Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים אקס ויוו ושיטות vivo להערכת פיזור חיידקים מזיהום פצע בעכברים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי לבדוק את היעילות של טיפולים אנטי מיקרוביאלית אקטואלי אנטי ביופילם, או כדי להעריך את יכולת הפיזור של זנים חיידקיים שונים או מינים שונים.

Abstract

זיהומים הקשורים Biofilm מעורבים במגוון רחב של מצבים כרוניים כגון כיבים ברגל סוכרתית שאינם ריפוי, סינוסיטיס כרונית, מדיה דלקת אוזניים חוזרת, ועוד רבים. תאים מיקרוביאליים בתוך זיהומים אלה מוגנים על ידי חומר פולימרי חוץ תאי (EPS), אשר יכול למנוע אנטיביוטיקה ולארח תאים חיסוניים מפני ניקוי הזיהום. כדי להתגבר על מכשול זה, חוקרים החלו לפתח סוכני פיזור כטיפולים פוטנציאליים. סוכנים אלה מתמקדים ברכיבים שונים בתוך ה- EPS של הביופילם, מחלישים את המבנה ויוזמים פיזור של החיידקים, אשר תיאורטית יכול לשפר את העוצמה האנטיביוטית ואת הסיווג החיסוני. כדי לקבוע את היעילות של סוכני פיזור עבור זיהומים פצע, פיתחנו פרוטוקולים המודדים פיזור biofilm הן ex vivo ו in vivo. אנו משתמשים במודל כריתה כירורגית של עכבר שתואר היטב כדי ליצור זיהומים כרוניים הקשורים לביופילם. כדי לפקח על פיזור vivo, אנו מדביקים את הפצעים עם זנים חיידקיים המבטאים לוציפראז. לאחר זיהומים בוגרים הוקמו, אנו להשקות את הפצעים עם פתרון המכיל אנזימים להשפיל רכיבים של EPS biofilm. לאחר מכן אנו עוקבים אחר המיקום והעוצמה של האות הזוהר בפצע ואיברים מסננים כדי לספק מידע על רמת הפיזור שהושגה. לניתוח ex vivo של פיזור biofilm, רקמת פצע נגוע שקוע בתמיסת אנזים משפיל biofilm, ולאחר מכן עומס חיידקי שנותר ברקמה, לעומת עומס חיידקי בתמיסה, מוערך. שני הפרוטוקולים יש חוזקות וחולשות והוא יכול להיות אופטימיזציה כדי לעזור לקבוע במדויק את היעילות של טיפולים פיזור.

Introduction

עליית עמידות לאנטיביוטיקה ברחבי העולם מובילה לחוסר אפשרויות אנטיביוטיות לטיפול במגוון זיהומים חיידקיים1. בנוסף לעמידות לאנטיביוטיקה, חיידקים יכולים להשיג סובלנות אנטיביוטית על ידי אימוץ אורח חיים הקשור לביופילם2. ביופילם היא קהילה של מיקרואורגניזמים המוגנים על ידי מטריצה של פוליסכרידים, דנ"א חוץ תאי, שומנים וחלבונים3, הנקראים באופן קולקטיבי החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS). ככל שמשבר ההתנגדות לאנטיביוטיקה נמשך, אסטרטגיות חדשות המאריכות את השימוש, או מחזקות את היעילות של, אנטיביוטיקה נחוצות מאוד. סוכני אנטי-ביופילם הם פתרון מבטיח אחד4.

בין אסטרטגיות אנטי-ביופילם שונות שהוצעו, ניצול סוכני פיזור, אשר למקד רכיבים שונים של EPS biofilm, נמצאים בחזית הפיתוח הטיפולי5. גליקוסייד הידרולאס (GH) הם סוג אחד כזה של חומר פיזור. GH הם סוג גדול של אנזימים לזרז את המחשוף של קשרים שונים בתוך פוליסכרידים המספקים שלמות מבנית EPS. הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, הראו כי GH יכול ביעילות להשפיל biofilms, לגרום לפיזור ולשפר את היעילות האנטיביוטית עבור מספר מינים חיידקיים שונים, הן במבחנה והן vivo6,7,8,9,10,11.

עם עניין גובר פיזור biofilm,חשוב לפתח שיטות יעילות להעריך את יעילות הפיזור. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לטיפול בדלקות פצע הקשורות biofilm עם סוכן פיזור בעכברים, ואת ההערכה של יעילות פיזור, ב vivo ו ex vivo. המטרה הכוללת היא לספק שיטות יעילות שניתן להשתמש בהן עם מודלים פרה-קוליניים למדידת פיזור ביופילם ביעילות וביעילות.

מודל זיהום כריתה כירורגית מורין שימש במחקרים אלה כדי להקים זיהום הקשורים biofilm. השתמשנו במודל זה למעלה מ-15 שנה ופרסמנו את התצפיות שלנו בהרחבה7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. באופן כללי, זהו מודל זיהום לא קטלני שבו חיידקים נשארים מקומיים למיטת הפצע והם הקשורים לביופילם (חיידקים הנראים בצבירות המוקפות ב- EPS), ומגדירים זיהום כרוני שנמשך עד 3 שבועות. עם זאת, אם עכברים הם immunocompromised (עם סוכרת מסוג 1 למשל), הם יכולים להיות רגישים יותר לפתח זיהום מערכתי קטלני במודל זה.

בדו"ח זה, אנו מספקים פרוטוקולים להערכת פיזור של חיידקים מפצע, הן vivo ו ex vivo. שני הפרוטוקולים יכולים לשמש כדי לבחון את היעילות של סוכן פיזור ויש להם נקודות החוזק והחולשה שלהם. לדוגמה, הערכת פיזור ב vivo יכול לספק חשוב, מידע בזמן אמת על התפשטות חיידקים לחלקים אחרים של הגוף לאחר פיזור, וכיצד המארח מגיב. מצד שני, הערכת ex vivo פיזור עשוי להיות רצוי יותר עבור סינון סוכנים מרובים, מינונים, או ניסוחים, כמו הרקמה ניתן לחלק סעיפים מרובים שניתן לבדוק בנפרד, ובכך להפחית את מספר העכברים הנדרש. בעת הערכת סוכנים מרובים, אנו בדרך כלל למדוד פיזור הראשון במבחנה כפי שתואר קודם לכן 6,9,22. לאחר מכן אנו בודקים את ex vivo היעיל ביותר ומילואים בדיקות vivo עבור מספר מוגבל של סוכנים מבטיחים מאוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה של בעלי חיים נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (פרוטוקול מספר 07044). מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת חיידקים לזיהומים בעכבר

הערה: כאן אנו מתארים עכברים מדביקים רק עם Pseudomonas aeruginosa. עם זאת, מינים חיידקיים אחרים עשויים לשמש כדי לגרום לזיהום. זנים וחומרים חיידקיים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. השתמש Pseudomonas aeruginosa סוג פראי זן PAO1 נושאת את פלסמיד זוהר pQF50-lux23 עבור ניסויים אלה כפי שתואר קודם לכן7.
  2. לגדול P. aeruginosa זנים צלפים ארלנמייר מבולבל, עם רועד ב 200 סל"ד, בציר לוריא-Bertani (LB) ב 37 °C (69 °F) עבור 16 עד 20 שעות. הוסף ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל של ampicillin לתרבות הלילה של PAO1 (pQF50-lux) לתחזוקה של פלסמיד.
  3. תת-תרבות P. aeruginosa על ידי הוספת 100 μL של תרבות הלילה בקבוק ארלנמייר המכיל 10 מ"ל של מרק LB עם ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל אמביצילין. לאחר מכן לגדול עבור 2-2.5 שעות ב 37 °C (67 °F) עם רועד, כדי OD600 ננומטר של 0.4, ולאחר מכן באופן סדרתי לדלל (1:10) שלוש פעמים עבור מנה מדביקה של כ 104 תאים.

2. הכנת אנזים פיזור ביופילם

הערה: למחקר זה אנו משתמשים בתמיסה של 10% של עמילאז וצלולאז בחלקים שווים (5% מכל אחד), אשר ייקרא "GH", לטיפול בפיזור.

  1. השתמש בתמיסת GH 10% (w/v) של עמילאז (מ Bacillus subtilis)ו cellulase פטרייתי (מ אספרגילוס ניז'ר)מדולל 1 x פוספט מאגר מלוחים (PBS). השתמש PBS כטיפול בקרת הרכב.
  2. מחממים את כל הטיפולים ל-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להפעלת אנזימים.

3. בעלי חיים ניסיוניים והתקנה טרום ניתוחית

  1. עכברי בית, 5 המלטה חברים לכלוב, בתנאים מבוקרים סביבה, עם 12 שעות מחזורים אור / כהה וגישה נאותה למזון ומים.
  2. רצוי, להשתמש בעכברי וובסטר שוויצרי נקבה, בין 8 ל 10 שבועות.
  3. לשקול עכברים כדי לקבוע את הכמות הנכונה של הרדמה לנהל.
  4. ניהול הרדמה על ידי הזרקה תוך-פריטונית של קטמין 100 מ"ג/ק"ג 10 מ"ג/ק"ג קסילאזין.
  5. החל קרם עיניים (למשל, רענן P.M.) בזהירות על העין באמצעות ספוגית כותנה כדי להפחית את היובש.
  6. לפקח על פרמטרים פיזיולוגיים כולל קצב הנשימה, צבע העור, וטמפרטורת הגוף לאורך כל הניתוח.

4. ניתוח כריתת עובי מלא גב

  1. להעריך מישור כירורגי של הרדמה על ידי צביטה בוהן וניטור של קצב הנשימה ומאמץ. גילחו את משטח הגב והחילו קרם דפילטורי למשך 10 דקות (או לפי הוראות המוצר), ולאחר מכן הסירו בעדינות, והבטיחו שהעור יבש.
  2. לטיפול בכאב, לנהל 0.05 מ"ל של לידוקאין תת עורית לתוך האזור כדי להיות מגורש, ולהזריק 0.02 מ"ל של buprenorphine תת עורית לתוך עורית הצוואר. המתן 10 דקות כדי להבטיח שהשגת טיפול בכאב.
  3. לפני כריתה, לחטא את משטח הגב באמצעות ספוגית אלכוהול לצייר עיגול בקוטר 1.5 ס"מ לכיוון החלק האחורי של הגב. לשמור על שדה כירורגי סטרילי לאורך כל ההליך והשתמשו במכשירים אוטומטיים וכפפות סטריליות. כדי להגביל את הזיהום, לבצע את הניתוח על ידי מבער בונזן מואר ולהשתמש בכלים נקיים עבור כל בעל חיים.
  4. לנהל עובי מלא, פצע עור excisional לרמה של שריר panniculus עם מספריים כירורגיים.
  5. לאחר כריתה, מיד לכסות פצעים עם רוטב פוליאוריתן למחצה.
  6. להזריק כ 104 CFU של חיידקים ב 100 μL PBS מתחת להלבשה, על מיטת הפצע, כדי להקים זיהום.
    הערה: פצעים יכולים גם להיות נגועים במינים מרובים של חיידקים ו / או פטריות בו זמנית, או על ידי הצבת biofilms נוצר מראש12, או אפילו רקמת פסולת שחולצו מחולים19, על מיטת הפצע.
  7. לאחר ההדבקה, הכניסו עכברים לכלוב עם רפידות חימום וניטור עד שהם חזרו לרפלקס הימני שלהם.
    הערה: ודא כי עכברים לא להתקרר כמו זה יכול להוביל למוות.
  8. להקים זיהומים פצע במשך 48 שעות.
  9. בדוק תחבושות דבק מדי יום עבור דמעות ואזורים של אי דבקות והוחלף במידת הצורך.

5. בטיפול בפיזור vivo

הערה: כאן אנו מתארים את הניהול של סוכני הפיזור על ידי יישום סדרה של 3 פתרונות השקיית פצעים מקומיים (איור 1). עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם עבור סוגים אחרים של משלוח כגון היישום של ג'לים, קרמים או רטבים.

  1. מניחים עכברים תחת הרדמה isoflurane (ב 3% ו 1 L לדקה של חמצן) תוך מתן הטיפולים.
  2. הכן שלושה מזרקים 1 מ"ל, עם 25 מחטים G, המכיל 200 μL של טיפול עבור כל עכבר.
  3. להזריק 200 μL של פתרון אנזים או PBS שליטה על הפצע על ידי הרמת בזהירות צובט את העור עם מלקחיים, מעט מעל הפצע לכיוון הראש של החיה. בזהירות לנקב את המזרק דרך העור הרים לאט להזריק את הפתרון בין ההלבשה לבין מיטת הפצע. ההלבשה מנוצל במחקר זה לעתים קרובות דבק הן את מיטת הפצע ואת הרקמה שמסביב.
    1. כדי להבטיח כי מיטת הפצע כולו מכוסה בתמיסה, בעדינות להעלות את ההלבשה עם מלקחיים, מושך אותו ממיטת הפצע, תוך הזרקת הפתרון לאט.
  4. לאחר הטיפול, מחזירים את העכברים לכלובים למשך 30 דקות.
  5. לאחר 30 דקות של חשיפה לטיפול, יש לה רדום מחדש את העכברים עם איזופלורן ולשאוף את הפתרון באמצעות מזרק, תוך הקפדה לנקב באותו אזור כמו קודם.
    הערה: פתרון שאיפה זה מכיל תאים חיידקיים מפוזרים, אשר ניתן לשמור עבור ניתוחים שונים במורד הזרם.
  6. לנהל את טיפולי ההשקיה השני והשלישי כראשון, באמצעות מזרק חדש בכל פעם.

6. בהדמיה וניתוח פיזור vivo

הערה: אם זן זוהר של חיידקים מנוצל כדי ליזום זיהום, מערכת הדמיה In Vivo (IVIS) ניתן להשתמש כדי לדמיין פיזור ממיטת הפצע.

  1. עכברי תמונה מיד לפני ואחרי הטיפול וב-10 ו-20 שעות לאחר הטיפול (איור 2 ואיור משלים 1).
  2. בצע הדמיה בזמן שעכברים נמצאים תחת הרדמה על ידי הצבתם בנפרד ב- IVIS והדמיה של כל אחד מהם במשך 5 שניות באורך גל של 560 ננומטר. שמור תמונות לניתוח נוסף.
    הערה: אורך הגל האופטימלי וזמן החשיפה יהיו תלויים בעיתונאי שבו נעשה שימוש ובמכשיר IVIS ובתוכנות ההדמיה.
  3. לצורך ניתוח, פתח תמונות בתוכנת IVIS ובחר את האזור שיש לנתח בלוח הכלים.
  4. כדי להסביר את הרקע, הנח עיגול על רקע תמונה ולאחר מכן הנח את אותו עיגול בגודל על גבי מיטת הפצע עבור כל עכבר.
  5. להעלאת ערכי מדידה, בחרו 'הצג - > מדידות אזור עניין (ROI) והעלו את טבלת המידות לגיליון אלקטרוני. הפחת את קריאת מעגל הרקע מכל אחת ממדידות מיטת הפצע כדי לחשב זוהר עבור כל דגימה. חשב אחוז זוהר שהשתנה על-ידי:
    החזר על ההשקעה טרום טיפול לאחר טיפול / החזר על ההשקעה) x 100.
    הערה: יש לנתח עכברים בשליטה ובטיפול בו-זמנית כדי לנרמל משתנים שעשויים להשפיע על רכישת תמונה או זוהר.

7. הערכת פיזור על ידי קביעת CFU

  1. באופן אנושי המתת חסד עכברים על ידי הזרקה תוך-אישית של 0.2 מ"ל של נתרן pentobarbital (למשל, קטלני פלוס) תחת הרדמה עם קטמין 100 מ"ג/ק"ג 10 מ"ג/ק"ג xylazine.
  2. רקמת מיטת פצע הקציר על ידי הסרת ההלבשה בעדינות עם מלקחיים סטריליים, ולאחר מכן לחתוך סביב ההיקף של מיטת הפצע עם מספריים כירורגיים סטריליים. בעדינות להרים קצה אחד של מיטת הפצע עם מלקחיים תוך שימוש במספריים לחתוך / להקניט את המדגם הרחק משכבה השריר.
  3. מניחים רקמה ממיטת הפצע בצינור הומוגניזציה 2 מ"ל שכותרתו מראש ושוקל מראש 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של PBS. לשקול את הצינורות שוב לאחר החדרת הדגימות, ולאחר מכן בעדינות להפוך 3-5 פעמים כדי לשטוף את כל חיידקים מפוזרים או דבקים באופן רופף, ולהסיר את PBS. הוסף 1 מ"ל של PBS טרי.
  4. על מנת לקצור את הטחולים, למקם עכברים במצב אנטומי עלה ומאובטח על ידי הצמדת הגפיים שלהם למשטח נתיחה. משרים את האזור כדי לנתח עם 70% אתנול על מנת לחטא את האזור ולשמור על הפרווה מזיהום המדגם.
  5. בזהירות לעשות חתך קטן בניצב לקו האמצע עם מספריים כירורגיים בדרמיס של הבטן התחתונה, הקפד למשוך את העור למעלה והתרחקות האיברים הפנימיים. המשך את החתך בפנים, לאורך קו האמצע, עד עצם החזה הושגה. לאחר חלל הצפק נחשף ואת האיברים הפנימיים היו גלויים, בעדינות להפריד את הטחול מרקמת החיבור ומניחים בצינור הומוגניזציה נפרד.
  6. שוקלים טחול ולשטוף עם PBS, כמתואר עבור רקמת מיטת הפצע.
    הערה: איברים אחרים בעלי עניין ניתן לקצור באופן דומה.
    1. בעת ביצוע החתך הראשוני, יש להקפיד להימנע מניקוב המעיים, או איברים אחרים.
  7. דגימות הומוגניזציה בצינורות טחנת חרוזים 2 מ"ל מלא מראש באמצעות homogenizer ספסל ב 5 m/s עבור 60 s, פעמיים.
  8. כדי למנות CFU, לדלל דגימות באופן סדרתי צלחת ספוט על אגר סלקטיבי. עבור דילול סדרתי, פיפטה 100 μL של המדגם לתוך 900 μL של PBS בצינור 1.5 מ"ל, מערבולת, ולחזור 5 פעמים. פיפט 10 μL של כל דילול על צלחת אגר כפי שמוצג באיור 3.
    הערה: אם נדרשת כמות CFU מדויקת יותר, מורחים 100 μL מכל דילול של המדגם על פני לוחות אגר נפרדים.

8. הערכה אקס ויוו של פיזור (איור 4)

  1. פצע עכברים להדביק עם כ 104 PAO1 כמתואר לעיל, ולאחר מכן המתת חסד 48 שעות לאחר ההדבקה.
  2. הסר בזהירות את ההלבשה עם מלקחיים, בטכניקה סטרילית ומבלי להפריע למיטת הפצע.
  3. השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי לחתוך את ההיקף של מיטת הפצע הרחק מהעור נגוע באמצעות מלקחיים להרים קצה אחד של מיטת הפצע ומספריים כדי להוציא רקמת פצע נגוע משכבת השריר מתחת וסביב רקמה נגועה. לחלק דגימות מיטת פצע לחלקים שווים או להשתמש שלם.
  4. מניחים רקמת פצע לתוך ריק, שקל מראש 2 מ"ל חרוז טחנת צינורות הומוגניזציה. ואז לשקול את הצינורות שוב לאחר הוספת המדגם. חשב את משקל המדגם על-ידי:
    משקל לאחר הוספת מדגם - משקל לפני הוספת מדגם.
  5. הוסף 1 מ"ל של PBS, בעדינות להפוך צינור 3-5 פעמים כדי לשטוף את המדגם ולהסיר את כל התאים הפלנקטוניים. הסר ובטל את ה- PBS.
  6. הוסף 1 מ"ל של טיפול GH (או PBS כבקרה שלילית) לדגימה ודגירה במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 80 סל"ד.
  7. הסר את הפתרון פיזור biofilm ומניחים לתוך צינור נפרד 1.5 מ"ל. זה מכיל את התאים המפוזרים.
  8. הוסף 1 מ"ל של PBS לדגימת הרקמה הנותרת והפך בעדינות 3-5 פעמים כדי לשטוף את כל התאים המפוזרים שנותרו. הסר ובטל את ה- PBS.
  9. הוסף 1 מ"ל של PBS לרקמה הנותרת הומוגנית ב 5 m/s עבור 60 s באמצעות homogenizer ספסל.
  10. לדלל באופן סדרתי את הפתרון של תאים מפוזרים מדגם רקמה הומוגנית על ידי הצבת 100 μL של מדגם לתוך 900 μL של PBS בצינור 1.5 מ"ל, וחוזר חמש פעמים עבור סך של 6 דילול.
  11. צלחת ספוט 10 μL של כל דילול על אגר סלקטיבי מדיה (למשל, Pseudomonas בידוד אגר עבור P. aeruginosa)ו הדגירה את הצלחות ב 37 °C (60 °F) לילה.
  12. לספור את CFU ולחשב את 'אחוז מפוזר' כמו (CFU ב supernatant / (CFU ב supernatant + CFU ברקמת biofilm)) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניסוי זה, עכברי וובסטר שוויצריים בני 8-10 שבועות נדבקוב-10 4 CFU של PAO1 הנושאים את פלסמיד הזוהר pQF50-lux. כפי שתואר לעיל, זיהום הורשה להקים במשך 48 שעות לפני מתן 3 x 30 דקות טיפולים של PBS (בקרת רכב) או 10% GH (טיפול) לעכל את EPS biofilm. עכברים צולמו טרום טיפול, מיד לאחר הטיפול (0 שעות) וב 10 שעות ו 20 שעות לאחר הטיפול. איור 2A ואיור נוסף 1 מראים זיהום מבוסס בתוך מיטת הפצע היוצר אות ביולומיננטי בהיר. פיזור של חיידקים מתוך מיטת הפצע ניתן לדמיין מיד לאחר הטיפול GH (0 שעות), אבל לא לאחר טיפול PBS. יש לציין כי במחקרים קודמים, זיהינו חיידקים בדם וטחול כבר 5 שעות לאחר טיפול GH7. הפצת חיידקים לאיברים ניתן לראות גם על ידי הנחת העכבר על צידו להדמיה, כפי שמוצג בלוח התחתון של איור 2A.

תמונות הן של PBS והן של עכברים שטופלו ב-GH הראו עלייה באות הזוהר במהירות של 20 שעות לאחר הטיפול בהשוואה לטיפול מקדים (איור 2B). אנו משערים שזה נובע מההפרעה המכנית של הביופילם הנגרמת על ידי השקיית הפתרון. בשעה 20 שעות לאחר הטיפול, העכברים היו מורדמים, ומיטות הפצע והטחול נאספו כדי למנות CFU / גרם של רקמה. בעוד העומסים החיידקיים במיטות הפצע היו דומים (איור 2C), חיידקים זוהו רק בטחול של עכברים שטופלו ב- GH (איור 2D), מה שמרמז על התפשטות מופצת של החיידקים המפוזרים.

בעבר, הראינו כי טיפול GH יכול לשבור אגרגטים של חיידקים, שיפור ספירת CFU21. זה עשוי להסביר את העלייה הקלה של עומס חיידקי במיטות הפצע של העכברים שטופלו GH. לבסוף, למרות מיטות פצע GH שטופלו היה מעט גבוה יותר CFU / גרם, היה שינוי bioluminescent אחוז נמוך יותר. תוצאות אלה מצביעות על החשיבות של אישור זוהר עם ספירת CFU. תוצאות מייצגות אלה נותנות דוגמה לנתונים שניתן לאסוף על-ידי שימוש בפרוטוקולים שתוארו לעיל.

Figure 1
איור 1. הקמת זיהומים בפצע הקשורים biofilm והערכת יעילות סוכן פיזור vivo. תחבושות נבדקו עבור דמעות או אובדן הידבקות בעור העכבר לפני הטיפול. תחבושות שנפרצו הוחלפו. עכברים הוכנסו להרדמה מיד לפני מתן הטיפול. 200 μL של פתרון אנזים, או בקרת רכב, הוזרק לתוך החלל בין מיטת הפצע ואת ההלבשה. ההלבשה הועלתה בעדינות באמצעות מלקחיים כדי להבטיח שהפצע כולו יהיה רווי בתמיסה. הטיפול הושאר על מיטת הפצע במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הטיפול היה שאפתן עם מזרק, ועוד 200 μL של טיפול נוסף. זה חזר על עצמו בסך הכל 3 טיפולים. כדי למדוד פיזור בזמן אמת, עכברים צולמו באמצעות IVIS לפני הטיפול, מיד לאחר הטיפול (0 שעות), 10 שעות, ו 20 שעות לאחר הטיפול. בשעה 20 שעות לאחר הטיפול, העכברים היו מורדמים, ומיטות הפצע והטחול נאספו. הדגימות שטפו ב- PBS ולאחר מכן הומוגניות ב- PBS טרי פעמיים ב 5 m / s במשך 60 s. הדגימות היו אז בדילול סדרתי מצופה נקודה. יחידות ה- CFU נמולאו ו- CFU/gram חושבו. רמת הפיזור של חיידקים מהפצע יכולה להיות מוערכת על ידי IVIS או על ידי קביעת מספר ה- CFU המתפשט באופן שיטתי בטחול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. נתונים מייצגים מדגימים כיצד להעריך את הפיזור ב- vivo. פצעים נגועים10 4 PAO1 (pQF50-lux) עבור 48 h טופלו או PBS, או 10% GH (פתרון אנזים פיזור ביופילם). טיפול PBS שימש כבקרת רכב. מיטות הפצע טופלו בטיפולים של 3 x 30 דקות. עכברים צולמו באמצעות IVIS לפני הטיפול, מיד לאחר הטיפול, 10 שעות לאחר הטיפול, ו 20 שעות לאחר הטיפול. יש לציין כי תמונות התצוגה הצדדית הן מעכברים שונים שטופלו ב- PBS ו- GH מאלה המוצגים בתמונות התצוגה התקורה (A). ההחזרים על ההשקעה עבור כל מיטת פצע טרום טיפול וכל מיטת פצע לאחר טיפול 20 שעות נרשמו. אחוז השינוי מ טרום טיפול חושב כמו (ROI טרום טיפול-ROI לאחר הטיפול / ROI טרום טיפול) x 100 (B). בשעה 20 שעות לאחר הטיפול, עכברים היו מורדמים. מיטות הפצע והטחול נאספו ונמשלו כדי לקבוע CFU / גרם (C ו- D, בהתאמה). נ=3. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. דילול סדרתי וציפוי ספוט. מדגם הומוגני היה מערבולת ו 100 μL הועבר צינור Eppendorf 1.5 מ"ל המכיל 900 μL של PBS. המדגם היה מערבולת ו 100 μL הועבר צינור Eppendorf אחר 1.5 מ"ל עם 900 μL של PBS. תהליך זה חזר על עצמו 5 פעמים. החל מצינור הדילול האחרון, 10 μL של מדגם היה מצופה נקודה על צלחת אגר במקום 10-8. זה נמשך עד דילול 10-3. בדרך כלל,10-3 דילול תוצאות מדשאה של חיידקים בתוך המקום. איברים מסוימים, אשר יש עומסים חיידקיים נמוכים, עשוי לדרוש ציפוי נקודה עד דילול10-1. חזור על הפעולה עבור כל דגימת רקמה. מניחים צלחת אגר באינקובטור ב 37 °C (60 °F) עבור 24-48 שעות, או לגדול בתנאים אופטימליים עבור מינים חיידקיים של עניין. כדי לספור CFU, לספור מושבות בודדות בדילול הנמוך ביותר האפשרי, ולהתרבות על ידי גורם הדילול המתאים כדי לקבוע CFU / mL או להשתמש במשקל הרקמה כדי לחשב CFU / g של רקמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. מדידת פיזור מרקמות נגועות ex vivo. עכברים היו מורדמים ורקמת הפצע הנגועה הוסרה באופן לא נכון. הרקמה הנגועה הוכנסה לצינור הומוגניזציה של טחנת חרוזים 2 מ"ל ושטוף לזמן קצר עם PBS. 1 מ"ל של חומר פיזור נוסף ואת המדגם היה דגירה במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 80 סל"ד. לאחר הדגירה, הפתרון המכיל את התאים המפוזרים הוסר והוכנס לצינור נפרד של 1.5 מ"ל. הרקמה הנותרת שטפה עם 1 מ"ל של PBS. 1 מ"ל של PBS טרי נוסף לרקמה הומוגני ב 5 m/s עבור 60 s. תמיסת האנזים והרקמה ההומוגנית היו אז מדוללים באופן סדרתי ונקודה מצופה על אגר סלקטיבי. ה- CFU סופרו ופיזור חושב כ: CFU מתמיסת אנזים / (CFU מתמיסת אנזים + CFU מרקמות) x 100. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1. מדידה בפיזור ויוו. פצעים נדבקו 104 PAO1 (pQF50-lux) עבור 48 שעות ולאחר מכן טופלו עם PBS, או 10% GH (פתרון אנזים פיזור biofilm). טיפול PBS שימש כבקרת רכב. מיטות הפצע טופלו בטיפולי השקיה של 3 x 30 דקות. עכברים צולמו באמצעות IVIS לפני הטיפול, מיד לאחר הטיפול, 10 שעות לאחר הטיפול, ו 20 שעות לאחר הטיפול (A). בשעה 20 שעות לאחר הטיפול, עכברים היו מורדמים. מיטות הפצע והטחול נאספו ונמשלו כדי לקבוע CFU / גרם (B ו- C, בהתאמה). נ=3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את היעילות של סוכני פיזור biofilm. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לשימוש עם סוגים שונים של חומרי פיזור, מינים חיידקיים או דגימות ex vivo, כולל דגימות פסולת קלינית. פרוטוקול זה מספק גם מודל רלוונטי קלינית לאיסוף וחקר תאים חיידקיים מפוזרים. הפנוטיפים של תאים חיידקיים מפוזרים הוכחו להיות נבדלים מאלה של תאים פלנקטוניים או biofilm 5,24,25,26; עם זאת, פנוטיפים של חיידקים מפוזרים vivo עדיין לא תוארו. אם סוכני פיזור יש להשתמש טיפולית, קביעת היעילות שלהם, כמו גם הבנת פנוטיפ כי תאים אלה לאמץ, חשוב. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד כיצד וריאציות במבנה EPS או שינוי של מסלולי איתות משפיעים על פיזור. לדוגמה, פיזור של זני P. aeruginosa עם מוטציות ברכיבי exopolysaccharide שונים (למשל, פל, Psl, אלגינט) ניתן להשוות לזה של זנים מסוג פראי.

בסך הכל, פרוטוקול זה ניתן לחלק לארבעה חלקים עיקריים: (1) הקמת זיהום (2) מתן טיפול או (3) איסוף רקמה נגועה לטיפול ex vivo ו (4) קביעת יעילות פיזור. החלק הקריטי של סעיף 1 הוא ההקמה המוצלחת של הזיהום במיטת הפצע. אם זנים זוהרים, הדורשים אנטיביוטיקה כדי לשמור על יציבות פלסמיד, מנוצלים זה הכרחי כדי להוסיף את האנטיביוטיקה המתאימה בעת culturing הזנים כהכנה לזיהום. כמו כן יש לקחת בחשבון כי פלסמידים לא יכול להישמר במהלך זיהום בבעלי חיים (ללא לחץ אנטיביוטי), ובכך הערכה של עומס חיידקי לא צריך להסתמך לחלוטין על הדמיית IVIS, אבל להיות מאושר על ידי CFU. המינון המחוסן הוא גם צעד קריטי ליזום זיהום. עבור P. aeruginosa ו S. aureus, מינון מדביק של 104-5 CFU משמש בדרך כלל, אבל המינון האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם למינים חיידקיים ועכבר בשימוש.

החלק הקריטי של סעיף 2 הוא להבטיח את מיטת הפצע מכוסה על ידי ההלבשה לאורך כל הפיתוח של זיהום וטיפול. אם ההלבשה אינה דבקה כראוי, הטיפול יכול לדלוף ממיטת הפצע ועלול להיות לא יעיל. ההלבשה חשובה גם לשמירה על מיטת הפצע מוגנת מפני מזהמים פוטנציאליים, ולפגיעה בריפוי התכווצותי על ידי העכבר, החיוני לחיקוי ריפוי פצעים אנושיים. לבסוף, החלק הקריטי של סעיף 3 הוא לטפל כראוי בדגימות שנאספו. כדי למנות CFU, יש לשטוף את הרקמה הנגועה עם 1 מ"ל של PBS לפני התוספת של עוד 1 מ"ל של PBS להומוגניזציה. איברים סיביים יותר, כגון הריאות, עשויים לדרוש הומוגניזציה יסודית יותר.

המגבלות העיקריות של פרוטוקולים אלה כוללות את המעקב הצמוד הנדרש של ההלבשה ואת הניצול של IVIS לפיזור תמונה ולהניח הנחות לגבי יעילות פיזור. עבור מחקרים ארוכי טווח, הצמיחה מחדש של פרווה יכולה להיות בעייתית כי זה יכול לעכב את הדבקות ההלבשה לאתר הפצע. תחבושות לעתים קרובות דורשים החלפה, והסרתם יכולה להוביל לפסולת מקרית של הפצע והזדמנות לזיהום. כדי לדמיין פיזור ממיטת הפצע, יש להשתמש בזן חיידקי ביולומינסנטי. אם מינים חיידקיים של עניין חסר כתב bioluminescent, אפשרות זו אינה אפשרית. מגבלה נוספת היא הפוטנציאל של טיפול פיזור כדי לגרום חיידקים, אשר יכול להוביל למוות של העכבר. עם זאת, ראינו כי תאים מפוזרים יכולים להיהרג ביעילות על ידי אנטיביוטיקה vivo7.

התוצאות הייצוגיות המתוארות באיור 2 ממחישות מגבלה של IVIS למדידת יעילות פיזור. ראשית, יש לנצל זן זוהר של מינים חיידקיים בעלי עניין. המתח חייב לייצר אות זוהר כי הוא בהיר מספיק כדי לזהות דרך שכבות מרובות של רקמה על מנת לדמיין פיזור ממיטת הפצע לחלקים אחרים של הגוף. הוצע כי מינימום של בערך 106 חיידקים נדרשים לייצר אות זוהר חזק מספיק כדי לזהות על ידי IVIS27. ירידה באות זוהר תוארה גם כאשר חיידקים נכנסים לשלב נייח28. הדבר עלול לגרום לניתוק בין ההחזרים על ההשקעה לבין CFU שנמדדו29. מגבלה זו יכולה להוביל להנחות שווא כאשר אין אות חזק מספיק לגילוי, אבל חיידקים עדיין נוכחים. כפי שמוצג באיור 2B, הטיפולים PBS ו-10% GH גרמו לעלייה בהבהירות לאחר הטיפול. זוהי התבוננות מוזרה ועקבית, אשר נראתה גם לאחר פיזור תאים במבחנה (קלאודיהמארקס, אוניברסיטת בינגהמטון, תקשורת אישית). ייתכן כי ההפרעה הפיזית של הביופילם מניהול הטיפול פשוט פורשת תאים שהיו ארוזים היטב, וכתוצאה מכך אות אור מוגבר. לחלופין, טיפול פיזור יכול 'לעורר' תאים biofilm אשר היו בעבר לא פעיל מטבולית, וכתוצאה מכך ביולומינציה מוגברת. כך או כך, חיוני לאשר את התוצאות של הדמיית IVIS עם נתוני CFU. לבסוף, יש התפלגות הטרוגנית של חיידקים בתוך רקמת פצע נגוע30,31. לכן, אם הרקמה מחולקת ex vivo לספק דגימות נוספות, אין להניח כי עומס חיידקי בכל קטע פצע זהה.

ישנם שינויים ופתרון בעיות שניתן לבצע כדי להתגבר על המגבלות של מודלים אלה. ראשית, ייתכן שיהיה צורך להתאים את משך הזמן המוקצב לחשיפת קרם המפרקים בהתאם למין העכבר המשמש. לדוגמה, 7 דקות משמש בדרך כלל עבור עכברי וובסטר שוויצרי, בעוד עכברי C57BL/6 ייתכן שיהיה צורך עד 10 דקות של חשיפה כדי להסיר בהצלחה את הפרווה. זה כמובן גם תלוי במוצר המשמש, ואת זמני החשיפה לא יעלה על הוראות היצרן. אם נערך מחקר ארוך (4+ ימים), ייתכן שיהיה צורך להחיל מחדש קרם דפילטורי כדי להסיר פרווה שגודלה מחדש ולהבטיח חותם מתאים של ההלבשה. לאחר מכן, אם קשה לזהות אות זוהר, ניתן להגדיל את זמן החשיפה במהלך הדמיית IVIS. ניתן גם להתאים את המינון המחוסן ואת זמן הזיהום. חשוב להשתמש במינון הדבקה שאינו גבוה מדי כי הוא מציף את העכבר, אבל הוא גם לא נמוך מדי כי החיידקים מנוקים מיד על ידי התגובה החיסונית.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טיפול 48 h-ישן זיהומים פצע עם סוכני פיזור, שכן זוהי נקודת זמן הראינו זיהומים שנגרמו על ידי P. aeruginosa ו / או S. aureus הוקמו biofilm הקשורים 12,15,16. עם זאת, בהתאם למין החיידקי, נקודות זמן אחרות עשויות להיות אופטימליות יותר. באופן אידיאלי, העומס החיידקי בפצע צריך מישור פעם אחת זיהום הוקמה. לדוגמה, ראינו כי עם P. aeruginosa ו S. aureus, העומס החיידקי בפצע מגיע כ 108 CFU / g של רקמה על ידי 48 שעות לאחר ההדבקה ונשאר ברמה זו עד סגירת הפצע. איור 1 מדגים טיפול בתמיסה הדורשת שטיפות של 3 x 30 דקות. עם זאת, אם סוכן הפיזור היה בצורה אחרת, הכביסה לא הייתה נחוצה. לדוגמה, קרם, ג'ל או רוטב מהונדס יכול פשוט להיות ממוקם על גבי מיטת הפצע. לבסוף, הפצע יכול להיות נגוע במגוון דרכים כולל חיסון של תאים חיידקיים פלנקטוניים, biofilms preformed12, או אפילו רקמת פסולת נגועה של בעל חיים אחר או אדם19,32. ראינו כי השתלת דגימת ביופילם או פסולת מעוצבת מראש על מיטת הפצע גורמת לזיהומים פולי-מיקרוביאליים מוצלחים יותר מאשר כאשר מינים מרובים מחוסנים בצורת הפלנקטוני שלהם12.

בסך הכל, פרוטוקולים אלה מתארים שיטות לחקר פיזור biofilm והערכה של סוכני פיזור biofilm טיפולית. מודלים אלה מאפשרים פיתוח של זיהומים מורכבים הקשורים לביופילם רב-מיקרוביאלי המחקים זיהומים אנושיים רלוונטיים קלינית. תקוותנו היא כי פרוטוקולים אלה ינוצלו ומעודנים כדי לקדם את הפיתוח של סוכני פיזור אנטי ביופילם לשימוש טיפולי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (R21 AI137462-01A1), קרן טד נאש לונג לייף, קרן ג'ספר ל' וג'ק דנטון וילסון ומשרד ההגנה (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 174 אקס ויוו In vivo ביופילם פיזור זיהום פצעים סוכן אנטי-ביופילם פסאודומונס aeruginosa
הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Redman, W. K., Welch, G. S.,… More

Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter