Summary
A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.
Abstract
O músculo esquelético tem uma notável capacidade de se regenerar após a lesão, que é impulsionada por células-tronco musculares residentes de tecido obrigatório. Após a lesão, a célula-tronco muscular é ativada e sofre proliferação celular para gerar um pool de míobios, que posteriormente se diferenciam para formar novas fibras musculares. Em muitas condições de perda muscular, incluindo distrofia muscular e envelhecimento, esse processo é prejudicado, resultando na incapacidade do músculo de se regenerar. O processo de regeneração muscular em zebrafish é altamente conservado com sistemas de mamíferos fornecendo um excelente sistema para estudar a função e a regeneração das células-tronco musculares, em condições de perda muscular, como distrofia muscular. Aqui, apresentamos um método para examinar a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular. O primeiro passo envolve o uso de uma plataforma de genotipagem que permite a determinação do genótipo das larvas antes de provocar uma lesão. Tendo determinado o genótipo, o músculo é ferido usando uma facada de agulha, seguindo a qual a microscopia de luz polarizadora é usada para determinar a extensão da regeneração muscular. Por isso, fornecemos um gasoduto de alta produtividade que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.
Introduction
O músculo esquelético é responsável por 30-50% da massa corporal humana, e não é apenas indispensável para a locomoção, mas também serve como um órgão metabólico e de armazenamento crítico1. Apesar de ser pós-metótico, o músculo esquelético é altamente dinâmico e mantém uma tremenda capacidade regenerativa após lesão. Isso é atribuído à presença de células-tronco residentes em tecidos (também chamadas de células satélites), localizadas sob a lamina basal de miofibers e marcadas pelos fatores de transcrição emparelhados da proteína da caixa 7 (pax7) e/ou proteína de caixa emparelhada 3 (pax3),entre outros2,3. Após a lesão, a célula satélite é ativada e sofre proliferação celular para gerar um pool de míobios, que posteriormente se diferenciam para formar novas fibras musculares. A cascata altamente conservada de sinais pró-regenerativos que regulam a ativação celular por satélite e o reparo muscular robusto é afetada em várias condições, como miopatias e envelhecimento homeostático4,5.
Um grupo tão diversificado de miopatias é a distrofia muscular, caracterizada pelo perda muscular progressiva e degeneração6. Essas doenças são consequência de mutações genéticas em proteínas-chave, incluindo distrofina e laminina-α2 (LAMA2), responsáveis pela fixação das fibras musculares à matriz extracelular7,8. Dado que as proteínas implicadas na distrofia muscular desempenham um papel central na manutenção da estrutura muscular, por muitos anos acreditava-se que uma falha nesse processo era o mecanismo responsável pela patogênese da doença9. No entanto, estudos recentes identificaram defeitos na regulação de células-tronco musculares e subsequente comprometimento na regeneração muscular como segunda base possível para a patologia muscular observada na distrofia muscular10,11. Como tal, mais estudos são necessários para investigar como um comprometimento na função de células-tronco musculares e elementos de nicho associados contribui para a distrofia muscular.
Na última década, o zebrafish (Danio rerio) emergiu como um importante modelo vertebrado para modelagem dedoenças 12. Isso é atribuído ao rápido desenvolvimento externo do embrião de zebrafish, aliado à sua clareza óptica, que permite a visualização direta da formação muscular, crescimento e função. Além disso, não só o desenvolvimento e estrutura do músculo altamente conservado em zebrafish, eles também apresentam um processo altamente conservado de regeneração muscular13. Consequentemente, o zebrafish representa um excelente sistema para estudar a trajetória das doenças musculares e explorar como a regeneração muscular é afetada nele. Para isso, desenvolvemos um método que permite o estudo oportuno da regeneração muscular esquelética em modelos de zebrafish de doença muscular. Este oleoduto de alto rendimento envolve um método para genótipo embriões vivos14, após o qual uma lesão agulha-facada é realizada e a extensão da regeneração muscular é imageada usando microscopia de luz polarizadora. A utilização desta técnica revelará, portanto, a capacidade regenerativa do músculo em modelos de zebrafish de doença muscular.
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Protocol
A manutenção de zebrafish foi realizada de acordo com os procedimentos operacionais padrão aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade monash sob licença de colônia de reprodução ERM14481.
1. Determinação do genótipo de embriões vivos usando uma plataforma de genotipagem de embriões.
- Anesthetize 3 dias após a fertilização (dpf) embriões de zebrafish adicionando metanos de tricaine a uma concentração final de 0,016% (v/v) em embrião médio (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 na água). Aguarde 10 minutos para garantir que os peixes estejam completamente anestesiados, evidentes quando os peixes param de nadar.
- Prepare o chip de extração de DNA de 24 câmaras descascando a película protetora clara da superfície superior do chip(Figura 1A).
- Corte a ponta de uma ponta de filtro de 20 μL para ampliar a abertura. Com isso, escolha um único embrião em um volume de 13 μL de meio de embrião e carregue na primeira câmara do chip. Repita este processo até que os embriões tenham sido dispensados em cada câmara.
NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma área com mínimos rascunhos de ar, pois o alto fluxo de ar pode causar evaporação excessiva do fluido, resultando posteriormente na redução da sensibilidade genotipagem e na sobrevivência dos embriões. - Uma vez que o número desejado de embriões tenha sido carregado no chip de extração de DNA, carregue-o na plataforma de genotipagem de embriões de zebrafish. Isso é melhor conseguido colocando-se em um lado primeiro, seguido pelo resto.
NOTA: Evite adicionar muita pressão na plataforma, pois isso pode estressar e danificar as molas subjacentes. - Afixe a tampa da plataforma magnética sobre o chip, que impedirá a evaporação da mídia embrionária durante o protocolo de extração de DNA, e feche a tampa da plataforma.
- Defina a unidade base para 2,4 volts, 0,051 A e 0,12 W e inicie o protocolo de extração de DNA pressionando o botão "ON/OFF". A plataforma deve começar a vibrar, o que pode ser avaliado tocando suavemente a tampa. O protocolo deve ser executado por 8 minutos.
NOTA: A vibração vigorosa resulta no derramamento de células epidérmicas, das quais o DNA genômico é extraído. - Enquanto o programa estiver em execução, prepare uma placa de 24 poços adicionando 1 mL de meio de embrião a cada poço, o que é necessário para separar embriões individuais enquanto ensaios de genotipagem a jusante estão sendo realizados.
- Além disso, rotule adequadamente 8 tubos de tira de poço, que serão usados para coleta de material de DNA de cada embrião.
- Na conclusão do protocolo de 8 minutos, pressione o botão ON/OFF para parar a vibração da plataforma.
- Abra a tampa da plataforma e remova suavemente a tampa magnética garantindo que a pressão mínima seja aplicada à plataforma.
- Remova cuidadosamente o chip de extração de DNA da plataforma e coloque-o em uma superfície plana.
- Da primeira câmara, remova 10 μL de mídia embrionária em torno do embrião e coloque-o no poço apropriado do tubo de tira de 8 poços. A mídia contém o material genético daquele embrião, que será usado para ensaios a jusante.
NOTA: Evite tocar no embrião com a ponta da pipeta durante a coleta de mídia, pois isso pode danificar o embrião. - Usando uma pipeta de plástico, adicione imediatamente duas gotas de meio de embrião fresco à mesma câmara. Pegue o embrião e mova-o para o primeiro poço de uma placa de 24 poços.
- Repita as etapas 1.12 e 1.13 para todas as câmaras restantes. Ao final deste, a placa de 24 poços contendo embriões vivos pode ser movida para uma incubadora de 28 °C.
- Realizar ensaios adequados de genotipagem a jusante para determinar o genótipo dos embriões.
NOTA: O DNA obtido da plataforma de genotipagem de embriões pode ser amplificado com sucesso pelo PCR e pode ser usado para análises subsequentes, incluindo sequenciamento, eletroforese de gel ou análise de derretimento de alta resolução14. Para genótipo foram utilizadas a cepa lama2 descrita nos resultados representativos, PCR, digestão de restrição e eletroforese gel. Dado que a concentração de DNA obtido de cada embrião é baixa, sugere-se utilizar a maioria, se não todos, do material genético obtido para o ensaio a jusante. - Uma vez identificado o genótipo de cada larva, transfira-as para placas de Petri de 90 mm, colocando cada genótipo em um prato diferente. Encha o prato com 25 mL médio embrião e mantenha-o na incubadora de 28 °C.
2. Realizar lesão muscular usando uma facada de agulha
- Uma vez que as larvas são 4 dpf, anestesia-as adicionando metanos de tricamina a uma concentração final de 0,016% (v/v) no meio do embrião. Aguarde 10 minutos para garantir que os peixes estejam completamente anestesiados, evidentes quando os peixes param de nadar.
NOTA: Para evitar viés, a identidade do genótipo deve ser cega para o investigador que realiza as facadas e análises a jusante. - Durante este tempo, prepare 24 placas de poço preenchendo cada poço com 1 mL de meio de embrião fresco, e configure o estereoscópio com fundo preto e luz de alta potência, para facilitar a visualização das bordas de somite.
- Usando uma pipeta de plástico, transfira uma larva anestesiada em uma nova placa de Petri.
- Remova cuidadosamente o excesso de embrião médio com uma pipeta, e sob um microscópio dissecando, oriente o peixe de tal forma que a cabeça esteja à esquerda, cauda à direita, região dorsal para cima e região ventral para baixo(Figura 1B).
- Trabalhando sob um microscópio dissecando, use uma agulha de calibre 30 para executar uma facada rápida, mas precisa no músculo epaxial localizado acima do mioseptum horizontal. Para garantir a consistência na posição anterior-posterior, aponte para 1-2 somites localizados acima do poro anal(Figura 1B).
NOTA: Evite esfaquear o tubo neural e o notochord, e trabalhe rapidamente para evitar a secagem do peixe durante o processo. - Usando uma pipeta de plástico, despeje uma gota de meio de embrião no zebrafish esfaqueado e transfira-o cuidadosamente para um poço da placa de 24 poços.
- Repita as etapas 2.3 a 2.6. até que todos os peixes tenham sido esfaqueados.
NOTA: Várias larvas podem ser esfaqueadas juntas dependendo da velocidade de processamento e proficiência do investigador, desde que os peixes não sequem durante o processo. - Uma vez que todas as larvas tenham sido esfaqueadas, coloque a placa de 24 poços na incubadora de 28 °C até que a imagem subsequente seja realizada.
3. Imagem de lesão muscular e recuperação
- Aos 1 dia de lesão pós(1 dpi), anestesiar as larvas esfaqueadas adicionando metanosulfonato de tricaína a uma concentração final de 0,016% (v/v) no meio do embrião. Aguarde 10 minutos para garantir que os peixes estejam completamente anestesiados, evidentes quando os peixes param de nadar.
NOTA: A 0 dpi, o local da ferida contém uma grande quantidade de detritos celulares, o que dificulta a quantificação da extensão da lesão muscular(Figura Suplementar 1A-B). Leva aproximadamente 18-20 horas para que esses detritos sejam retirados do local da ferida, e como tal é mais confiável para a imagem larvas a 1 dpi, em vez de 0 dpi, para determinar a extensão da lesão provocada. - Coloque um prato à base de vidro limpo e vazio no estágio do microscópio polarizador e coloque o fundo usando o software integrado.
NOTA: Não use placas de Petri de plástico para a birefringência da imagem, pois elas não transmitem adequadamente a luz refratada. Dependendo do microscópio polarizado utilizado, configurações adicionais podem ser necessárias de acordo com as diretrizes do fabricante. - Tendo definido o fundo, remova o prato à base de vidro do estágio do microscópio, e usando uma pipeta de vidro, transfira o peixe anestesiado e esfaqueado para o prato à base de fundo de vidro.
- Remova cuidadosamente o excesso de meio embrião usando uma pipeta e oriente o peixe conforme 2,5 - a cabeça está à esquerda, cauda à direita, região dorsal para cima e região ventral para baixo.
NOTA: Certifique-se de que as larvas estão montadas o mais planas possível, pois a montagem desigual resulta em diferentes intensidades de birefringência em diferentes somitas. - Coloque o prato à base de vidro com as larvas anestesiadas no estágio do microscópio e imagem do músculo usando luz polarizada(Figuras 1C & 1D).
NOTA: Dependendo do tipo de microscópio/lente polarizada utilizada, a orientação do peixe em seu eixo anterior-posterior pode afetar a birefringência geral15. Certifique-se de incluir pelo menos 5 somites em ambos os lados do local da lesão ao fotografar. - Usando uma pipeta de plástico, despeje uma gota de meio embrião para reidratar o peixe e coloque o peixe em um poço de uma placa de 24 poços cheia de meio de embrião.
NOTA: É importante realizar a imagem o mais rápido possível para evitar que o peixe seque. - Repita os passos 3.3. para 3,6. até que todos os peixes tenham sido imagens.
- Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, guarde-as em formato .tiff para análises subsequentes.
- Coloque o peixe de volta na incubadora de 28 °C até realizar imagens subsequentes em 3 dpi (7 dpf).
- Quando os peixes estiverem com 3 dpi, imagem do peixe de 3,3 a 3,8.
- Uma vez que todos os peixes tenham sido imageados, eutanize-os adicionando metanos de tricaína a uma concentração final de 0,2% (v/v) em meio de embrião. Aguarde pelo menos 10 minutos para garantir que os peixes sejam eutanizados, evidentes pela perda da capacidade de natação, bombeamento das tampas da brânquia e falta de uma resposta de voo após o toque.
4. Quantificação da regeneração muscular
- Abra uma imagem de 1 dpi em um software de análise de imagens, como o software Image J disponível gratuitamente.
- Utilizando a ferramenta polígono, desenhe ao redor do local da ferida e meça a área e a intensidade média de birefringência desta região (Figuras 1C & 1D). Copie esses valores para as células D3 e E3 no modelo fornecido (Tabela Suplementar 1).
- Desenhe duas regiões adicionais, cada uma abrangendo 1-2 somites ilesos, e meça a área e intensidades médias de birefringência de cada uma dessas regiões (Figuras 1C e 1D). Copie esses valores para as células D4-D5 e E4-E5 no modelo fornecido (Tabela Suplementar 1).
NOTA: Embora seja preferível selecionar os mesmos somites não feridos nas imagens de 1 dpi e 3 dpi, o descolamento esporádico das fibras musculares e a subsequente redução da birefringência em mutantes podem tornar isso impossível. Portanto, caso as mesmas somitas não possam ser selecionadas em 1 dpi e 3 dpi devido à redução da integridade muscular em mutantes, selecione duas áreas diferentes, mas não afetadas em cada um dos pontos de tempo. - Calcule a birefringência normalizada para cada região dividindo a intensidade média de birefringência daquela região pela área - exibida na coluna F no modelo fornecido (Tabela Suplementar 1).
- Repita as etapas 4.1-4.4 para todas as imagens de 1 dpi e 3 dpi.
NOTA: Ao utilizar o modelo fornecido (Tabela Suplementar 1), a área de 1 dpi e os valores médios de intensidade de birefringência devem ser inseridos nas colunas D e E, respectivamente, e a área de 3 dpi e valores médios de intensidade de birefringência devem ser inseridos nas colunas J e K, respectivamente. - Para cada ponto de tempo, calcule a média normalizada das duas regiões não feridas. Este valor fornece um ponto de referência do músculo ileso.
NOTA: No modelo fornecido (Tabela Suplementar 1), esse valor é computado nas colunas G e M, para as imagens de 1 dpi e 3 dpi, respectivamente. - Em seguida, determine a extensão da lesão muscular em 1 dpi, dividindo a birefringência normalizada da região da lesão pela bireringência normalizada média das regiões não feridas (calculada em 4,6).
NOTA: Utilizando o procedimento de punhalação de agulha detalhado acima, as larvas de tipo selvagem tipicamente apresentam uma bireringência normalizada de 48,5 ± 14,3% no local da ferida a 1 dpi, indicando que a birefringência reduziu em aproximadamente 50% quando comparada a somitas não feridas. Ao utilizar o modelo (Tabela Suplementar 1), esse valor é computado como uma porcentagem na coluna H. - Para determinar a extensão da regeneração muscular, divida a birefringência normalizada da região da lesão na imagem de 3 dpi, pela intensidade normalizada média das regiões não feridas nesta fase.
NOTA: A 3 dpi, as larvas de tipo selvagem normalmente apresentam uma bireringência normalizada de 60 ± 15,3% no local da ferida. Dado que a bireringência normalizada dentro do local da ferida em 1 dpi foi de 48,5 ± 14,3% (etapa 4,7), o aumento da birferência em 3 dpi para 60 ± 15,3% indica uma recuperação de aproximadamente 11,5%. Ao utilizar o modelo (Tabela Suplementar 1), esse valor é computado como uma porcentagem na coluna N. - Mantendo os peixes dentro de cada genótipo separados, realize um teste t emparelhado comparando a birefringência normalizada do local da ferida em 3 dpi (etapa 4.8) com o de 1 dpi (etapa 4.7). Isso revelará a trajetória de regeneração muscular exibida por cada peixe em cada genótipo, e destacará se a extensão da regeneração muscular exibida por cada genótipo foi significativamente alterada.
- Por fim, calcule o índice regenerativo dividindo o valor obtido na etapa 4.8, que é a extensão da regeneração muscular em 3 dpi, pelo valor obtido na etapa 4.7, que é a extensão da lesão muscular em 1 dpi. Um índice regenerativo de 1 indica que a lesão em 1 dpi é comparável a 3 dpi e que a regeneração muscular não ocorreu; um valor acima de 1 indica que a 3 dpi novo músculo se formou no local da ferida destacando que o músculo se regenerou; e um índice regenerativo de menos de 1 destaca que a ferida em 3 dpi é pior que 1 dpi, e que a regeneração muscular em prejudicada. Um teste t ou um ANOVA unidirecional pode ser realizado para comparar estatisticamente a extensão da regeneração muscular entre os diferentes genótipos. Ao utilizar o modelo fornecido (Tabela Suplementar 1), esse valor é calculado na coluna O.
NOTA: Recomenda-se realizar todo o experimento em triplicados, com peixes de cada experimento obtidos de diferentes pais biológicos, e cada experimento realizado em dias diferentes, para evitar qualquer viés.
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Representative Results
A capacidade de quantificar a birefringência do músculo esquelético fornece um método não invasivo, mas altamente reprodutível, para examinar e comparar níveis de dano muscular, e examinar a regeneração muscular in vivo. A birefringência resulta da difração da luz polarizada através da matriz pseudo-cristalina dos sarcomeres musculares15, e após lesão ou dano ao músculo, é evidente uma redução na birefringência. Da mesma forma, a ativação e diferenciação das células-tronco resulta na formação de novas fibras musculares dentro do local da lesão, aumentando posteriormente a intensidade de birefringência dentro desta região. Utilizando este sistema, examinamos a regeneração muscular em um modelo de zebrafish de distrofia muscular congênita tipo 1A (MDC1A), causada por uma deficiência em Lama216. Uma embreagem de embriões de um cruzamento entre dois lama2+/- zebrafish foi coletada, e em 3 dpf, os embriões foram transferidos para um chip de extração de DNA (Figura 1A) e, posteriormente, genótipos usando uma tecnologia de genotipagem de embriões. Tendo identificado o genótipo, lama2-/- larvas, que modelo MDC1A16, e irmãos lama2+/+ foram feridos usando uma agulha apunhalada conforme a Figura 1B, e imagens em um microscópio polarizador a 1 dpi, e 3 dpi, e as intensidades de birefringência foram quantificadas. Enquanto a lesão muscular resulta em uma redução na intensidade de birefringência em 1 dpi(Figura 1Ci e Di), a regeneração bem sucedida dos músculos resulta em aumento da birefringência na mesma região(Figura 1Cii e Dii). Destaca-se também que, enquanto as larvas lama2+/+ exibem intensidade uniforme de birefringência(Figura 1C),devido à normal padronização muscular, a intensidade de birefringência no músculo de lama2-/- foi desigual e altamente esporádica(Figura 1D),atribuída à redução da integridade muscular.
Usando essa abordagem, revelamos que ambas as larvas do tipo selvagem(lama2+/+; Figura 2A), e larvas deficientes em lama2 (lama2-/-; Figura 2B), mostrar aumento significativo da intensidade de birefringência no local da ferida em 3 dpi em comparação com 1 dpi (Figura 2C), indicando que o músculo se regenerou. Para comparar o potencial regenerativo das larvas em cada genótipo, o índice regenerativo foi determinado, e revelamos que as larvas lama2-/- apresentaram um aumento impressionante na regeneração muscular em comparação com as larvas lama2+/+ (Figura 2D; média em lama2-/- = 1,30 ±- 0,251; média em lama2-/- = 1,83 ± 0,439). Para validar ainda mais a melhor regeneração em lama2-/- larvas, manchamos o músculo com um anticorpo contra F-Actin (FiguraSuplementar 1B-D). Embora esses resultados confirmem que lama2-/- realmente se regenera, evidente pela presença de fibras musculares diferenciadas dentro do local da ferida, a incapacidade de examinar o mesmo peixe a 1 dpi e 3 dpi limita a capacidade de quantificar e comparar a resposta regenerativa entre lama2+/+ e lama2-/- peixe. Embora a base mecanicista para essa melhora da capacidade de regeneração em lama2-/- larvas permaneça evasiva, acreditamos que a perda de lama2 aumenta o número de células-tronco ativadas, o que resulta posteriormente em uma melhor regeneração muscular. No entanto, mais estudos são necessários para determinar isso. Coletivamente, esses resultados destacam que a capacidade da técnica descrita de identificar alterações na regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.
Figura 1: Visão geral do protocolo de genotipagem e regeneração muscular. (A) Imagem de um chip de extração de DNA contendo 24, 3 larvas de zebrafish dpf. (B) Esquema da orientação em que as 4 larvas dpf devem ser colocadas para realizar a facada da agulha, com a cabeça à esquerda, cauda à direita, região dorsal para cima e região ventral para baixo. A facada na agulha deve ser realizada usando uma agulha calibre 30, visando 1-2 somites de músculo epaxial. Criado com BioRender.com. (C-D) Imagens de birefringence em um lama2+/+ e lama2-/- larvas a 1 dpi e 3 dpi. Regiões mostradas em branco e vermelho refletem as áreas utilizadas para quantificar a bireringência no local da ferida e somitas não feridas, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação da regeneração muscular em larvas de zebrafish deficientes lama2. Imagens de birefringência em lama2+/+ (A) e larvas lama2-/- (B) a 1 dpi e 3 dpi. A ferida a 3 dpi em ambos, lama2+/+ e lama2-/- larvas é preenchida com novo músculo. (C) Gráfico da birefringência normalizada de cada larva a 1 dpi e 3 dpi. A birefringência normalizada no local da ferida em lama2+/+ e lama2-/- larvas é significativamente aumentada em 3dpi, conforme determinado por meio de um teste t emparelhado. (D) Índice regenerativo em lama2+/+, e lama2-/- com este último mostrando maior regeneração muscular, conforme determinado por meio de um teste T. As barras de erro representam o SEM com larvas de três experimentos independentes (lama2+/+n=28 e lama2-/- n=16). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Exame da regeneração muscular em larvas deficientes lama2. Imagens de birefringence em lama2+/+ (Ai), e larvas lama2-/- (Aii) a 0 dpi demonstrando a presença de detritos celulares dentro do local da ferida. Imagens confocalas de projeção máxima do miotome larval manchada para F-actin em 0 dpi (B), 1 dpi (C) e 3 dpi (D). Às 3 dpi, o local da ferida de lama2+/+ e lama2-/- larvas é caracterizado pelo aparecimento de fibras musculares rotuladas por F-actin. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 1: Modelo para quantificação da regeneração muscular. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos obrigatórios, cuja função é alterada em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, impedindo posteriormente o processo de regeneração muscular. Aqui, descrevemos um protocolo de alta produtividade para examinar a regeneração muscular em modelos de zebrafish vivos de doença muscular. O primeiro passo do gasoduto utiliza uma plataforma de genotipagem de embriões14, que é um método fácil de usar e preciso para determinar o genótipo de larvas vivas, antes de realizar o ensaio de regeneração a jusante. Um benefício direto disso é que permite a seleção de genótipos que são apenas de interesse, e/ou número comparável de peixes dentro de cada grupo genótipo, reduzindo significativamente o número de peixes que precisam ser processados através do resto do protocolo. No entanto, vale ressaltar que a quantidade de DNA genômico obtido do dispositivo genotipagem de embriões é relativamente baixa, o que pode comprometer os ensaios de genotipagem a jusante. Por isso, é importante que todos os ensaios de genotipagem sejam testados e otimizados antes de usá-los para o experimento principal. Além disso, a fonte do DNA é principalmente epidérmica, e como tal, o sistema de genotipagem de embriões não pode ser usado com sucesso para genótipo larvas exibindo mutações específicas do tecido.
A segunda parte do protocolo demonstra o uso de uma lesão agulha-facada, que é uma técnica econômica e de alto rendimento que não só resulta em um tamanho de lesão altamente reprodutível, mas também é suficiente para desencadear a ativação de células-tronco musculares resultando em regeneração muscular. Uma abordagem alternativa para induzir lesão muscular esquelética em zebrafish é usar ablação celular mediada a laser13,17,18 . Embora isso forneça a capacidade de se concentrar em planos específicos x, y e z e, posteriormente, atingir células musculares únicas, o tamanho extremamente pequeno da ferida induzida limita a quantificação precisa da regeneração muscular, especialmente em modelos de doenças musculares em que a integridade do músculo já está comprometida. Por isso, favorecemos o uso de lesões de agulha ao examinar a regeneração muscular em modelos de doença muscular de zebrafish.
Para quantificar com precisão a extensão da regeneração muscular, aproveitamos a natureza birefringente do músculo esquelético, que pode ser facilmente imagen usando um microscópio de polarização padrão. Há dois pontos críticos que precisam ser considerados ao utilizar essa abordagem. Em primeiro lugar, dependendo do tipo de microscópio e/ou lente polarizada utilizada, a orientação do peixe em seu eixo anterior-posterior pode afetar as intensidades gerais de birefringência15, e isso precisa ser considerado durante a imagem. Finalmente, embora a regeneração muscular não esteja totalmente completa por 3 dpi, a extensão da recuperação é suficiente para permitir a distinção das capacidades de regeneração em diferentes cepas13 (Figura 1). Nosso trabalho anterior demonstrou que, usando o protocolo que delineamos, as larvas do tipo selvagem se regeneram totalmente após 14 dpi19, e, portanto, para determinar se uma cepa não pode se regenerar ou se a regeneração muscular está atrasada, pode ser necessário examinar as intensidades de birefringência além de 3 dpi.
Deve-se notar que, em peixes teleost, o crescimento muscular ocorre ao longo da vida do animal20, e como tal, é muito importante normalizar as intensidades de birefringência do local da ferida, com a de somites não feridos dentro do mesmo peixe. Esta etapa fornece um controle interno e remove o viés nas análises devido a diferenças na quantidade de músculo nos diferentes pontos de tempo, ou diferenças nos parâmetros de imagem durante diferentes sessões. Esta etapa de normalização também é imprescindível para quantificar com precisão a regeneração muscular em modelos de doença muscular, o que pode inerentemente ter reduzido os miofibrils e/ou exibir integridade muscular comprometida, reduzindo posteriormente as intensidades globais de birefringência. Além disso, embora este protocolo possa efetivamente revelar alterações na capacidade regenerativa do músculo, é possível que eles sejam resultado de efeitos indiretos sobre a função das células-tronco. A regeneração muscular é um processo complexo que envolve sinais de múltiplos tipos de células, incluindo células musculares, macrófagos, progenitores fibro-adepogênicos e células intersticiais. É possível que a capacidade alterada do músculo de se regenerar talvez explicada por mudanças na biologia de qualquer um desses outros tipos celulares que posteriormente influenciam a função das células-tronco musculares e o processo regenerativo. Portanto, embora este protocolo possa identificar alterações na regeneração muscular em modelos de doença muscular, análises celulares e moleculares a jusante precisam ser realizadas para identificar os mecanismos responsáveis pelas alterações observadas.
Em conclusão, a capacidade regenerativa do músculo em diversas doenças musculares não é totalmente compreendida, e o surgimento de novas técnicas para examinar a regeneração muscular in vivo fornece uma plataforma para enfrentar tais questões. O método pode ser usado como base para a exploração de pistas celulares e moleculares que regulam a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Alex Fulcher e à Monash Micro Imaging pela assistência com a manutenção e configuração dos microscópios. O Instituto Australiano de Medicina Regenerativa é apoiado por subsídios do Governo do Estado de Victoria e do Governo Australiano. Este trabalho foi financiado por uma concessão de projeto da Associação de Distrofia Muscular (EUA) para P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
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