Summary
Skelettmuskelregenerering drivs av vävnad bosatta muskelstamceller, som är nedsatta i många muskelsjukdomar såsom muskeldystrofi, och detta resulterar i oförmågan hos muskler att regenerera. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter undersökning av muskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom.
Abstract
Skelettmuskeln har en anmärkningsvärd förmåga att regenerera efter skada, som drivs av obligate vävnad bosatta muskelstamceller. Efter skada aktiveras muskelstamcellen och genomgår cellproliferation för att generera en pool av myoblaster, som därefter skiljer sig från att bilda nya muskelfibrer. I många muskelförtvining villkor, inklusive muskeldystrofi och åldrande, denna process är nedsatt vilket resulterar i oförmågan hos muskler att regenerera. Processen med muskelregenerering i zebrafisk är mycket bevarad med däggdjurssystem som ger ett utmärkt system för att studera muskelstamcellsfunktion och regenerering, i muskelförtviningsförhållanden som muskeldystrofi. Här presenterar vi en metod för att undersöka muskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom. Det första steget innebär användning av en genotypningsplattform som gör det möjligt att bestämma larvernas genotyp innan en skada framkallas. Efter att ha bestämt genotypen skadas muskeln med hjälp av ett nålhugg, varefter polariserande ljusmikroskopi används för att bestämma omfattningen av muskelregenerering. Vi tillhandahåller därför en hög genomströmning pipeline som möjliggör undersökning av muskel regenerering i zebrafisk modeller av muskelsjukdom.
Introduction
Skelettmuskulatur står för 30-50% av människokroppens massa, och är inte bara oumbärlig för rörelse, men det fungerar också som ett kritiskt metaboliskt och lagringsorgan1. Trots att det är postmitotic, skelettmuskulaturen är mycket dynamisk och behåller en enorm regenerativ kapacitet efter skada. Detta tillskrivs förekomsten av vävnad bosatta stamceller (även kallade satellitceller), som ligger under basala lamina av myofibers och markeras av transkriptionsfaktorerna parat box protein 7 (pax7) och / eller parat boxprotein 3 (pax3), blandandra 2,3. Efter skada aktiveras satellitcellen och genomgår cellproliferation för att generera en pool av myoblaster, som därefter skiljer sig åt för att bilda nya muskelfibrer. Den mycket bevarade kaskaden av pro-regenerativa signaler som reglerar satellitcellsaktivering och robust muskelreparation påverkas under olika förhållanden som myopatier och homeostatiskt åldrande4,5.
En sådan mångfaldig grupp myopatier är muskeldystrofi, kännetecknad av progressiv muskelförtvining och degeneration6. Dessa sjukdomar är följden av genetiska mutationer i viktiga proteiner, inklusive dystroin och laminin-α2 (LAMA2), ansvarig för fastsättning av muskelfibrer till den extracelluläramatrisen 7,8. Med tanke på att proteiner som är inblandade i muskeldystrofi spelar en så central roll för att upprätthålla muskelstrukturen, trodde man under många år att ett misslyckande i denna process var den mekanism som ansvarar för sjukdomspatogenes9. Nyligen genomförda studier har dock identifierat defekter i regleringen av muskelstamceller och efterföljande försämring av muskelregenerering som en andra möjlig grund för muskelpatologin som observerats i muskeldystrofi10,11. Som sådan behövs ytterligare studier för att undersöka hur en försämring av muskelstamcellsfunktionen och tillhörande nischelement bidrar till muskeldystrofi.
Under det senaste decenniet har zebrafisk (Danio rerio) dykt upp som en viktig ryggradsdjur modell för sjukdom modellering12. Detta tillskrivs zebrafiskembryons snabba externa utveckling, i kombination med dess optiska klarhet, vilket möjliggör direkt visualisering av muskelbildning, tillväxt och funktion. Dessutom är inte bara utvecklingen och strukturen av muskler mycket bevarade i zebrafisk, de visar också en mycket bevarad process av muskelregenerering13. Följaktligen representerar zebrafisk ett utmärkt system för att studera patobiologin hos muskelsjukdomar och utforska hur muskelregenerering påverkas i den. För detta ändamål har vi utvecklat en metod som möjliggör snabb studie av skelettmuskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom. Denna pipeline med hög genomströmning innebär en metod för genotyp levande embryon14, varefter en nål-stab skada utförs och omfattningen av muskelregenerering avbildas med polariserande ljusmikroskopi. Användningen av denna teknik kommer därför att avslöja muskelns regenerativa kapacitet i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafiskunderhåll utfördes enligt de standardrutiner som godkänts av Monash University Animal Ethics Committee under avelskolonilicens ERM14481.
1. Bestämning av genotypen av levande embryon med hjälp av en embryogenotypningsplattform.
- Bedöva 3 dagar efter befruktning (dpf) zebrafiskembryon genom att tillsätta trikainmetansulfonat till en slutlig koncentration på 0,016% (v/v) i embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 i vatten). Vänta i 10 minuter för att säkerställa att fisken är helt bedövad, uppenbart när fisken slutar simma.
- Förbered DNA-extraktionschipet med 24 kammare genom att skala den klara skyddsfilmen från chippets övre yta (figur 1A).
- Kapa spetsen på en filterspets på 20 μL för att bredda öppningen. Använd detta, välj ett enda embryo i en 13 μL volym embryomedium och ladda i chipens första kammare. Upprepa denna process tills embryon har dispenserats i varje kammare.
OBS: Detta steg bör utföras i ett område med minimala luftutkast, eftersom högt luftflöde kan orsaka överdriven avdunstning av vätskan och därefter resultera i minskad genotypningskänslighet och överlevnad hos embryona. - När önskat antal embryon har laddats på DNA-extraktionschipet, ladda det på zebrafiskembryon genotypningsplattformen. Detta uppnås bäst genom att placera i ena sidan först, följt av resten av den.
OBS: Undvik att lägga till för mycket tryck på plattformen eftersom detta kan överbelasta och skada de underliggande fjädrarna. - Fäst det magnetiska plattformslocket över chippet, vilket förhindrar avdunstning av embryomedia under DNA-extraktionsprotokollet, och stäng plattformslocket.
- Ställ in basenheten på 2,4 volt, 0,051 A och 0,12 W och starta DNA-extraktionsprotokollet genom att trycka på "ON/OFF"-knappen. Plattformen ska börja vibrera, vilket kan bedömas genom att försiktigt vidröra locket. Protokollet ska köras i 8 minuter.
OBS: Den kraftiga vibrationen resulterar i utgjutning av epidermala celler, från vilka genomiskt DNA extraheras. - Medan programmet körs, förbered en 24 brunnsplatta genom att lägga till 1 ml embryomedium till varje brunn, vilket är nödvändigt för att separera enskilda embryon medan nedströms genotypningsanalyser utförs.
- Dessutom, på lämpligt sätt märka 8 brunnsliströr, som kommer att användas för insamling av DNA-material från varje embryo.
- När protokollet på 8 minuter är klart trycker du på ON/OFF-knappen för att stoppa vibrationerna på plattformen.
- Öppna plattformens lock och ta försiktigt bort magnetlocket så att minimalt tryck appliceras på plattformen.
- Ta försiktigt bort DNA-extraktionschipet från plattformen och placera det på en plan yta.
- Från den första kammaren, ta bort 10 μL embryomedia som omger embryot och placera det i lämplig brunn på 8-brunnsremsröret. Medierna innehåller det genetiska materialet från embryot, som kommer att användas för nedströmsanalyser.
OBS: Undvik att vidröra embryot med pipettspetsen under mediesamlingen, eftersom det kan skada embryot. - Använd en plastpipett och tillsätt omedelbart två droppar färskt embryomedium till samma kammare. Samla embryot och flytta det till den första brunnen på en 24 brunnsplatta.
- Upprepa steg 1.12 och 1.13 för alla återstående kamrar. När detta är klart kan 24 brunnsplattan som innehåller levande embryon flyttas till en inkubator på 28 °C.
- Utför lämpliga genotypningsanalyser nedströms för att bestämma embryonas genotyp.
OBS: DNA som erhålls från embryots genotypningsplattform kan framgångsrikt förstärkas av PCR och kan användas för efterföljande analys inklusive sekvensering, gelelektrofores eller högupplöst smältanalys14. Till genotyp lama2 stam beskrivs i de representativa resultaten, PCR, begränsning matsmältningen och gel elektrofores användes. Med tanke på att koncentrationen av DNA från varje embryo är låg, föreslås det att de flesta, om inte alla, av det genetiska material som erhålls för nedströmsanalysen används. - När genotypen av varje larver har identifierats, överför dem till 90 mm Petri-rätter och placera varje genotyp i en annan maträtt. Fyll skålen med 25 ml embryomedium och förvara dem i inkubatorn 28 °C.
2. Utföra muskelskada med ett nålhugg
- När larverna är 4 dpf, bedöva dem genom att tillsätta trikainmetansulfonat till en slutlig koncentration på 0,016% (v/v) i embryomedium. Vänta i 10 minuter för att säkerställa att fisken är helt bedövad, uppenbart när fisken slutar simma.
OBS: För att undvika partiskhet bör genotypens identitet förblindas för den prövare som utför knivarna och nedströmsanalyserna. - Under denna tid, förbered 24 brunnsplattor genom att fylla varje brunn med 1 ml färskt embryomedium och ställa in stereomikroskopet med en svart bakgrund och högeffektljus, för att underlätta visualiseringen av somitgränserna.
- Använd en plastpipett och överför en bedövad larva till en ny Petri-skål.
- Avlägsna försiktigt överflödigt embryomedium med en pipett och orientera fisken så att huvudet är till vänster, svansen till höger, dorsalområdet upp och ventral region nedåt(figur 1B).
- Arbeta under ett dissekerande mikroskop, använd en 30-gauge nål för att utföra ett snabbt men exakt hugg i epaxial muskeln som ligger ovanför den horisontella myoseptum. För att säkerställa konsekvens i främre bakre position, sikta på 1-2 somiter ovanför analporen(figur 1B).
OBS: Undvik att sticka neuralröret och notokordet och arbeta snabbt för att undvika torkning av fisken under processen. - Använd en plastpipett, häll en droppe embryomedium på den knivhuggna zebrafisken och överför den försiktigt till en brunn av 24-brunnsplattan.
- Upprepa steg 2.3 till 2.6. tills alla fiskar har blivit knivhuggna.
OBS: Flera larver kan huggas ihop beroende på prövarens bearbetningshastighet och färdigheter, så länge fisken inte torkar ut under processen. - När alla larver har huggits, placera 24 brunnsplattan i inkubatorn 28 °C tills efterföljande avbildning utförs.
3. Bildbehandling av muskelskada och återhämtning
- Vid 1 dag efter skada (1 dpi), bedöva de knivhuggna larverna genom att tillsätta trikain metansulfonat till en slutlig koncentration av 0,016% (v/v) i embryo medium. Vänta i 10 minuter för att säkerställa att fisken är helt bedövad, uppenbart när fisken slutar simma.
OBS: Vid 0 dpi innehåller sårplatsen en stor mängd cellulärt skräp, vilket gör det svårt att kvantifiera omfattningen av muskelskada (kompletterande figur 1A-B). Det tar ungefär 18-20 timmar för detta skräp att rensas från sårplatsen, och som sådan är det mer tillförlitligt att avbilda larver vid 1 dpi, snarare än 0 dpi, för att bestämma omfattningen av skada som framkallas. - Placera en ren och tom glasbotten baserad på scenen i det polariserande mikroskopet och ställ in bakgrunden med hjälp av den integrerade programvaran.
OBS: Använd inte petriskålar av plast för att avbilda dubbelrefringens, eftersom de inte på lämpligt sätt överför reflekterat ljus. Beroende på vilket polariserat mikroskop som används kan ytterligare inställningar krävas enligt tillverkarens riktlinjer. - Efter att ha ställt in bakgrunden, ta bort glasbottenbaserad maträtt från mikroskopstadiet och använd en glaspipett, överför den sövda, huggna fisken på glasbottenbaserad maträtt.
- Ta försiktigt bort överskottet av embryomedium med en pipett och orientera fisken enligt 2,5 - huvudet är till vänster, svansen till höger, dorsalregionen upp och ventral region ner.
OBS: Se till att larverna är monterade så platt som möjligt, eftersom ojämn montering resulterar i olika birefringensintensnivåer över olika somiter. - Placera den glasbottenbaserade skålen med de bedövade larverna på mikroskopstadiet och avbilda muskeln med polariserat ljus (Figur 1C & 1D).
OBS: Beroende på vilken typ av mikroskop/polariserad lins som används kan fiskorienteringen på dess främre bakre axel påverka den totala birefringensen15. Se till att inkludera minst 5 somiter på vardera sidan av skadestället vid avbildning. - Använd en plastpipett, häll en droppe embryomedium för att återfukta fisken och placera fisken i en brunn på en 24 brunnsplatta fylld med embryomedium.
OBS: Det är viktigt att utföra avbildningen så snabbt som möjligt för att förhindra att fisken torkar. - Upprepa steg 3.3. till 3,6. tills alla fiskar har avbildats.
- När alla bilder har förvärvats sparar du dem i .tiff format för efterföljande analyser.
- Sätt tillbaka fisken i inkubatorn på 28 °C tills den utför efterföljande avbildning vid 3 dpi (7 dpf).
- När fisken är 3 dpi, avbilda fisken enligt 3,3 till 3,8.
- När all fisk har avbildats avlivar du dem genom att tillsätta trikainmetansulfonat till en slutlig koncentration på 0,2 % (v/v) i embryomedium. Vänta i minst 10 minuter för att se till att fisken avlivas, vilket framgår av förlusten av simförmåga, pumpning av gillskydden och brist på flygrespons efter beröring.
4. Kvantifiering av muskelregenerering
- Öppna en 1 dpi-bild på en bildanalysprogramvara som den fritt tillgängliga Image J-programvaran.
- Använd polygonverktyget, rita runt sårplatsen och mät området och medelintensiteten i denna region (Figur 1C & 1D). Kopiera dessa värden till cellerna D3 och E3 i den angivna mallen (kompletterande tabell 1).
- Rita ytterligare två regioner, som var och en spänner över 1-2 oskadade somiter, och mät området och medelvärdet av birefringensintensnivåer i var och en av dessa regioner (figurerna 1C & 1D). Kopiera dessa värden till cellerna D4-D5 och E4-E5 i den angivna mallen (kompletterande tabell 1).
OBS: Även om det är att föredra att välja samma oskadade somiter i 1 dpi och 3 dpi bilder, kan sporadisk avskildhet av muskelfibrer och efterföljande minskning av birefringence i mutanter göra detta omöjligt. Därför, i händelse av att samma somiter inte kan väljas vid 1 dpi och 3 dpi på grund av minskningen av muskelintegritet i mutanter, välj två olika men opåverkade områden vid var och en av tidpunkterna. - Beräkna den normaliserade birefringensen för varje region genom att dividera regionens genomsnittliga birefringensintens med området - som visas i kolumn F i den angivna mallen (kompletterande tabell 1).
- Upprepa steg 4.1-4.4 för alla 1 dpi- och 3 dpi-bilder.
OBS: Vid användning av den angivnamallen (tilläggstabell 1)ska värdena 1 dpi-området och medelvärdet för birefringensintens infogas i kolumnerna D respektive E, och värdena 3 dpi-området respektive medelvärdet för birefringensintensitet ska infogas i kolumnerna J respektive K. - För varje tidpunkt beräknar du den genomsnittliga normaliserade birefringensen för de två oskadade regionerna. Detta värde ger en referenspunkt för oskadd muskel.
OBS: I mallen(tilläggstabell 1)beräknas det här värdet i kolumnerna G och M för bilderna 1 dpi respektive 3 dpi. - Därefter bestämma omfattningen av muskelskada vid 1 dpi, genom att dividera den normaliserade birefringensen av skaderegionen med den genomsnittliga normaliserade birefringensen i de oskadda regionerna (beräknad i 4,6).
OBS: Med hjälp av ovanstående detaljerade nål stab förfarande, wildtype larver visar vanligtvis en normaliserad birefringence på 48,5 ± 14,3% vid sårplatsen vid 1 dpi, vilket indikerar att birefringence har minskat med cirka 50% jämfört med oskadade somiter. När du använder mallen( Kompletterande tabell 1) beräknas det här värdet i procent i kolumn H. - För att bestämma omfattningen av muskelregenerering, dela den normaliserade birefringence av skaderegionen i 3 dpi bilden, med den genomsnittliga normaliserade intensiteten i de oskadda regionerna i detta skede.
OBS: Vid 3 dpi visar vildtyp larver vanligtvis en normaliserad birefringence på 60 ± 15,3% på sårplatsen. Med tanke på att den normaliserade birefringensen inom sårstället vid 1 dpi var 48,5 ± 14,3% (steg 4, 7), indikerar ökningen av birefringens vid 3 dpi till 60 ± 15,3% en återhämtning på cirka 11,5%. När du använder mallen( Kompletterande tabell 1) beräknas det här värdet som en procentandel i kolumn N. - Håll fisken inom varje genotyp separat, utför ett parat t-test som jämför sårställets normaliserade birefringens vid 3 dpi (steg 4. 8) med den 1 dpi (steg 4.7). Detta kommer att avslöja banan för muskelregenerering som visas av varje fisk i varje genotyp, och markera om omfattningen av muskelregenerering som visas av varje genotyp har förändrats avsevärt.
- Slutligen beräkna regenerativt index genom att dividera värdet som erhålls i steg 4,8, vilket är omfattningen av muskelregenerering vid 3 dpi, med det värde som erhålls i steg 4, 7, vilket är omfattningen av muskelskada vid 1 dpi. Ett regenerativt index på 1 indikerar att skadan vid 1 dpi är jämförbar med 3 dpi och att muskelregenerering inte har inträffat. ett värde över 1 indikerar att vid 3 dpi nya muskler har bildats i sårstället som belyser att muskeln har regenererats; och ett regenerativt index på mindre än 1 belyser att såret vid 3 dpi är värre än 1 dpi och att muskelregenerering i nedsatt. Ett t-test eller en enkelvägs ANOVA kan utföras för att statistiskt jämföra omfattningen av muskelregenerering mellan de olika genotyperna. När du använder den angivna mallen (tilläggstabell 1) beräknas det här värdet i kolumn O.
OBS: Det rekommenderas att utföra hela experimentet i triplikater, med fisk från varje experiment som erhållits från olika biologiska föräldrar, och varje experiment utförs på olika dagar, för att undvika fördomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan att kvantifiera birefringence av skelettmuskulatur ger en icke-invasiv men mycket reproducerbar metod för att undersöka och jämföra nivåer av muskelskador, och undersöka muskelregenerering in vivo. Birefringence är resultatet av diffraktion av polariserat ljus genom den pseudo-kristallina matrisen av muskel sarkomeres15, och efter skada eller skador på muskeln, en minskning av birefringence är uppenbart. På samma sätt resulterar aktivering och differentiering av stamceller i bildandet av nya muskelfibrer inom skadeområdet, vilket senare ökar birefringensintensiteten inom denna region. Med hjälp av detta system har vi undersökt muskelregenerering i en zebrafiskmodell av medfödd muskeldystrofi typ 1A (MDC1A), orsakad av en brist i Lama216. En koppling av embryon från en korsning mellan två lama2+/- zebrafisk samlades in, och vid 3 dpf överfördes embryona till ett DNA-extraktionschip (figur 1A) och därefter genotypade med hjälp av en embryo genotypningsteknik. Efter att ha identifierat genotypen, lama2-/- larver, som modell MDC1A16, och lama2+/+ syskon skadades med hjälp av en nål stab enligt figur 1B, och avbildas på ett polariserande mikroskop vid 1 dpi och 3 dpi, och birefringens intensiteter kvantifierades. Medan muskelskada resulterar i en minskning av birefringensintensen vid 1 dpi (figur 1Ci och Di), resulterar den framgångsrika regenereringen av muskler i ökad birefringence i samma region (Figur 1Cii och Dii). Det är också anmärkningsvärt att medan lama2+/+ larver visar enhetlig birefringens intensitet (Figur 1C), på grund av normala muskel mönstring, birefringence intensiteten i muskeln lama2-/- var ojämn och mycket sporadisk (Figur 1D), tillskrivs minskad muskelintegritet.
Med hjälp av detta tillvägagångssätt avslöjar vi att båda vildtyp larverna (lama2+/+; Figur 2A) och larver som saknas i lama2 (lama2-/-; Figur 2B), visar signifikant ökad birefringensintens i sårstället vid 3 dpi jämfört med 1 dpi (figur 2C), vilket indikerar att muskeln har regenererats. För att jämföra larvernas regenerativa potential i varje genotyp, regenerativa indexet fastställdes, och vi avslöjar att lama2-/- larver visade en slående ökning av muskelregenerering jämfört med lama2+/+ larver (Figur 2D; medelvärde i lama2-/- = 1,30 ±- 0,251; medelvärde i lama2-/- = 1,83 ± 0,439). För att ytterligare validera den förbättrade regenereringen i lama2-/- larver färgade vi muskeln med en antikropp mot F-Actin(kompletterande figur 1B-D). Medan dessa resultat bekräftar att lama2-/- verkligen regenerera, vilket framgår av närvaron av differentierade muskelfibrer inom sårområdet, begränsar oförmågan att undersöka samma fisk vid 1 dpi och 3 dpi förmågan att kvantifiera och jämföra det regenerativa svaret mellan lama2+/+ och lama2-/- fisk. Även om den mekanistiska grunden för denna förbättrade regenereringskapacitet i lama2-/- larver fortfarande är svårfångad, tror vi att förlusten av lama2 ökar antalet aktiverade stamceller, vilket senare resulterar i förbättrad muskelregenerering. Ytterligare studier behövs dock för att fastställa detta. Sammantaget belyser dessa resultat den förmågan hos den beskrivna tekniken att identifiera förändringar i muskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom.
Figur 1: Översikt över genotypnings- och muskelregenereringsprotokollet. A) Bild av ett DNA-extraktionschip som innehåller 24, 3 dpf zebrafisklarver. (B) Schematisk för den orientering i vilken de 4 dpf larverna ska placeras för att utföra nålståret, med huvudet till vänster, svansen till höger, dorsalregionen upp och ventral region ner. Nålståret ska utföras med en 30-gauge nål, riktad mot 1-2 somiter epaxial muskel. Skapad med BioRender.com. Jag (C-D) Bilder av birefringence i en lama2+/+ och lama2-/- larver vid 1 dpi och 3 dpi. Regioner som visas i vitt och rött återspeglar de områden som används för att kvantifiera birefringensen i sårområdet respektive oskadda somiter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Kvantifiering av muskelregenerering i lama2 bristfälliga zebrafisklarver. Bilder av birefringence i lama2+/+ (A) och lama2-/- (B) larver vid 1 dpi och 3 dpi. Såret vid 3 dpi i båda, lama2+/+ och lama2-/- larver är fyllda med nya muskler. c) Diagram över varje larvers normaliserade dubbelrefringens vid 1 dpi och 3 dpi. Den normaliserade birefringence i sår platsen i lama2+/+ och lama2-/- larver ökas avsevärt vid 3dpi, som bestäms med hjälp av ett parat t-test. (D) Regenerativt index i lama2+/+och lama2-/- där det senare visar ökad muskelregenerering, enligt ett t-test. Felstaplar representerar SEM med larver från tre oberoende experiment (lama2+/+n=28 och lama2-/- n=16). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Undersökning av muskelregenerering hos lama2 bristfälliga larver. Bilder av birefringence i lama2+/+ (Ai) och lama2-/- (Aii) larver vid 0 dpi visar närvaron av cellulärt skräp inom sårplatsen. Maximala projektionskonfokala bilder av larv myotome färgas för F-aktin vid 0 dpi (B), 1 dpi (C) och 3 dpi (D). Vid 3 dpi kännetecknas sårplatsen för lama2+/+ och lama2-/- larver av utseendet på F-aktinmärkta muskelfibrer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 1: Mall för kvantifiering av muskelregenerering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skelettmuskelregenerering drivs av obligate vävnad bosatta muskelstamceller, vars funktion ändras i många muskelsjukdomar såsom muskeldystrofi, därefter imped processen för muskelregenerering. Här beskriver vi ett högt genomströmningsprotokoll för att undersöka muskelregenerering i levande zebrafiskmodeller av muskelsjukdom. Det första steget i rörledningen använder en embryo genotypningsplattform14, som är en användarvänlig och exakt metod för att bestämma genotypen av levande larver, innan du utför nedströms regenereringsanalys. En direkt fördel med detta är att det gör det möjligt att välja genotyper som endast är av intresse och/eller jämförbart antal fiskar inom varje genotypgrupp, vilket avsevärt minskar antalet fiskar som behöver bearbetas genom resten av protokollet. Det är dock anmärkningsvärt att mängden genomiskt DNA som erhålls från embryot genotypningsanordning är relativt låg, vilket kan äventyra genotypningsanalyser nedströms. Det är därför viktigt att alla genotypningsanalyser testas och optimeras innan de används för huvudexperimentet. Dessutom är källan till DNA främst epidermal, och som sådan kan embryot genotypningssystem inte framgångsrikt användas för genotyplarver som visar vävnadsspecifika mutationer.
Den andra delen av protokollet visar användningen av en nål-stab skada, som är en kostnadseffektiv och hög genomströmning teknik som inte bara resulterar i en mycket reproducerbar skada storlek, men är också tillräckligt för att utlösa aktivering av muskel stamceller som resulterar i muskel regenerering. Ett alternativt tillvägagångssätt för att inducera skelettmuskelskada hos zebrafisk är att använda lasermedierad cellablation13,17,18 . Medan detta ger förmågan att fokusera på specifika x, y och z plan och därefter rikta in sig på enstaka muskelceller, den extremt små sårstorlek inducerad begränsar korrekt kvantifiering av muskelregenerering, särskilt i muskelsjukdom modeller där muskelns integritet redan äventyras. Vi föredrar därför användning av nål stab skador när undersöka muskel regenerering i zebrafisk muskelsjukdom modeller.
För att exakt kvantifiera omfattningen av muskelregenerering drar vi nytta av skelettmuskelns birefringenta natur, som lätt kan avbildas med hjälp av ett standardpolariserande mikroskop. Det finns två kritiska punkter som måste beaktas när man använder denna metod. För det första, beroende på vilken typ av mikroskop och/eller polariserad lins som används, kan fiskens orientering i dess främre bakre axel påverka övergripande birefringens intensititer15, och detta måste beaktas vid avbildning. Slutligen, även om muskelregenereringen inte är helt fullständig med 3 dpi, är återhämtningens omfattning tillräcklig för att möjliggöra åtskillnad av regenereringskapaciteten i olikastammar 13 (figur 1). Vårt tidigare arbete har visat att med hjälp av protokollet vi har beskrivit, vildtyp larver regenereras helt efter 14 dpi19, och därför, för att avgöra om en stam inte kan regenerera eller om muskelregenerering försenas, kan det vara nödvändigt att undersöka birefringensintensnivåer utöver 3 dpi.
Det måste noteras att muskeltillväxt förekommer under hela djuretsliv 20, och som sådan är det mycket viktigt att normalisera sårplatsens birefringensintensnivåer, med den hos oskadda somiter inom samma fisk. Detta steg ger en intern kontroll och tar bort partiskhet i analyserna på grund av skillnader i mängden muskler vid de olika tidpunkterna, eller skillnader i bildparametrar under olika sessioner. Detta normaliseringssteg är också absolut nödvändigt att exakt kvantifiera muskelregenerering i modeller av muskelsjukdom, som i sig kan ha minskat myofibrils och/eller visa komprometterad muskelintegritet, därefter minska övergripande birefringens intensiteter. Dessutom, medan detta protokoll effektivt kan avslöja förändringar i muskelns regenerativa kapacitet, är det möjligt att de är ett resultat av indirekta effekter på stamcellsfunktionen. Muskelregenerering är en komplex process som involverar signaler från flera celltyper inklusive muskelceller, makrofager, fibro-adepogena stamceller och interstitiella celler. Det är möjligt att muskelns förändrade förmåga att regenerera kanske förklaras av förändringar i biologin hos någon av dessa andra celltyper som senare påverkar muskelstamcellsfunktionen och regenerativa processen. Därför, medan detta protokoll kan identifiera förändringar i muskelregenerering i modeller av muskelsjukdom, nedströms cellulära och molekylära analyser måste utföras för att identifiera de mekanism(er) som ansvarar för de observerade förändringarna.
Sammanfattningsvis är muskelns regenerativa kapacitet i olika muskelsjukdomar inte helt förstådd, och framväxten av nya tekniker för att undersöka muskelregenerering in vivo ger en plattform för att ta itu med sådana frågor. Metoden kan användas som grund för utforskning av cellulära och molekylära signaler som reglerar muskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Alex Fulcher och Monash Micro Imaging för hjälp med underhåll och installation av mikroskop. Australian Regenerative Medicine Institute stöds av bidrag från delstatsregeringen i Victoria och australiensiska regeringen. Detta arbete finansierades av ett projektbidrag för muskeldystrofi (USA) till P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
