Summary
התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
Abstract
לשריר השלד יש יכולת יוצאת דופן להתחדש בעקבות פציעה, המונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות. בעקבות פציעה, תא גזע השריר מופעל ועובר התפשטות תאים כדי ליצור מאגר של myoblasts, אשר לאחר מכן להבדיל כדי ליצור סיבי שריר חדשים. במצבים רבים של בזבוז שרירים, כולל ניוון שרירים והזדקנות, תהליך זה נפגע וכתוצאה מכך חוסר היכולת של השריר להתחדש. תהליך התחדשות השרירים בדגי זברה נשמר מאוד במערכות יונקים המספקות מערכת מצוינת לחקר תפקוד תאי גזע שריריים והתחדשות, בתנאים מבזבזי שרירים כגון ניוון שרירים. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים. הצעד הראשון כרוך בשימוש בפלטפורמת genotyping המאפשרת קביעת הגנוטיפ של הזחלים לפני גרימת פציעה. לאחר שקבע את הגנוטיפ, השריר נפגע באמצעות דקירת מחט, שלאחריה מיקרוסקופיה אור מקוטב משמש כדי לקבוע את מידת התחדשות השרירים. לכן אנו מספקים צינור תפוקה גבוהה המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
Introduction
שריר השלד מהווה 30-50% ממסת גוף האדם, והוא לא רק הכרחי לקטר, אלא הוא משמש גם כאיבר מטבולי ואחסון קריטי1. למרות היותו פוסט-מיטוטי, שריר השלד דינמי מאוד ושומר על יכולת התחדשות אדירה בעקבות פציעה. זה מיוחס לנוכחות של תאי גזע תושב רקמות (המכונה גם תאי לווין), הממוקם מתחת למינה הבסיסית של myofibers ומסומן על ידי גורמי שעתוק זיווג חלבון תיבה 7 (pax7) ו / או חלבון תיבת מזווג 3 (pax3), בין היתר2,3. בעקבות פציעה, תא הלוויין מופעל ועובר התפשטות תאים כדי ליצור מאגר של myoblasts, אשר לאחר מכן להבדיל כדי ליצור סיבי שריר חדשים. מפל שמור מאוד של אותות פרו-רגנרטיביים המסדירים את הפעלת תאי הלוויין ותיקון שרירים חזק מושפע בתנאים שונים כגון מיופתיות והזדקנות הומיאוסטטית4,5.
קבוצה מגוונת כזו של מיופתיות היא ניוון שרירים, המאופיין בבזבוז שרירים מתקדם וניוון6. מחלות אלה הן תוצאה של מוטציות גנטיות בחלבונים מרכזיים, כולל דיסטרופין ולמינין-α2 (LAMA2), האחראי על צירוף סיבי שריר למטריקס החוץ תאי7,8. בהתחשב בכך חלבונים מעורבים ניוון שרירים לשחק תפקיד מרכזי כזה בשמירה על מבנה השריר, במשך שנים רבות האמינו כי כישלון בתהליך זה היה המנגנון האחראי על פתוגנזההמחלה 9. עם זאת, מחקרים אחרונים זיהו פגמים בוויסות תאי גזע שרירים ופגיעה לאחר מכן בהתחדשות השרירים כבסיס אפשרי שני לפתולוגיית השרירים שנצפו בניוון שרירים10,11. ככזה, דרושים מחקרים נוספים כדי לחקור כיצד פגיעה בתפקוד תאי גזע שרירים ואלמנטים נישה הקשורים תורם ניוון שרירים.
בעשור האחרון, דגי זברה(דניו rerio)הופיעו כמודל בעל חוליות חשוב עבור מודל מחלות12. זה מיוחס להתפתחות החיצונית המהירה של העובר דג הזברה, יחד עם הבהירות האופטית שלו, המאפשרת הדמיה ישירה של היווצרות שרירים, צמיחה ותפקוד. בנוסף, לא רק הפיתוח והמבנה של שריר שמור מאוד דגי זברה, הם גם מציגים תהליך שמור מאוד שלהתחדשות שרירים 13. כתוצאה מכך, דגי זברה מייצגים מערכת מצוינת לחקר הפתוביולוגיה של מחלות שרירים, ולחקור כיצד התחדשות השרירים מושפעת ממנה. לכך פיתחנו שיטה המאפשרת מחקר בזמן של התחדשות שרירי השלד במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים. צינור תפוקה גבוה זה כרוך בשיטה לגנוטיפ עוברים חיים14, ולאחר מכן מתבצעת פגיעה דקירת מחט ומידת התחדשות השרירים מצטלם באמצעות מיקרוסקופיית אור מקוטבת. ניצול טכניקה זו יחשוף אפוא את היכולת המתחדשת של השריר במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תחזוקת דגי הזברה בוצעה בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים שאושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת מונאש תחת רישיון מושבת הרבייה ERM14481.
1. קביעת הגנוטיפ של עוברים חיים באמצעות פלטפורמת גנוטיפינג עוברית.
- 2000 גרם ל-3 ימים לאחר ההפריה (dpf) עוברים של דגי זברה על ידי הוספת מתאנסולפונט טריקאין לריכוז סופי של 0.016% (v/v) בעובר בינוני (5 מ"מ NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 מ"מ CaCl2, 0.33 מ"מ MgSO4 במים). המתן 10 דקות כדי להבטיח שהדגים הם מרדים לחלוטין, ניכר כאשר הדגים מפסיקים לשחות.
- הכן את שבב מיצוי הדנ"א של 24 התאים על ידי קילוף סרט ההגנה הברור מפני השטח העליונים של השבב(איור 1A).
- גזור את הקצה של קצה מסנן 20 μL כדי להרחיב את הפתח. באמצעות זה, לבחור עובר יחיד בנפח 13 μL של בינוני העובר ולהעמיס לתוך החדר הראשון של השבב. חזור על תהליך זה עד העוברים חולקו לכל תא.
הערה: שלב זה צריך להתבצע באזור עם טיוטות אוויר מינימליות, כמו זרימת אוויר גבוהה עלולה לגרום אידוי מוגזם של הנוזל לאחר מכן וכתוצאה מכך רגישות genotyping מופחתת והישרדות של העוברים. - לאחר שמספר העוברים הרצוי הועלה על שבב מיצוי הדנ"א, העמיס אותו על פלטפורמת הגנוטיפינג של עוברי הזברה. זה מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי הצבה בצד אחד הראשון, ואחריו את השאר.
הערה: הימנע מהוספת לחץ רב מדי על הפלטפורמה מכיוון שהדבר עלול להגזים ולפגוע במעיינות הבסיסיים. - הדביק את מכסה הפלטפורמה המגנטית מעל השבב, אשר ימנע אידוי של מדיה עוברית במהלך פרוטוקול חילוץ DNA, ולסגור את מכסה הפלטפורמה.
- הגדר את יחידת הבסיס ל- 2.4 וולט, 0.051 A ו- 0.12 W והתחל את פרוטוקול חילוץ ה- DNA על-ידי לחיצה על לחצן "הפעלה/כיבוי". הפלטפורמה צריכה להתחיל לרטט, אשר ניתן להעריך על ידי נגיעה עדינה במכסה. הפרוטוקול צריך להיות מופעל במשך 8 דקות.
הערה: הרטט הנמרץ גורם לשפיכת תאים אפידרמיסיים, שממנו מופק DNA גנומי. - בזמן התוכנית פועלת, להכין צלחת 24 היטב על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום עובר לכל באר, אשר יש צורך להפריד עוברים בודדים בעוד במורד הזרם בדיקות genotyping מבוצעים.
- בנוסף, לתייג כראוי 8 צינורות פסים היטב, אשר ישמשו לאיסוף של חומר DNA מכל עובר.
- בסיום פרוטוקול 8 דקות, לחץ על לחצן ON / OFF כדי לעצור את הרטט של הפלטפורמה.
- פתח את המכסה של הפלטפורמה, והסר בעדינות את המכסה המגנטי המבטיח הפעלת לחץ מינימלי על הפלטפורמה.
- הסר בזהירות את שבב מיצוי ה- DNA מהפלטפורמה והניח אותו על משטח שטוח.
- מהתא הראשון, להסיר 10 μL של מדיה עובר המקיפה את העובר ולהניח אותו לתוך הבאר המתאימה של צינור רצועה 8-well. התקשורת מכילה את החומר הגנטי מהעובר הזה, שישמש לבדיקות במורד הזרם.
הערה: הימנעו מלגעת בעובר עם טיפ הפיפטה במהלך איסוף המדיה, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לעובר. - בעזרת פיפטה מפלסטיק, מוסיפים מיד שתי טיפות של מדיום עובר טרי לאותו תא. לאסוף את העובר ולהעביר אותו לבאר הראשונה של צלחת 24 היטב.
- חזור על שלבים 1.12 ו- 1.13 עבור כל התאים הנותרים. בסיום זה, צלחת 24 באר המכילה עוברים חיים ניתן להעביר אינקובטור 28 °C (28 °F).
- בצע בוצעו ציות גנוטיפינג מתאימות במורד הזרם כדי לקבוע את הגנוטיפ של העוברים.
הערה: ה- DNA המתקבל מפלטפורמת הגנוטיפינג של העובר יכול להיות מוגבר בהצלחה על ידי PCR והוא יכול לשמש לניתוח עוקב כולל רצף, אלקטרופורזה ג'ל, או היתוך ברזולוציה גבוהה14. כדי genotype זן lama2 המתואר בתוצאות הייצוגיות, PCR, עיכול הגבלה אלקטרופורזה ג'ל שימשו. בהתחשב בכך שריכוז הדנ"א המתקבל מכל עובר נמוך, מומלץ לנצל את רוב החומר הגנטי המתקבל לבדיקה במורד הזרם. - לאחר הגנוטיפ של כל זחל זוהה, להעביר אותם 90 מ"מ צלחות פטרי, הצבת כל גנוטיפ במנה אחרת. ממלאים את המנה בעובר בינוני 25 מ"ל ושומרים אותם באינקובטור 28 מעלות צלזיוס.
2. ביצוע פגיעה בשרירים באמצעות דקירת מחט
- לאחר הזחלים הם 4 dpf, להרדים אותם על ידי הוספת מתאנסולפונט tricaine לריכוז הסופי של 0.016% (v/v) במדיום העובר. המתן 10 דקות כדי להבטיח שהדגים הם מרדים לחלוטין, ניכר כאשר הדגים מפסיקים לשחות.
הערה: כדי למנוע הטיה, יש לסנוור את זהות הגנוטיפ לחוקר המבצע את הדקירות ואת הניתוחים במורד הזרם. - במהלך תקופה זו, להכין 24 צלחות היטב על ידי מילוי כל באר עם 1 מ"ל של מדיום עובר טרי, ולהגדיר את סטריאומיקוסקופ עם רקע שחור ואור כוח גבוה, כדי להקל על הדמיה של גבולות סומיט.
- בעזרת פיפטה מפלסטיק, מעבירים זחל אחד מרדים לצלחת פטרי חדשה.
- הסר בזהירות מדיום עובר עודף עם פיפטה, ותחת מיקרוסקופ ניתח, כוון את הדג כך שהראש נמצא בצד שמאל, זנב מימין, אזור הגב למעלה ואזור הגחון למטה (איור 1B).
- בעבודה תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש במחט 30-מד כדי לבצע דקירה מהירה אך מדויקת בשריר epaxial הממוקם מעל myoseptum אופקי. כדי להבטיח עקביות בעמדה הקדמית-אחורית, כוונו ל-1-2 סומיות הממוקמות מעל הנקבובית האנאלית(איור 1B).
הערה: הימנע דקירת הצינור העצבי ו notochord, ולעבוד במהירות כדי למנוע את ייבוש של הדגים במהלך התהליך. - בעזרת פיפטה מפלסטיק, יוצקים טיפה של מדיום עוברי על דג הזברה הנדקר ומעבירים אותו בזהירות לבאר של צלחת 24 הבאר.
- חזור על שלבים 2.3 עד 2.6. עד שכל הדגים נדקרו.
הערה: מספר זחלים ניתן לדקור יחד בהתאם למהירות העיבוד ואת מיומנותו של החוקר, כל עוד הדגים אינם מתייבשים במהלך התהליך. - לאחר שכל הזחלים נדקרו, מניחים את צלחת 24 הבאר באינקובטור 28 מעלות צלזיוס עד להדמיה הבאה.
3. הדמיה של פגיעה בשרירים והתאוששות
- ביום אחד לאחר פציעה (1 dpi), להרדמה הזחלים נדקר על ידי הוספת מתאנסולפונט tricaine לריכוז סופי של 0.016% (v/v) במדיום העובר. המתן 10 דקות כדי להבטיח שהדגים הם מרדים לחלוטין, ניכר כאשר הדגים מפסיקים לשחות.
הערה: ב 0 dpi, אתר הפצע מכיל כמות גדולה של פסולת הסלולר, מה שמקשה לכמת את היקף הפגיעה בשרירים (איור משלים 1A-B). זה לוקח בערך 18-20 שעות עבור פסולת זו להיות פינה מאתר הפצע, וככזה זה אמין יותר לדמיין זחלים ב 1 dpi, ולא 0 dpi, כדי לקבוע את היקף הפציעה עורר. - מניחים צלחת זכוכית נקייה וריקה על הבמה של המיקרוסקופ המקטב ומגדירים רקע באמצעות התוכנה המשולבת.
הערה: אין להשתמש בצלחות פטרי מפלסטיק כדי לדמות דו-קיום, מכיוון שהן אינן משדרות אור שנפר כראוי. בהתאם למיקרוסקופ המקוטב שבו נעשה שימוש, ייתכן שיידרשו הגדרות נוספות בהתאם להנחיות היצרן. - לאחר הגדרת הרקע, להסיר את צלחת מבוססי תחתית זכוכית משלב המיקרוסקופ, ושימוש פיפטה זכוכית, להעביר את הדגים מרדים, נדקר על צלחת על בסיס התחתון זכוכית.
- בזהירות להסיר את עודף של עובר בינוני באמצעות pipette, וכוון את הדגים לפי 2.5 - הראש הוא בצד שמאל, זנב בצד ימין, אזור גבי למעלה ואזור גחוני למטה.
הערה: ודאו שהזחלים רכובים שטוחים ככל האפשר, מכיוון שהרכבה לא אחידה גורמת לעוצמות שונות של birefringenceence על פני סומיטים שונים. - מניחים את המנה המבוססת על תחתית הזכוכית עם הזחלים המרדימים על במת המיקרוסקופ ומצלמים את השריר באמצעות אור מקוטב(איורים 1C ו- 1D).
הערה: בהתאם לסוג המיקרוסקופ / עדשה מקוטבת בשימוש, כיוון הדגים על צירו הקדמי-אחורי יכול להשפיע על birefringence הכולל15. הקפד לכלול לפחות 5 סומיות משני צדי אתר הפציעה בעת הדמיה. - בעזרת פיפטה מפלסטיק, יוצקים טיפה של מדיום עובר כדי לייבש מחדש את הדגים ומניחים את הדג בבאר של צלחת 24 היטב מלאה במדיום עובר.
הערה: חשוב לבצע את ההדמיה מהר ככל האפשר כדי למנוע את הדגים מתייבשים. - חזור על שלבים 3.3. ל-3.6. עד שכל הדגים יצוינו.
- לאחר שכל התמונות נרכשו, שמור אותן בתבנית .tiff עבור ניתוחים הבאים.
- מחזירים את הדג לאינקובטור 28 מעלות צלזיוס עד לביצוע הדמיה לאחר מכן ב-3 dpi (7 dpf).
- כאשר הדגים הם 3 dpi, לדמיין את הדגים לפי 3.3 עד 3.8.
- לאחר שכל הדגים צולמו, המת תקומה אותם על ידי הוספת מתאנסולפונט טריקאין לריכוז סופי של 0.2% (v/v) במדיום העובר. המתינו לפחות 10 דקות כדי להבטיח שהדגים יומתו, מה שמתבטא באובדן יכולת השחייה, שאיבת כיסויי הזימים והיעדר תגובת טיסה בעקבות מגע.
4. כימות התחדשות השרירים
- פתח תמונת dpi 1 בתוכנת ניתוח הדמיה כגון תוכנת Image J הזמינה באופן חופשי.
- באמצעות הכלי מצולע, לצייר סביב אתר הפצע, ולמדוד את האזור ואת עוצמת birefringence הממוצע של אזור זה (איורים 1C ו 1D). העתק ערכים אלה לתאים D3 ו- E3 בתבנית שסופקה (טבלה משלימה 1).
- צייר שני אזורים נוספים, שכל אחד מהם משתרע על פני 1-2 סומטים ללא פגע, ומדוד את האזור ואת עוצמת ההרחבה המשמעותית של כל אחד מהאזורים הללו(איורים 1C ו- 1D). העתק ערכים אלה לתאים D4-D5 ו- E4-E5 בתבנית שסופקה (טבלה משלימה 1).
הערה: אמנם עדיף לבחור את אותם סומיטים שלא נפגעו בתמונות 1 dpi ו- 3 dpi, אך הניתוק הלא סדיר של סיבי השריר והירידה הבאה בהסרה במוטנטים עשויים להפוך את זה לבלתי אפשרי. לכן, במקרה שלא ניתן לבחור את אותם סומיטים ב- 1 dpi ו- 3 dpi בשל הירידה בשלמות השרירים במוטנטים, בחר שני אזורים שונים אך לא מושפעים בכל אחת מנקודות הזמן. - חשב את ההשתנות המנורמלת עבור כל אזור על-ידי חלוקת עוצמת ההשתתפות הממוצעת של אזור זה לפי האזור - המוצג בעמודה F בתבנית שסופקה (טבלה משלימה 1).
- חזור על שלבים 4.1-4.4 עבור כל תמונות 1 dpi ו- 3 dpi.
הערה: בעת שימוש בתבנית שסופקה (טבלה משלימה 1), יש להוסיף את אזור 1 dpi וערכי עוצמת ה- birefringence הממוצעים בעמודות D ו- E בהתאמה, ויש להוסיף את ערכי אזור 3 dpi ועוצמת ה- birefringence הממוצעת בעמודות J ו- K בהתאמה. - עבור כל נקודת זמן, חשב את ההפרשה הנורמלית הממוצעת של שני האזורים שלא נפגעו. ערך זה מספק נקודת התייחסות של שריר לא נפגע.
הערה: בתבנית שסופקה (טבלה משלימה 1), ערך זה מחושב בעמודות G ו- M, עבור תמונות 1 dpi ו- 3 dpi בהתאמה. - לאחר מכן, לקבוע את היקף הפגיעה בשרירים ב 1 dpi, על ידי חלוקת birefringence מנורמל של אזור הפציעה על ידי birefringence מנורמל הממוצע של האזורים ללא פגע (מחושב 4.6).
הערה: באמצעות הליך דקירת מחט המפורט לעיל, זחלי wildtype בדרך כלל להראות birefringence מנורמל של 48.5 ± 14.3% באתר הפצע ב 1 dpi, המציין כי birefringence הצטמצם בכ -50% בהשוואה לסומיטים ללא פגע. בעת שימוש בתבנית (טבלה משלימה 1), ערך זה מחושב כאחוז בעמודה H. - כדי לקבוע את מידת התחדשות השרירים, חלק את ההפרשה המנורמלת של אזור הפציעה בתמונת 3 dpi, על ידי העוצמה הנורמלית הממוצעת של האזורים שלא נפגעו בשלב זה.
הערה: ב 3 dpi, זחלי wildtype בדרך כלל להראות birefringence מנורמל של 60 ± 15.3% באתר הפצע. בהתחשב בכך שההיכוד המנורמל בתוך אתר הפצע ב-1 dpi היה 48.5 ± 14.3% (שלב 4.7), העלייה ב-birefringence ב-3 dpi ל-60 ± 15.3% מצביעה על התאוששות של כ-11.5%. בעת שימוש בתבנית (טבלה משלימה 1), ערך זה מחושב כאחוז בעמודה N. - שמירה על דגים בתוך כל גנוטיפ נפרד, לבצע t-test מזווג השוואת birefringence מנורמל של אתר הפצע ב 3 dpi (שלב 4.8) עם זה של 1 dpi (שלב 4.7). זה יחשוף את המסלול של התחדשות שרירים המוצג על ידי כל דג בכל גנוטיפ, ולהדגיש אם היקף התחדשות השריר המוצג על ידי כל גנוטיפ השתנה באופן משמעותי.
- לבסוף, לחשב את המדד הרגנרטיבי על ידי חלוקת הערך המתקבל בשלב 4.8, שהוא היקף התחדשות השרירים ב 3 dpi, על ידי הערך המתקבל בשלב 4.7, שהוא היקף הפגיעה בשריר ב 1 dpi. אינדקס רגנרטיבי של 1 מציין כי הפציעה ב 1 dpi דומה 3 dpi וכי התחדשות שרירים לא התרחשה; ערך מעל 1 מציין כי ב 3 dpi שריר חדש נוצר באתר הפצע המדגיש כי השריר התחדש; ומדד רגנרטיבי של פחות מ 1 מדגיש כי הפצע ב 3 dpi הוא גרוע יותר מאשר 1 dpi, וכי התחדשות שרירים לקוי. T-test או ANOVA חד כיווני יכול להתבצע כדי להשוות סטטיסטית את היקף התחדשות השרירים בין הגנוטיפים השונים. בעת שימוש בתבנית שסופקה (טבלה משלימה 1), ערך זה מחושב בעמודה O.
הערה: מומלץ לבצע את הניסוי כולו בטריפליקאטים, עם דגים מכל ניסוי המתקבל מהורים ביולוגיים שונים, וכל ניסוי מבוצע בימים שונים, כדי למנוע כל הטיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת לכמת את ההעתקה הדו-צדדית של שריר השלד מספקת שיטה לא פולשנית אך ניתנת לשחזור רב כדי לבחון ולהשוות רמות של נזק לשרירים, ולבחון התחדשות שרירים ב- vivo. Birefringence נובע עקיפה של אור מקוטב דרך המערך פסאודו גבישי של sarcomeres שריר15, ולאחר פציעה או נזק לשריר, ניכרת ירידה birefringence ניכרת. כמו כן, ההפעלה וההבחנה של תאי גזע גורמת להיווצרות סיבי שריר חדשים בתוך אתר הפציעה, ובהמשך מגבירה את עוצמת ההפרכה באזור זה. באמצעות מערכת זו, בדקנו התחדשות שרירים במודל דג זברה של ניוון שרירים מולד סוג 1A (MDC1A), הנגרמת על ידי מחסור Lama216. מצמד של עוברים מצלב בין שני לאמה2+/- דגי זברה נאסף, וב-3 dpf, העוברים הועברו לשבב מיצוי DNA(איור 1A)ולאחר מכן גנוטי באמצעות טכנולוגיית genotyping עובר. לאחר שזיהה את הגנוטיפ, lama2-/- זחלים, אשר מודל MDC1A16, ו lama2+/+ אחים נפצעו באמצעות דקירת מחט לפי איור 1B, ותמונה על מיקרוסקופ מקוטב ב 1 dpi, ו 3 dpi, ואת עוצמות birefringence היו מכמתים. בעוד שפציעה בשרירים גורמת לירידה בעוצמת ה-birefringence ב-1 dpi (איור 1Ci ו-Di),ההתחדשות המוצלחת של השרירים גורמת לירידה בעוצמה דו-צדדית באותו אזור ( איור1Cii ו-Dii). כמו כן, ראוי לציין כי בעוד lama2+/+ זחלים להציג עוצמת birefringence אחידה (איור 1C),בשל דפוס שרירים נורמלי, עוצמת birefringence בשריר של lama2-/- היה אחיד מאוד ספורדי (איור 1D),המיוחס שלמות שריר מופחתת.
באמצעות גישה זו, אנו חושפים כי הן זחלי wildtype (lama2+/+; איור 2A) וזחלים לקויים בלאמה2 (לאמה2-/-; איור 2B), הראה עלייה משמעותית בעוצמת ההשתתפות באתר הפצע ב-3 dpi לעומת 1 dpi (איור 2C),מה שמצביע על כך שהשריר התחדש. כדי להשוות את הפוטנציאל המתחדש של זחלים בכל גנוטיפ, נקבע מדד ההתחדשות, ואנו חושפים כי lama2-/- זחלים הראו עלייה מרשימה בהתחדשות השרירים בהשוואה ללאמה2+/+ זחלים (איור 2D; ממוצע בלאמה2-/- = 1.30 ±- 0.251; ממוצע ב lama2-/- = 1.83 ± 0.439). כדי לאמת עוד יותר את ההתחדשות המשופרת ב lama2-/- זחלים, הכתמנו את השריר בנוגדן נגד F-Actin ( איורמשלים 1B-D). בעוד תוצאות אלה מאשרות כי lama2-/- אכן להתחדש, ניכר על ידי נוכחות של סיבי שריר מובחנים בתוך אתר הפצע, חוסר היכולת לבחון את אותו דגים ב 1 dpi ו 3 dpi מגביל את היכולת לכמת ולהשוות את התגובה רגנרטיבית בין lama2+/+ ו lama2-/- דגים. למרות הבסיס המכניסטי זה שיפור יכולת התחדשות lama2-/- זחלים נשאר חמקמק, אנו מאמינים כי אובדן lama2 מגדיל את מספר תאי גזע מופעלים, אשר לאחר מכן תוצאות שיפור התחדשות השריר. עם זאת, דרושים מחקרים נוספים כדי לקבוע זאת. באופן קולקטיבי, תוצאות אלה מדגישות את היכולת של הטכניקה המתוארת לזהות שינויים בהתחדשות השרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול הגנוטיפינג והתחדשות השרירים. (A) תמונה של שבב מיצוי DNA המכיל 24, 3 זחלי דגי זברה dpf. (B) שרטוט של הכיוון שבו 4 זחלי dpf צריך להיות ממוקם כדי לבצע את דקירת המחט, עם הראש בצד שמאל, זנב בצד ימין, אזור גבי למעלה ואזור הגחון למטה. דקירת המחט צריכה להתבצע באמצעות מחט 30-מד, מיקוד 1-2 סומיטים של שריר אפקסיאלי. נוצר עם BioRender.com. (סי-די) תמונות של birefringence ב lama2+/+ ולאמה2-/- זחלים ב 1 dpi ו 3 dpi. אזורים המוצגים בלבן ובאדום משקפים את האזורים המשמשים לכימות ההפרשה באתר הפצע והסומיטים שלא נפגעו בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כימות התחדשות השרירים בזחלי דגי הזברה הלומיים לאמה2. תמונות של birefringence ב lama2+/+ (A), ולאמה2-/- (B) זחלים ב 1 dpi ו 3 dpi. הפצע ב 3 dpi בשניהם, lama2+/+ ולאמה2-/- זחלים מלא בשריר חדש. (C) גרף של ההנעה המנורמלת של כל זחל ב- 1 dpi ו- 3 dpi. birefringence מנורמל באתר הפצע lama2+/+ ו lama2-/- זחלים גדל באופן משמעותי ב 3dpi, כפי שנקבע באמצעות t-test מזווג. (D) אינדקס רגנרטיבי ב lama2+/+, ו lama2-/- עם האחרון מראה התחדשות שרירים מוגברת, כפי שנקבע באמצעות t-test. קווי שגיאה מייצגים את SEM עם זחלים משלושה ניסויים עצמאיים (lama2+/+n=28 ו-lama2-/- n=16). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: בחינה של התחדשות שרירים בזחלים לקויים lama2. תמונות של birefringence ב lama2+/+ (Ai), ו lama2-/- (Aii) זחלים ב 0 dpi מדגים את נוכחותם של פסולת תאית בתוך אתר הפצע. תמונות קונפוקליות הקרנה מקסימלית של מיוטום זחל מוכתם עבור F-actin ב 0 dpi (B), 1 dpi (C) ו 3 dpi (D). ב 3 dpi, אתר הפצע של lama2+/+ ו lama2-/- זחלים מאופיין על ידי המראה של F-actin מסומן סיבי שריר. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: תבנית לכימות התחדשות השרירים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שרירים תושב רקמות מחייבים, שתפקידם משתנה במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, ובהמשך פוגע בתהליך של התחדשות השרירים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול תפוקה גבוהה כדי לבחון התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה חיים של מחלת שרירים. השלב הראשון של הצינור משתמש בפלטפורמת genotyping עובר14, שהיא שיטה ידידותית למשתמש ומדויקת כדי לקבוע את הגנוטיפ של זחלים חיים, לפני ביצוע ההתחדשות במורד הזרם assay. יתרון ישיר לכך הוא שהוא מאפשר בחירה של גנוטיפים שמעניינים בלבד, ו/או מספר דומה של דגים בתוך כל קבוצת גנוטיפ, ולכן מפחית באופן משמעותי את מספר הדגים שיש לעבד באמצעות שאר הפרוטוקול. עם זאת, ראוי לציין כי כמות הדנ"א הגנומי המתקבלת ממכשיר הגנוטיפינג העוברי נמוכה יחסית, מה שעלול לסכן במורד הזרם בדיקות גנוטיפינג. לכן חשוב שכל בדיקות הגנוטיפינג ייבדקו וימוטבו לפני השימוש בו לניסוי העיקרי. בנוסף, מקור ה- DNA הוא בעיקר אפידרמיס, וככזה, מערכת הגנוטיפינג העובר לא ניתן להשתמש בהצלחה כדי genotype זחלים הצגת מוטציות ספציפיות לרקמות.
החלק השני של הפרוטוקול מדגים את השימוש בפגיעה בדקירת מחט, שהיא טכניקה חסכונית וגבוהה שלא רק גורמת לגודל פגיעה רב לשחזור, אלא גם מספיקה כדי להפעיל את ההפעלה של תאי גזע שריריים וכתוצאה מכך התחדשות שרירים. גישה חלופית לפגיעה בשריר השלד בדגי זברה היא להשתמש בבלציה של תאים בתיווך לייזר13,17,18 . בעוד זה מספק את היכולת להתמקד ספציפי x, y ו z מטוסים ולאחר מכן למקד תאי שריר בודדים, גודל הפצע הקטן מאוד המושרה מגביל כימות מדויק של התחדשות שרירים, במיוחד במודלים של מחלות שרירים לפיה שלמות השריר כבר נפגע. לכן אנו מעדיפים את השימוש בפציעות דקירת מחט בעת בחינת התחדשות שרירים במודלים של מחלות שרירי דגי זברה.
כדי לכמת במדויק את מידת התחדשות השרירים, אנו מנצלים את האופי הדו-לשוני של שריר השלד, אשר ניתן לדמיין בקלות באמצעות מיקרוסקופ קיטוב סטנדרטי. ישנן שתי נקודות קריטיות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בגישה זו. ראשית, בהתאם לסוג המיקרוסקופ ו/או העדשה המקוטבת שבה נעשה שימוש, כיוון הדג בציר הקדמי-אחורי שלו עשוי להשפיע על עוצמת ה-birefringence הכוללת15, ויש לקחת זאת בחשבון בזמן ההדמיה. לבסוף, למרות שהתחדשות השרירים אינה שלמה לחלוטין על ידי 3 dpi, מידת ההתאוששות מספיקה כדי לאפשר את ההבחנה של יכולות התחדשות בזנים שונים13 (איור 1). העבודה הקודמת שלנו הוכיחה כי באמצעות הפרוטוקול תיארנו, זחלי wildtype להתחדש באופן מלא לאחר 14 dpi19, ולכן, כדי לקבוע אם זן לא יכול להתחדש או אם התחדשות שריר מתעכבת, ייתכן שיהיה צורך לבחון את עוצמות birefringence מעבר 3 dpi.
יש לציין כי בדגים טלוסט, צמיחת שרירים מתרחשת לאורך כל חייו של החיה20, וככזה, חשוב מאוד לנרמל את עוצמות birefringence של אתר הפצע, עם זה של סומטים ללא פגע בתוך אותו דגים. שלב זה מספק בקרה פנימית ומסיר הטיה במספר הניתוחים עקב הבדלים בכמות השרירים בנקודות הזמן השונות, או הבדלים בפרמטרי ההדמיה במהלך מפגשים שונים. שלב נורמליזציה זה הוא גם הכרחי לכמת במדויק התחדשות שרירים במודלים של מחלת שרירים, אשר עשוי מטבעו להפחית myofibrils ו / או להציג שלמות שריר נפגעת, ולאחר מכן להפחית את עוצמות birefringence הכולל. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה יכול לחשוף ביעילות שינויים ביכולת ההתחדשות של השריר, ייתכן שהם כתוצאה של השפעות עקיפות על תפקוד תאי הגזע. התחדשות שרירים היא תהליך מורכב הכולל אותות מסוגי תאים מרובים כולל תאי שריר, מקרופאגים, אבות פיברו-אדפוגניים ותאים ביניים. ייתכן כי היכולת המשתנה של השריר להתחדש אולי מוסבר על ידי שינויים בביולוגיה של כל אחד מסוגי התאים האחרים אשר לאחר מכן להשפיע על תפקוד תאי גזע שריר ואת תהליך התחדשות. לכן, בעוד פרוטוקול זה יכול לזהות שינויים בהתחדשות שרירים במודלים של מחלת שרירים, ניתוחים תאיים ומולקולריים במורד הזרם צריך להתבצע כדי לזהות את המנגנונים האחראים לשינויים שנצפו.
לסיכום, היכולת המתחדשת של השרירים במחלות שרירים שונות אינה מובנת במלואה, והופעתן של טכניקות חדשות לבחינת התחדשות שרירים ב- vivo מספקת פלטפורמה להתמודדות עם שאלות כאלה. השיטה יכולה לשמש כבסיס לחקר רמזים תאיים ומולקולריים המווסתים את התחדשות השרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר אלכס פולצ'ר, ול-מונאש מיקרו הדמיה על הסיוע בתחזוקת מיקרוסקופ והגדרתם. המכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית נתמך על ידי מענקים מממשלת מדינת ויקטוריה וממשלת אוסטרליה. עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט של האגודה לניוון שרירים (ארה"ב) ל-P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
