Summary
İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
İskelet kası, zorunlu doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilen yaralanmadan sonra yenilenme konusunda dikkat çekici bir yete sahiptir. Yaralanmadan sonra, kas kök hücresi aktive edilir ve daha sonra yeni kas lifleri oluşturmak için farklılaşarak bir mioblast havuzu oluşturmak için hücre çoğalmasından geçer. Kas distrofisi ve yaşlanma da dahil olmak üzere birçok kas israfı koşulunda, bu işlem bozulur ve bu da kasın yenilenememesine neden olur. Zebra balıklarında kas yenilenme süreci, kas distrofisi gibi kas israfı koşullarında kas kök hücre fonksiyonunu ve yenilenmeyi incelemek için mükemmel bir sistem sağlayan memeli sistemleri ile yüksek oranda korunur. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesini incelemek için bir yöntem sunuyoruz. İlk adım, bir yaralanma ortaya çıkmadan önce larvaların genotipinin belirlenmesine izin veren bir genotipleme platformunun kullanılmasını içerir. Genotip belirlendikten sonra, kas bir iğne bıçağı kullanılarak kas yaralanır, ardından kas yenilenmesinin boyutunu belirlemek için polarize edici ışık mikroskopisi kullanılır. Bu nedenle, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan yüksek verimli bir boru hattı sağlıyoruz.
Introduction
İskelet kası insan vücut kütlesinin% 30-50'sini oluşturur ve sadece hareketlilik için vazgeçilmez değildir, aynı zamanda kritik bir metabolik ve depolama organı olarak da hizmet eder1. Postmitotik olmasına rağmen, iskelet kası son derece dinamiktir ve yaralanmadan sonra muazzam bir rejeneratif kapasiteye sahip olur. Bu, miyofiberlerin bazal laminası altında bulunan ve transkripsiyon faktörleri ile işaretlenmiş kutu protein 7 ( pax7 ) ve / veya eşleştirilmiş kutu protein 3( pax3 ) ile işaretlenmiş doku yerleşik kök hücrelerin (uydu hücreleri olarak da adlandırılır) varlığınaatfedilir. Yaralanmadan sonra, uydu hücresi aktive edilir ve daha sonra yeni kas lifleri oluşturmak için farklılaşılan bir mioblast havuzu oluşturmak için hücre çoğalmasından geçer. Uydu hücresi aktivasyonunu ve sağlam kas onarımını düzenleyen pro-rejeneratif sinyallerin yüksek oranda korunmuş kaskadı miyopatiler ve homeostatik yaşlanma4,5gibi çeşitli durumlarda etkilenir.
Bu kadar çeşitli miyopatilerden biri, ilerleyici kas israfı ve dejenerasyon ile karakterize kas distrofisidir6. Bu hastalıklar, kas liflerinin hücre dışı matris7,8'ebağlanmasından sorumlu olan distrofin ve laminin-α2 (LAMA2) dahil olmak üzere anahtar proteinlerdeki genetik mutasyonların sonucudur. Kas distrofisine karışan proteinlerin kas yapısının korunmasında bu kadar merkezi bir rol oynadığı göz önüne alındığında, uzun yıllar boyunca bu süreçteki bir başarısızlığın hastalık patogenezden sorumlu mekanizma olduğuna inanılıyordu9. Bununla birlikte, son çalışmalar kas kök hücrelerinin düzenlenmesinde kusurlar ve kas yenilenmesinde daha sonra bozulmayı kas distrofisinde gözlenen kas patolojisinin ikinci olası temeli olarak tanımlamıştır10,11. Bu nedenle, kas kök hücre fonksiyonundaki ve ilişkili niş elemanlardaki bir bozukluğun kas distrofisine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Son on yılda, zebra balığı (Danio rerio) hastalık modellemesi için önemli bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmıştır12. Bu, zebra balığı embriyosunun hızlı dış gelişimine, kas oluşumunun, büyümesinin ve işlevinin doğrudan görselleştirilmesine izin veren optik netliği ile birleştiğinde atfedilir. Ek olarak, sadece zebra balıklarında yüksek oranda korunan kas gelişimi ve yapısı değil, aynı zamanda yüksek oranda korunmuş bir kas rejenerasyon sürecigösterirler 13. Sonuç olarak, zebra balığı kas hastalıklarının patobiyolojisini incelemek ve kas yenilenmesinin içinde nasıl etkilendiğini keşfetmek için mükemmel bir sistemi temsil eder. Bu amaçla, kas hastalığının zebra balığı modellerinde iskelet kas rejenerasyonunun zamanında incelenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Bu yüksek verim boru hattı genotip canlı embriyolar için bir yöntem içerir14, ardından bir iğne-bıçak yaralanması gerçekleştirilir ve kas rejenerasyonunun boyutu polarize ışık mikroskopisi kullanılarak görüntülenmiştir. Bu nedenle bu tekniğin kullanımı, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kasın rejeneratif kapasitesini ortaya getirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balığı bakımı, Monash Üniversitesi Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanan standart işletme prosedürlerine göre, üreme kolonisi lisansı ERM14481 kapsamında gerçekleştirildi.
1. Embriyo genotip platformu kullanılarak canlı embriyoların genotipinin belirlenmesi.
- Embriyo ortamında (5 mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO4) embriyo ortamında %0.016 (v/v) nihai konsantrasyona trikain metansülfonat ekleyerek döllenme sonrası3gün (dpf) zebra balığı embriyolarını uyuşturun. Balıkların yüzmeyi bıraktığında belirgin olarak tamamen uyuşturulmasını sağlamak için 10 dakika bekleyin.
- Şeffaf koruyucu filmi çipin üst yüzeyinden soyarak 24 oda DNA ekstraksiyon çipini hazırlayın (Şekil 1A).
- Açıklığı genişletmek için 20 μL filtre ucunun ucunu kesin. Bunu kullanarak, 13 μL'lik embriyo ortamında tek bir embriyo seçin ve çipin ilk odasına yükleyin. Embriyolar her odaya dağıtılana kadar bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Bu adım minimum hava cereyanları olan bir alanda yapılmalıdır, çünkü yüksek hava akışı sıvının aşırı buharlaşmasına neden olabilir ve daha sonra genotip hassasiyetinin azalmasına ve embriyoların hayatta kalmasına neden olabilir. - İstenilen sayıda embriyo DNA ekstraksiyon çipine yüklendikten sonra zebra balığı embriyo genotipleme platformuna yükleyin. Bu en iyi önce bir tarafa, ardından geri kalanına yerleştirilerek elde edilir.
NOT: Platforma çok fazla baskı eklemekten kaçının, çünkü bu, alttaki yayları aşabilir ve zarar verebilir. - DNA ekstraksiyon protokolü sırasında embriyo ortamlarının buharlaşmasını önleyecek manyetik platform kapağını çipin üzerine yapıştırın ve platform kapağını kapatın.
- Taban ünitesini 2,4 volt, 0,051 A ve 0,12 W olarak ayarlayın ve "AÇ/KAPA" düğmesine basarak DNA çıkarma protokolünü başlatın. Platform titreşime başlamalıdır, bu da kapağı hafifçe dokunarak değerlendirilebilir. Protokol 8 dakika çalıştırılmalıdır.
NOT: Güçlü titreşim, genomik DNA'nın çıkarıldığı epidermal hücrelerin dökülmesiyle sonuçlanır. - Program çalışırken, aşağı akış genotipleme tahlilleri yapılırken bireysel embriyoları ayırmak için gerekli olan her kuyuya 1 mL embriyo ortamı ekleyerek 24 kuyu plakası hazırlayın.
- Ayrıca, her embriyodan DNA materyali toplanması için kullanılacak 8 kuyu şeridi tüpünü uygun şekilde etiketlenin.
- 8 dakikalık protokolün tamamlanmasıyla, platformun titreşimini durdurmak için KAPA/KAPA düğmesine basın.
- Platformun kapağını açın ve platforma minimum basınç uygulanmasını sağlamak için manyetik kapağı hafifçe çıkarın.
- DNA ekstraksiyon çipini platformdan dikkatlice çıkarın ve düz bir yüzeye yerleştirin.
- İlk odadan, embriyoyu çevreleyen 10 μL embriyo medyasını çıkarın ve 8 kuyulu şerit tüpün uygun kuyusuna yerleştirin. Medya, o embriyonun genetik materyalini içeriyor.
NOT: Embriyoya zarar verebileceğinden, ortam toplama sırasında pipet ucu ile embriyoya dokunmaktan kaçının. - Plastik bir pipet kullanarak, hemen aynı odaya iki damla taze embriyo ortamı ekleyin. Embriyoyu toplayın ve 24 kuyu plakasının ilk kuyusuna taşıyın.
- Kalan tüm odalar için 1.12 ve 1.13 adımlarını yineleyin. Bunun tamamlanmasıyla, canlı embriyo içeren 24 kuyu plakası 28 °C inkübatöre taşınabilir.
- Embriyoların genotipini belirlemek için uygun aşağı akış genotipleme tahlilleri gerçekleştirin.
NOT: Embriyo genotipleme platformundan elde edilen DNA PCR tarafından başarıyla yükseltilebilir ve sıralama, jel elektroforez veya yüksek çözünürlüklü erime analizi dahil olmak üzere sonraki analizler için kullanılabilir14. Temsili sonuçlarda açıklanan lama2 suşunu genotiplamak için PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi kullanılmıştır. Her embriyodan elde edilen DNA konsantrasyonunun düşük olduğu göz önüne alındığında, aşağı akış testi için elde edilen genetik materyalin hepsi olmasa da çoğundan yararlanıldığı önerilmektedir. - Her larvanın genotipi belirlendikten sonra, her genotipi farklı bir yemeğe yerleştirerek 90 mm Petri tabaklarına aktarın. Yemeği 25 mL embriyo ortamı ile doldurun ve 28 °C inkübatörde tutun.
2. İğne saplama kullanarak kas yaralanması gerçekleştirme
- Larvalar 4 dpf olduğunda, embriyo ortamında% 0.016 (v / v) nihai konsantrasyona trikain metansülfonat ekleyerek onları uyuşturun. Balıkların yüzmeyi bıraktığında belirgin olarak tamamen uyuşturulmasını sağlamak için 10 dakika bekleyin.
NOT: Önyargıyı önlemek için, genotipin kimliği, bıçaklama ve aşağı akış analizlerini yapan araştırmacıya kör edilmelidir. - Bu süre zarfında, her kuyuyu 1 mL taze embriyo ortamı ile doldurarak 24 kuyu plakası hazırlayın ve somit sınırlarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için stereomikroskopu siyah bir arka plan ve yüksek güçlü ışıkla ayarlayın.
- Plastik bir pipet kullanarak, uyuşturuldu bir larvayı yeni bir Petri kabına aktarın.
- Fazla embriyo ortamını bir pipetle dikkatlice çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobu altında, balığı başı solda, kuyruğu sağda, dorsal bölgeyi yukarı ve ventral bölgeyi aşağı olacak şekilde yönlendirin (Şekil 1B).
- Bir diseksiyon mikroskobu altında çalışarak, yatay miyoptumun üzerinde bulunan apolikal kasta hızlı ama hassas bir bıçaklama yapmak için 30 kalibrelik bir iğne kullanın. Ön-arka konumda tutarlılık sağlamak için, anal gözenek üzerinde bulunan 1-2 somites hedefleyin (Şekil 1B).
NOT: Sinir tüpünü ve notochord'ı bıçaklamaktan kaçının ve işlem sırasında balığın kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. - Plastik bir pipet kullanarak, bıçaklanan zebra balığının üzerine bir damla embriyo ortamı dökün ve dikkatlice 24 kuyu plakasının bir kuyusuna aktarın.
- 2.3 ile 2.6 arasında olan adımları yineleyin. Ta ki tüm balıklar bıçaklanana kadar.
NOT: Balık işlem sırasında kurumadıkça, araştırmacının işlem hızına ve yeterliliğine bağlı olarak birkaç larva birlikte bıçaklanabilir. - Tüm larvalar bıçaklandıktan sonra, sonraki görüntüleme yapılana kadar 24 kuyu plakasını 28 °C inkübatöre yerleştirin.
3. Kas yaralanması ve iyileşmesinin görüntülenmesi
- Yaralanma sonrası 1 gün sonra (1 dpi), embriyo ortamında% 0.016 (v/ v) nihai konsantrasyona trikain metanülfonat ekleyerek bıçaklanan larvaları uyuşturun. Balıkların yüzmeyi bıraktığında belirgin olarak tamamen uyuşturulmasını sağlamak için 10 dakika bekleyin.
NOT: 0 dpi'de, yara bölgesi çok miktarda hücresel döküntü içerir, bu da kas yaralanmasının boyutunu ölçmeyi zorlaştırır(Ek Şekil 1A-B). Bu enkazın yara bölgesinden temizlenmesi yaklaşık 18-20 saat sürer ve bu nedenle, ortaya çıkan yaralanmanın boyutunu belirlemek için larvaları 0 dpi yerine 1 dpi'de görüntülemek daha güvenilirdir. - Polarize mikroskop sahnesine temiz ve boş bir cam taban bazlı tabak yerleştirin ve entegre yazılımı kullanarak arka planı ayarlayın.
NOT: Plastik Petri kaplarını, kırılan ışığı uygun şekilde iletmedikleri için birefringence'ı görüntülemeyin. Kullanılan polarize mikroskopa bağlı olarak, üreticinin yönergelerine göre ek ayarlar gerekebilir. - Arka planı ayarladıktan sonra, cam alt bazlı kabı mikroskop aşamasından çıkarın ve bir cam pipet kullanarak, uyuşturulmuş, bıçaklanmış balıkları cam taban bazlı tabağa aktarın.
- Bir pipet kullanarak embriyo ortamının fazlalığını dikkatlice çıkarın ve balığı 2,5'e göre yönlendirin - kafa solda, kuyruk sağda, dorsal bölge yukarı ve ventral bölge aşağı.
NOT: Larvaların mümkün olduğunca düz monte edildiğine emin olun, çünkü düzensiz montaj farklı somitlerde farklı birefringence yoğunluklarına neden olur. - Cam alt bazlı kabı uyuşturulmuş larvalarla birlikte mikroskop aşamasına yerleştirin ve polarize ışık kullanarak kası görüntüleyin (Şekil 1C & 1D).
NOT: Kullanılan mikroskop/polarize lensin türüne bağlı olarak, ön-arka eksenindeki balık yönü genel birefringence15'ietkileyebilir. Görüntüleme sırasında yaralanma bölgesinin her iki tarafına en az 5 somite eklediğinizden emin olun. - Plastik bir pipet kullanarak, balığı yeniden sulandırmak için bir damla embriyo ortamı dökün ve balığı embriyo ortamıyla dolu 24 kuyu plakasının bir kuyusuna yerleştirin.
NOT: Balıkların kurumasını önlemek için görüntülemenin mümkün olduğunca çabuk yapılması önemlidir. - 3.3. adımları yineleyin. 'yi 3.6'ya kadar. tüm balıklar görüntülenine kadar.
- Tüm görüntüler elde edildiğinde, sonraki analizler için bunları .tiff biçimde kaydedin.
- 3 dpi 'de (7 dpf) sonraki görüntülemeyi yapana kadar balığı 28 °C inkübatöre geri koyun.
- Balık 3 dpi olduğunda, balığı 3,3 ila 3,8 arasında görüntüleyin.
- Tüm balıklar görüntülendikten sonra, embriyo ortamında% 0.2 (v / v) nihai konsantrasyona trikain metanülfonat ekleyerek onları ötenazi edin. Balıkların ötenazi olduğundan, yüzme yeteneğinin kaybından, solungaç kapaklarının pompalamasından ve dokunmadan sonra uçuş tepkisinin olmamasından emin olmak için en az 10 dakika bekleyin.
4. Kas yenilenmesinin nicelleştirilmesi
- Serbestçe kullanılabilen Image J yazılımı gibi bir görüntüleme analizi yazılımında 1 dpi görüntü açın.
- Çokgen aracını kullanarak, yara bölgesinin etrafını çizin ve bu bölgenin alanını ve ortalama birefringence yoğunluğunu ölçün (Şekil 1C & 1D). Bu değerleri sağlanan şablondaki D3 ve E3 hücrelerine kopyalayın (Tamamlayıcı Tablo 1).
- Her biri 1-2 yaralanmamış somite yayılan iki ek bölge çizin ve bu bölgelerin her birinin alanını ve ortalama birefringence yoğunluklarını ölçün (Şekil 1C & 1D). Bu değerleri sağlanan şablondaki D4-D5 ve E4-E5 hücrelerine kopyalayın (Tamamlayıcı Tablo 1).
NOT: 1 dpi ve 3 dpi görüntüde aynı yaralanmamış somitlerin seçilmesi tercih edilirken, kas liflerinin sporadik olarak kopması ve daha sonra mutantlarda birefringence azalması bunu imkansız hale getirebilir. Bu nedenle, mutantlarda kas bütünlüğünün azalması nedeniyle aynı somitlerin 1 dpi ve 3 dpi'de seçilememesi durumunda, zaman noktalarının her birinde iki farklı ancak etkilenmemiş alan seçin. - Sağlanan şablonda F sütununda görüntülenen o bölgenin ortalama birefringence yoğunluğunu alana bölerek her bölge için normalleştirilmiş birefringence'ı hesaplayın (Tamamlayıcı Tablo 1).
- 1 dpi ve 3 dpi görüntülerin tümü için 4.1-4.4 adımlarını yineleyin.
NOT: Sağlanan şablonu kullanırken (Tamamlayıcı Tablo 1), 1 dpi alanı ve ortalama birefringence yoğunluk değerleri sırasıyla D ve E sütunlarına, 3 dpi alanı ve ortalama birefringence yoğunluk değerleri ise sırasıyla J ve K sütunlarına eklenmelidir. - Her zaman noktası için, iki yaralanmamış bölgenin ortalama normalleştirilmiş birefringence'ını hesaplayın. Bu değer yaralanmamış kas referans noktası sağlar.
NOT: Sağlanan şablonda (Tamamlayıcı Tablo 1), bu değer sırasıyla 1 dpi ve 3 dpi görüntüler için G ve M sütunlarında hesaplanır. - Daha sonra, yaralanma bölgesinin normalleştirilmiş birefringansını yaralanmamış bölgelerin ortalama normalleştirilmiş birefringence'ına bölerek 1 dpi'de kas yaralanmasının boyutunu belirleyin (4.6'da hesaplanır).
NOT: Yukarıdaki ayrıntılı iğne saplama prosedürünü kullanarak, wildtype larvaları tipik olarak 1 dpi'deki yara yerinde% 48.5 ±% 14.3 normalleştirilmiş bir birefringence gösterir, bu da yaralanmamış somitlere kıyasla birefringansın yaklaşık% 50 azaldığını gösterir. Şablonu kullanırken (Tamamlayıcı Tablo 1), bu değer H sütununda yüzde olarak hesaplanır. - Kas yenilenmesinin kapsamını belirlemek için, 3 dpi görüntüde yaralanma bölgesinin normalleştirilmiş birefringence'ını, bu aşamada yaralanmamış bölgelerin ortalama normalleştirilmiş yoğunluğuna bölün.
NOT: 3 dpi'de, wildtype larvaları tipik olarak yara yerinde% 60 ±% 15.3 normalleştirilmiş bir birefringence gösterir. Yara bölgesinde 1 dpi'de normalleştirilmiş birefringence'ın % 14.3'± 48.5 olduğu göz önüne alındığında (adım 4.7), 3 dpi'deki birefringence'ın 60'a ±% 15.3'e yükselmesi yaklaşık% 11.5'lik bir iyileşmeye işaret ediyor. Şablonu kullanırken (Tamamlayıcı Tablo 1), bu değer N sütununda yüzde olarak hesaplanır. - Her genotipteki balıkları ayrı tutarak, yara bölgesinin normalleştirilmiş birefringence'ını 3 dpi'de (adım 4.8) 1 dpi (adım 4.7) ile karşılaştıran eşleştirilmiş bir t testi gerçekleştirin. Bu, her genotipteki her balık tarafından görüntülenen kas yenilenmesinin yörüngesini ortaya çıkaracak ve her genotip tarafından görüntülenen kas yenilenmesinin kapsamının önemli ölçüde değişip değişmediğini vurgulayacaktır.
- Son olarak, 3 dpi'de kas yenilenmesinin kapsamı olan 4.8. adımda elde edilen değeri, 1 dpi'de kas yaralanmasının boyutu olan 4.7. 1 rejeneratif indeksi, 1 dpi'deki yaralanmanın 3 dpi ile karşılaştırılabilir olduğunu ve kas yenilenmesinin gerçekleşmediğini gösterir; 1'in üzerindeki bir değer, yara bölgesinde kasın yenilendiğini vurgulayan 3 dpi'de yeni kas oluştuğunu gösterir; ve 1'den az rejeneratif indeks, 3 dpi'deki yaranın 1 dpi'den daha kötü olduğunu ve bozulmuş kas yenilenmesi olduğunu vurgulamaktadır. Farklı genotipler arasındaki kas yenilenme boyutunu istatistiksel olarak karşılaştırmak için bir t testi veya tek yönlü ANOVA yapılabilir. Sağlanan şablon (Tamamlayıcı Tablo 1) kullanırken, bu değer O sütununda hesaplanır.
NOT: Herhangi bir önyargıdan kaçınmak için, farklı biyolojik ebeveynlerden elde edilen her deneyden elde edilen balıklarla ve farklı günlerde gerçekleştirilen her deneyle, tüm deneyin üç taraflı olarak yapılması önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İskelet kasının birefringence'ını ölçme yeteneği, kas hasarı seviyelerini incelemek ve karşılaştırmak ve kas yenilenmesini in vivoolarak incelemek için invaziv olmayan ancak oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Birefringence, polarize ışığın kas sarkoerlerinin sözde kristal dizisi15aracılığıyla kırınımından kaynaklanır ve kastaki yaralanma veya hasarı takiben, birefringence'da bir azalma belirgindir. Aynı şekilde, kök hücrelerin aktivasyonu ve farklılaşması, yaralanma bölgesinde yeni kas liflerinin oluşmasına neden olur ve daha sonra bu bölgede birefringence yoğunluğunu artırır. Bu sistemi kullanarak, Lama216'dakibir eksikliğin neden olduğu konjenital kas distrofisi tip 1A'nın (MDC1A) zebra balığı modelinde kas yenilenmesini inceledik. İki lama2+/- zebra balığı arasındaki bir haçtan embriyo debriyajı toplandı ve 3 dpf'de embriyolar bir DNA ekstraksiyon çipine (Şekil 1A)aktarıldı ve daha sonra embriyo genotipleme teknolojisi kullanılarak genotiplendi. MDC1A16modeli olan genotip, lama2-/- larvaları ve lama2+/+ kardeşler Şekil 1B'yegöre bir iğne saplama kullanılarak yaralandı ve 1 dpi ve 3 dpi'de polarize edici bir mikroskopta görüntülendi ve birefringence yoğunlukları ölçüldü. Kas yaralanması 1 dpi'de birefringence yoğunluğunda azalma ile sonuçlanırken (Şekil 1Ci ve Di), kasların başarılı yenilenmesi aynı bölgede birefringansın artmasına neden olur (Şekil 1CII ve Dii). Ayrıca, lama2+/+ larvaların normal kas deseni nedeniyle tek tip birefringence yoğunluğu (Şekil 1C) gösterirken, lama2-/- kaslarındaki birefringence yoğunluğunun düzensiz ve son derece sporadik olması da dikkat çekicidir (Şekil 1D), kas bütünlüğünün azalmasına atfedilir.
Bu yaklaşımı kullanarak, her iki wildtype larvanın da (lama2+/+; Şekil 2A) ve larva eksikliği lama2 (lama2-/-; Şekil 2B), yara bölgesinde 1 dpi'ye kıyasla 3 dpi'de önemli ölçüde artmış birefringence yoğunluğu gösterir (Şekil 2C), kasın yenilendiğini gösterir. Her genotipteki larvaların rejeneratif potansiyelini karşılaştırmak için, rejeneratif indeks belirlendi ve lama2-/- larvalarının lama2 +/+ larvalara göre kas yenilenmesinde çarpıcı bir artış sergilediğini ortaya koyuyoruz(Şekil 2D; lama2'de ortalama-/- = 1.30 ±- 0.251; lama2-/- = 1.83 ± 0.439'da ortalama). Lama2-/- larvalarda gelişmiş rejenerasyonunu daha da doğrulamak için, kası F-Actin'e karşı bir antikorla lekeledik(Ek Şekil 1B-D). Bu sonuçlar, yara bölgesinde farklılaşmış kas liflerinin varlığı ile belirgin olan lama2-/- gerçekten yenilenme olduğunu doğrulasa da, aynı balığın 1 dpi ve 3 dpi'de incelenememesi, lama2+/+ ve lama2 -/- balık arasındaki rejeneratif yanıtı ölçme ve karşılaştırma yeteneğini sınırlar. Lama2-/- larvalarda bu gelişmiş rejenerasyon kapasitesinin mekanistik temeli zor olsa da, lama2 kaybının aktif kök hücre sayısını artırdığına ve daha sonra kas yenilenmesinin iyileştiğine inanıyoruz. Ancak, bunu belirlemek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Toplu olarak, bu sonuçlar açıklanan tekniğin kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesindeki değişiklikleri belirleme yeteneğini vurgulamaktadır.
Şekil 1: Genotipleme ve kas rejenerasyon protokolüne genel bakış. (A) 24, 3 dpf zebra balığı larvaları içeren bir DNA ekstraksiyon çipinin görüntüsü. (B) İğne saplamayı gerçekleştirmek için 4 dpf larvanın yerleştirilmesi gereken oryantasyonun şeması, başı solda, kuyruk sağda, dorsal bölge yukarı ve ventral bölge aşağı. İğne saplama, 1-2 apolik kası hedef alan 30 kalibrelik bir iğne kullanılarak yapılmalıdır. BioRender.com ile oluşturuldu. (C-D) 1 dpi ve 3 dpi'de bir lama2+/+ ve lama2-/- larvalarda birefringence görüntüleri. Beyaz ve kırmızı renkte gösterilen bölgeler, yara bölgesindeki birefringence'ı ölçmek için kullanılan alanları ve yaralanmamış somitleri sırasıyla yansıtır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lama2 eksik zebra balığı larvalarında kas yenilenmesinin nicelemesi. Lama2+/+ (A) ve lama2-/- (B) larvalarında 1 dpi ve 3 dpi'de birefringence görüntüleri. Her ikisinde de 3 dpi olan yara, lama2+/+ ve lama2-/- larvalar yeni kaslarla doldurulur. (C) 1 dpi ve 3 dpi'deki her larvanın normalleştirilmiş birefringence grafiği. Lama2+/+ ve lama2 -/- larvalarındaki yara bölgesinde normalleştirilmiş birefringence, eşleştirilmiş bir t testi kullanılarak belirlendiği gibi 3dpi'de önemli ölçüde artar. (D) lama2+/+ve lama2-/- rejeneratif indeksi, ikincisi bir t-testi kullanılarak belirlendiği gibi artan kas yenilenmesini gösterir. Hata çubukları SEM'yi üç bağımsız deneyden larvalarla temsil eder (lama2+/+n=28 ve lama2-/- n=16). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Lama2 eksik larvalarda kas yenilenmesinin incelenmesi. Lama2+/+ (Ai) ve lama2-/- (Aii) larvalarında 0 dpi'de birefringence görüntüleri yara bölgesinde hücresel kalıntıların varlığını gösterir. F-actin için 0 dpi (B), 1 dpi (C) ve 3 dpi (D) olarak lekelenmiş larva miyotomunun maksimum projeksiyon konfokal görüntüleri. 3 dpi'de, lama2+/+ ve lama2-/- larvalarının yara bölgesi F-actin etiketli kas liflerinin ortaya çıkması ile karakterizedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Kas yenilenmesinin nicelleştirilmesi için şablon. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında işlevi değiştirilen ve daha sonra kas yenilenme sürecini engelleyen zorunlu doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir. Burada, kas hastalığının canlı zebra balığı modellerinde kas yenilenmesini incelemek için yüksek verim protokolünü açıklıyoruz. Boru hattının ilk adımı, aşağı akış rejenerasyon testini gerçekleştirmeden önce, canlı larvaların genotipini belirlemek için kullanıcı dostu ve doğru bir yöntem olan embriyo genotipleme platformu14'ükullanır. Bunun doğrudan bir yararı, yalnızca ilgi çekici genotiplerin ve / veya her genotip grubundaki benzer sayıda balığın seçilmesine izin sağlaması ve bu nedenle protokolün geri kalanı aracılığıyla işlenmesi gereken balık sayısını önemli ölçüde azaltmasıdır. Bununla birlikte, embriyo genotipleme cihazından elde edilen genomik DNA miktarının nispeten düşük olması dikkat çekicidir, bu da aşağı akış genotipleme testlerini tehlikeye atabilir. Bu nedenle, tüm genotipleme testlerinin ana deney için kullanmadan önce test edilmiş ve optimize edilmiş olması önemlidir. Ek olarak, DNA'nın kaynağı öncelikle epidermaldir ve bu nedenle embriyo genotip sistemi dokuya özgü mutasyonları gösteren larvaları genotip etmek için başarıyla kullanılamaz.
Protokolün ikinci bölümü, sadece yüksek oranda tekrarlanabilir bir yaralanma boyutuyla sonuçlanan değil, aynı zamanda kas kök hücrelerinin kas yenilenmesiyle sonuçlanan aktivasyonunu tetiklemek için yeterli olan uygun maliyetli ve yüksek verim tekniği olan iğne saplı bir yaralanmanın kullanımını göstermektedir. Zebra balıklarında iskelet kası yaralanmasını teşvik etmek için alternatif bir yaklaşım lazer aracılı hücre ablasyonunukullanmaktır 13,17,18 . Bu, belirli x, y ve z düzlemlerine odaklanma ve daha sonra tek kas hücrelerini hedefleme yeteneği sağlarken, son derece küçük yara boyutu, özellikle kas bütünlüğünün zaten tehlikeye girdiği kas hastalığı modellerinde, kas yenilenmesinin doğru niceliğini sınırlar. Bu nedenle zebra balığı kas hastalığı modellerinde kas yenilenmesini incelerken iğne saplama yaralanmalarının kullanılmasını destekliyoruz.
Kas yenilenmesinin boyutunu doğru bir şekilde ölçmek için, standart bir polarize edici mikroskop kullanılarak kolayca görüntülenebilen iskelet kasının birefringent doğasından yararlanıyoruz. Bu yaklaşımı kullanırken dikkat edilmesi gereken iki kritik nokta vardır. İlk olarak, kullanılan mikroskop ve/ veya polarize lensin türüne bağlı olarak, balığın ön-arka eksenindeki yönelimi genel birefringence intensitites15'i etkileyebilir ve görüntüleme sırasında bunun göz önünde bulundurulması gerekir. Son olarak, kas yenilenmesi 3 dpi ile tam olarak tamamlanmış olmasa da, iyileşmenin kapsamı farklı suşlarda rejenerasyon kapasitelerinin ayrımını sağlamak için yeterlidir13 (Şekil 1). Önceki çalışmamız, özetlediğimiz protokolü kullanarak, wildtype larvalarının 14 dpi19'dan sonra tamamen yenilendiğini ve bu nedenle, bir zorlanmanın yenilenemeyeceğini veya kas yenilenmesinin gecikip geciktirilmediğini belirlemek için, 3 dpi'nin ötesindeki birefringence yoğunluklarını incelemek gerekebileceğini göstermiştir.
Teleost balıklarında, kas büyümesinin hayvanın yaşamı boyunca meydana geldiği belirtilmelidir20ve bu nedenle, yara bölgesinin birefringence yoğunluklarını, aynı balık içindeki yaralanmamış somitlerinkiyle normalleştirmek çok önemlidir. Bu adım bir iç kontrol sağlar ve farklı zaman noktalarındaki kas miktarındaki farklılıklar veya farklı seanslar sırasında görüntüleme parametrelerindeki farklılıklar nedeniyle analizlerdeki önyargıyı ortadan kaldırır. Bu normalleşme adımı, doğal olarak miyofibrilleri azaltmış ve / veya aşınmış kas bütünlüğünü göstermiş olabilecek ve daha sonra genel birefringence yoğunluklarını azaltabilecek kas hastalığı modellerinde kas yenilenmesini doğru bir şekilde ölçmek için de zorunludur. Ek olarak, bu protokol kasın rejeneratif kapasitesindeki değişiklikleri etkili bir şekilde ortaya açığa açarken, kök hücre fonksiyonu üzerindeki dolaylı etkilerin bir sonucu olarak olması mümkündür. Kas yenilenmesi, kas hücreleri, makrofajlar, fibro-adepojenik progenitörler ve interstisyel hücreler dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden gelen sinyalleri içeren karmaşık bir süreçtir. Kasların yenilenme kapasitesinin değişmesi, belki de daha sonra kas kök hücre fonksiyonunu ve rejeneratif süreci etkileyen bu diğer hücre tiplerinden herhangi birinin biyolojisindeki değişikliklerle açıklanabilir. Bu nedenle, bu protokol kas hastalığı modellerinde kas yenilenmesindeki değişiklikleri tanımlayabilirken, gözlenen değişikliklerden sorumlu mekanizmaları belirlemek için aşağı akış hücresel ve moleküler analizlerin yapılması gerekir.
Sonuç olarak, çeşitli kas hastalıklarında kasın rejeneratif kapasitesi tam olarak anlaşılamamıştır ve kas yenilenmesini in vivo incelemek için yeni tekniklerin ortaya çıkması bu tür soruların üstesinden gelmek için bir platform sağlar. Yöntem, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesini düzenleyen hücresel ve moleküler ipuçlarının araştırılması için temel olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Alex Fulcher'a ve Monash Micro Imaging'e mikroskop bakımı ve kurulumu konusunda yardımları için teşekkür ederiz. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti'nin hibeleriyle desteklenmektedir. Bu çalışma, P.D.'ye (628882) bir Musküler Distrofi Derneği (ABD) projesi hibesi ile finanse .C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
