Summary
Diese Methode beschreibt den Einsatz einer neuartigen Hochdurchsatzmethode, basierend auf tröpfchenchemischen Reaktionen, zur schnellen und wirtschaftlichen Optimierung von Radiopharmazeutika unter Verwendung von Nanomolmengen an Reagenzien.
Abstract
Aktuelle automatisierte Radiosynthesizer sind für die Herstellung großer klinischer Chargen von Radiopharmazeutika ausgelegt. Sie eignen sich nicht gut für die Reaktionsoptimierung oder die neuartige radiopharmazeutische Entwicklung, da jeder Datenpunkt einen erheblichen Reagenzienverbrauch mit sich bringt und die Kontamination des Geräts Zeit für den radioaktiven Zerfall vor der nächsten Verwendung benötigt. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine Plattform für die parallele Durchführung von Arrays von Miniatur-Tröpfchenreaktionen entwickelt, die jeweils in einer Oberflächenspannungsfalle auf einem gemusterten Polytetrafluorethylen-beschichteten Silizium-"Chip" eingeschlossen sind. Diese Chips ermöglichen schnelle und bequeme Untersuchungen von Reaktionsparametern wie Reagenzkonzentrationen, Reaktionslösungsmittel, Reaktionstemperatur und -zeit. Diese Plattform ermöglicht den Abschluss von Hunderten von Reaktionen in wenigen Tagen mit minimalem Reagenzienverbrauch, anstatt Monate mit einem herkömmlichen Radiosynthesizer zu dauern.
Introduction
Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Radiopharmazeutika werden häufig als Forschungswerkzeuge zur Überwachung spezifischer biochemischer Prozesse in vivo und zur Untersuchung von Krankheiten sowie zur Entwicklung neuer Medikamente und Therapien eingesetzt. Darüber hinaus ist PET ein wichtiges Instrument zur Diagnose oder Staging von Krankheiten und zur Überwachung des Ansprechens eines Patienten auf die Therapie1,2,3. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von PET-Radioisotopen (z. B. 110 min für Fluor-18-markierte Radiopharmazeutika) und der Strahlengefährdung werden diese Verbindungen mit speziellen automatisierten Systemen hergestellt, die hinter der Strahlenabschirmung arbeiten und müssen kurz vor der Verwendung vorbereitet werden.
Aktuelle Systeme, die zur Synthese von Radiopharmazeutika verwendet werden, sind so konzipiert, dass sie große Chargen produzieren, die in viele Einzeldosen aufgeteilt werden, um die Produktionskosten zu teilen. Während aktuelle Systeme für die Herstellung weit verbreiteter Radiotracer wie [18F]FDG geeignet sind (da mehrere Patientenscans und Forschungsexperimente an einem einzigen Tag geplant werden können), können diese Systeme für die Herstellung neuartiger Radiotracer in der frühen Entwicklungsphase oder weniger häufig verwendeter Radiotracer verschwenderisch sein. Die Volumina, die herkömmliche Systeme verwenden, liegen typischerweise im Bereich von 1-5 ml, und die Reaktionen erfordern Vorläufermengen im Bereich von 1-10 mg. Darüber hinaus ist die Verwendung herkömmlicher Radiosynthesizer bei Optimierungsstudien in der Regel umständlich, da die Apparatur nach dem Gebrauch kontaminiert wird und der Benutzer vor dem nächsten Experiment auf den Zerfall der Radioaktivität warten muss. Abgesehen von den Ausrüstungskosten können die Kosten für das Radioisotop und die Reagenzien daher für Studien, die die Herstellung mehrerer Chargen erfordern, sehr hoch werden. Dies kann beispielsweise bei der Optimierung von Syntheseprotokollen für neuartige Radiotracer auftreten, um eine ausreichende Ausbeute und Zuverlässigkeit für erste in vivo Bildgebungsstudien zu erreichen.
Mikrofluidische Technologien werden zunehmend in der Radiochemie eingesetzt, um mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Systemen zu nutzen4,5,6. Mikrofluidische Plattformen, einschließlich solcher, die auf 1-10 μL Reaktionsvolumina7,8,9basieren, haben eine signifikante Reduzierung des Reagenzienvolumens und des Verbrauchs teurer Vorprodukte sowie kurze Reaktionszeiten gezeigt. Diese Reduzierungen führen zu niedrigeren Kosten, schnelleren Erhitzungs- und Verdampfungsschritten, kürzerer und einfacherer nachgeschalteter Reinigung, einem insgesamt "grüneren" chemischen Prozess10und einer höheren molaren Aktivität der produzierten Radiotracer11. Diese Verbesserungen machen es praktischer, umfangreichere Optimierungsstudien durchzuführen, indem die Reagenzkosten jeder Synthese gesenkt werden. Weitere Vorteile können durch die Durchführung mehrerer Experimente aus einer einzigen Charge von Radioisotopen an einem einzigen Tag erreicht werden. Zum Beispiel können mikrofluidische Strömungschemie-Radiosynthesizer, die im "Entdeckungsmodus" arbeiten, Dutzende von Reaktionen nacheinander durchführen, wobei jede nur 10s des μL-Reaktionsvolumens12verwendet.
Inspiriert von diesen Vorteilen wurde ein Multi-Reaction-Droplet-Array-Chip entwickelt, bei dem Mikrovolumenreaktionen auf eine Reihe von Oberflächenspannungsfallen auf einer Siliziumoberfläche beschränkt sind, die mit einer gemusterten Teflonbeschichtung erzeugt werden. Diese Chips ermöglichen die gleichzeitige Durchführung mehrerer Reaktionen auf der Skala von 1-20 μL, was die Möglichkeit eröffnet, 10 verschiedene Reaktionsbedingungen pro Tag mit jeweils mehreren Replikaten zu untersuchen. In diesem Artikel wird der Nutzen dieses neuen Hochdurchsatzansatzes für die Durchführung schneller und kostengünstiger radiochemischer Optimierungen demonstriert. Die Verwendung von Multireaktions-Tröpfchenchips ermöglicht eine bequeme Untersuchung der Auswirkungen von Reagenzkonzentrationen und Reaktionslösungsmitteln, und die Verwendung mehrerer Chips könnte die Untersuchung der Reaktionstemperatur und -zeit ermöglichen, während gleichzeitig sehr geringe Mengen an Vorläufern verbraucht werden.
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Protocol
ACHTUNG: Dieses Protokoll beinhaltet den Umgang mit radioaktiven Stoffen. Experimente sollten nicht ohne die notwendige Schulung und persönliche Schutzausrüstung und Genehmigung durch die Strahlenschutzbehörde Ihrer Organisation durchgeführt werden. Versuche sollten hinter Strahlenabschirmung durchgeführt werden, vorzugsweise in einer belüfteten heißen Zelle
1. Herstellung von Multireaktionschips
HINWEIS: Chargen von Multireaktions-Mikrotröpfchenchips werden aus 4-Zoll-Siliziumwafern unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken hergestellt, wie zuvorbeschrieben 10 (Abbildung 1). Bei diesem Verfahren werden 7 Chips mit jeweils 4 x 4 Arrays von Reaktionsstellen erzeugt.
- Legen Sie den Siliziumwafer auf das Spincoaterfutter und stellen Sie sicher, dass es zentriert ist. 3 mL Polytetrafluorethylenlösung in der Mitte des Wafers mit einer Transferpipette und einem Beschichtungswafer bei 1000 U/min für 30 s (500 U/min Rampe) abscheiden.
- Um die Beschichtung zu verfestigen, legen Sie den Wafer für 10 min auf eine 160 °C Warmplatte und werden dann für 10 min auf eine 245 °C Warmplatte übertragen.
- Die Beschichtung in einem Hochtemperaturofen bei 340 °C für 3,5 h unter Stickstoffatmosphäre glühen, gefolgt von einer Abkühlung auf 70 °C an einer 10 °C/min-Rampe.
- Legen Sie den Siliziumwafer auf das Spincoaterfutter und stellen Sie sicher, dass er zentriert ist. Gießen Sie 2 ml positives Fotolack in der Mitte des Wafers mit einer Transferpipette und führen Sie dann die Beschichtung bei 3000 U / min für 30 s (1000 U / min / s Rampe) durch.
- Verfestigen Sie den Fotolack, indem Sie die Waffel 3 min lang weich auf einer 115 °C warmen Kochplatte backen.
- Installieren Sie den Wafer und die Fotomaske in einem Mask aligner und führen Sie eine Belichtung von 14 s bei 12 mW/cm2 Lampenintensität und 356 nm Wellenlänge im Hartkontaktmodus durch. In diesem Schritt wird eine Transparenzmaske verwendet, die das negative endgültige Polytetrafluorethylenmuster enthält, d. H. Ein Muster mit einem Durchmesser von 4 Zoll und 4 Kopien des 16-Reaktionschips, wobei die Reaktionsstellen transparent und alle anderen Bereiche in undurchsichtiger Farbe sind.
- Tauchen Sie den Wafer mit 20 ml Fotolack-Entwicklerlösung für 3 min in einen Glasbehälter mit leichtem Rühren, um das belichtete Muster zu entwickeln.
- Spülen Sie die sich entwickelnde Lösung ab, indem Sie den Wafer in einen Glasbehälter mit 20 mL DI-Wasser für 3 min mit leichtem Rühren tauchen. Trocknen Sie den Wafer mit einer Stickstoffpistole.
- Entfernen Sie die exponierten Polytetrafluorethylen-Bereiche durch reaktives Ionenätzen (RIE) mit Sauerstoffplasma unter folgenden Bedingungen: 30 s Exposition, 100 mTorrdruck, 200 W Leistung und 50 sccm Sauerstofffluss.
- Würfeln Sie den Wafer mit einem Siliziumwafer-Cutter in einzelne Chips (insgesamt 7 pro Wafer).
- Tauchen Sie jeden Chip für 1 Minute in Aceton, um das Fotolack zu entfernen, dann Isopropanol für 1 Minute. Zum Schluss trocknen Sie jeden Chip mit einer Stickstoffpistole.
- Trockene Späne in einen Glasbehälter geben und zur Aufbewahrung bis zum Gebrauch mit Aluminiumfolie abdecken.
2. Planung der Optimierungsstudie
HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Synthese des Radiopharmazeutika [18F]fallyprid als Beispiel zur Veranschaulichung der Hochdurchsatzoptimierung verwendet (Abbildung 2). Mit einem einzigen Chip können 16 gleichzeitige Reaktionen durchgeführt werden, z.B. mit unterschiedlicher Vorläuferkonzentration (8 verschiedene Konzentrationen, n=2 repliziert jeweils). Die Bedingungen sind den Reaktionsstellen in Abbildung 3Azugeordnet. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um andere Reaktionsparameter (z. B. Reaktionslösungsmittel, Reaktionsvolumen, TbAHCO3usw.) oder andere Radiopharmazeutika zu optimieren.
- Wählen Sie die zu variierenden Reaktionsparameter, die zu verwendenden spezifischen Werte und die Anzahl der Replikate aus.
- Berechnen Sie die Anzahl der Chips, die für die Durchführung des Experiments erforderlich sind.
- Bereiten Sie für jeden Chip eine Karte vor, welche Reaktionsbedingungen an jeder Reaktionsstelle verwendet werden, um die Reagenzienvorbereitung und die Durchführung der Tröpfchenreaktionen zu unterstützen.
3. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Optimierung der Radiosynthese von [18F]fallyprid
HINWEIS: Die tröpfchenbasierte Radiosynthese von [18F]fallyprid (Abbildung 2) beginnt mit der Zugabe von [18F]fluorid und Phasentransferkatalysator (TBAHCO3)an der Reaktionsstelle, gefolgt von einer Erwärmung, um Wasser zu verdampfen und einen getrockneten Rückstand zu hinterlassen. Als nächstes wird ein Tröpfchen Vorläufer (Tosyl-Fallyprid) im Reaktionslösungsmittel (Thexylalkohol und Acetonitril) zugegeben und erhitzt, um die Radiofluorierungsreaktion durchzuführen. Schließlich wird das Rohprodukt zur Analyse vom Chip gesammelt. Die Reagenzienvorbereitungs- und Syntheseverfahren sollten angepasst werden, wenn die Optimierung eines anderen Tracers erfolgt.
- Bereiten Sie eine Stammlösung des Reaktionslösungsmittels vor, bestehend aus Thexylalkohol und Acetonitril in einer 1:1 Volumenmischung. Stellen Sie sicher, dass das Volumen ausreicht, um die geplante Verdünnungsreihe zu erstellen. In diesem Beispiel ist die Optimierung von ~30 μL ausreichend.
- Eine 30 μL Stammlösung des Vorläufers (Tosyl-Fallyprid) im Reaktionslösungsmittel mit der maximal zu untersuchenden Konzentration (77 mM) wird hergestellt. Stellen Sie sicher, dass das Volumen ausreicht, um das geplante Experiment durchzuführen. In diesem Beispiel ist die Optimierung von ~30 μL ausreichend.
- Führen Sie aus der Vorläuferlösung und dem Reaktionslösungsmittel 2x serielle Verdünnungen durch, um die verschiedenen Konzentrationen der Vorläuferlösung herzustellen. Stellen Sie sicher, dass das Volumen jeder Verdünnung ausreicht, um die gewünschte Anzahl von Replikaten für jede Bedingung durchzuführen. In diesem Beispiel der Optimierung sind ~15 μL jeder Konzentration ausreichend.
- Bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen vor, um jedes rohe Reaktionsprodukt mit einem permanenten Marker zu sammeln, um jedes Röhrchen mit einer eindeutigen Nummer zu beschriften. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Mikrozentrifugenröhrchen mit der Anzahl der Bedingungen multipliziert mit der Anzahl der Replikate (8 x 2 = 16) übereinstimmt.
- Bereiten Sie einen Bestand an Sammellösung (10 ml) vor, der 9:1 Methanol:DI-Wasser (v/v) ent. Aliquot 50 μL in jede von 16 zusätzlichen markierten Mikrozentrifugenröhrchen (eine pro Reaktionsstelle auf dem Chip).
- Eine [18F]fluorid-Stammlösung in einem 500 μL Mikrozentrifugenröhrchen wird durch Mischen [18F]fluorid/[18O]H2 O (~260 MBq [7 mCi]) mit 75 mM TBAHCO3-Lösung (56 μL) und Verdünnen mit DI-Wasser bis zu 140 μL vorbereitet. 8 μL dieser Lösung werden an jede Reaktionsstelle geladen (mit ~15 MBq [0,40 mCi] Aktivität und 240 nmol TBAHCO3).
4. Parallelsynthese von [18F]fallyprid mit unterschiedlichen Vorläuferkonzentrationen
HINWEIS: Der Chip wird auf einer Heizplattform (aufgebaut wie zuvor beschrieben13)betrieben, die aus einer 25 mm x 25 mm Keramikheizung besteht, die mit einem Ein-Aus-Temperaturregler mit dem internen Thermoelementsignal für die Rückmeldung gesteuert wird. Die Oberflächentemperaturen der Heizung wurden mittels Wärmebildtechnik kalibriert. Wenn eine solche Plattform nicht verfügbar ist, kann ein Paar Heizplatten verwendet werden (eine bei 105 °C und eine bei 110 °C).
- Load [18F]fluorid-Stammlösung (mit Phasentransferkatalysator).
- Laden Sie mit einer Mikropipette einen 8 μL-Tropfen [18F]fluorid-Stammlösung auf den ersten Reaktionspunkt eines Multireaktionschips. Messen Sie die Aktivität des Chips, indem Sie ihn in einen Dosiskalibrator legen und den Zeitpunkt aufzeichnen, zu dem die Messung durchgeführt wird.
- Entfernen Sie den Chip aus dem Dosiskalibrator und laden Sie dann einen 8 μL-Tröpfchen [18F] Fluorid-Stammlösung auf die zweite Reaktionsstelle. Messen Sie die Aktivität auf dem Chip, indem Sie ihn erneut in den Dosiskalibrator legen und den Zeitpunkt aufzeichnen, zu dem die Messung durchgeführt wird.
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip.
- Berechnen Sie die pro Reaktionsstelle belastete Aktivität, indem Sie die Aktivitätsmessung nach dem Laden des Radioisotops durchführen und die vorherige Messung (zerfallskorrigiert) subtrahieren, bevor diese Stelle geladen wurde.
- Richten Sie den Multireaktionschip an der Heizung aus.
- Fügen Sie eine dünne Schicht Wärmeleitpaste auf die Keramikheizung hinzu.
- Legen Sie den Chip vorsichtig mit einer Pinzette auf die Heizung, um das Verschütten der Tröpfchen zu vermeiden, und richten Sie die Referenzecke des Chips mit der Referenzecke der Heizung aus (siehe Abbildung 3B). Der Chip wird die Heizung um einen kleinen Betrag überhängen.
- Trocknen Sie den [18F]fluorid und Phasentransferkatalysator.
- Erhitzen Sie den Chip für 1 minute, indem Sie die Heizung im Regelprogramm auf 105 °C einstellen, um die Tröpfchen trocken zu verdampfen und einen getrockneten Rückstand von [18F] Fluorid und TBHACO3zu hinterlassen. Kühlen Sie nach 1 minute den Chip ab, indem Sie die Heizung ausschalten und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschalten.
- Fügen Sie die Vorläuferlösung hinzu.
- Mit einer Mikropipette wird eine 6 μL-Lösung des Fallypridvorläufers auf den getrockneten Rückstand an der ersten Reaktionsstelle hinzugefügt.
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip. Verwenden Sie den Optimierungsplan, um zu bestimmen, welche Konzentration der Verdünnungsreihe für jede Reaktionsstelle verwendet wird.
- Führen Sie eine Fluorierungsreaktion durch.
- Erhitzen Sie jeden Chip für 7 min auf 110 °C mit dem Steuerungsprogramm, um eine Radiofluorierungsreaktion durchzuführen. Kühlen Sie anschließend den Chip, indem Sie die Heizung ausschalten und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschalten.
- Sammeln Sie die Rohprodukte von den Reaktionsstellen.
- Sammeln Sie das Rohprodukt an der ersten Reaktionsstelle, indem Sie 10 μL Sammellösung aus dem dafür vorgesehenen Mikrozentrifugenröhrchen über mikropipette hinzufügen. Nachdem Sie 5 s gewartet haben, verwenden Sie die Mikropipette (mit der gleichen Spitze installiert), um das verdünnte Rohprodukt abzusaugen und in das entsprechende markierte Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt 4 Mal mit derselben Pipettenspitze für alle Operationen.
- Wiederholen Sie den Sammelvorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip.
5. Syntheseanalyse zur Bestimmung der Reaktionsleistung und optimaler Bedingungen
- Bestimmen Sie die "Sammeleffizienz" für die erste Reaktion auf dem Chip.
- Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem gesammelten Rohprodukt der ersten Reaktionsstelle in den Dosiskalibrator, um die Aktivität zu messen. Zeichnen Sie die Messung und den Zeitpunkt der Messung auf.
- Berechnen Sie die Sammeleffizienz, indem Sie die Aktivität des gesammelten Rohprodukts durch die für dieselbe Reaktionsstelle gemessene Startaktivität dividieren (Zerfallskorrektur der Aktivitätswerte auf denselben Zeitpunkt).
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip.
- Analysieren Sie die Zusammensetzung (Fluorierungseffizienz) jedes gesammelten Rohprodukts.
HINWEIS: Um die Analyse aller Proben in kurzer Zeit praktisch zu machen, wird die Fluorierungseffizienz mit einem zuvor beschriebenen Hochdurchsatz-Radiodünnschichtchromatographie -Ansatz (Radio-TLC) analysiert14. Diese Technik ermöglicht es, bis zu acht Proben parallel zu verarbeiten, indem sie nebeneinander (5 mm Raster, 0,5 μL pro Spot) auf einer einzigen TLC-Platte spotten, dann zusammen entwickeln und gemeinsam mit Cerenkov Imaging14,15auslesen. Für die Beispieloptimierung mit 16 parallelen Reaktionen werden 2 TLC-Platten benötigt. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung der Radio-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Radio-HPLC) für die Analyse, obwohl die Zeit für Trennung, Reinigung und Gleichgewicht die Anzahl der proben, die analysiert werden können, begrenzen kann.- Zeichnen Sie für jede TLC-Platte (50 mm x 60 mm) mit einem Bleistift eine Linie in 15 mm Entfernung von einer 50-mm-Kante (unten) und eine andere Linie in 50 mm Entfernung von derselben Kante. Die erste Zeile ist die Ursprungslinie; die zweite ist die Lösungsmittelfrontlinie. Zeichnen Sie 8 kleine "X" entlang der Ursprungslinie in einem Abstand von 5 mm, um die Probenposition für jede der 8 "Bahnen" zu definieren.
- Mit einer Mikropipette werden 0,5 μL des ersten Rohprodukts auf die TLC-Platte am "X" für die erste Spur übertragen. Wiederholen Sie dies für zusätzliche Rohprodukte (bis zu 8 pro TLC-Platte). Warten Sie, bis die rohen Produktflecken auf der TLC-Platte getrocknet sind.
- Für jede TLC-Platte wird eine mobile Phase von 60% MeCN in 25 mMNH4 HCO2mit1% TEA (v/v) entwickelt, bis die Lösungsmittelfront die Lösungsmittelfront erreicht. Warten Sie, bis das Lösungsmittel auf der TLC-Platte getrocknet ist, und decken Sie es dann mit einem Glasmikroskopobjektträger (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm dick) ab.
- Erhalten Sie ein Radioaktivitätsbild jeder TLC-Platte, indem Sie die Platte für eine 5-minütige Belichtung in ein Cerenkov-Bildgebungssystem legen. Führen Sie Standardbildkorrekturen durch (Dunkelstromsubtraktion, Flachfeldkorrektur, Medianfilterung und Hintergrundsubtraktion).
- Verwenden Sie die ROI-Analyse (Region of Interest) für die erste Spur der ersten TLC-Platte. Zeichnen Sie Bereiche um jedes Band, das in der Spur sichtbar ist. Die Software berechnet den Anteil der integrierten Intensität jeder Region (Band) im Vergleich zur gesamten integrierten Intensität aller Regionen (Bänder).
- Bei dieser mobilen Phase werden bei den angegebenen Retentionsfaktoren folgende Bänder erwartet: Rf = 0,0: Unreacted [18F]fluorid; Rf = 0,9: [18F]fallypride; Rf = 0,94: Nebenprodukt. Bestimmen Sie die Fluorierungseffizienz als Anteil der Aktivität im [18F]fallypriden Band.
- Wiederholen Sie diese Analyse für alle anderen Fahrspuren auf allen TLC-Platten.
HINWEIS: Wenn keine Cerenkov-Bildgebungskammer verfügbar ist, kann ein optisches In-vivo-Bildgebungssystem für kleine Tiere (präklinisch) verwendet werden, um die TLC-Platten abbilden. Alternativ kann ein 2-dimensionaler TLC-Scanner verwendet werden. Alternativ, wenn nur ein 1-dimensionaler TLC-Scanner verfügbar ist, können die TLC-Platten analysiert werden, indem mit einer Schere in Streifen geschnitten (1 pro Spur) und jeder Streifen einzeln gescannt wird.
- Bestimmen Sie die rohe radiochemische Ausbeute (Roh-RCY) für jede Reaktionsstelle.
- Bestimmen Sie den Roh-RCY für das erste Rohprodukt, indem Sie die Sammeleffizienz mit der Fluorierungseffizienz multiplizieren.
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen.
- Analysieren Sie die Ergebnisse
- Aggregieren Sie Werte für alle Replikationsexperimente zu einer Mittel- und Standardabweichung.
- Zeichnen Sie die Sammeleffizienz, die Fluorierungseffizienz und den rohen RCY als Funktion des parameters auf, der variiert wurde (Vorläuferkonzentration in diesem Beispiel).
- Wählen Sie die optimalen Bedingungen anhand der gewünschten Kriterien aus. In der Regel ist dies der maximale rohe RCY. Darüber hinaus wird der Punkt oft in einem Bereich gewählt, in dem die Steigung des Diagramms relativ flach ist, was darauf hindeutet, dass er unempfindlich gegen kleine Änderungen des Parameters ist, was ein robusteres Protokoll bietet.
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Representative Results
Zur Veranschaulichung dieser Methode wurde ein repräsentatives Experiment durchgeführt. Unter Verwendung von 16 Reaktionen wurden Optimierungsstudien des radiopharmazeutischen [18F]fallyprids durch unterschiedliche Vorläuferkonzentrationen (77, 39, 19, 9,6, 4,8, 2,4, 1,2 und 0,6 mM) in Thexylalkohol:MeCN (1:1, v/v) als Reaktionslösungsmittel durchgeführt. Reaktionen wurden bei 110 °C für 7 min durchgeführt. Die Sammlungseffizienz, die Probenzusammensetzung (d. h. die Anteile von [18F]fallypride Produkt, nicht umgesetztem [18F]fluorid und Nebenprodukt) sind in Tabelle 1 tabellarisch dargestellt und in Abbildung 4grafisch zusammengefasst.
Die Studie zeigte, dass die Fluorierungseffizienz (Anteil von [18F]fallyprid) mit zunehmender Vorläuferkonzentration zunimmt und dass das verbleibende nicht umgesetzte [18F]fluorid umgekehrt variierte (Abbildung 4A). Es gab eine kleine Menge eines radioaktiven Nebenprodukts bei niedrigen Vorläuferkonzentrationen, aber der Anteil sank bei den höheren Vorläuferkonzentrationen auf nahezu Null (Abbildung 4A). Die Sammeleffizienz war für die meisten Bedingungen nahezu quantitativ, obwohl sie bei niedrigen Vorläuferkonzentrationen leicht zurückging.
Aus diesen Ergebnissen kann der höchste RCY mit ~230 nmol Vorläufer (d.h. 39 mM Konzentration in einem 6 μL Tröpfchen) erreicht werden. Unter dieser Bedingung betrug die Fluorierungseffizienz 96,0 ± 0,5% (n = 2) und der rohe RCY betrug 87,0 ± 2,7 (n = 2), und es gab keine beobachtete radioaktive Nebenproduktbildung. Während die Verwendung von 77 mM-Vorläufern ähnliche Ergebnisse zeigte, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine geringere Menge an Vorläufer zu verwenden, um die Kosten zu senken und die nachgelagerten Reinigungsschritte zu vereinfachen.
Abbildung 1: Herstellung von Multireaktions-Mikrotröpfchenchips mittels Photolithographie. (A) Foto des Multireaktions-Mikrotröpfchenchips mit 4 x 4 Array von Reaktionsstellen. Der Chip besteht aus polytetrafluorethylenbeschichtetem Silizium mit kreisförmigen Bereichen aus Polytetrafluorethylen, die weggeätzt wurden, um die hydrophilen Reaktionsstellen zu erzeugen. (B) Schematische Darstellung des Herstellungsverfahrens. Ein Siliziumwafer wird mit Teflonlösung spinbeschichtet und gebacken, um die Beschichtung zu verfestigen. Als nächstes wird der Fotolack spinbeschichtet und mittels Photolithographie gemustert, um eine Ätzmaske zu erzeugen. Der Fotolack wird mit einer Fotolack-Entwicklungslösung entwickelt. Das freiliegende Teflon wird dann durch Trockenätzen mit Sauerstoffplasma entfernt. Der Wafer wird in einzelne Chips gewürfelt und der Fotolack wird entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verfahren für parallele Reaktionen. Experimentelles Verfahren zur Durchführung von 16 parallelen Synthesen des radiopharmazeutischen [18F]fallyprid auf einem Multireaktionschip. In diesem Beispiel wird die Vorläuferkonzentration für jede Reaktion variiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Karte der Bedingungen an Reaktionsstellen. (A) Experimentelles Design zur Untersuchung des Einflusses der Vorläuferkonzentration auf die Radiofluorierung von Tosylfrüchprid mit einem einzigen 16-Reaktionschip (Dr. ansicht). Acht verschiedene Konzentrationen wurden mit jeweils n=2 Replikaten untersucht. Andere Reaktionsbedingungen wurden konstant gehalten (Temperatur: 110 °C; Zeit: 7 min; Lösungsmittel: Thexylalkohol:MeCN; die Menge an TBAHCO3:240 nmol). Jede Reaktion wurde mit ~14 MBq Aktivität durchgeführt. (B) Foto eines 16-Reaktionschips, der während des Experiments auf der Heizplattform installiert wurde. Rote Linien stellen die Referenzecke des Chips dar, die für die Ausrichtung mit der Referenzecke der Heizung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Einfluss der Vorläuferkonzentration auf die Mikrotropletsynthese von [18F]fallyprid. (A) Anteil der radioaktiven Spezies, die im gesammelten Rohreaktionsprodukt vorhanden sind, d. h. [18F]fallyprid, Nebenprodukt oder nicht umgesetztes [18F]fluorid. (B) Syntheseleistung. Sammeleffizienz, Fluorierungseffizienz und Roh-RCY werden als Funktion der Vorläuferkonzentration dargestellt. In beiden Diagrammen stellen Datenpunkte den Durchschnitt von n=2-Replikaten und Fehlerbalken die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Vorläuferkonzertation (mM) | Sammeleffizienz (%) | Fluorierungseffizienz (%) | Roher RCY (%) | Nicht umgesetztes [18F]fluorid (%) | Nebenprodukt (%) |
| 77 | 91,8 ± 2,1 | 96,7 ± 2,0 | 88,8 ± 3,9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96,0 ± 0,5 | 87,0 ± 2,7 | 4,0 ± 0,5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91,1 ± 0,5 | 81,1 ± 0,3 | 73,9 ± 0,7 | 8.4 ± 1.2 | 10,5 ± 2,0 |
| 9.6 | 90,9 ± 0,6 | 62,7 ± 0,9 | 57,0 ± 0,5 | 23.3 ± 2.1 | 14,0 ± 0,9 |
| 4.8 | 88,4 ± 0,8 | 37,0 ± 1,5 | 32,8 ± 1,6 | 47,3 ± 0,8 | 15,7 ± 1,0 |
| 2.4 | 87,6 ± 2,0 | 21,0 ± 2,1 | 18.4 ± 2.2 | 67.4 ± 2.1 | 11,6 ± 1,0 |
| 1.2 | 82,3 ± 1,6 | 12,7 ± 0,3 | 10,4 ± 0,1 | 72,8 ± 0,7 | 14,5 ± 1,0 |
| 0.6 | 81,2 ± 3,7 | 6,3 ± 0,8 | 5,1 ± 0,5 | 84,3 ± 0,2 | 9.4 ± 1.0 |
Tabelle 1: Daten aus der Untersuchung der Vorläuferkonzentration. Alle Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichungen, die aus n=2-Replikaten berechnet werden.
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Discussion
Aufgrund der Einschränkungen herkömmlicher radiochemischer Systeme, die nur eine oder eine kleine Anzahl von Reaktionen pro Tag zulassen und eine signifikante Menge an Reagenzien pro Datenpunkt verbrauchen, kann in der Praxis nur ein winziger Teil des gesamten Reaktionsparameterraums untersucht werden, und oft werden Ergebnisse ohne Wiederholungen gemeldet (n = 1). Im Vergleich zu herkömmlichen Systemen macht es diese Multireaktions-Tröpfchen-Radiosyntheseplattform praktisch, umfassendere und strengere Studien der Radiosynthesebedingungen durchzuführen und gleichzeitig sehr wenig Zeit und Menge an Vorläufern zu verbrauchen, was möglicherweise neue Erkenntnisse über Parameter ermöglicht, die die Produktausbeute und die Bildung von Nebenprodukten beeinflussen. Die Informationen können verwendet werden, um die Bedingungen auszuwählen, die zu der höchsten Produktausbeute oder der robustesten Synthese führen. Der geringe Vorläuferverbrauch kann besonders bei der frühen Entwicklung neuartiger Radiotracer nützlich sein, wenn nur eine geringe Menge an Vorläufern verfügbar sein kann oder wenn der Vorläufer teuer ist. Während die offene Natur der Chips zu einer schnellen Synthesezeit und einem einfachen Zugang über Pipette beiträgt, kann sie zu erheblichen Verlusten flüchtiger Moleküle führen und ist möglicherweise nicht praktikabel, wenn die Synthese von Radiopharmazeutika mit flüchtigen Vorläufern, Zwischenprodukten oder Produkten optimiert wird.
Aufgrund der Gefahr der Strahlenexposition sollte wiederholt werden, dass diese Versuche nur mit geeigneter Ausbildung und Zulassung durchgeführt werden sollten und hinter Strahlenschutz, vorzugsweise in einer belüfteten heißen Zelle, durchgeführt werden sollten. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit der Radioisotope ist es wichtig, die Experimente schnell und effizient durchzuführen. Das Pipettieren von Reagenzien auf den Chip und das Sammeln von Produkten aus dem Chip sollten unter nicht radioaktiven Bedingungen geübt werden, um sich mit dem reduzierten Zugang und der eingeschränkten Sichtbarkeit in einer heißen Zelle vertraut zu machen. Ebenso sollte das Installieren und Entfernen des Chips und das Durchführen von Messungen des Chips mit dem Dosiskalibrator geübt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, mit einer detaillierten Experimentkarte (d. H. Spezifische Reaktionsbedingungen an jeder Stelle auf dem Chip) organisiert zu sein. Es ist auch hilfreich, im Voraus eine Tabelle mit Ergebnissen vorzubereiten, die bei den Messungen ausgefüllt werden müssen. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, insbesondere bei der Möglichkeit menschlicher Fehler, sollten mehrere Replikationen jedes Satzes von Bedingungen durchgeführt werden. Es ist wichtig, beim Sammeln der Rohproben vom Chip besonders vorsichtig zu sein, um zu vermeiden, dass Flüssigkeit außerhalb der Reaktionsstelle verschüttet wird und eine Kreuzkontamination mit benachbarten Reaktionsstellen verursacht wird. Wenn Fehler bemerkt werden, ist es wichtig, diese Reaktionsstellen zu kennzeichnen, damit die Daten von der eventuellen Analyse ausgeschlossen werden können.
In dieser Beispielstudie betrug die Menge, die für 16 Datenpunkte verbraucht wurde, 1,1 mg (~ 70 μg jeweils), verglichen mit 4 mg pro Datenpunkt mit einem herkömmlichen Radiosynthesizer. Darüber hinaus wurden alle 16 Reaktionen in 25 Minuten in einem einzigen Experiment abgeschlossen. Im Vergleich dazu benötigt die Synthese von rohem [18F] Fallyprid auf einem herkömmlichen Radiosynthesizer ~ 15-20 min pro Reaktion16,17.
Dieses repräsentative Experiment demonstrierte den Nutzen eines Multireaktions-Mikrotröpfchenchips mit 16 Reaktionen zur Optimierung der Bedingungen für die Radiosynthese des Radiopharmazeutika [18F] Fallyprid, indem 8 verschiedene Vorläuferkonzentrationen (n = 2 repliziert für jede Bedingung) schnell und wirtschaftlich untersucht wurden. Andere Variablen, die bequem mit einem Multireaktionschip optimiert werden können, sind die Menge der Radioaktivität, die Art des Phasentransferkatalysators, die Menge des Phasentransferkatalysators, die Verdampfungs- / Trocknungsbedingungen (z. B. Anzahl der azeotropen Trocknungsschritte), das Reaktionslösungsmittel usw. Durch die Verwendung mehrerer Multireaktionschips ist es auch möglich, den Einfluss von Reaktionstemperatur und Reaktionszeit zu untersuchen, zusätzlich zu Bedingungen wie Verdampfungs- / Trocknungstemperatur und -zeit. Solche Studien müssten nacheinander mit dem einzeln Heizgerät durchgeführt werden oder könnten durch gleichzeitigen Betrieb mehrerer Heizgeräte parallelisiert werden.
Die zugrunde liegende Tröpfchensynthesemethode hat sich als kompatibel mit einer Breiten palette von 18F-markierten Radiopharmazeutika wie [18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F]FBB20 erwiesen und kann zur Optimierung der meisten anderen 18F-markierten Verbindungen und Verbindungen, die mit anderen Isotopen markiert sind, verwendet werden. Darüber hinaus nutzen die daraus resultierenden optimierten tröpfchenbasierten Reaktionen die Vorteile der Mikrovolumen-Radiochemie, einschließlich eines reduzierten Vorläuferverbrauchs, schnellerer Prozesszeiten und kompakter Instrumentierung, und können dieselben Vorteile für die Routinemäßigproduktion großer Chargen bieten. Größere Chargen erfordern lediglich eine Skalierung der Aktivität, die zu Beginn der Reaktion ursprünglich geladen wurde. Zur Herstellung eines für die Verwendung in in vitro oder in vivo Assays geeigneten Tracers muss das Rohprodukt gereinigt (z.B. mittels HPLC im analytischen Maßstab) und formuliert werden (z.B. durch Verdunstungs- oder Festphasenlösungsmittelaustausch21)Alternativ kann es möglich sein, die optimalen Bedingungen von der Tröpfchenskala an einen herkömmlichen Radiosynthesizer auf Fläschchenbasis anzupassen. Die Untersuchung dieser Möglichkeit ist im Gange.
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Disclosures
Die Regenten der University of California haben Sofie, Inc. Technologie lizenziert, die von Dr. van Dam erfunden wurde, und haben sich im Rahmen der Lizenztransaktion an Sofie, Inc. beteiligt. Dr. van Dam ist Gründer und Berater von Sofie, Inc. Die übrigen Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Diese Arbeit wurde teilweise vom National Cancer Institute (R33 240201) unterstützt.
Acknowledgments
Wir danken der UCLA Biomedical Cyclotron Facility und Dr. Roger Slavik und Dr. Giuseppe Carlucci für die großzügige Bereitstellung von [18F]fluorid für diese Studien und dem UCLA NanoLab für die Unterstützung mit Geräten für die Chipherstellung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
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