Method Article

הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין

DOI:

10.3791/62136

⸱

August 7th, 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים אקס ויוו ושיטות vivo להערכת פיזור חיידקים מזיהום פצע בעכברים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי לבדוק את היעילות של טיפולים אנטי מיקרוביאלית אקטואלי אנטי ביופילם, או כדי להעריך את יכולת הפיזור של זנים חיידקיים שונים או מינים שונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים הקשורים Biofilm מעורבים במגוון רחב של מצבים כרוניים כגון כיבים ברגל סוכרתית שאינם ריפוי, סינוסיטיס כרונית, מדיה דלקת אוזניים חוזרת, ועוד רבים. תאים מיקרוביאליים בתוך זיהומים אלה מוגנים על ידי חומר פולימרי חוץ תאי (EPS), אשר יכול למנוע אנטיביוטיקה ולארח תאים חיסוניים מפני ניקוי הזיהום. כדי להתגבר על מכשול זה, חוקרים החלו לפתח סוכני פיזור כטיפולים פוטנציאליים. סוכנים אלה מתמקדים ברכיבים שונים בתוך ה- EPS של הביופילם, מחלישים את המבנה ויוזמים פיזור של החיידקים, אשר תיאורטית יכול לשפר את העוצמה האנטיביוטית ואת הסיווג החיסוני. כדי לקבוע את היעילות של סוכני פיזור עבור זיהומים פצע, פיתחנו פרוטוקולים המודדים פיזור biofilm הן ex vivo ו in vivo. אנו משתמשים במודל כריתה כירורגית של עכבר שתואר היטב כדי ליצור זיהומים כרוניים הקשורים לביופילם. כדי לפקח על פיזור vivo, אנו מדביקים את הפצעים עם זנים חיידקיים המבטאים לוציפראז. לאחר זיהומים בוגרים הוקמו, אנו להשקות את הפצעים עם פתרון המכיל אנזימים להשפיל רכיבים של EPS biofilm. לאחר מכן אנו עוקבים אחר המיקום והעוצמה של האות הזוהר בפצע ואיברים מסננים כדי לספק מידע על רמת הפיזור שהושגה. לניתוח ex vivo של פיזור biofilm, רקמת פצע נגוע שקוע בתמיסת אנזים משפיל biofilm, ולאחר מכן עומס חיידקי שנותר ברקמה, לעומת עומס חיידקי בתמיסה, מוערך. שני הפרוטוקולים יש חוזקות וחולשות והוא יכול להיות אופטימיזציה כדי לעזור לקבוע במדויק את היעילות של טיפולים פיזור.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עליית עמידות לאנטיביוטיקה ברחבי העולם מובילה לחוסר אפשרויות אנטיביוטיות לטיפול במגוון זיהומים חיידקיים1. בנוסף לעמידות לאנטיביוטיקה, חיידקים יכולים להשיג סובלנות אנטיביוטית על ידי אימוץ אורח חיים הקשור לביופילם2. ביופילם היא קהילה של מיקרואורגניזמים המוגנים על ידי מטריצה של פוליסכרידים, דנ"א חוץ תאי, שומנים וחלבונים3, הנקראים באופן קולקטיבי החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS). ככל שמשבר ההתנגדות לאנטיביוטיקה נמשך, אסטרטגיות חדשות המאריכות את השימוש, או מחזקות את היעילות של, אנטיביוטיקה נחוצות מאוד. סוכני אנטי-ביופילם הם פתרון מבטיח אחד4.

בין אסטרטגיות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה של בעלי חיים נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (פרוטוקול מספר 07044). מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת חיידקים לזיהומים בעכבר

הערה: כאן אנו מתארים עכברים מדביקים רק עם Pseudomonas aeruginosa. עם זאת, מינים חיידקיים אחרים עשויים לשמש כדי לגרום לזיהום. זנים וחומרים חיידקיים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. השתמש Pseudomonas aeruginosa סוג פראי זן PAO1 נושאת את פלסמיד זוהר pQF50-lux23 עבור ניסויים אלה כפי שתואר קודם....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניסוי זה, עכברי וובסטר שוויצריים בני 8-10 שבועות נדבקוב-10 4 CFU של PAO1 הנושאים את פלסמיד הזוהר pQF50-lux. כפי שתואר לעיל, זיהום הורשה להקים במשך 48 שעות לפני מתן 3 x 30 דקות טיפולים של PBS (בקרת רכב) או 10% GH (טיפול) לעכל את EPS biofilm. עכברים צולמו טרום טיפול, מיד לאחר הטיפול (0 שעות) וב 10 שעות ו 20 שעות לאחר הטיפול. איור 2A ואיור נוסף 1 מראים זיהום מבוסס בתוך מיטת הפצע היוצר אות ביולומיננטי בהיר. פיזור של חיידקים מתוך מיטת הפצע ניתן לדמיין מיד לאחר הטיפול.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את היעילות של סוכני פיזור biofilm. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לשימוש עם סוגים שונים של חומרי פיזור, מינים חיידקיים או דגימות ex vivo, כולל דגימות פסולת קלינית. פרוטוקול זה מספק גם מודל רלוונטי קלינית לאיסוף וחקר תאים חיידקיים מפוזרים. הפנוטיפים של תאים חיידקיים מפוזרים הוכחו להיות נבדלים מאלה של תאים פלנקטוניים או biofilm 5,24,25,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (R21 AI137462-01A1), קרן טד נאש לונג לייף, קרן ג'ספר ל' וג'ק דנטון וילסון ומשרד ההגנה (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לפישר14823434 השתמש להשלמת דילולים סדרתיים של דגימות
25G 58 במחטפישר14823434מתחבר למזרק 1 מ"ל
Ampicillin נתרן מלחפישרBP1760-5הכינו תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל והוסיפו 100 ומיקרו; L עד 10 מ"ל של מרק LB הן ללילה והן לתת-תרבות
AmylaseMP Biomedicals2100447הכינו תמיסה של 5% w/v, מערבולת- ניתן להשתמש בחומרי פיזור אחרים
בופרנורפין SR-LAB 5 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל)ZooPharmRX216118להשתמש כטיפול בכאב - עשוי להשתמש באפשרויות אחרות
CellulaseMP Biomedicals2150583הוסף 5% w/v לתמיסת העמילאז של 5% w/v, מערבולת, הפעל ב-37 מעלות; C למשך 30 דקות- ניתן להשתמש בחומרי פיזור אחרים
קרם אפילציהWalmart287746השתמש בכמות קטנה כדי לעסות לתוך זקיקי השיער בגב החיה והקצה 10 דקות להסרת שיער
מלקחיים לבישה, טיפים משונניםפישר12-460-536יכול להשתמש בצורות אחרות של מלקחיים
צלוחיות ארלנמאייר מבולבלות 125 מ"ל101406פישר השתמש לגידול לילה ותת-תרביות של חיידקים
FastPrep-24 הומוגנייזר ספסלMP Biomedicals6VFV9השתמש ב-5 m/s למשך 60 שניות פעמיים כדי להומוגניזציה של רקמות
Fatal PlusVortech Pharmaceuticals0298-9373-68הזרקת 0.2 מ"ל תוך פריטנאלי לכל עכבר
צינורות הומוגניזציה (צינור חרוזים 2 מ"ל 2.4 מ"מ מתכת)פישר15340151משמש להומוגניזציה של דגימות לציפוי
תרופותגב יהלום איזופלורן
תמיסת קטמין הידרוכלוריד/קסילזין הידרוכלוריד C-IIINSigma AldrichK4138השתמש כאנסתיה - ניתן להשתמש באפשרויות אחרות גם כדי להשיג שדה כירורגי של מרק אנסתיה
LB, מילרפישרBP1426-2הוסף 25 גרם לליטר ואוטוקלאב
לידוקאין 2%תרופות גב יהלום2468הזריק 0.05 מ"ל דרך הצד של אזור מיטת הפצע המסומן כך שהוא יופקד במרכז הסימן. יש להקצות 10 דקות לפני החיתוך
מרופנםסיגמא אולדריץ'PHR1772-500 מ"גלהכין 5 מ"ג/מ"ל להוספה לתמיסת GH למריחה מקומית ותמיסה של 15 מ"ג/מ"ל להזרקה תוך-פריטנאלית 4 שעות לפני ו-6 שעות לאחר הטיפול
ספוגי גזה כותנה לא סטרילייםפישר13-761-52השתמש להסרת קרם האפילציה
PAO1 pQF50-lux זן חיידקיRef [13]N/APAO1 pgF50-lux שימש כזן P. aeruginosa המעניין בתוצאות המייצגות של מאמר זה
צלחות פטריפישרPHR1772-500MG
מאגר פוספט מלוח 10xFisherBP3991לדלל פי 10 עד 1x לפני השימוש
רוטב פוליאוריטןMckesson66024007חותכים את הקצה המעוגל וחותכים את הריבוע הנותר ל-4 חלקים שווים
Pseudomonas אגר בידודVWR90004-394הוסף 20 מ"ל/ליטר גליצרול ו-45 גרם/מ"ל למים, חיטוי ושפך 20 מ"ל לצלחות פטרי
רענן אחר הצהריים.Walmartהשתמש בעיניים כדי להפחית יובש במהלך ההליך.
רפידות הכנה לאלכוהול סטריליותפישר22-363-750השתמש לניקוי העור מיד לפני הפציעה כדי לחטא את האזור
מספריים עדינים ישריםפישר89515יכול גם להשתמש במספריים מעוקלים
עכברי וובסטר שוויצרייםצ'ארלס ריבר551NCISWWEBניתן להשתמש בזני עכברים אחרים קצה
החלקה מזרק 1 מ"לפישר14823434משמש למתן תרופות ו טיפול באנזימים
להזרקה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biofilm DispersalMurine Wound ModelChronic Wound InfectionDispersal AgentsExtracellular Polymeric SubstanceIn Vivo ImagingBacterial Load QuantitationEx Vivo AnalysisPolymicrobial InfectionEnzyme Treatment

Related Articles