal azeotrope droogstappen), reactieoplosmiddel, enz. Door gebruik te maken van meerdere multi-reactie chips is het ook mogelijk om de invloed van reactietemperatuur en reactietijd te onderzoeken, naast omstandigheden zoals verdamping/droogtemperatuur en tijd. Dergelijke studies zouden opeenvolgend moeten worden uitgevoerd met behulp van de enkele kachel of kunnen parallel lopen door meerdere kachels tegelijkertijd te bedienen.
De onderliggende druppelsynthesemethode is compatibel gebleken met een breed scala van 18F-gelabelde radiofarmaceutica, zoals [18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F]FBB20 en het kan worden gebruikt voor de optimalisatie van de meeste andere 18F-gelabelde verbindingen en verbindingen gelabeld met andere isotopen. Bovendien maken de resulterende geoptimaliseerde druppelgebaseerde reacties intrinsiek gebruik van de voordelen van microvolumeradiochemie, waaronder een lager precursorverbruik, snellere procestijden en compacte instrumentatie, en kunnen ze dezelfde voordelen bieden voor routinematige productie van grote batches. Grotere batches vereisen gewoon het opschalen van de hoeveelheid activiteit die aanvankelijk aan het begin van de reactie is geladen. Om een tracer te bereiden die geschikt is voor gebruik in in vitro of in vivo assays, moet het ruwe product worden gezuiverd (bv. met behulp van HPLC op analytische schaal) en geformuleerd (bv. via verdamping of uitwisseling van vaste-fase oplosmiddelen21) Als alternatief kan het mogelijk zijn om de optimale omstandigheden aan te passen van druppelschaal tot een conventionele radiosynthesizer op basis van flacons. Het onderzoek naar deze mogelijkheid loopt nog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De Regenten van de Universiteit van Californië hebben technologie in licentie gegeven aan Sofie, Inc. die is uitgevonden door Dr. van Dam, en hebben aandelen in Sofie, Inc. genomen als onderdeel van de licentietransactie. Dr. van Dam is oprichter en consultant van Sofie, Inc. De overige auteurs verklaren geen belangenconflicten. Dit werk werd mede ondersteund door het National Cancer Institute (R33 240201).
Acknowledgments
We danken de UCLA Biomedical Cyclotron Facility en Dr. Roger Slavik en Dr. Giuseppe Carlucci voor het royaal leveren van [18F]fluoride voor deze studies en het UCLA NanoLab voor ondersteuning met apparatuur voor chipfabricage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
