Summary
Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.
Abstract
Skeletspier heeft een opmerkelijk vermogen om te regenereren na letsel, dat wordt aangedreven door obligate weefsel ingezetene spierstamcellen. Na een blessure wordt de spierstamcel geactiveerd en ondergaat celproliferatie om een pool van myoblasten te genereren, die vervolgens differentiëren om nieuwe spiervezels te vormen. In veel spier verspillen voorwaarden, met inbegrip van spierdystrofie en veroudering, dit proces wordt aangetast, wat resulteert in het onvermogen van de spier om te regenereren. Het proces van spierregeneratie bij zebravissen is zeer geconserveerd met zoogdiersystemen die een uitstekend systeem bieden om de functie en regeneratie van spierstamcellen te bestuderen, in spierverspillende omstandigheden zoals spierdystrofie. Hier presenteren we een methode om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte. De eerste stap omvat het gebruik van een genotyperingsplatform dat de bepaling van het genotype van de larven mogelijk maakt voordat een verwonding wordt veroorzaakt. Na het genotype te hebben bepaald, wordt de spier verwond met behulp van een naaldsteek, waarna polariserende lichtmicroscopie wordt gebruikt om de mate van spierregeneratie te bepalen. We bieden daarom een pijpleiding met hoge doorvoer die het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekten.
Introduction
Skeletspieren zijn goed voor 30-50% van de menselijke lichaamsmassa en zijn niet alleen onmisbaar voor voortbeweging, maar het dient ook als een kritisch metabolisch en opslagorgaan1. Ondanks het feit dat postmitotisch, skeletspieren is zeer dynamisch en behoudt een enorme regeneratieve capaciteit na blessure. Dit wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van in weefsel ingezeten stamcellen (ook wel satellietcellen genoemd), gelegen onder de basale lamina van myofiberen en gekenmerkt door de transcriptiefactoren gekoppeld dooseiwit 7 (pax7) en/of gepaard dooseiwit 3 (pax3), onder andere2,3. Na letsel wordt de satellietcel geactiveerd en ondergaat celproliferatie om een pool van myoblasten te genereren, die vervolgens differentiëren om nieuwe spiervezels te vormen. De sterk geconserveerde cascade van pro-regeneratieve signalen die satellietcelactivering en robuust spierherstel reguleren , wordt beïnvloed in verschillende omstandigheden zoals myopathieën en homeostatische veroudering4,5.
Een dergelijke diverse groep myopathieën is spierdystrofie, gekenmerkt door progressieve spierverspilling en degeneratie6. Deze ziekten zijn het gevolg van genetische mutaties in belangrijke eiwitten, waaronder dystrofine en laminine-α2 (LAMA2), verantwoordelijk voor de aanhechting van spiervezels aan de extracellulaire matrix7,8. Gezien het feit dat eiwitten die betrokken zijn bij spierdystrofie zo'n centrale rol spelen bij het behoud van de spierstructuur, werd jarenlang aangenomen dat een mislukking in dit proces het mechanisme was dat verantwoordelijk was voor ziektepathogenese9. Recente studies hebben echter defecten in de regulatie van spierstamcellen en daaropvolgende stoornissen in spierregeneratie geïdentificeerd als een tweede mogelijke basis voor de spierpathologie waargenomen bij spierdystrofie10,11. Als zodanig zijn verdere studies nodig om te onderzoeken hoe een stoornis in de spierstamcelfunctie en bijbehorende niche-elementen bijdraagt aan spierdystrofie.
In de afgelopen tien jaar is zebravis (Danio rerio) naar voren gekomen als een belangrijk gewerveld model voor ziektemodellering12. Dit wordt toegeschreven aan de snelle externe ontwikkeling van het zebravisembryo, in combinatie met de optische helderheid, die de directe visualisatie van spiervorming, groei en functie mogelijk maakt. Bovendien is niet alleen de ontwikkeling en structuur van spieren sterk geconserveerd in zebravissen, ze vertonen ook een zeer geconserveerd proces van spierregeneratie13. Bijgevolg vertegenwoordigen zebravissen een uitstekend systeem om de pathobiologie van spierziekten te bestuderen en te onderzoeken hoe spierregeneratie erin wordt beïnvloed. Hiervoor hebben we een methode ontwikkeld die het mogelijk maakt om skeletspierregeneratie tijdig te bestuderen in zebravismodellen van spierziekten. Deze pijpleiding met hoge doorvoer omvat een methode om levende embryo's14te genotypen, waarna een naaldsteekletsel wordt uitgevoerd en de mate van spierregeneratie wordt afgebeeld met behulp van polariserende lichtmicroscopie. Het gebruik van deze techniek zal daarom het regeneratieve vermogen van spieren in zebravismodellen van spierziekte onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebravisonderhoud werd uitgevoerd volgens de standaard operationele procedures die zijn goedgekeurd door de Monash University Animal Ethics Committee onder fokkolonielicentie ERM14481.
1. Bepaling van het genotype van levende embryo's met behulp van een embryo-genotyperingsplatform.
- Verdoof 3 dagen na de bevruchting (dpf) zebravisembryo's door tricainemethaansulfaat toe te voegen aan een eindconcentratie van 0,016% (v/v) in embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 in water). Wacht 10 minuten om ervoor te zorgen dat de vis volledig verdoofd is, duidelijk wanneer de vis stopt met zwemmen.
- Bereid de DNA-extractiechip met 24 kamers voor door de doorzichtige beschermfolie van het bovenoppervlak van de chip te pellen (figuur 1A).
- Snijd de punt van een filtertip van 20 μL om de opening te verbreden. Kies hiermee een enkel embryo in een embryomedium van 13 μL en laad het in de eerste kamer van de chip. Herhaal dit proces totdat embryo's in elke kamer zijn afgegeven.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in een gebied met minimale luchtafvoer, omdat een hoge luchtstroom overmatige verdamping van de vloeistof kan veroorzaken, wat vervolgens resulteert in een verminderde genotyperingsgevoeligheid en overleving van de embryo's. - Zodra het gewenste aantal embryo's op de DNA-extractiechip is geladen, laadt u deze op het genotyperingsplatform van zebravissenembryo's. Dit kan het beste worden bereikt door eerst aan één kant te plaatsen, gevolgd door de rest.
OPMERKING: Voeg niet te veel druk toe op het platform, omdat dit de onderliggende veren kan overspannen en beschadigen. - Bevestig het magnetische platformdeksel over de chip, dat verdamping van embryomedia tijdens het DNA-extractieprotocol voorkomt en sluit het platformdeksel.
- Stel de basiseenheid in op 2,4 volt, 0,051 A en 0,12 W en start het DNA-extractieprotocol door op de knop "AAN/UIT" te drukken. Het platform moet beginnen te trillen, wat kan worden beoordeeld door het deksel voorzichtig aan te raken. Het protocol moet 8 minuten worden uitgevoerd.
OPMERKING: De krachtige trilling resulteert in het afwerpen van epidermale cellen, waaruit genomisch DNA wordt geëxtraheerd. - Terwijl het programma loopt, bereidt u een 24-putplaat voor door 1 ml embryomedium aan elke put toe te voegen, wat nodig is om individuele embryo's te scheiden terwijl downstream genotyperingstesten worden uitgevoerd.
- Label bovendien op de juiste manier 8 putstripbuizen, die zullen worden gebruikt voor het verzamelen van DNA-materiaal van elk embryo.
- Druk na afloop van het 8 minuten durende protocol op de AAN/UIT-knop om de trillingen van het platform te stoppen.
- Open het deksel van het platform en verwijder voorzichtig het magnetische deksel om ervoor te zorgen dat er minimale druk op het platform wordt uitgeoefend.
- Verwijder de DNA-extractiechip voorzichtig van het platform en plaats deze op een vlakke ondergrond.
- Verwijder uit de eerste kamer 10 μL embryomedia rond het embryo en plaats het in de juiste put van de 8-put stripbuis. De media bevatten het genetisch materiaal van dat embryo, dat zal worden gebruikt voor downstream-test.
OPMERKING: Raak het embryo niet aan met de pipettip tijdens het verzamelen van de media, omdat dit het embryo kan beschadigen. - Voeg met behulp van een plastic pipet onmiddellijk twee druppels vers embryomedium toe aan dezelfde kamer. Verzamel het embryo en verplaats het naar de eerste put van een bord met 24 put.
- Herhaal stap 1.12 en 1.13 voor alle resterende kamers. Aan het einde hiervan kan de 24 putplaat met levende embryo's worden verplaatst naar een incubator van 28 °C.
- Voer geschikte downstream genotyperingstesten uit om het genotype van de embryo's te bepalen.
OPMERKING: Het DNA verkregen uit het embryo genotyperingsplatform kan met succes worden versterkt door PCR en kan worden gebruikt voor latere analyse, waaronder sequencing, gel-elektroforese of smeltanalyse met hoge resolutie14. Om de lama2-stam te genotypen die in de representatieve resultaten wordt beschreven, werden PCR, restrictievertering en gelelektroforese gebruikt. Aangezien de concentratie DNA die uit elk embryo wordt verkregen laag is, wordt voorgesteld het meeste, zo niet alle, genetisch materiaal dat voor de downstreamtest is verkregen, te gebruiken. - Zodra het genotype van elke larve is geïdentificeerd, breng je ze over naar 90 mm Petrischalen en plaats je elk genotype in een andere schaal. Vul de schaal met 25 ml embryomedium en bewaar ze in de incubator van 28 °C.
2. Het uitvoeren van spierblessure met behulp van een naaldsteek
- Zodra de larven 4 dpf zijn, verdooft u ze door tricaïnemethaansulfaat toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,016% (v/v) in embryomedium. Wacht 10 minuten om ervoor te zorgen dat de vis volledig verdoofd is, duidelijk wanneer de vis stopt met zwemmen.
OPMERKING: Om bias te voorkomen, moet de identiteit van het genotype worden verblind door de onderzoeker die de steken en downstreamanalyses uitvoert. - Bereid gedurende deze tijd 24 putplaten voor door elke put te vullen met 1 ml vers embryomedium en stel de stereomicroscoop in met een zwarte achtergrond en hoog vermogend licht, om de visualisatie van de somietranden te vergemakkelijken.
- Breng met behulp van een plastic pipet een verdoofde larve over in een nieuwe petrischaal.
- Verwijder voorzichtig overtollig embryomedium met een pipet en onder een ontleedmicroscoop oriënteer de vis zodanig dat de kop zich links bevindt, de staart aan de rechterkant, het dorsale gebied omhoog en het ventrale gebied naar beneden (figuur 1B).
- Werk onder een ontleedmicroscoop en gebruik een 30-gauge naald om een snelle maar nauwkeurige steek uit te voeren in de epaxiale spier boven het horizontale myoseptum. Om consistentie in de voorste-posterieure positie te garanderen, streeft u naar 1-2 somieten boven de anale porie (figuur 1B).
OPMERKING: Vermijd steken van de neurale buis en notochord en werk snel om het drogen van de vis tijdens het proces te voorkomen. - Giet met behulp van een plastic pipet een druppel embryomedium op de gestoken zebravis en breng deze voorzichtig over in een put van de 24 putplaat.
- Herhaal stap 2.3 tot en met 2.6. totdat alle vissen zijn gestoken.
OPMERKING: Verschillende larven kunnen samen worden gestoken, afhankelijk van de verwerkingssnelheid en bekwaamheid van de onderzoeker, zolang de vissen tijdens het proces niet uitdrogen. - Zodra alle larven zijn gestoken, plaatst u de 24 putplaat in de incubator van 28 °C totdat de volgende beeldvorming is uitgevoerd.
3. Beeldvorming van spierblessure en herstel
- Verdoof de gestoken larven na 1 dag na het letsel (1 dpi) door tricaïnemethaansulfaat toe te voegen aan een eindconcentratie van 0,016% (v/v) in embryomedium. Wacht 10 minuten om ervoor te zorgen dat de vis volledig verdoofd is, duidelijk wanneer de vis stopt met zwemmen.
OPMERKING: Bij 0 dpi bevat de wondplaats een grote hoeveelheid cellulair puin, waardoor het moeilijk is om de omvang van spierletsel te kwantificeren (Aanvullend figuur 1A-B). Het duurt ongeveer 18-20 uur voordat dit puin van de wondplaats is verwijderd, en als zodanig is het betrouwbaarder om larven op 1 dpi in plaats van 0 dpi in beeld te brengen om de mate van letsel te bepalen. - Plaats een schone en lege glazen bodem op basis van een schotel op het podium van de polariserende microscoop en stel de achtergrond in met behulp van de geïntegreerde software.
OPMERKING: Gebruik geen plastic petrischalen om birefringence in beeld te brengen, omdat ze geen gebroken licht op de juiste manier overbrengen. Afhankelijk van de gebruikte gepolariseerde microscoop kunnen aanvullende instellingen vereist zijn volgens de richtlijnen van de fabrikant. - Nadat u de achtergrond hebt ingesteld, verwijdert u de schotel op basis van de glazen bodem uit het microscoopstadium en gebruikt u een glazen pipet en breng u de verdoofde, gestoken vis over op de schotel op basis van de glazen bodem.
- Verwijder voorzichtig het teveel aan embryomedium met behulp van een pipet en oriënteer de vis volgens 2,5 - de kop bevindt zich aan de linkerkant, staart aan de rechterkant, dorsale regio omhoog en ventrale regio naar beneden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de larven zo vlak mogelijk zijn gemonteerd, omdat ongelijkmatige montage resulteert in verschillende birefringentie-intensiteiten over verschillende somieten. - Plaats de schotel op glasbodem met de verdoofde larven op het microscoopstadium en beeld de spier in met gepolariseerd licht(figuren 1C & 1D).
OPMERKING: Afhankelijk van het type microscoop/gepolariseerde lens dat wordt gebruikt, kan de visoriëntatie op de voorste-posterieure as de algehele birefringentie beïnvloeden15. Zorg ervoor dat u ten minste 5 somieten aan weerszijden van de letselplaats opneemt bij het beeldvorming. - Giet met behulp van een plastic pipet een druppel embryomedium om de vis te rehydrateren en plaats de vis in een put van een 24-putplaat gevuld met embryomedium.
OPMERKING: Het is belangrijk om de beeldvorming zo snel mogelijk uit te voeren om te voorkomen dat de vis uitdroogt. - Herhaal stap 3.3. tot 3.6. totdat alle vissen in beeld zijn gebracht.
- Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, slaat u ze op in .tiff formaat voor latere analyses.
- Plaats de vis terug in de incubator van 28 °C totdat de volgende beeldvorming wordt uitgevoerd bij 3 dpi (7 dpf).
- Wanneer de vissen 3 dpi zijn, beeldt u de vis in volgens 3,3 tot 3,8.
- Zodra alle vissen in beeld zijn gebracht, euthanaseert u ze door tricaïnemethaansulfaat toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,2% (v/v) in embryomedium. Wacht minstens 10 minuten om ervoor te zorgen dat de vissen worden geëuthanaseerd, wat blijkt uit het verlies van zwemvaardigheid, het pompen van de kieuwdeksels en het ontbreken van een vluchtreactie na aanraking.
4. Kwantificering van spierregeneratie
- Open een afbeelding van 1 dpi op een imaging-analysesoftware, zoals de vrij beschikbare Image J-software.
- Teken met behulp van het gereedschap veelhoek rond de wondplaats en meet het gebied en de gemiddelde birefringentie-intensiteit van dit gebied (figuren 1C & 1D). Kopieer deze waarden naar de cellen D3 en E3 in de meegeleverde sjabloon (Aanvullende tabel 1).
- Teken twee extra regio's, elk verspreid over 1-2 ongewonde somieten, en meet het gebied en de gemiddelde birefringentie-intensiteiten van elk van deze regio's (Figuren 1C & 1D). Kopieer deze waarden naar de cellen D4-D5 en E4-E5 in de meegeleverde sjabloon (Aanvullende tabel 1).
OPMERKING: Hoewel het de voorkeur verdient om dezelfde ongeïmproveerde somieten te selecteren in de afbeeldingen van 1 dpi en 3 dpi, kunnen de sporadische loslating van spiervezels en de daaropvolgende vermindering van birefringentie bij mutanten dit onmogelijk maken. Daarom, in het geval dat dezelfde somieten niet kunnen worden geselecteerd op 1 dpi en 3 dpi vanwege de vermindering van spierintegriteit in mutanten, selecteert u twee verschillende maar niet-beïnvloede gebieden op elk van de tijdspunten. - Bereken de genormaliseerde birefringentie voor elk gebied door de gemiddelde birefringentie-intensiteit van dat gebied te delen door het gebied - weergegeven in kolom F in de meegeleverde sjabloon (Aanvullende tabel 1).
- Herhaal stap 4.1-4.4 voor alle 1 dpi en 3 dpi afbeeldingen.
OPMERKING: Bij gebruik van de meegeleverde sjabloon(aanvullende tabel 1)moeten de waarden voor de intensiteit van het gebied van 1 dpi en de gemiddelde birefringentie-intensiteit worden ingevoegd in respectievelijk de kolommen D en E, en de waarden voor het gebied van 3 dpi en de gemiddelde birefringentie-intensiteitswaarden moeten worden ingevoegd in respectievelijk de kolommen J en K. - Bereken voor elk tijdspunt de gemiddelde genormaliseerde birefringentie van de twee niet-gewonde regio's. Deze waarde biedt een referentiepunt van niet-gewonde spieren.
OPMERKING: In demeegeleverde sjabloon (aanvullende tabel 1)wordt deze waarde berekend in kolommen G en M, voor respectievelijk de afbeeldingen van 1 dpi en 3 dpi. - Bepaal vervolgens de omvang van spierblessures bij 1 dpi, door de genormaliseerde birefringentie van het letselgebied te delen door de gemiddelde genormaliseerde birefringentie van de niet-gewonde regio's (berekend in 4,6).
OPMERKING: Met behulp van de bovenstaande gedetailleerde naaldsteekprocedure vertonen wildtypelarven meestal een genormaliseerde birefringentie van 48,5 ± 14,3% op de wondplaats bij 1 dpi, wat aangeeft dat de birefringentie met ongeveer 50% is afgenomen in vergelijking met niet-gewonde somieten. Wanneer u de sjabloon (Aanvullende tabel 1 )gebruikt, wordt deze waarde berekend als een percentage in kolom H. - Om de mate van spierregeneratie te bepalen, deelt u de genormaliseerde birefringentie van het letselgebied in het 3 dpi-beeld door de gemiddelde genormaliseerde intensiteit van de niet-gewonde regio's in dit stadium.
OPMERKING: Bij 3 dpi vertonen wildtypelarven meestal een genormaliseerde birefringentie van 60 ± 15,3% op de wondplaats. Aangezien de genormaliseerde birefringentie binnen de wondplaats bij 1 dpi 48,5 ± 14,3% was (stap 4.7), duidt de toename van birefringentie bij 3 dpi tot 60 ± 15,3% op een herstel van ongeveer 11,5%. Wanneer u de sjabloon (aanvullende tabel 1 )gebruikt, wordt deze waarde berekend als een percentage in kolom N. - Houd vissen binnen elk genotype gescheiden, voer een gekoppelde t-test uit waarbij de genormaliseerde birefringentie van de wondplaats bij 3 dpi (stap 4.8) wordt vergeleken met die van 1 dpi (stap 4.7). Dit zal het traject van spierregeneratie onthullen dat door elke vis in elk genotype wordt weergegeven, en benadrukken of de mate van spierregeneratie die door elk genotype wordt weergegeven, aanzienlijk is veranderd.
- Bereken ten slotte de regeneratieve index door de waarde verkregen in stap 4.8, de mate van spierregeneratie bij 3 dpi, te delen door de waarde verkregen in stap 4.7, namelijk de mate van spierblessure bij 1 dpi. Een regeneratieve index van 1 geeft aan dat de blessure bij 1 dpi vergelijkbaar is met 3 dpi en dat spierregeneratie niet heeft plaatsgevonden; een waarde boven 1 geeft aan dat zich bij 3 dpi nieuwe spieren hebben gevormd op de wondplaats die benadrukt dat de spier is geregenereerd; en een regeneratieve index van minder dan 1 benadrukt dat de wond bij 3 dpi erger is dan 1 dpi, en dat spierregeneratie bij verminderde. Een t-test of een eenrichtings ANOVA kan worden uitgevoerd om de mate van spierregeneratie tussen de verschillende genotypen statistisch te vergelijken. Bij gebruik van de meegeleverde sjabloon (aanvullende tabel 1) wordt deze waarde berekend in kolom O.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het hele experiment uit te voeren in drievoud, met vissen uit elk experiment verkregen van verschillende biologische ouders, en elk experiment uitgevoerd op verschillende dagen, om elke bias te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vermogen om birefringentie van skeletspieren te kwantificeren biedt een niet-invasieve maar zeer reproduceerbare methode om niveaus van spierschade te onderzoeken en te vergelijken en spierregeneratie in vivote onderzoeken . Birefringentie is het gevolg van de diffractie van gepolariseerd licht door de pseudokristallijne array van de spiersarcoom15, en na letsel of schade aan de spier is een vermindering van birefringentie duidelijk. Evenzo resulteert de activering en differentiatie van stamcellen in de vorming van nieuwe spiervezels binnen de blessureplaats, waardoor de birefringentie-intensiteit binnen dit gebied toeneemt. Met behulp van dit systeem hebben we spierregeneratie onderzocht in een zebravismodel van congenitale spierdystrofie type 1A (MDC1A), veroorzaakt door een tekort aan Lama216. Een koppeling van embryo's van een kruising tussen twee lama2+/- zebravissen werd verzameld en bij 3 dpf werden de embryo's overgebracht naar een DNA-extractiechip (figuur 1A) en vervolgens genotoxiceerd met behulp van een embryo-genotyperingstechnologie. Nadat ze het genotype hadden geïdentificeerd, werden lama2-/- larven, die MDC1A16modelleren, en lama2+/+ broers en zussen gewond geraakt met behulp van een naaldsteek volgens figuur 1B, en afgebeeld op een polariserende microscoop met 1 dpi en 3 dpi, en de birefringentie-intensiteiten werden gekwantificeerd. Hoewel spierblessures resulteren in een vermindering van de birefringentie-intensiteit bij 1 dpi (figuur 1Ci en Di), resulteert de succesvolle regeneratie van spieren in een verhoogde birefringentie in dezelfde regio (figuur 1Cii en Dii). Het is ook opmerkelijk dat, hoewel lama2+/+ larven een uniforme birefringentie-intensiteit vertonen(figuur 1C),als gevolg van normale spierpatronen, de birefringentie-intensiteit in de spier van lama2-/- ongelijk en zeer sporadisch was(figuur 1D),toegeschreven aan verminderde spierintegriteit.
Met deze aanpak onthullen we dat beide wildtypelarven (lama2+/+; Figuur 2A), en larven met een tekort aan lama2 (lama2-/-; Figuur 2B), tonen significant verhoogde birefringentie intensiteit in de wond site op 3 dpi in vergelijking met 1 dpi (Figuur 2C), wat aangeeft dat de spier is geregenereerd. Om het regeneratieve potentieel van larven in elk genotype te vergelijken, werd de regeneratieve index bepaald en we onthullen dat lama2-/- larven een opvallende toename van spierregeneratie vertoonden in vergelijking met lama2+/+ larven (Figuur 2D; gemiddelde in lama2-/- = 1,30 ±- 0,251; gemiddelde in lama2-/- = 1,83 ± 0,439). Om de verbeterde regeneratie bij lama2-/- larven verder te valideren, hebben we de spier bevlekt met een antilichaam tegen F-Actin (Aanvullend Figuur 1B-D). Hoewel deze resultaten bevestigen dat lama2-/- inderdaad regenereert, wat blijkt uit de aanwezigheid van gedifferentieerde spiervezels in de wondplaats, beperkt het onvermogen om dezelfde vis te onderzoeken bij 1 dpi en 3 dpi het vermogen om de regeneratieve respons tussen lama2+/+ en lama2-/- vissen te kwantificeren en te vergelijken. Hoewel de mechanistische basis voor deze verbeterde regeneratiecapaciteit in lama2-/- larven ongrijpbaar blijft, geloven we dat het verlies van lama2 het aantal geactiveerde stamcellen verhoogt, wat vervolgens resulteert in verbeterde spierregeneratie. Er zijn echter verdere studies nodig om dit vast te stellen. Gezamenlijk benadrukken deze resultaten dat vermogen van de beschreven techniek om veranderingen in spierregeneratie te identificeren in zebravismodellen van spierziekte.
Figuur 1: Overzicht van het genotyperings- en spierregeneratieprotocol. (A) Afbeelding van een DNA-extractiechip met 24, 3 dpf zebravislarven. (B) Schematische van de oriëntatie waarin de 4 dpf larven moeten worden geplaatst om de naaldsteek uit te voeren, met de kop aan de linkerkant, staart aan de rechterkant, dorsale regio omhoog en ventrale regio naar beneden. De naaldsteek moet worden uitgevoerd met behulp van een 30-gauge naald, gericht op 1-2 somieten van epaxiale spier. Gemaakt met BioRender.com. (C-D) Afbeeldingen van birefringentie in een lama2+/+ en lama2-/- larven bij 1 dpi en 3 dpi. De in wit en rood weergegeven gebieden weerspiegelen de gebieden die worden gebruikt om respectievelijk de birefringentie in de wondplaats en niet-gewonde somieten te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering van spierregeneratie bij lama2-deficiënte zebravislarven. Afbeeldingen van birefringentie in lama2+/+ (A), en lama2-/- (B) larven bij 1 dpi en 3 dpi. De wond bij 3 dpi in beide, lama2+/+ en lama2-/- larven is gevuld met nieuwe spieren. (C) Grafiek van de genormaliseerde birefringentie van elke larve bij 1 dpi en 3 dpi. De genormaliseerde birefringentie in de wondplaats in lama2+/+ en lama2-/- larven wordt significant verhoogd bij 3dpi, zoals bepaald met behulp van een gepaarde t-test. (D) Regeneratieve index in lama2+/+, en lama2-/- waarbij de laatste een verhoogde spierregeneratie vertoont, zoals bepaald met behulp van een t-test. Foutbalken vertegenwoordigen SEM met larven uit drie onafhankelijke experimenten (lama2+/+n=28 en lama2-/- n=16). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Onderzoek naar spierregeneratie bij lama2-deficiënte larven. Afbeeldingen van birefringentie in lama2+/+ (Ai) en lama2-/- (Aii) larven bij 0 dpi die de aanwezigheid van cellulair puin in de wondplaats aantonen. Maximale projectie confocale afbeeldingen van de larvale myotoom gekleurd voor F-actine bij 0 dpi (B), 1 dpi (C) en 3 dpi (D). Bij 3 dpi wordt de wondplaats van lama2+/+ en lama2-/- larven gekenmerkt door het verschijnen van F-actine gelabelde spiervezels. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Sjabloon voor de kwantificering van spierregeneratie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door obligate weefsel ingezetene spierstamcellen, waarvan de functie wordt gewijzigd bij veel spierziekten zoals spierdystrofie, waardoor het proces van spierregeneratie wordt belemmerd. Hier beschrijven we een protocol met hoge doorvoer om spierregeneratie te onderzoeken in levende zebravismodellen van spierziekte. De eerste stap van de pijpleiding maakt gebruik van een embryo genotypering platform14, dat is een gebruiksvriendelijke en nauwkeurige methode om het genotype van levende larven te bepalen, voordat de downstream regeneratietest wordt uitgevoerd. Een direct voordeel hiervan is dat het de selectie mogelijk maakt van genotypen die alleen van belang zijn, en/of een vergelijkbaar aantal vissen binnen elke genotypegroep, waardoor het aantal vissen dat via de rest van het protocol moet worden verwerkt, aanzienlijk wordt verminderd. Het is echter opmerkelijk dat de hoeveelheid genomisch DNA die wordt verkregen uit het embryo-genotyperingsapparaat relatief laag is, wat downstream genotyperingstesten in gevaar kan brengen. Het is daarom belangrijk dat alle genotyperingstesten worden getest en geoptimaliseerd voordat ze worden gebruikt voor het hoofdexperiment. Bovendien is de bron van het DNA voornamelijk epidermaal en als zodanig kan het embryogenotyperingssysteem niet met succes worden gebruikt om larven te genotyperen die weefselspecifieke mutaties vertonen.
Het tweede deel van het protocol toont het gebruik van een naaldsteekblessure, een kosteneffectieve en hoge doorvoertechniek die niet alleen resulteert in een zeer reproduceerbare blessuregrootte, maar ook voldoende is om de activering van spierstamcellen te activeren, wat resulteert in spierregeneratie. Een alternatieve benadering voor het induceren van skeletspierletsel bij zebravissen is het gebruik van lasergemedieerde celablatie13,17,18 . Hoewel dit de mogelijkheid biedt om zich te concentreren op specifieke x-, y- en z-vlakken en vervolgens gericht te zijn op enkele spiercellen, beperkt de extreem kleine wondgrootte nauwkeurige kwantificering van spierregeneratie, vooral in spierziektemodellen waarbij de integriteit van spieren al in gevaar is. We geven daarom de voorkeur aan het gebruik van naaldsteekblessures bij het onderzoeken van spierregeneratie in zebravisspierziektemodellen.
Om de mate van spierregeneratie nauwkeurig te kwantificeren, maken we gebruik van de birefringente aard van skeletspieren, die gemakkelijk kunnen worden afgebeeld met behulp van een standaard polariserende microscoop. Er zijn twee kritieke punten waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van deze aanpak. Ten eerste, afhankelijk van het type microscoop en/of gepolariseerde lens dat wordt gebruikt, kan de oriëntatie van de vis in zijn voorste-achterste as de algehele birefringentie intensitieten15beïnvloeden, en dit moet worden overwogen tijdens het beeldvorming. Ten slotte is, hoewel spierregeneratie niet volledig is voltooid met 3 dpi, de mate van herstel voldoende om het onderscheid van regeneratiecapaciteiten in verschillende stammen mogelijk te maken13 (figuur 1). Ons vorige werk heeft aangetoond dat met behulp van het protocol dat we hebben geschetst, wildtypelarven volledig regenereren na 14 dpi19, en daarom, om te bepalen of een stam niet kan regenereren of als spierregeneratie wordt vertraagd, het nodig kan zijn om de birefringentieintensiteiten boven 3 dpi te onderzoeken.
Opgemerkt moet worden dat bij teleostvissen spiergroei optreedt gedurende het hele leven van het dier20, en als zodanig is het erg belangrijk om de birefringentieintensiteiten van de wondplaats te normaliseren, met die van ongewonde somieten in dezelfde vis. Deze stap biedt een interne controle en verwijdert bias in de analyses als gevolg van verschillen in de hoeveelheid spieren op de verschillende tijdstippen, of verschillen in beeldvormingsparameters tijdens verschillende sessies. Deze normalisatiestap is ook noodzakelijk om spierregeneratie nauwkeurig te kwantificeren in modellen van spierziekte, die inherent myofibrils kunnen hebben verminderd en/ of gecompromitteerde spierintegriteit vertonen, waardoor vervolgens de algehele birefringentieintensiteiten worden verminderd. Bovendien, hoewel dit protocol effectief veranderingen in het regeneratieve vermogen van spieren kan onthullen, is het mogelijk dat ze het gevolg zijn van indirecte effecten op de stamcelfunctie. Spierregeneratie is een complex proces met signalen van meerdere celtypen, waaronder spiercellen, macrofagen, fibro-adepogene voorlopers en interstitiële cellen. Het is mogelijk dat het veranderde vermogen van spieren om te regenereren misschien wordt verklaard door veranderingen in de biologie van een van deze andere celtypen die vervolgens de spierstamcelfunctie en het regeneratieve proces beïnvloeden. Daarom, hoewel dit protocol veranderingen in spierregeneratie in modellen van spierziekte kan identificeren, moeten downstream cellulaire en moleculaire analyses worden uitgevoerd om het mechanisme (de mechanismen) te identificeren dat verantwoordelijk is (zijn) voor de waargenomen veranderingen.
Concluderend, het regeneratieve vermogen van spieren bij verschillende spierziekten is niet volledig begrepen, en de opkomst van nieuwe technieken om spierregeneratie in vivo te onderzoeken, biedt een platform om dergelijke vragen aan te pakken. De methode kan worden gebruikt als basis voor de exploratie van cellulaire en moleculaire signalen die spierregeneratie reguleren in zebravismodellen van spierziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We willen Dr. Alex Fulcher en Monash Micro Imaging bedanken voor hulp bij het onderhoud en de installatie van microscopen. Het Australian Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door subsidies van de staatsregering van Victoria en de Australische regering. Dit werk werd gefinancierd door een projectsubsidie van de Muscular Dystrophy Association (USA) aan P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
