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Bioengineering

कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और माइक्रोबबल-मध्यस्थता दवा वितरण अध्ययन के लिए विवो मॉडल में चिकन एक्स ओवो भ्रूण और कोरियोलैंटोइक मेम्ब्रेन वेसल्स की तैयारी

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62076
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Thoraxcenter, Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, 2Laboratory of Acoustical Wavefield Imaging, Faculty of Applied Sciences, Delft University of Technology

Summary

यह प्रोटोकॉल 5 से 8 दिन पुराने चिकन भ्रूण और उनके कोरियोएलांटोइक झिल्ली (सीएएम) को प्राप्त करने और उपयोग करने के तरीके पर तीन तरीकों का वर्णन करता है ताकि कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और माइक्रोबबल-मध्यस्थता दवा वितरण का अध्ययन किया जा सके।

Abstract

चिकन भ्रूण और रक्त-वाहिका समृद्ध कोरियोलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) बायोमेडिकल प्रक्रियाओं, नई अल्ट्रासाउंड स्पंदन योजनाओं, या कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और माइक्रोबबल-मध्यस्थता दवा वितरण के लिए उपन्यास ट्रांसड्यूसर की जांच करने के लिए विवो मॉडल में एक मूल्यवान है। इसके कारण सीएएम के भ्रूण और पोत नेटवर्क की पहुंच के साथ-साथ मॉडल की कम लागत भी हैं। भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं तक पहुंच प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम अंडे की सामग्री को अंडे के छिलके से बाहर निकालना है। इस प्रोटोकॉल में, इनक्यूबेशन के दिन 5 और 8 के बीच अंडे के छिलके से सामग्री को बाहर निकालने के लिए तीन तरीकों का वर्णन किया गया है, इस प्रकार भ्रूण को इन दिनों तक अंडे के छिलके के अंदर विकसित करने की अनुमति मिलती है। वर्णित विधियों को केवल सरल उपकरणों और उपकरणों की आवश्यकता होती है और एक्स ओवो सुसंस्कृत भ्रूण (~ 50%) की तुलना में 5-दिन के लिए 90%, 6-दिन के लिए 75%, 7-दिन के लिए 50%, और 8-दिवसीय इनक्यूबेट अंडे के लिए 60% की उच्च जीवित रहने की सफलता दर प्राप्त होती है। प्रोटोकॉल यह भी वर्णन करता है कि सीएएम संवहनी प्रणाली में गुहिकायन नाभिक, जैसे माइक्रोबबल्स को कैसे इंजेक्ट किया जाए, ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी अध्ययन के लिए भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को शेष अंडे की सामग्री से कैसे अलग किया जाए, और विभिन्न प्रकार के अल्पकालिक अल्ट्रासाउंड प्रयोगों में चिकन भ्रूण और सीएएम का उपयोग कैसे किया जाए। विवो चिकन भ्रूण और सीएएम मॉडल कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए नए इमेजिंग प्रोटोकॉल, अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों और अल्ट्रासाउंड स्पंदन योजनाओं की जांच करने और अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता दवा वितरण के तंत्र को उजागर करने के लिए बेहद प्रासंगिक है।

Introduction

एक्स ओवो चिकन भ्रूण और रक्त-वाहिका समृद्ध कोरियोलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) भ्रूणजनन, ऑन्कोलॉजी और दवा वितरण 1,2,3,4 जैसी विभिन्न जैविक और बायोमेडिकल प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक उपयुक्त मॉडल साबित हुए हैं। अल्ट्रासाउंड का उपयोग भ्रूण के हृदय के विकास 4,5 की इमेजिंग के लिए और संवहनी दवा वितरण 6,7 के लिए माइक्रोबबल जैसे इंजेक्शन पर गुहिकायन नाभिक को सक्रिय करने के लिए किया गया है। चिकन भ्रूण सस्ती हैं, कम बुनियादी ढांचे और उपकरणों की आवश्यकता होती है, और अन्य पशु मॉडल 8 की तुलना में कम सख्त कानूनहोते हैं। अंडे को खोलने के बाद चिकन भ्रूण और सीएएम वाहिकाएं आसानी से सुलभ होती हैं जबकि स्तनधारी भ्रूण और वाहिकाओं के साथ यह बहुत अधिक कठिन साबित होता है। इसके अलावा, चिकन भ्रूण और सीएएम वाहिकाएं दिल की धड़कन और एक स्पंदित रक्त प्रवाह प्रदान करती हैं। सीएएम स्तनधारियों के साथ पोत शरीर रचना विज्ञान में समानता दिखाता है और इसका उपयोग दवा स्क्रीनिंग 8,9,10 के लिए किया जा सकता है। इन विशेषताओं के कारण, सीएएम वाहिकाओं ने कंट्रास्ट एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग (सीईयूएस) 11,12,13,14,15,16 की जांच के लिए एक उपयुक्त मॉडल भी साबित किया है। इसके अलावा, मॉडल का उपयोग अल्ट्रा-हाई-स्पीड कैमरे का उपयोग करके अल्ट्रासाउंड क्षेत्र में अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों के व्यवहार की ऑप्टिकल रूप से जांच करने और दवाओं के प्रोपेलिंग, बाइंडिंग और एक्स्ट्रावेसन पर ध्वनिक विकिरण बल के प्रभावकी जांच करने के लिए किया जा सकता है। यद्यपि चिकन भ्रूण और सीएएम दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए कम उपयुक्त हैं, वे विवो प्रयोगों में अल्पावधि के लिए फायदेमंद हो सकते हैं।

प्रयोगों के दौरान चिकन भ्रूण और सीएएम पर दृश्यता और नियंत्रण बढ़ाने के लिए, अंडे के छिलके18 से भ्रूण और सीएएम युक्त अंडे की सामग्री लेना महत्वपूर्ण है। अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों से जुड़े पिछले चिकन भ्रूण अध्ययनों में 5 से 6 दिन पुराने भ्रूण 7,11,12,17,19 और 14 से 18 दिन पुराने भ्रूण 13,14,15,16 का उपयोग किया गया था। शेल 18,20,21 से अंडे की सामग्री को बाहर निकालने के लिए कई दृष्टिकोणों का विस्तार से वर्णन किया गया है। हालांकि, हमारे ज्ञान के अनुसार, पहले प्रकाशित दृष्टिकोण इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद अंडे की सामग्री को अंडे के छिलके से बाहर निकालने पर ध्यान केंद्रित करते हैं (यानी, हैमबर्गर और हैमिल्टन (एचएच) चरण 19-2022), और संस्कृति पूर्व ओवो को जारी रखते हैं। इस एक्स ओवो कल्चर दृष्टिकोण के कई नुकसान हैं जिनमें संस्कृति के दौरान मृत्यु का खतरा (~ 50%) 1,18, एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग18,20, और ओवो विकास23 की तुलना में कुल पोत की लंबाई में कमी शामिल है। चूंकि अंडे के छिलके के भीतर भ्रूण की खेती सबसे प्राकृतिक वातावरण प्रदान कर रही है, इसलिए प्रयोग के दिन तक अंडे के छिलके के भीतर भ्रूण को सेने में सबसे आसान है। इस कारण से, एक दृष्टिकोण जिसमें अंडे की सामग्री को 5 से 8 दिनों के इनक्यूबेशन पर अंडे के छिलके से बाहर निकाला जाता है, विशेष रूप से 5 से 8 दिन के भ्रूण पर प्रयोगों के लिए फायदेमंद होगा।

इस प्रोटोकॉल में, हम अंडे के छिलके से अंडे की सामग्री को बाहर निकालने के लिए तीन तरीकों का वर्णन करते हैं जब भ्रूण विकास के दिन 5 से 8 (एचएच 26-3522) पर होता है, जिससे भ्रूण को प्रयोग के दिन तक अंडे के छिलके के भीतर विकसित करने की अनुमति मिलती है। सीएएम पोत का आकार व्यास में 10-15 μm से होता है, 8 दिन के भ्रूण24 की छोटी केशिकाओं में, 6 और 8 दिन पुराने भ्रूण24,25 के बड़े बर्तन में व्यास में 115-136 μm तक होता है। तीन वर्णित विधियों को केवल बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है और प्रयोग शुरू होने से पहले जटिलताओं के जोखिम को कम किया जाता है, जिससे अनावश्यक लागत और श्रम कम हो जाता है। हम माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए सीएएम को ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी बनाने के लिए जर्दी बोरी से भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को अलग करने की एक विधि का भी विस्तार करते हैं। क्योंकि भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को उदाहरण के लिए ध्वनिक झिल्ली के साथ एक धारक पर पिन किया जा सकता है, सेटअप को ध्वनिक रूप से पारदर्शीभी बनाया जा सकता है, जिससे माइक्रोस्कोपी और अल्ट्रासाउंड अध्ययनों के संयोजन की अनुमति मिलती है जब प्रकाश पथ जर्दी से प्रभावित होगा। अंत में, हम कई अन्य अल्ट्रासाउंड सेटअपों का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग अल्ट्रासाउंड या सीईयूएस इमेजिंग के लिए किया जा सकता है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को जानवरों पर नीदरलैंड प्रयोग अधिनियम के अनुसार और वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए पशु उपयोग की सुरक्षा पर यूरोपीय परिषद (2010/63 / ईयू) के अनुसार आयोजित किया गया था।

1 . भ्रूण तैयारी प्रोटोकॉल

  1. निषेचित चिकन अंडे के इनक्यूबेशन
    1. ताजा निषेचित चिकन अंडे को एक सप्ताह तक 15 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. निषेचित अंडों को सेने के लिए, उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस, ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में पॉइंटी साइड के साथ लंबवत रूप से रखें। इनक्यूबेशन के दौरान अंडे को मोड़ना आवश्यक नहीं है।
      नोट: एक स्थायी मार्कर का उपयोग करके अंडे के शीर्ष इनक्यूबेशन की प्रारंभिक तिथि लिखें।
  2. 5-दिन (120 घंटे) पुराने भ्रूण (एचएच चरण 26-28) तक तैयार करना22
    1. कार्य क्षेत्र की तैयारी
      1. एक हीटिंग प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      2. हीटिंग प्लेट पर एक धातु अंडा धारक (चित्रा 1 ए, बी), एक धातु वजन नाव धारक (चित्रा 1 सी, डी), और पीबीएस से भरा 10 एमएल एर्लेनमेयर रखें।
      3. अल्ट्रासाउंड जेल की 10 मिमी परत के साथ एक वजन वाली नाव (85 मिमी × 85 मिमी × 25 मिमी) भरें और भरी हुई वजन वाली नाव को पूर्वनिर्मित धातु वजन नाव धारक में रखें।
        नोट: अल्ट्रासाउंड जेल के साथ वजन नाव भरने से भ्रूण और सीएएम बढ़ जाएगा। यह भ्रूण और सीएएम के इंजेक्शन या इमेजिंग के लिए फायदेमंद हो सकता है लेकिन अंडे के छिलके से भ्रूण और सीएएम को बाहर निकालने के लिए आवश्यक नहीं है।
      4. टेप के कुछ टुकड़े (लगभग 3 सेमी लंबाई) तैयार करें, जिसमें एक छोर का हिस्सा वापस मुड़ा हुआ हो ताकि अब चिपक न जाए।
    2. अंडे के छिलके से अंडे की सामग्री को बाहर निकालना
      1. एक 5 दिन पुराना इनक्यूबेटेड निषेचित अंडा लें और इसे पूर्वनिर्मित धातु अंडा धारक (चित्रा 1 ए, बी) में स्थानांतरित करें। अंडे को एक ही अभिविन्यास (यानी, शीर्ष पर तारीख) में रखना सुनिश्चित करें।
        नोट: अंडे के शीर्ष में हवा की थैली और भ्रूण और सीएएम को एक ही स्थिति में रखने के लिए अंडे को एक ही अभिविन्यास में रखना महत्वपूर्ण है।
      2. एक चिमटी (या इसी तरह) के पॉइंटी बैक का उपयोग करें; चित्र 1E) अंडे के शीर्ष पर एक छोटा सा इंडेंट बनाने के लिए (जहां तारीख लिखी गई है) (चित्रा 2 ए)।
      3. अंडे के किनारे पर अंडे के किनारे पर दूसरा इंडेंट बनाने के लिए चिमटी के पीछे की ओर का उपयोग करें (चित्र 2 बी)।
        नोट: सावधान रहें कि इंडेंट को बहुत बड़ा न बनाएं और एक छेद बनाएं। यदि दुर्घटना से एक छेद बनाया जाता है, तो छेद को टेप से सील करें और एक और इंडेंट न बनाएं।
      4. बड़े चिमटी (चित्रा 1 ई) का उपयोग करके, अंडे के शीर्ष पर इंडेंटेड क्षेत्र से अंडे के छिलके का एक छोटा टुकड़ा निकालें (लिखित तिथि के साथ)। सुनिश्चित करें कि अंडे के छिलके के शीर्ष में हवा की थैली अंडे के बाहर की हवा के साथ संपर्क करती है, लेकिन शेल में बहुत गहरी प्रवेश न करें।
        नोट: यदि शीर्ष इंडेंट बनाते समय खोल बहुत गहरा प्रवेश करता है, तो भ्रूण और सीएएम क्षतिग्रस्त हो सकते हैं और भ्रूण शेल से हटाने से बच नहीं पाएगा। यह महत्वपूर्ण है कि शीर्ष पर छोटा छेद अंडे के अंदर और बाहर के बीच वायु संपर्क बनाता है। यदि ऐसा नहीं किया जाता है, तो प्रक्रिया के अगले चरणों में एक वैक्यूम बनाया जाएगा जिसके परिणामस्वरूप सीएएम के नीचे बड़े हवा के बुलबुले फंस जाएंगे जिससे भ्रूण और सीएएम बेकार हो जाएंगे। अंडे के अंदर हवा की थैली की स्थिति की जांच करने के लिए, एक प्रकाश स्रोत का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि इसकी स्थिति हमेशा शीर्ष पर नहीं होती है और साइड में भी अधिक हो सकती है।
      5. अंडे के नीचे 2/3 तरफ दूसरे इंडेंट के माध्यम से शेल में प्रवेश करने के लिए 5 एमएल सिरिंज और 19 जी सुई का उपयोग करें और अंडे की सफेदी के ~ 2 एमएल को वापस लें (चित्रा 2 सी)।
        नोट: सुनिश्चित करें कि सुई भ्रूण और सीएएम को नुकसान पहुंचाने की संभावना को रोकने के लिए अंडे के निचले हिस्से की ओर इशारा कर रही है। यह कदम अंडे की सामग्री को हटाने के लिए आवश्यक अंडे के शीर्ष में एक बड़ी हवा की जेब बनाता है। यदि चरण 1.2.2.3 में एक इंडेंट के बजाय गलती से एक छेद बनाया जाता है, तो अंडे के सफेद भाग की वापसी के लिए सुई के साथ टेप को पंचर करें। टेप के एक और टुकड़े के साथ पंचर को फिर से सील करें।
      6. सुई को बाहर निकालें और किनारे पर अंतर को सील करने के लिए टेप का उपयोग करें (चित्रा 2 डी)।
        नोट: अंडे की सफेदी को अंडे से बाहर निकलने से रोकने के लिए, सुई को बाहर निकालने से पहले उंगली का उपयोग करके शीर्ष छेद को बंद किया जा सकता है। यदि अंडे का सफेद भाग पहले से ही टेप के साथ लीक होता रहता है, तो पहले यह सुनिश्चित करने के लिए कि टेप ठीक से चिपक जाता है, पहले ऊतक के टुकड़े के साथ अंडे की सफेदी को हटा दें।
      7. वजन वाली नाव में अंडे की सफेदी जोड़कर सिरिंज खाली करें।
      8. अंडे के शीर्ष पर छोटे उद्घाटन को बड़ा करने के लिए बड़े चिमटी (चित्रा 1 ई) का उपयोग करें (चित्रा 2 ई)। शीर्ष पर उद्घाटन के माध्यम से अंडे के अंदर देखते समय, भ्रूण और सीएएम दिखाई देते हैं। जितना संभव हो उतना अंडे के छिलके को दूर करते समय भ्रूण और सीएएम का पता लगाते रहें (चित्रा 2 एफ)।
        नोट: खोल के अंदर भ्रूण और सीएएम की स्थिति पर अधिकतम दृश्यता बनाए रखने के लिए अंडे को हिलाते रहें। सुनिश्चित करें कि शेल में उद्घाटन का किनारा सीएएम से कम नहीं जाता है। इसके अलावा, आंतरिक झिल्ली में प्रवेश न करें और तेज किनारों को रोकें।
      9. उद्घाटन बनाने के बाद, अंडे को 180 ° घुमाएं और अंडे को अंडे को अंडे के धारक में इस तरह से वापस रखें कि अंडे के शीर्ष पर बनाया गया उद्घाटन अब नीचे की ओर है। भ्रूण ऊपर तैरेगा और नीचे से अदृश्य हो जाएगा (चित्रा 2 जी) जिसमें 1-2 मिनट लगते हैं। सुनिश्चित करें कि पूरे भ्रूण और सीएएम (सभी वाहिकाओं सहित) गायब हो गए हैं और अगले चरण (चित्रा 2 एच) पर आगे बढ़ने से पहले केवल जर्दी दिखाई दे रही है।
        नोट: यदि भ्रूण अभी भी 2 मिनट के बाद नीचे से दिखाई दे रहा है, तो अंडे को 1-2 मिनट के लिए घड़ी की तरह घुमाएं। यह भ्रूण और सीएएम को तैरने में मदद करेगा।
      10. टेप को साइड खोलने से हटा दें। देखें कि क्या अंडे के अंदर का हिस्सा अब नीचे के उद्घाटन से बाहर निकलता है। यदि यह मामला है, तो अगले चरण पर आगे बढ़ें। यदि नहीं, तो अंडे में वैक्यूम छोड़ने के लिए एक बार फिर साइड पर उद्घाटन को पंचर करने के लिए सिरिंज पर सुई का उपयोग करें। जर्दी की बोरी को पंचर करने की संभावना को रोकने के लिए सुई के साथ ऊपर की ओर इंगित करना सुनिश्चित करें। अंडे के उभार को नीचे के उद्घाटन से बाहर निकलने तक जारी रखें।
      11. धातु वजन वाली नाव धारक (चित्रा 1 सी, डी) में वजन करने वाली नाव के करीब अंडे के निचले हिस्से को पकड़ते हुए, धीरे से लेकिन जल्दी से छोटे चिमटी (चित्रा 1 एफ) के तेज बिंदुओं में से एक का उपयोग करके उद्घाटन की पूरी चौड़ाई पर झिल्ली में क्षैतिज खरोंच करें और धीरे से अंडे की सामग्री को वजन नाव (चित्रा 2 आई) में गिरा दें।
        नोट: यदि अंडे की मात्रा बाहर नहीं आती है, तो सिरिंज पर सुई का उपयोग करें ताकि सुई को ऊपर की ओर इशारा करते हुए साइड को फिर से पंचर किया जा सके।
      12. यदि भ्रूण वजन वाली नाव के किनारे है, तो यह आमतौर पर अपने आप ऊपर चला जाएगा। यदि ऐसा नहीं होता है, तो भ्रूण को पुनर्स्थापित करने के लिए टिशू पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें। भ्रूण पर टिशू पेपर के एक तरफ रखें, टिशू पेपर को दूसरे छोर पर खींचें, और प्लास्टिक पाश्चर पाइपेट का उपयोग करके ~ 30 μL PBS (37 °C) की कुछ बूंदों के साथ टिशू पेपर छोड़ दें।
      13. नेत्रहीन रूप से जांचें कि क्या भ्रूण जीवित है यह सुनिश्चित करके कि दिल की धड़कन अभी भी मौजूद है, सीएएम वाहिकाएं बरकरार हैं और कोई रक्तस्राव नहीं है, और जर्दी का कोई रिसाव नहीं है। यदि इनमें से कोई एक बात सही नहीं है, तो भ्रूण और सीएएम को त्याग दें क्योंकि यह व्यवहार्य नहीं होगा।
      14. सुनिश्चित करें कि भ्रूण और सीएएम को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है और सूख नहीं जाता है क्योंकि इससे सीएएम वाहिकाएं खराब हो जाएंगी और अंततः भ्रूण मर जाएगा। इसे रोकने के लिए, नियमित रूप से भ्रूण और सीएएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के ~ 30 μL की छोटी बूंदें डालें।
  3. 6 से 7 दिन (144-168 घंटे) पुराने भ्रूण (एचएच चरण 28-32)22 की तैयारी
    1. कार्य क्षेत्र की तैयारी
      1. खंड 1.2.1 में वर्णित चरण तैयार करें।
    2. अंडे के छिलके से अंडे की सामग्री को बाहर निकालना
      1. प्रयोग के दो घंटे पहले, 6 से 7 दिन पुराने इनक्यूबेट किए गए अंडे लें और अंडे को इनक्यूबेटर के अंदर 180 डिग्री घुमाएं ताकि अंडे का शीर्ष नीचे की ओर हो। 1 घंटे के बाद, अंडे को उसकी मूल स्थिति में वापस घुमाएं और एक और 1 घंटे के लिए छोड़ दें।
        नोट: प्रयोग से 2 घंटे पहले अंडे को घुमाने से अंडे की सामग्री को शेल से बाहर निकालना आसान हो जाएगा।
      2. घूमने के बाद, अंडे को इनक्यूबेटर से लें।
      3. चरण 1.2.2.2.4 तक चरण 1.2.2.2 निष्पादित करें।
      4. अंडे के 2/3 नीचे की तरफ दूसरे इंडेंट के माध्यम से शेल में प्रवेश करने के लिए 5 एमएल सिरिंज और 19 जी सुई का उपयोग करें और अंडे के सफेद भाग के 5-6 एमएल के बीच वापस लें। सुनिश्चित करें कि सुई अंडे के निचले हिस्से की ओर इशारा कर रही है।
        नोट: हमारे द्वारा उपयोग किए गए 5 एमएल सिरिंज के साथ, 6 एमएल तक वापस लेना संभव है इसलिए केवल एक प्रवेश की आवश्यकता है।
      5. सुई को बाहर निकालें और किनारे पर अंतर को सील करने के लिए टेप के एक टुकड़े का उपयोग करें (चित्रा 2 डी)।
      6. वजन वाली नाव में अल्ट्रासाउंड जेल में अंडे की सफेदी डालकर सिरिंज खाली करें।
      7. अंडे के शीर्ष पर छोटे उद्घाटन को बड़ा करने के लिए बड़े चिमटी (चित्रा 1 ई) का उपयोग करें (चित्रा 2 ई)। उद्घाटन को जितना संभव हो उतना बड़ा बनाने की कोशिश करें लेकिन सुनिश्चित करें कि शेल में उद्घाटन का किनारा सीएएम से कम न जाए। इसके अलावा, आंतरिक झिल्ली में प्रवेश न करें और तेज किनारों को रोकने की कोशिश करें।
      8. चरण 1.3.2.4 के दौरान वापस ली गई मात्रा की तुलना में ~ 1 एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस से अधिक सिरिंज भरें।
      9. साइड गैप से टेप को हटा दें, भरी हुई सिरिंज के साथ गैप को भेदें, और इसे खोल में खाली करें। सुनिश्चित करें कि सुई अंडे के निचले हिस्से की ओर इशारा कर रही है।
        नोट: चूंकि अंडे की सफेदी में पीबीएस (~ 1 सीपी) की तुलना में अधिक चिपचिपाहट (~ 160 सीपी) 27 होती है, इसलिए अंडे की सफेदी को पीबीएस के साथ प्रतिस्थापित करने से अंडे की सामग्री को शेल से बाहर निकालते समय भ्रूण और सीएएम पर तनाव और तनाव दोनों कम हो जाता है।
      10. सुई को बाहर निकालें और टेप के एक टुकड़े (चित्रा 2 डी) के साथ अंतर को जल्दी से फिर से सील करें।
      11. अंडे को 180° घुमाएं और अंडे को अंडे को वापस अंडे धारक में इस तरह रखें कि अंडे के शीर्ष पर बनाया गया उद्घाटन अब नीचे की ओर है। अंडे को घड़ी की तरह घुमाएं जब तक कि पूरे भ्रूण और सीएएम (सभी वाहिकाओं सहित) गायब न हो जाएं और केवल जर्दी दिखाई न दे।
      12. चरण 1.2.2.10 से चरण 1.2.2.14 तक निष्पादित करें।
  4. 8 दिन (192 घंटे) पुराने भ्रूण (एचएच चरण 32-35) 22 तैयार करना
    1. कार्य क्षेत्र की तैयारी
      1. एक हीटिंग प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      2. हीटिंग प्लेट पर पीबीएस से भरा एक धातु वजन नाव धारक (चित्रा 1 सी, डी) और 10 एमएल एर्लेनमेयर रखें।
      3. 170 x 110 x 70 मिमी, या इसी तरह का उथला कंटेनर लें, और कंटेनर को 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के 1 एल से भरें।
      4. 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में एक वजन वाली नाव (85 × 85 × 25 मिमी) रखें। पेट्री डिश और वजन नाव को कंटेनर के तल पर रखें और सुनिश्चित करें कि वे पूरी तरह से जलमग्न हैं।
    2. अंडे के छिलके से अंडे की सामग्री को बाहर निकालना
      1. प्रयोग के दो घंटे पहले, एक 8 दिन पुराना इनक्यूबेटेड अंडा लें और अंडे को इनक्यूबेटर के अंदर 180 डिग्री घुमाएं ताकि अंडे का शीर्ष नीचे की ओर हो। 1 घंटे के बाद, अंडे को उसकी मूल स्थिति में वापस घुमाएं और एक और 1 घंटे के लिए छोड़ दें।
        नोट: प्रयोग से 2 घंटे पहले अंडे को घुमाने से अंडे की सामग्री को शेल से बाहर निकालना आसान हो जाएगा।
      2. इनक्यूबेटर से 8 दिन पुराना इनक्यूबेट किया हुआ अंडा लें।
      3. अंडे को क्षैतिज रूप से पकड़ें और अंडे के नीचे एक छोटा सा इंडेंट बनाने के लिए बड़े चिमटी (चित्रा 1 ई) के पॉइंटी बैक का उपयोग करें। अंडे के छिलके के चारों ओर 360 ° रिंग पैटर्न में छोटे इंडेंट बनाना जारी रखें। मांग पत्रों के बीच ~ 10 मिमी की दूरी का उपयोग करें।
        नोट: इस प्रक्रिया के दौरान, मांगों के बीच छोटी दरारें बनना शुरू हो सकती हैं।
      4. खोल के चारों ओर छोटे इंडेंट बनाने के बाद, बड़े चिमटी के पॉइंटी बैक का उपयोग करके दो छोटे इंडेंट के बीच शेल को क्रैक करके एक बड़ा छेद बनाएं।
      5. अंडे को पूरी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में डुबो दें और इसे 5 मिनट के लिए जलमग्न रखें। 5 मिनट के बाद, अंडे को कंटेनर के अंदर वजन नाव के करीब रखें। बड़े छेद में दोनों अंगूठों के शीर्ष को रखें और धीरे से अंडे को खोलें। अंडे छोटे इंडेंट के साथ फट जाएंगे।
      6. जब अंडे के छिलके के चारों ओर दरार बन जाती है, तो धीरे से दो अंडे के टुकड़ों को अलग करने की कोशिश करें और धीरे से दो टुकड़ों को आगे और पीछे ले जाते रहें जब तक कि अंडे की सामग्री खोल से अलग न हो जाए। फिर, धीरे से वजन करने वाली नाव में अंडे की सामग्री गिराएं।
        नोट: अंडे के छिलके के दो टुकड़ों को आगे और पीछे ले जाने से, अंडे के छिलके में अधिक पीबीएस प्रवाहित होगा, जो शेल से अंडे की सामग्री को अलग करने में मदद करेगा। कभी-कभी, अंडे का थोड़ा सा सफेद भाग अंडे के छिलके के अंदर तक चिपक जाएगा। जब ऐसा होता है, तो अंडे के सफेद भाग को खोल से अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
      7. धीरे-धीरे पेट्री डिश को ऊपर उठाएं जिसमें पीबीएस से वजन नाव और अंडे की सामग्री होती है। पीबीएस से बाहर निकलने पर, अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के लिए वजन वाली नाव को थोड़ा झुकाएं।
      8. धातु वजन नाव धारक में अंडे की सामग्री वाली वजन नाव रखें और वांछित प्रयोगात्मक सेटअप पर जाएं।

2. चयनित अनुप्रयोग

  1. सीएएम जहाजों में माइक्रोबबल और / या अन्य समाधान इंजेक्ट करना
    1. इंजेक्शन सेटअप तैयार करना
      1. माइक्रो फोर्ज (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके ग्लास केशिका ट्यूबों से कांच की सुइयों को खींचें या खींची गई ग्लास केशिका सुइयों को खरीदें।
      2. यदि कांच की केशिका सुई की नोक को बंद नहीं किया जाता है, तो सुई की नोक का एक छोटा सा हिस्सा तोड़ दें। कांच की सुई को खनिज तेल से भरें और इसे माइक्रो-इंजेक्शन सिस्टम में रखें। सुनिश्चित करें कि कांच की सुई में खनिज तेल में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
        नोट: खनिज तेल हमारे द्वारा उपयोग की जाने वाली इंजेक्शन प्रणाली के निर्माता के निर्देश के अनुसार जोड़ा जाता है।
      3. खींची गई ग्लास केशिका सुई को खाली करें जहां तक माइक्रो-इंजेक्शन सिस्टम अनुमति देता है और आंशिक रूप से कांच की सुई को हवा के साथ फिर से भर देता है।
        नोट: हवा का छोटा सा हिस्सा खनिज तेल और इंजेक्शन वाले समाधान के मिश्रण को रोक देगा।
      4. मोमी फिल्म (चित्रा 3 बी) के एक टुकड़े पर, इस प्रोटोकॉल माइक्रोबबल में वांछित समाधान का 10 μL डालें। यदि एक से अधिक समाधान की आवश्यकता है, तोसमाधान को पाइपिंग 7 से पहले मिलाया जा सकता है।
        नोट: सुई को माइक्रोबबल से भरने से पहले, माइक्रोबबल ड्रॉप को मोमी फिल्म पर ~ 1 मिनट के लिए छोड़ दें ताकि माइक्रोबबल ड्रॉप के शीर्ष पर तैर जाएं और केंद्रित हो जाएं। एफ-टाइप कस्टम-निर्मित अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट28 के लिए, यह एकाग्रता चरण ~ 30% के साथ इंजेक्शन वाले माइक्रोबबल एकाग्रता को बढ़ाएगा। चिकन भ्रूण के रक्त में इंजेक्शन के बाद की एकाग्रता 5 दिन के भ्रूण के लिए32 x 10 3 माइक्रोबबल / μL और 6 दिन के भ्रूण के लिए 19 x 103 माइक्रोबबल /
      5. कांच की सुई को माइक्रोबबल और / या अन्य समाधान के साथ भरें, ग्लास सुई टिप को मोमी फिल्म पर ड्रॉप में रखकर। माइक्रोबबल्स को एस्पिरेटेड करते समय, माइक्रोबबल समृद्ध समाधान को एस्पिरेट करने के लिए तरल बूंद के शीर्ष में सुई की नोक को रखना सुनिश्चित करें।
        नोट: माइक्रोबबल इंजेक्ट करने से पहले, कांच की सुई की नोक को उसके उच्चतम बिंदु तक उठाएं और ~ 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें। यह सुनिश्चित करेगा कि माइक्रोबबल कांच की सुई की नोक में केंद्रित होंगे।
  2. सीएएम जहाजों में इंजेक्शन
    1. इंजेक्शन से पहले, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत सीएएम को देखें और इंजेक्शन लगाने के लिए सबसे अच्छा पोत चुनें। हमेशा भ्रूण की नसों में से एक में इंजेक्ट करें। ये वे वाहिकाएं हैं जिनमें रक्त प्रवाह भ्रूण की ओर बढ़ता है। ऑक्सीजन युक्त रक्तके कारण धमनियों की तुलना में नसें रंग में हल्की होती हैं। इसके अलावा, नसें हमेशा दो अपवादों के साथ धमनी के शीर्ष पर होती हैं अर्थात् पूर्वकाल और पीछे की विटेलिन नसें (यानी, कम शाखित नसें, चित्रा 6 ए, बी में तारांकन के साथ इंगित) जिनके परिवेश में धमनी नहीं होती है।
      नोट: शाखाओं में से एक में इंजेक्शन इंजेक्शन के दौरान रक्त प्रवाह की रुकावट को सीमित करेगा। चित्रा 6 ए, बी में तीर के साथ अच्छे इंजेक्शन साइटों का संकेत दिया गया है। नस में इंजेक्ट करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह इंजेक्शन वाले पदार्थ को भ्रूण की ओर बहने के लिए मजबूर करेगा। इसके अलावा, धमनी में इंजेक्शन लगाने से कांच की सुई को हटाते समय बड़े पैमाने पर रक्तस्राव होगा जो भ्रूण को मार देगा।
    2. कांच की सुई और भ्रूण को इस तरह से रखें कि कांच की सुई की नोक और चयनित नस एक ही फोकल प्लेन में और दिशा की एक ही रेखा में हों। चयनित नस के समानांतर सुई को यथासंभव क्षैतिज स्थिति में रखने का प्रयास करें। सुई की नोक को पोत की दीवार को छूना चाहिए।
      नोट: कांच की सुई को यथासंभव क्षैतिज रूप से स्थापित करके, पूरे पोत के माध्यम से छेदने की संभावना कम होती है।
    3. स्थिति के बाद, धीरे-धीरे आगे बढ़ें और कांच की सुई के साथ पोत की दीवार में प्रवेश करें। प्रवेश के दौरान, सीएएम को पहले कांच की सुई की गति से दूर धकेल दिया जाएगा। कांच की सुई को तब तक आगे बढ़ाते रहें जब तक कि पोत की दीवार में प्रवेश न हो जाए।
      नोट: यदि दुर्घटना से जहाज को छेद दिया जाता है और उसके माध्यम से, धीरे-धीरे सुई को वापस लुमेन में वापस ले जाएं। लुमेन के अंदर वापस आने पर, सुई को थोड़ा ऊपर उठाएं और सुई को फिर से स्थापित करने के लिए बर्तन के साथ आगे बढ़ें।
    4. प्रवेश के बाद, बर्तन लुमेन के अंदर नोक को बेहतर ढंग से रखने के लिए कांच की सुई को थोड़ा सा मोड़ें और कांच की सुई को साइडवे ले जाएं ताकि यह जांचा जा सके कि यह पोत की दीवार से जुड़ा नहीं है। धीरे-धीरे समाधान की एक छोटी मात्रा को इंजेक्ट करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि टिप पोत लुमेन (चित्रा 3 सी) के अंदर स्थित है।
    5. सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन समाधान रक्त प्रवाह का अनुसरण करता है। यदि ऐसा नहीं होता है, तो कांच की सुई को थोड़ा हिलाएं और छोटी मात्रा में इंजेक्ट करते रहें जब तक कि कांच की सुई सहीढंग से तैनात न हो जाए।
    6. जब वांछित मात्रा इंजेक्ट की जाती है, तो बड़े पैमाने पर रक्तस्राव को रोकने के लिए कांच की सुई को ~ 15 सेकंड के लिए बर्तन में छोड़ दें। फिर, कांच की सुई को थोड़ा सा साइड, ऊपर और नीचे, और कुछ बार आगे और पीछे ले जाएं ताकि कांच की सुई को धीरे से वापस लेने की अनुमति मिल सके।
      नोट: कुछ रक्तस्राव सामान्य है। प्रत्येक इंजेक्शन के लिए एक नई कांच की सुई का उपयोग करें क्योंकि कांच की सुई अंडे की सफेदी से आसानी से बंद और कुंद हो जाती है।
  3. भ्रूण और / या सीएएम वाहिकाओं की माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
    1. ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक तैयार करना
      1. एक सेल कल्चर चैंबर लें जिसमें दो समानांतर 50 μm मोटी ध्वनिक रूप से पारदर्शी पॉली कार्बोनेट झिल्ली26 के साथ एक वर्ग प्लास्टिक धारक होता है, जिसे आगे ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक के रूप में जाना जाता है। ढक्कन के साथ दोनों बंदरगाहों को बंद करें।
      2. ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक से दो झिल्ली में से एक को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
        नोट: झिल्ली को हटाने के लिए, प्लास्टिक पर गोंद रेखा के ठीक बगल में झिल्ली काटें। अन्य झिल्ली को नुकसान को रोकने के लिए किनारे से फिसलने से बचने के लिए सावधान रहें।
      3. एक छोटे ग्लास बीकर में 80-95 डिग्री सेल्सियस के बीच गर्म करके डेमी पानी के घोल में ~ 15 एमएल 2% अगारोस तैयार करें। एक बहते हुए ठंडे पानी के नल के नीचे घुले हुए अगारोस घोल के साथ ग्लास बीकर को ठंडा करें।
        नोट: यदि अगारोस बहुत गर्म है तो यह ध्वनिक झिल्ली को पिघला देगा जो एक असमान सतह बनाएगा।
      4. जब घोल को लगभग 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है, तो धीरे-धीरे ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक में घोल डालें जब तक कि यह पूरे धारक को न भर दे। ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक को थोड़ा झुकाएं ताकि अगारोस परत प्लास्टिक फ्रेम के अंदर समान रूप से वितरित हो (चित्रा 4 ए)। सुनिश्चित करें कि अगारोस परत सपाट है और कमरे के तापमान पर अगारोस सेट होने दें।
    2. जर्दी की बोरी से भ्रूण और सीएएम को निकालना और ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक पर रखना
      1. खंड 1.2, 1.3, या 1.4 में वर्णित अंडे की सामग्री को अंडे से बाहर निकालें।
      2. यदि आवश्यक हो, तो सीएएम को माइक्रोबबल और / या अन्य समाधान (ओं) के साथ इंजेक्ट करें जैसा कि अनुभाग 2.1.2 में वर्णित है।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के ~ 500 एमएल के साथ एक 1 एल पेट्री डिश भरें और डिश के निचले भाग पर अगारोस के साथ ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक रखें। सुनिश्चित करें कि अगारोस परत ऊपर की ओर है।
      4. जर्दी की बोरी की झिल्ली में जल्दी से काटने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें, जिसे विटेलस झिल्ली भी कहा जाता है, पूरे सीएएम के चारों ओर, जबकि अंडे की सामग्री वजन नाव में होती है (चित्रा 4 बी)। कैंची को उसी स्थिति में रखें और बेहतर परिशुद्धता और अधिक गति के लिए काटते समय वजन वाली नाव को घुमाएं।
        नोट: जिस क्षण से पहला कट लगाया जाता है, जर्दी लीक होना शुरू हो जाएगी। यह भ्रूण और सीएएम की दृश्यता को कम करता है। 6-7 कट के भीतर सीएएम के चारों ओर सभी तरह से कटौती करने की कोशिश करें। इसमें 20 सेकंड से अधिक समय नहीं लगना चाहिए। छोटे चिमटी (चित्रा 1 एफ) का उपयोग विटेलिन झिल्ली के किनारे को पकड़ने और सीएएम में काटने से रोकने के लिए किया जा सकता है।
      5. वजन वाली नाव से भ्रूण और सीएएम युक्त कट-आउट झिल्ली को खींचने के लिए एक बड़े चम्मच का उपयोग करें। धीरे-धीरे वजन करने वाली नाव से चम्मच उठाएं और नेत्रहीन निरीक्षण करें कि भ्रूण और सीएएम युक्त कट-आउट झिल्ली अभी भी शेष जर्दी बोरी झिल्ली से जुड़ी हुई है या नहीं। जब यह मामला है, तो अतिरिक्त कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें। स्कूपिंग करते समय, चम्मच को थोड़ा झुकाएं ताकि जितना संभव हो उतनी जर्दी से छुटकारा मिल सके लेकिन इसे सूखने न दें। भ्रूण और सीएएम युक्त कट-आउट झिल्ली को 1 एल पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में डूब जाएं, और चम्मच को हटा दें।
      6. जब भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में डूब जाती है, तो झिल्ली के एक किनारे को पकड़ने के लिए छोटे चिमटी (चित्रा 1 एफ) का उपयोग करें और धीरे से झिल्ली के चारों ओर घूमें ताकि जर्दी से छुटकारा मिल सके जो अभी भी जुड़ा हुआ है।
      7. जब सभी जर्दी हटा दी जाती है, तो भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को स्थानांतरित करने के लिए छोटे चिमटी का उपयोग करें और इसे ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक के ऊपर रखें।
      8. एक कोने में भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को पिन करने के लिए एक कीट नमूना पिन का उपयोग करें। सीएएम में वाहिकाओं को छेदने से बचें और केवल झिल्ली को पिन करें।
      9. विकर्ण विपरीत कोने पर भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को पिन करने के लिए एक दूसरे कीट नमूना पिन का उपयोग करें।
      10. धीरे-धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस से भ्रूण और सीएएम युक्त ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक को उठाएं। अधिकांश पीबीएस से छुटकारा पाने के लिए धारक को थोड़ा झुकाएं।
      11. भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक पर फैलाने और समान रूप से वितरित करने के लिए छोटे चिमटी (चित्रा 1 एफ) का उपयोग करें और बाकी झिल्ली को पिन करें। सुनिश्चित करें कि भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली यह सुनिश्चित करने के लिए थोड़ी फैली हुई है कि यह सपाट है (चित्रा 4 सी)।
      12. भ्रूण और सीएएम युक्त पिन की गई झिल्ली के साथ ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक को माइक्रोस्कोपी सेटअप में रखें जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है।
      13. ऑप्टिकल विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए भ्रूण या सीएएम (चित्रा 4 डी) पर रुचि के क्षेत्र के शीर्ष पर एक कवरस्लिप या ध्वनिक और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी झिल्ली (वांछित उद्देश्य और अल्ट्रासाउंड के उपयोग के आधार पर या नहीं) रखें।
  4. चिकन भ्रूण और / या सीएएम वाहिकाओं की अल्ट्रासाउंड इमेजिंग
    1. चिकन भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं के किनारे से अल्ट्रासाउंड इमेजिंग
      1. खंड 1.2, 1.3, या 1.4 में वर्णित अंडे की सामग्री को बाहर निकालें। हालांकि, मानक वजन नाव का उपयोग न करें। इसके बजाय, एक ध्वनिक रूप से पारदर्शी दीवार के साथ एक कस्टम-निर्मित वजन नाव का उपयोग करें।
        नोट: मानक वजन वाली नाव को वजन वाली नाव के एक तरफ काटकर समायोजित किया गया था और इसे पॉलिएस्टर पन्नी की खिड़की के साथ बदल दिया गया था जिसे एपॉक्सी गोंद का उपयोग करके एक साथ चिपकाया गया था।
      2. पसंदीदा अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डुबोएं और आवश्यक गतिरोध दूरी के साथ वांछित स्थान पर स्थिति रखें।
      3. वजन करने वाली नाव को पानी के स्नान में इस तरह रखें कि पारदर्शी दीवार ट्रांसड्यूसर के सामने हो। सुनिश्चित करें कि वजन करने वाली नाव ट्रांसड्यूसर के साथ समतल होने के लिए पर्याप्त गहरी है, लेकिन वजन वाली नाव में पानी आने से बचें (चित्रा 5 ए)।
      4. यदि वांछित हो, तो भ्रूण या सीएएम जहाजों के शीर्ष पर एक और सेटअप जोड़ें, जैसे माइक्रोस्कोप या लेजर (चित्रा 5 ए)।
    2. ध्वनिक हस्तक्षेप के बिना भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं के शीर्ष से अल्ट्रासाउंड इमेजिंग
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ एक 2 एल बीकर ग्लास भरें। 2 एल बीकर ग्लास के निचले हिस्से पर 500 एमएल बीकर ग्लास उल्टा रखें। 500 एमएल बीकर ग्लास के अंदर हवा से बचें।
        नोट: 500 एमएल बीकर ग्लास पीबीएस सतह के करीब अंडे की सामग्री वाली वजन वाली नाव को बढ़ाने के लिए है। अन्य आकारों वाली वस्तुओं के लिए बीकर को प्रतिस्थापित करके, ट्रांसड्यूसर और अंडे की सामग्री के बीच की दूरी को भिन्न किया जा सकता है।
      2. भरे हुए 2 लीटर बीकर ग्लास को 500 एमएल बीकर ग्लास के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में अंदर रखें।
      3. खंड 1.2, 1.3, या 1.4 में वर्णित अंडे की सामग्री को बाहर निकालें।
      4. अंडे की सामग्री को 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ गीला करें और भ्रूण को स्पष्ट क्लिंग फिल्म के साथ कवर करें। यह भ्रूण को एक ही स्थिति में रखने और इसे घूमने या तैरने से रोकने के लिए किया जा सकता है।
        नोट: पीबीएस के साथ अंडे की सामग्री को गीला करने से, यह कम चिपचिपा हो जाएगा जो स्पष्ट क्लिंग फिल्म के साथ अंडे की सामग्री को कवर करना आसान बनाता है।
      5. 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में अंडे की सामग्री के साथ वजन वाली नाव रखें और धीरे-धीरे पेट्री डिश को पीबीएस (चित्रा 5 बी) में डुबो दें।
        नोट: एक दूसरे के विपरीत पेट्री डिश के किनारों पर दो क्लैंप का उपयोग करने से पेट्री डिश को जलमग्न करना आसान हो जाता है।
      6. अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को वांछित गतिरोध दूरी के साथ रखें।
    3. एक जंगम ट्रांसड्यूसर के साथ चिकन भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं की अल्ट्रासाउंड इमेजिंग
      1. खंड 1.2, 1.3, या 1.4 में वर्णित अंडे की सामग्री को बाहर निकालें।
      2. एक छोटे ग्लास बीकर में 80-95 डिग्री सेल्सियस के बीच घोल को गर्म करके डेमी पानी में 2% अगारोस घोल तैयार करें। एक चल रहे ठंडे पानी टैब के नीचे घुलित अगारोस समाधान के साथ ग्लास बीकर को ठंडा करें।
      3. लगभग 1 मिमी मोटा अगारोस पैड बनाने के लिए एक फ्लैट कंटेनर में अगारोस समाधान डालें। जब पूरी तरह से ठंडा हो जाए और सेट हो जाए, तो स्केलपेल का उपयोग करके एगारोस पैड को वांछित आकार में काट लें।
        नोट: अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के सही कामकाज के लिए आवश्यक वांछित फोकल दूरी प्राप्त करने के लिए अगारोस पैड की मोटाई को बदला जा सकता है।
      4. भ्रूण और सीएएम (चित्रा 5 सी) के शीर्ष पर अगारोस पैड रखें। अगारोस पैड और ट्रांसड्यूसर के बीच एक पतली पीबीएस परत बनाने के लिए अगारोस पैड के शीर्ष पर ~ 30 डिग्री सेल्सियस पीबीएस की कुछ बूंदें जोड़ें।
        नोट: पीबीएस का उपयोग ट्रांसड्यूसर को अगारोस पैड से चिपकने से रोक देगा। यह फायदेमंद है, उदाहरण के लिए, तीन आयामी स्कैन (चित्रा 9 बी) 11 बनाने के लिए दो-आयामी ट्रांसड्यूसर को यांत्रिक रूप से स्थानांतरित करने के लिए मोटर का उपयोग करना। जब ट्रांसड्यूसर को स्थानांतरित करने की आवश्यकता नहीं होती है, तो पीबीएस को अल्ट्रासाउंड जेल के साथ भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
      5. वांछित अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर की स्थिति।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम इनक्यूबेशन के दिन 5-8 (एचएच 26-35 22) में शेल से अंडे की सामग्री को बाहर निकालने के लिए तीन तरीकों का वर्णनकरते हैं। चित्र 6 शेल से बाहर निकाले जाने के बाद वजन करने वाली नौकाओं में अंडे की मात्रा को दर्शाता है। 5 दिन पुराने भ्रूण और सीएएम (चित्रा 6 ए) को खंड 1.2 में वर्णित विधि का उपयोग करके बाहर निकाला गया था। 6 और 7 दिन पुराने भ्रूण और सीएएम (चित्रा 6 बी, सी) को खंड 1.3 में वर्णित विधि का उपयोग करके बाहर निकाला गया था। 8 दिन पुराने भ्रूण और सीएएम (चित्रा 6 डी) को खंड 1.4 में वर्णित विधि का उपयोग करके बाहर निकाला गया था। भ्रूण या सीएएम को कोई रक्तस्राव या क्षति नहीं देखी जा सकती है, यह दर्शाता है कि इन तरीकों का उपयोग भ्रूण या सीएएम वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना शेल से अंडे की सामग्री को सुरक्षित रूप से बाहर निकालने के लिए किया जा सकता है। जब सही ढंग से निष्पादित किया जाता है, तो 5-दिन पुराने भ्रूण के लिए विधि सभी प्रक्रियाओं के 90% में एक व्यवहार्य भ्रूण और बरकरार सीएएम प्रदान करेगी। व्यवहार्यता दर अंडे के छिलके से सफलतापूर्वक निकाले गए निषेचित अंडों की कुल संख्या पर आधारित है। दूसरी विधि के साथ, 6 और 7-दिवसीय इनक्यूबेटेड अंडों के लिए, एक व्यवहार्य भ्रूण और बरकरार सीएएम की संभावना 6-दिन के बच्चों के लिए लगभग 75% और 7-दिन के बच्चों के लिए लगभग 50% है। 8-दिन पुराने भ्रूण के लिए वर्णित तीसरी विधि के साथ, एक व्यवहार्य भ्रूण और बरकरार सीएएम की संभावना लगभग 60% है। 5 और 8 दिन के भ्रूण के बीच विकास के चरणों में अंतर देखा जा सकता है जो हैमबर्गर और हैमिल्टन22 के साथ सहमत है। भ्रूण का आकार और सीएएम वाहिकाओं की जटिलता दोनों विकास के दौरान बढ़ जाती हैं (चित्रा 6 ए-डी)। चित्रा 6 सी अंडे की सामग्री के शीर्ष पर अगारोस का एक पतला पैच दिखाता है जो भ्रूण और सीएएम को चित्रा 5 सी में दिखाए गए अल्ट्रासाउंड सेटअप का उपयोग करके चित्रित करने की अनुमति देता है। अंडे की सामग्री को खोल से बाहर निकालने के बाद भ्रूण के दिल की धड़कन नग्न आंखों से दिखाई देती है। इन एक्स ओवो भ्रूणों की हृदय गति दिन 5 पर 183 बीट प्रति मिनट (बीपीएम) पर ओवो भ्रूण के समान है, जो दिन 830 पर ~ 208 बीपीएम तक है। जब ह्यूमिडिफ़ायर और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, तो भ्रूण प्रयोगात्मक अल्ट्रासाउंड सेटअप में ~ 5 घंटे के लिए इस हृदय गति को बनाए रखेगा।

पहले वर्णित तीन तरीकों के दौरान कई जटिलताएं हो सकती हैं। चित्रा 7 ए सीएएम के नीचे फंसी हुई हवा को दर्शाता है जो भ्रूण को अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त बनाता है और हवा के बुलबुले (ओं) का दबाव भ्रूण और / या सीएएम को भी नुकसान पहुंचा सकता है। यह समस्या तब उत्पन्न होती है जब शेल के अंदर की हवा की थैली शेल से अंडे की सामग्री को बाहर निकालते समय शेल के बाहर की हवा से संपर्क नहीं करती है। चित्र 7 बी छवि के ऊपरी दाईं ओर जर्दी बोरी से जर्दी का एक छोटा रिसाव दिखाता है। यह अंडे की सामग्री को खोल से बाहर निकालते समय हो सकता है जब जर्दी की बोरी खोल के तेज किनारों से क्षतिग्रस्त हो जाती है या जब जर्दी की बोरी चिमटी द्वारा प्रवेश करती है। जर्दी का रिसाव भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं की दृश्यता को प्रभावित कर सकता है। चित्रा 7 सी एक भ्रूण दिखाता है जिसमें सीएएम के नीचे एक हवा का बुलबुला फंस जाता है। यह कभी-कभी भ्रूण के विकास में होता है। एक और जटिलता जो हो सकती है वह वाहिकाओं को नुकसान है। यह क्षति अंडे की सामग्री को खोल से बाहर निकालते समय या इंजेक्शन (चित्रा 7 डी) करते समय बनाई जा सकती है। इसके अलावा, भ्रूण और वाहिकाएं भी समय के साथ सूख सकती हैं (चित्रा 7 ई)। यह तब होता है जब अंडे की सामग्री पीबीएस के साथ छिड़की नहीं जाती है। भ्रूण के सूखने से बड़े पैमाने पर केशिका अवरोध (चित्रा 7 एफ) हो सकता है जो भ्रूण की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है। बड़े पैमाने पर केशिका अवरोध विकास के दौरान या जब भ्रूण के दिल की धड़कन स्थिर नहीं होती है तो भी हो सकती है।

अंडे की सामग्री को बिना किसी जटिलता के खोल से बाहर निकालने के बाद, भ्रूण को इंजेक्शन दिया जा सकता है, उदाहरण के लिए, अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट जैसे माइक्रोबबल (चित्रा 3 सी)। चित्रा 8 इंजेक्शन पर रक्त वाहिका के लुमेन में माइक्रोबबल को प्रसारित करता है। इन माइक्रोबबल्स को रक्त प्रवाह के साथ ले जाया जाता है और कई घंटों तक रक्त परिसंचरण में मौजूद रहता है (पूरक वीडियो 1)। परिसंचरण में इन माइक्रोबबल्स की उपस्थिति विभिन्न प्रकार के सीईयूएस और दवा वितरणप्रयोगों 7,11,12 को करने की संभावना पैदा करती है। सीएएम नए अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट डिटेक्शन विधियों की जांच करने के लिए आदर्श है जिसके लिए हम तीन उदाहरण दिखाते हैं। चित्रा 9 ए माइक्रोबबल इंजेक्शन से पहले और बाद में बी-मोड और सीईयूएस में 6-दिवसीय चिकन भ्रूण की उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड सबहारमोनिक इमेजिंग दिखाता है। यहां, सीएएम वाहिकाओं को अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के 5 μL के साथ इंजेक्ट किया गया था और इमेजिंग को MS250 जांच (30 MHz ट्रांसमिट और 15 MHz प्राप्त आवृत्ति, 10% शक्ति) के साथ प्रीक्लिनिकल पशु अल्ट्रासाउंड मशीन के साथ किया गया था। माइक्रोबबल इंजेक्शन से पहले, बी-मोड छवियों (चित्रा 9 ए-आई) में भ्रूण के दिल के अंदर कंट्रास्ट पहले से ही देखा जा सकता है। यह घटना एवियन लाल रक्त कोशिका में एक नाभिक की उपस्थिति के कारण होती है जो अल्ट्रासाउंड इमेजिंग 5,31 में रक्त के विपरीत को बढ़ाती है। माइक्रोबबल्स के अलावा बी-मोड और सीईयूएस इमेजिंग दोनों में भ्रूण के कंट्रास्ट और दृश्यता में वृद्धि हुई। चित्रा 9 बी 6 दिन के भ्रूण और आसपास के जहाजों की एक ऑप्टिकल और एक उच्च आवृत्ति 3 डी सबहारमोनिक छवि दिखाता है। सीएएम को अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के 5 μL के साथ इंजेक्ट किया गया था और इमेजिंग को MS550s जांच (40 MHz की संचरण आवृत्ति, पीक नकारात्मक दबाव ~ 300 kPa) के साथ प्रीक्लिनिकल पशु अल्ट्रासाउंड मशीन के साथ किया गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि सीईयूएस इमेजिंग को कंट्रास्ट एजेंट के साथ संयुक्त रूप से उच्च आवृत्ति 3 डी सबहारमोनिक छवियां बनाने और भ्रूण के बाहर रक्त वाहिकाओं की छवि बनाने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 9 सी एक ऑप्टिकल छवि और एक अल्ट्राहारमोनिक इंट्रावस्कुलर अल्ट्रासाउंड (आईवीयूएस) छवि दिखाता है जो 6 दिन के भ्रूण के सीएएम माइक्रोवाइल की कस्टम जांच के साथ बनाया गया है (26 मेगाहर्ट्ज ट्रांसमिट और 39 और 65 मेगाहर्ट्ज आवृत्ति प्राप्त करते हैं)। सीएएम वाहिकाओं को 4 ± 1 1 एसएल अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के साथ इंजेक्ट किया गया था। ऑप्टिकल छवि और आईवीयूएस छवि एक ही भ्रूण और रुचि के एक ही क्षेत्र से हैं जो संबंधित पोत नेटवर्क दिखाते हैं।

चिकन भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं का उपयोग अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता दवा वितरण की जांच के लिए भी किया जा सकता है जिसके लिए हम एक उदाहरण दिखाते हैं। चूंकि जर्दी इमेजिंग के दौरान प्रकाश पथ को बाधित करती है, इसलिए भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं में दवा वितरण की ऑप्टिकल जांच के लिए जर्दी की बोरी को हटाना आवश्यक है। इस अध्ययन के लिए, भ्रूण और सीएएम को सूक्ष्म इमेजिंग के लिए तैयार किया गया था जैसा कि खंड 2.2 में समझाया गया है, भ्रूण और सीएएम युक्त झिल्ली को जर्दी बोरी से अलग करके (चित्रा 4 सी)। इन भ्रूणों में, हृदय गति 80 बीपीएम के आसपास स्थिर होती है और भ्रूण 37 डिग्री सेल्सियस 7 पर रखे जाने पर 2 घंटे तक जीवित रहतेहैं। चित्रा 10 सीएएम वाहिकाओं के एंडोथेलियल कोशिकाओं में एक अल्ट्रासाउंड और माइक्रोबबल मध्यस्थता दवा वितरण अध्ययन दिखाता है। लिपिड-लेपित माइक्रोबबल, αवीβ3-एंटीबॉडी का उपयोग करके पोत की दीवार पर लक्षित और फ्लोरोसेंट डाई डीआईआई7 के साथ सना हुआ, सीएएम वाहिकाओं में इंजेक्ट किया गया (चित्रा 10 ए, सी)। सीएएम पोत एंडोथेलियल सेल नाभिक को होचस्ट 33342 (चित्रा 10 बी) के साथ दाग दिया गया था और मॉडल दवा प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) का उपयोग सोनोपोरेशन7 की कल्पना करने के लिए किया गया था। इन दोनों रंगों को माइक्रोबबल के साथ एक साथ इंजेक्ट किया गया था। अल्ट्रासाउंड उपचार (1 मेगाहर्ट्ज, 200 केपीए पीक नकारात्मक दबाव, 1000 चक्रों का एकल विस्फोट) पर, लक्षित माइक्रोबबल्स के निकटतम नाभिक में पीआई अपटेक देखा गया (चित्रा 10 डी)। इससे पता चलता है कि लक्षित माइक्रोबबल के अल्ट्रासाउंड-प्रेरित दोलन एंडोथेलियल सेल झिल्ली में एक छिद्र बनाने में सक्षम थे।

Figure 1
चित्र 1. भ्रूण तैयार करने के उपकरण। (A-B) धातु अंडा धारक के शीर्ष और साइड दृश्य और (सी-डी) धातु वजन नाव धारक का शीर्ष और साइड दृश्य। (ई-एफ) चिमटी को अंडे की सामग्री को शेल से बाहर निकालने की आवश्यकता होती है। सेमी में स्केल करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. भ्रूण हटाने की प्रक्रिया। (ए) अंडे के शीर्ष पर छोटा इंडेंट, काले सर्कल द्वारा इंगित किया गया है। (बी) अंडे के नीचे 2/3 छोटा इंडेंट, काले सर्कल द्वारा इंगित किया गया है। (सी) अंडे के सफेद भाग के ~ 2 एमएल को वापस लेना। (डी) टेप के साथ किनारे पर सीलबंद अंतर। (ई) अंडे के शीर्ष पर छोटे उद्घाटन को बढ़ाना। (एफ) शेल के हिस्से को हटाने के बाद भ्रूण दिखाई देने लगता है। (G-H) अंडे को 180 ° घुमाने के बाद, भ्रूण तैरता है और अदृश्य हो जाएगा (तीर भ्रूण की चलती दिशा को इंगित करते हैं)। 1-2 मिनट के बाद, भ्रूण नीचे से अदृश्य है। (I) झिल्ली को खरोंचने के बाद, अंडे की मात्रा वजन वाली नाव में गिर जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. सीएएम जहाजों में माइक्रोबबल का इंजेक्शन। (ए) ग्लास केशिका सुई। (बी) प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) समाधान (बाएं बूंद) और माइक्रोबबल (दाएं बूंद) इंजेक्शन से पहले आकांक्षा से पहले। सुई (काले रंग में उल्लिखित) को ऊपरी दाएं कोने (सी) माइक्रोबबल इंजेक्शन में देखा जा सकता है। केशिका सुई टिप नसों (बाएं) में से एक के लुमेन के अंदर स्थित है। माइक्रोबबल्स, एक तीर के साथ इंगित सफेद बादल, रक्त प्रवाह (दाएं) के बाद इंजेक्ट और फैल जाते हैं। स्केल पट्टी 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. जर्दी की बोरी से भ्रूण और सीएएम को निकालना और ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक पर रखना। (ए) अगारोस परत से भरे ध्वनिक झिल्ली के साथ धारक। (बी) काटने से पहले वजन नाव में चिकन भ्रूण और सीएएम पोत। डॉटेड लाइन सीएएम के चारों ओर कटिंग लाइन को इंगित करती है। (सी) चिकन भ्रूण और सीएएम जर्दी से अलग हो जाते हैं और ध्वनिक झिल्ली पर पिन किए जाते हैं। (डी) सीएएम के शीर्ष पर रखे गए धारक (नीले) में ध्वनिक और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी झिल्ली के साथ चिकन भ्रूण को पिन किया गया। धारक को डेमी पानी से भरा जा सकता है ताकि पानी डिपिंग उद्देश्य का उपयोग किया जा सके। सभी स्केल पट्टियाँ 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. चिकन भ्रूण और सीएएम अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए विभिन्न सेटअप। (ए) साइड से अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए सेटअप। चिकन भ्रूण को एक ध्वनिक रूप से पारदर्शी दीवार के साथ एक कस्टम-समायोजित वजन नाव में रखा गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा गया था। अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को ध्वनिक रूप से पारदर्शी दीवार के बगल में बाईं (ए) तरफ और शीर्ष पर फोटोएकोस्टिक इमेजिंग के लिए लेजर (बी) पर तैनात किया गया था। (बी) शीर्ष से अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए सेटअप। भ्रूण और सीएएम पीबीएस के एक बीकर में डूबे हुए थे जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा गया था। डैश्ड आउटलाइन 2 एल ग्लास बीकर (ए) को 500 एमएल ग्लास बीकर (बी) के साथ अंदर दिखाती है। (सी) एक जंगम ट्रांसड्यूसर के साथ शीर्ष से अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए सेटअप। ट्रांसड्यूसर और अगारोस सतह के बीच युग्मन के रूप में पीबीएस की एक पतली परत के साथ भ्रूण के शीर्ष पर एक पतली अगारोस पैड (डॉटेड लाइन) रखी गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6. खोल के बाहर अंडे की मात्रा। (ए) अंडे की मात्रा इनक्यूबेशन के 5 दिनों के बाद खोल से बाहर निकाला जाता है। कोरिओलैंटोइक झिल्ली (सीएएम), भ्रूण शरीर (ईबी), पूर्ववर्ती और पीछे की विटेलिन नसों (*), और इंजेक्शन (एरोहेड) के लिए उपयुक्त साइटों का संकेत दिया जाता है। (बी) अंडे की मात्रा इनक्यूबेशन के 6 दिनों के बाद खोल से बाहर निकाली गई। पूर्ववर्ती और पीछे की विटेलिन नसों (*) और इंजेक्शन (तीर) के लिए उपयुक्त साइटों को इंगित किया गया है। (c) अंडे की मात्रा इनक्यूबेशन के 7 दिनों के बाद खोल से बाहर निकाला जाता है। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की अनुमति देने के लिए शीर्ष पर अगारोस का एक पैच रखा जाता है। अगारोस पैच के कोनों को काले घेरे के साथ इंगित किया गया है। (डी) अंडे की मात्रा इनक्यूबेशन के 8 दिनों के बाद खोल से बाहर निकाली जाती है। सभी स्केल पट्टियाँ 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7. जटिलताएं जो चिकन भ्रूण और सीएएम मॉडल के साथ प्रक्रियाओं के दौरान हो सकती हैं। (ए) विधि 1.2 (5 दिन पुराने भ्रूण) या 1.3 (6 से 7 दिन पुराने भ्रूण) का उपयोग करके अंडे की सामग्री को शेल से बाहर निकालते समय सीएएम के नीचे फंसे हवा के बुलबुले। (बी) जर्दी का छोटा रिसाव ऊपर दाईं ओर एक तीर के साथ इंगित किया गया है (6 दिन पुराना भ्रूण)। (सी) सीएएम के नीचे फंसी हवा, काले बिंदीदार सर्कल (7 दिन पुराने भ्रूण) द्वारा इंगित की गई है। (डी) रक्तस्राव, काले तीर (5 दिन पुराने भ्रूण) के साथ इंगित किया गया। (ई) सूखा भ्रूण और सीएएम (5 दिन पुराना भ्रूण)। (एफ) बड़े पैमाने पर केशिका अवरोध (5 दिन पुराना भ्रूण)। सभी स्केल पट्टियाँ 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8. सीएएम रक्त वाहिका में माइक्रोबबल। पोत की दीवार को एक बिंदीदार रेखा के साथ इंगित किया जाता है और एकल माइक्रोबबल को तीर के साथ इंगित किया जाता है। स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है। संबंधित माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग पूरक वीडियो 1 में पाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र 9. चिकन भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं में कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग। (ए) बी-मोड (I, III) और रीयल-टाइम सबहारमोनिक (II, IV) छवियों (MS250 जांच के साथ प्रीक्लिनिकल पशु अल्ट्रासाउंड मशीन, 30 MHz ट्रांसमिटिंग और 15 MHz प्राप्त आवृत्ति, 10% शक्ति) का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। शीर्ष चित्र (I, II) 5 μL अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के इंजेक्शन के बाद पहले और नीचे (III, IV) परिणाम दिखाते हैं। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। इस छवि को डेचिन एट अल 2015 11 (बी) ऑप्टिकल (बाएं) और 3 डी सबहारमोनिक इमेजिंग (दाएं) की अनुमति से 6 दिन के चिकन भ्रूण की अनुमति से संशोधित किया गया है, जिसमें शीर्ष पर अगारोस का पैच है। सीएएम वाहिकाओं को 5 μL अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के साथ इंजेक्ट किया गया था और इमेजिंग को एक उच्च आवृत्ति जांच (MS550s जांच के साथ प्रीक्लिनिकल पशु अल्ट्रासाउंड मशीन, 40 MHz की संचरण आवृत्ति, पीक नकारात्मक दबाव ~ 300 kPa, प्रीक्लिनिकल पशु अल्ट्रासाउंड मशीन 3-डी मोड में प्रस्तुत) के साथ किया गया था। स्केल बार 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। इस छवि को डेचिन एट अल 2015 11 की अनुमति के साथ संशोधित किया गयाहै। (सी) 6 दिन के भ्रूण के सीएएम माइक्रोवास्कुलचर के अल्ट्राहार्मोनिक इंट्रावस्कुलर अल्ट्रासाउंड (आईवीयूएस) (दाएं) की ऑप्टिकल छवि (बाएं) और औसत तीव्रता प्रक्षेपण। सीएएम जहाजों को 4 ± 1 1 लीटर कंट्रास्ट एजेंट के साथ इंजेक्ट किया गया था। अल्ट्राहारमोनिक आईवीयूएस इमेजिंग एक कस्टम आईवीयूएस जांच (ट्रांसमिशन आवृत्ति 35 मेगाहर्ट्ज, पीक नकारात्मक दबाव 600 केपीए) के साथ किया गया था। दोनों छवियां एक ही भ्रूण और रुचि के क्षेत्र से बनाई गई हैं। तीर दो छवियों में संबंधित जहाजों को इंगित करते हैं। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। इस छवि को मारेस्का एट अल. 2014 12 की अनुमति से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 

Figure 10
चित्र 10. 6 दिन के भ्रूण में सीएएम पोत एंडोथेलियल कोशिकाओं को दवा वितरण। (ए) अल्ट्रासाउंड उपचार से पहले पोत की दीवार का पालन करते हुए सफेदतीरों के साथ इंगित छह αवी β3-लक्षित माइक्रोबबल की ब्राइटफील्ड छवि। (बी) अल्ट्रासाउंड उपचार से पहले एंडोथेलियल सेल नाभिक फ्लोरोसेंटली सना हुआ। (सी) अल्ट्रासाउंड उपचार से पहले सफेद तीरों के साथ संकेतित दाग वाले लक्षित माइक्रोबबल की फ्लोरोसेंट छवि। (डी) अल्ट्रासाउंड उपचार के बाद लक्षित माइक्रोबबल के नीचे सेल नाभिक में मॉडल दवा प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) का उत्थान (1 मेगाहर्ट्ज, 200 केपीए पीक नकारात्मक दबाव, 1000 चक्रों का एकल विस्फोट)। स्केल बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करता है और सभी छवियों पर लागू होता है। इस छवि को Skachkov et al. 2014 7 से अनुमति के साथ संशोधितकिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फाइलें

पूरक वीडियो 1. सीएएम रक्त वाहिका में माइक्रोबबल। स्केल पट्टी 20 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल 5 से 8 दिन पुराने चिकन भ्रूण और उनके सीएएम को प्राप्त करने और उपयोग करने के तरीके पर तीन तरीकों का वर्णन करता है ताकि कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और माइक्रोबबल-मध्यस्थता दवा वितरण का अध्ययन किया जा सके। शेल से 5-दिन पुराने (धारा 1.2) और 6 से 7-दिन पुराने (धारा 1.3) भ्रूण को शेल से बाहर निकालने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) अंडे के सफेद भाग को वापस लेने से पहले पूरे अंडे के छिलके के माध्यम से हवा की थैली में जाने के लिए अंडे के शीर्ष में छोटे छेद बनाएं; 2) खोल में बड़े उद्घाटन के लिए चिकनी किनारे बनाएं। शेल से 8 दिन पुराने भ्रूण को बाहर निकालने की विधि के लिए (खंड 1.4) सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) अंडे के साथ एक अच्छी दरार बनाने के लिए पर्याप्त संख्या में इंडेंट बनाएं; 2) अंडे को पीबीएस में डुबोकर रखें। सभी तरीकों के लिए भ्रूण व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए अंडे और इसकी सामग्री को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सीएएम धमनी में इंजेक्शन लगाने से बचें। अध्ययन के दौरान भ्रूण की हृदय गति की नेत्रहीन निगरानी भ्रूण जीवन शक्ति सुनिश्चित करने की सिफारिश की जाती है। भ्रूण के सटीक विकास चरण की पुष्टि करने के लिए, हैमबर्गर और हैमिल्टन22 के संकेत का उपयोग किया जा सकता है।

भ्रूण, सीएएम और जर्दी बोरी को नुकसान को रोकना महत्वपूर्ण है। यह क्षति भ्रूण और सीएएम की व्यवहार्यता, रक्त प्रवाह और दृश्यता को प्रभावित कर सकती है। इसके अलावा, जर्दी की बोरी को नुकसान और परिणामस्वरूप झिल्ली की कम कठोरता सीएएम वाहिकाओं में एक इंजेक्शन को असंभव बनाती है। एक 5 दिन के भ्रूण में अपेक्षाकृत छोटी हवा की थैली होती है, इसलिए शेल में पर्याप्त रूप से बड़ा छेद बनाने में सक्षम होने के लिए जिसके माध्यम से अंडे की सामग्री को हटाया जा सकता है, अंडे की सफेदी के 2 एमएल को वापस लेने की आवश्यकता होती है। नतीजतन, अंडे के छिलके और भ्रूण के बीच अधिक जगह बनाई जाती है। अंडे की सफेदी की वापसी के बाद, टेप के एक टुकड़े को उस छेद को बंद करने की आवश्यकता होती है जहां सुई अंदर गई थी। यदि अंडे का सफेद भाग अभी भी लीक होता है, तो टेप का एक और टुकड़ा लागू करें। इसके अलावा, साइड में छेद पर टेप का अनुप्रयोग अंडे के अंदर एक वैक्यूम बनाता है जो चरण 1.2.2.8 में बड़ा छेद बनने पर अंडे की सामग्री को अपने वजन के कारण बाहर गिरने से रोकता है। भ्रूण या सीएएम को नुकसान तब भी हो सकता है जब अंडे के छिलके का किनारा बहुत तेज था या जब अंडे की सामग्री को वजन करने वाली नाव में बहुत कठोरता से गिरा दिया जाता है, इसलिए अंडे के छिलके को वजन करने वाली नाव के बहुत करीब रखा जाना चाहिए। विकास के दिन 5 और 6 के बीच, सीएएम शेल झिल्ली 32 से जुड़ना शुरू करदेता है। यह लगाव अंडे के छिलके से अंडे की सामग्री को बाहर निकालते समय भ्रूण और सीएएम को नुकसान पहुंचाने का खतरा बढ़ाता है। 6 से 7-दिवसीय इनक्यूबेटेड अंडे के लिए या पीबीएस से भरे कंटेनर में पीबीएस के इंजेक्शन के बाद अंडे को खोलने से, जैसा कि 8-दिवसीय इनक्यूबेटेड अंडे के लिए वर्णित है, क्षति का खतरा कम हो जाता है। सीएएम नस में एक इंजेक्शन के बारे में: यदि पहला इंजेक्शन विफल हो जाता है, तो दूसरा इंजेक्शन उसी नस में आगे बढ़ाया जा सकता है यदि नुकसान मामूली था या किसी अन्य सीएएम नस में था। जर्दी से भ्रूण और सीएएम को अलग करने से भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं को ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी बनाया जाता है। नतीजतन, भ्रूण पोषक तत्वों के अपने प्राथमिक स्रोत को खोदेता है। पोषक तत्वों का यह नुकसान 6-दिवसीय भ्रूण के लिए ~ 190 की तुलना में 80 बीपीएम की कम हृदय गति के लिए एक स्पष्टीकरण हो सकता है जो अभी भी जर्दी30 के संपर्क में है और इस पृथक्करण प्रक्रिया के बाद 2 घंटे का कम जीवित रहने का समय है। एक और कारक जो कम हृदय गति और जीवित रहने के समय में भूमिका निभा सकता है, वह जर्दी-अलग भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने की चुनौती है। एक माइक्रोस्कोप चरण इनक्यूबेटर सहायता कर सकता है। इसके अलावा, जर्दी से सीएएम की टुकड़ी संभवतः ऊतक में यांत्रिक परिवर्तन की ओर ले जाती है क्योंकि झिल्ली तनाव कम हो जाता है। निचले झिल्ली तनाव से आंतरिक वाहिका कतरनी दर में वृद्धि हो सकती है जो कम हृदय गति की ओर ले जाती है।

एक्स ओवो चिकन भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं में विवो मॉडल की तरह कुछ सीमाएं हैं, जिसमें केवल कम समय के अवलोकन शामिल हैं, इसके विपरीत उन्नत अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और माइक्रोबबल-मध्यस्थता दवा वितरण अध्ययन के लिए। दिन 5 पर 100±23 μL और दिन 634 पर 171±23 μL की छोटी रक्त मात्रा के कारण, ~ 5 μL की अधिकतम मात्रा इंजेक्ट की जा सकती है। विकास के बाद के चरणों (दिन 7 और उससे अधिक) में, पोत की कठोरता बढ़ जाती है और जर्दी लोच कम हो जाती है। यह पुराने भ्रूण में एक सफल इंजेक्शन को जटिल कर सकता है। एक बार जब माइक्रोबबल इंजेक्ट किए जाते हैं, तो वे घंटों तक घूमते हैं क्योंकि चिकन भ्रूण में इस चरण35 में पूरी तरह से विकसित प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं होती है। इसलिए, माइक्रोबबल को ~ 6 मिनट के भीतर साफ़ नहीं किया जाता है क्योंकि मनुष्यों में36,37 गैर-बाध्य लक्षित माइक्रोबबल को साफ़ करने के लिए 5-10 मिनट की प्रतीक्षा अवधि के साथ विशिष्ट अल्ट्रासाउंड आणविक इमेजिंग अध्ययन करते हैं। माइक्रोबबल को लक्षित करने के लिए, एवियन एंडोथेलियल कोशिकाओं को बांधने में सक्षम उपयुक्त लिगेंड का उपयोग करने की आवश्यकता होती है जैसे कि पहले एंजियोजेनेसिस मार्कर αवीβ37 के लिए वर्णित किया गया था। इस मॉडल के लिए विचार करने वाले अन्य पहलुओं में पुराने भ्रूण (> 8 दिनों) में जर्दी से भ्रूण और सीएएम वाहिकाओं को अलग करने की बढ़ती कठिनाई और मनुष्यों की तुलना में ~ 20% 39 का कम हेमटोक्रिट है। उत्तरार्द्ध माइक्रोबबल दोलनों को प्रभावित कर सकता है क्योंकि यह ज्ञात है कि माइक्रोबबल दोलन अधिक चिपचिपेवातावरण में नम होते हैं। सीएएम धमनियां सीएएम नसों41,42 की तुलना में कम ऑक्सीजन युक्त होती हैं। इस अंतर को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब उदाहरण के लिए रक्त ऑक्सीकरण के फोटोएकॉस्टिक इमेजिंग का अध्ययन किया जाता है।

यहां वर्णित विधियां अल्ट्रासाउंड इमेजिंग या दवा वितरण अध्ययन के दिन अंडे की सामग्री को अंडे के छिलके से बाहर निकालने की अनुमति देती हैं, आमतौर पर इनक्यूबेशन के दिन 5 से 8 पर। यह मौजूदा तरीकों से अलग है जहां अंडे की सामग्री को 3-दिवसीय इनक्यूबेशन के बाद खोल से बाहर निकाला जाता है और आगे एक्स ओवो कल्चर 18,20,21 के रूप में विकसितकिया जाता है। इसके फायदे 5-दिन के लिए 90%, 6-दिन के लिए 75%, 7-दिन के लिए 50%, और 8-दिन पुराने इनक्यूबेटेड अंडों के लिए 60% की उच्च जीवित रहने की दर है, जबकि अंडे के छिलके से निकाले गए 3-दिवसीय भ्रूण के लिए ~ 50% की तुलना में और आगे की गई वृद्धि हुई है। ईएक्स ओवो संस्कृति के लिए 20 और बड़े बाँझ इनक्यूबेटर। 6-से-8-दिन पुराने भ्रूण का अस्तित्व कम है क्योंकि सीएएम खुद को शेल21 से जोड़ना शुरू कर देता है जो निष्कर्षण पर सीएएम झिल्ली को टूटने का अधिक खतरा छोड़ देता है। जर्दी के सीएएम के साथ भ्रूण के पृथक्करण को भ्रूण और सीएएम को ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी बनाने का भी वर्णन किया गया है।

अंडे की सामग्री को विभिन्न सेटअपों में रखकर, चिकन भ्रूण और सीएएम का उपयोग अल्ट्रासाउंड इमेजिंग अध्ययनों की भीड़ के लिए किया जा सकता है, जैसे आईवीयूएस, फोटोएकोस्टिक, 2 डी और 3 डी में अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों के बिना या उनके साथ। ध्यान नई अल्ट्रासाउंड स्पंदन योजनाओं को विकसित करने या नए ट्रांसड्यूसर का परीक्षण करने पर हो सकता है। इसके अलावा, मॉडल का उपयोग नए अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों और प्रवाह के तहत रक्त वाहिकाओं में उनके व्यवहार की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। चूंकि माइक्रोबबल-मध्यस्थता दवा वितरण का तंत्र अभीभी अज्ञात है, इसलिए विवो सीएएम मॉडल का उपयोग सेलुलर प्रतिक्रिया के संबंध में माइक्रोबबल व्यवहार का अध्ययन करके तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है। अंत में, सीएएम वाहिकाओं ने जेनोग्राफ्ट ट्यूमर प्रत्यारोपण 44 की जांच के लिए एक उपयुक्त प्रणाली साबितकी है। यह अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके ट्यूमर इमेजिंग की जांच करने और सीईयूएस का उपयोग करके ट्यूमर के अंदर रक्त प्रवाह की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में सीएएम पोत का उपयोग करने की संभावना बनाता है। ट्यूमर को आम तौर पर 8 या 9 दिन के भ्रूण 1,14,45 के सीएएम वाहिकाओं पर ग्राफ्ट किया जाता है, जिसके लिए भ्रूण को इनक्यूबेशन के दिन 3 में अंडे के छिलके से बाहर निकाला जाता है और आगे एक्स ओवो विकसित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों का उपयोग ट्यूमर ग्राफ्टिंग के दिन तक ओवो में भ्रूण विकसित करने के लिए किया जा सकता है।

लेखकों का मानना है कि यह पेपर उन शोधकर्ताओं के लिए सहायक होगा जो कंट्रास्ट एजेंटों और प्रवाह अध्ययनों के अनुप्रयोगों के लिए एक इनविवो मॉडल के रूप में चिकन भ्रूण और उनके कोरिओलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) का उपयोग करना चाहते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एप्लाइड एंड इंजीनियरिंग साइंसेज (टीटीडब्ल्यू) (विडी-प्रोजेक्ट 17543) द्वारा समर्थित किया गया था, जो एनडब्ल्यूओ का हिस्सा था। लेखक बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग से रॉबर्ट बेउरस्केन्स, लुक्सी वेई और रेजा पाकदमन जांगाबाद और तकनीकी सहायता के लिए प्रायोगिक चिकित्सा इंस्ट्रूमेंटेशन विभाग से मिचिएल मैंटेन और गीर्ट स्प्रिंगलिंग को धन्यवाद देना चाहते हैं, सभी इरास्मस एमसी यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर रॉटरडैम, नीदरलैंड से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) MABIO, Tourcoing, France CLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipets VWR 612-1747
Eggs Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands Freshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needles Drummond 1-000-1000 Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection system FUJIFILM VisualSonics
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-100ML
Needle, 19 G VWR (TERUMO) 613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x ThermoFisher 10010023
Petri dish, 1 L Glass
Petri dish, 90 mm diameter VWR 391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250) FUJIFILM VisualSonics 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s) FUJIFILM VisualSonics transmission frequency of 40 MHz
Scalpel VWR (SWANN-MORTON) 233-5363
Scissors, small Fine Science Tools (FST) 14558-09
Syringe, 5 mL VWR (TERUMO) 613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape) Scotch
Tissue paper Tork
Tweezers large  VWR (USBECK Laborgeräte) 232-0107 See figure 1E
Tweezers small DUMONT Medical, Switzerland 0103-5/45 See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity) Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gel Aquasonic
Waxi film (Parafilm) Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) VWR 611-0094

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References

  1. Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (99), e1 (2015).
  2. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e1 (2016).
  3. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e1 (2015).
  4. Oosterbaan, A. M., Ursem, N. T. C., Struijk, P. C., Bosch, J. G., van der Steen, A. F. W., Steegers, E. A. P. Doppler flow velocity waveforms in the embryonic chicken heart at developmental stages corresponding to 5-8 weeks of human gestation. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 33 (6), 638-644 (2009).
  5. McQuinn, T. C., Bratoeva, M., DeAlmeida, A., Remond, M., Thompson, R. P., Sedmera, D. High-Frequency Ultrasonographic Imaging of Avian Cardiovascular Development. Developmental Dynamics. 236 (12), 3503-3513 (2007).
  6. Stieger, S. M., Caskey, C. F., Adamson, R. H., Curry, F. E., Wisner, E. R., Ferrara, K. W. Enhancement of Vascular Permeability with Low-Frequency Contrast-enhanced Ultrasound in the Chorioallantoic Membrane Model. Radiology. 243 (1), 112-121 (2007).
  7. Skachkov, I., Luan, Y., van der Steen, A. F. W., De Jong, N., Kooiman, K. Targeted microbubble mediated sonoporation of endothelial cells in vivo. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (10), 1661-1667 (2014).
  8. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (11), 1162-1176 (2007).
  9. Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In vivo. Journal of Visualized Experiments. (96), e1 (2015).
  10. Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., Silva, N. J. D. The Chick Chorioallantoic Membrane In vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of Visualized Experiments. (148), e1 (2019).
  11. Daeichin, V., Bosch, J. G., Needles, A., Foster, F. S., van der Steen, A., de Jong, N. Subharmonic, non-linear fundamental and ultraharmonic imaging of microbubble contrast at high frequencies. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (2), 486-497 (2015).
  12. Maresca, D., et al. Imaging microvasculature with contrast-enhanced ultraharmonic ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 40 (6), 1318-1328 (2014).
  13. Lindsey, B. D., et al. High Resolution Ultrasound Superharmonic Perfusion Imaging: In vivo Feasibility and Quantification of Dynamic Contrast-Enhanced Acoustic Angiography. Annals of Biomedical Engineering. 45 (4), 939-948 (2017).
  14. Paproski, R. J., Jovel, J., Wong, G. K. S., Lewis, J. D., Zemp, R. J. Enhanced detection of cancer biomarkers in blood-borne extracellular vesicles using nanodroplets and focused ultrasound. Cancer Research. 77 (1), 3-13 (2017).
  15. Huang, C., et al. Short Acquisition Time Super-Resolution Ultrasound Microvessel Imaging via Microbubble Separation. Scientific Reports. 10, 1-13 (2020).
  16. Lowerison, M. R., Huang, C., Kim, Y., Lucien, F., Chen, S., Song, P. In vivo Confocal Imaging of Fluorescently Labeled Microbubbles: Implications for Ultrasound Localization Microscopy. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 67 (9), 1811-1819 (2020).
  17. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo Characterization of Ultrasound Contrast Agents: Microbubble Spectroscopy in a Chicken Embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e4 (2010).
  19. Kokhuis, T. J. A., et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force. Biotechnology and Bioengineering. 112 (1), 220-227 (2015).
  20. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development. Journal of Visualized Experiments. (95), e6 (2015).
  21. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. Journal of Visualized Experiments. (33), e2 (2010).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. A Series Of Normal Stages In The Developent Of The Chick Embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 231-272 (1951).
  23. Ribatti, D. A morphometric study of the expansion of the chick vasculosa in shell-less culture. Journal of Anatomy. 186, 639-644 (1995).
  24. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Burri, P. H., Djonov, V. Chorioallantoic Membrane Capillary Bed: A Useful Target for Studying Angiogenesis and Anti-Angiogenesis In vivo. Anatomical Record. 324, 317-324 (2001).
  25. DeFouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the Microcirculation in the Chick Chorioallantoic Membrane during Normal Angiogenesis. Microvascular research. 38, 136-147 (1989).
  26. Beekers, I., van Rooij, T., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Verweij, M. D., Kooiman, K. Acoustic characterization of the CLINIcell for ultrasound contrast agent studies. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (1), 244-246 (2019).
  27. Lang, E. R., Rha, C. Apparent shear viscosity of native egg white. Journal of Food Science and Technology. 17, 595-606 (1982).
  28. Daeichin, V., et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555-567 (2017).
  29. Mcferrin, H. E., Olson, S. D., Gutschow, M. V., Semon, J. A., Sullivan, D. E., Prockop, D. J. Rapidly Self-Renewing Human Multipotent Marrow Stromal Cells (hMSC) Express Sialyl Lewis X and Actively Adhere to Arterial Endothelium in a Chick Embryo Model System. PLoS ONE. 9 (8), 1-11 (2014).
  30. Akiyama, R., Mitsubayashi, H., Tazawa, H., Burggren, W. W. Heart rate responses to altered ambient oxygen in early (days 3-9) chick embryos in the intact egg. Journal of Comparative Physiology - B Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 169 (2), 85-92 (1999).
  31. Foster, F. S., Hossack, J., Adamson, S. L. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface Focus. 1, 576-601 (2011).
  32. Gabrielli, M. G., Accili, D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular, Structural, and Functional Adaptation to Transepithelial Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-12 (2010).
  33. van der Wagt, I., de Jong, I. C., Mitchell, M. A., Molenaar, R., van den Brand, H. A review on yolk sac utilization in poultry. Poultry Science. 99, 2162-2175 (2020).
  34. Kind, C. The development of the circulating blood volume of the chick embryo. Anatomy and Embryology. 147, 127-132 (1975).
  35. Ribatti, D. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Useful Tool to Study Angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  36. Schneider, M. Characteristics of SonoVue(TM). Echocardiography. 16 (7), 743-746 (1999).
  37. Kitzman, D. W., Goldman, M. E., Gillam, L. D., Cohen, J. L., Aurigemma, G. P., Gottdiener, J. S. Efficacy and Safety of the Novel Ultrasound Contrast Agent Perflutren (Definity) in Patients With Suboptimal Baseline Left Ventricular Echocardiographic Images. American Journal of Cardiology. 86, 669-674 (2000).
  38. Kosareva, A., Abou-Elkacem, L., Chowdhury, S., Lindner, J. R., Kaufmann, B. A. Seeing the Invisible-Ultrasound Molecular Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (3), 479-497 (2020).
  39. Al-Roubaie, S., Jahnsen, E. D., Mohammed, M., Henderson-Toth, C., Jones, E. A. V. Rheology of embryonic avian blood. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2473-2481 (2011).
  40. Helfield, B., Chen, X., Qin, B., Villanueva, F. S. Individual lipid encapsulated microbubble radial oscillations: Effects of fluid viscosity. The Journal of the Acoustical Society of America. 139 (1), 204-214 (2016).
  41. Metcalfe, J., Stock, M. K. Oxygen exchange in the chorioallantoic membrane, avian homologue of the mammalian placenta. Placenta. 14, 605-613 (1993).
  42. Tazawa, H. Oxygen and CO2 exchange and acid-base regulation in the avian embryo. American Journal of Zoology. 20, 395-404 (1980).
  43. Kooiman, K., et al. Ultrasound-Responsive Cavitation Nuclei for Therapy and Drug Delivery. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  44. Li, M., Pathak, R. R., Lopez-rivera, E., Friedman, S. L., Aguirre-ghiso, J. A., Sikora, A. G. The In ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e1 (2015).
  45. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e1 (2013).

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कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और माइक्रोबबल-मध्यस्थता दवा वितरण अध्ययन के लिए विवो मॉडल में चिकन एक्स ओवो भ्रूण और कोरियोलैंटोइक मेम्ब्रेन वेसल्स की तैयारी
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Meijlink, B., Skachkov, I., van der… More

Meijlink, B., Skachkov, I., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Kooiman, K. The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies. J. Vis. Exp. (168), e62076, doi:10.3791/62076 (2021).

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