Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Allestedsnærværende og vævsspecifik RNA-målretning i Drosophila Melanogaster ved hjælp af CRISPR/CasRx

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California

Summary

Denne artikel skitserer en detaljeret protokol til brug af RNA-målretning Cas13D enzym (RfxCas13D) i fluer.

Abstract

CasRx, et medlem af RNA-målretning Cas13 familien, er en lovende ny tilføjelse af CRISPR / Cas teknologier i effektiv genudskrift reduktion med en attraktiv off-target profil på både cellulære og organismeniveau. Det er for nylig rapporteret, at CRISPR / CasRx-systemet kan bruges til at opnå allestedsnærværende og vævsspecifik genudskriftsreduktion i Drosophila melanogaster. Dette papir beskriver metoderne fra det seneste arbejde, der består af tre dele: 1) allestedsnærværende in vivo endogenme RNA målretning ved hjælp af en to-komponent CasRx system; 2) allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretning ved hjælp af en tre-komponent CasRx system; og 3) vævsspecifik in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med tre komponenter. Virkningerne af RNA målretning observeret omfatter målrettede genspecifikke fænotypiske ændringer, målrettet RNA udskrift reduktion, og lejlighedsvis dødelighed fænotyper forbundet med højt udtryk for CasRx protein og indirekte aktivitet. Samlet set viste disse resultater, at CasRx-systemet er i stand til at målrette RNA-udskriftsreduktion på organismeniveau på en programmerbar og effektiv måde, hvilket viser, at in vivo transcriptome targeting, og engineering er mulig og danner grundlaget for fremtidige in vivo CRISPR-baserede RNA-målretningsteknologier.

Introduction

Siden fremkomsten af Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) teknologier har meget af fokus på dette område været på DNA-redigering, som tilbyder transformative anvendelser inden for medicin og bioteknologi1. Permanent ændring af DNA-sekvenser er imidlertid ikke altid ønsket på grund af etiske overvejelser. I lyset af dette begyndte nylige undersøgelser at udvikle CRISPR-baserede værktøjer til målretning af RNA og viste, at CRISPR-teknologier faktisk kan bruges til RNA-målretning i en række biologiske systemer2,3,4,5,6,7. I mange af disse testede systemer er den nuværende udbredte tilgang til målretning af RNA og reduktion af udskrift RNA-interferens (RNAi), som langt fra er perfekt, og som ofte udviser varieret effektivitet og høj off-target aktivitet, når den anvendes i vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . I betragtning af disse teknologiers status er det derfor værd yderligere at undersøge potentialerne i CRISPR-baserede værktøjer til RNA-målretning.

En bemærkelsesværdig nylig undersøgelse rapporterede, at ribonuclease CasRx, et medlem af Cas13d klassen, effektivt kan reducere genudskrift niveauer i den menneskelige celle kultur og besidder en attraktiv off-target profil4. Dette resultat førte til spørgsmålet om, hvorvidt denne nye ribonuklease kan opretholde sin effektivitet og lav off-target sats for RNA målretning på organismeniveau. En nylig undersøgelse behandlet dette spørgsmål ved at vise, at CasRx systemet kan bruges til at opnå allestedsnærværende og vævs-specifikke genudskrift reduktion i Drosophila melanogaster5.

For at strømline anvendeligheden af denne nyligt offentliggjorte tilgang beskriver denne protokol metoderne fra dette nylige arbejde, som består af tre hoveddele: 1) allestedsnærværende in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med to komponenter; 2) allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretning ved hjælp af en tre-komponent CasRx system; og 3) vævsspecifikin vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med tre komponenter.

Guide RNA (gRNA), der er rettet mod forskellige målgener under kontrol af en allestedsnærværende promotor, blev designet, og der blev genereret flyvelinjer, der udtrykker disse gRNA-holdige konstruktioner. CasRx konstruktioner under kontrol af enten en allestedsnærværende promotor, eller en betinget upstream aktivering sekvens (UASt) promotor aktiveres af GAL4 transskription faktor, blev også designet og flyve linjer huser disse CasRx-holdige konstruktioner genereret. Katalytisk inaktive CasRx konstruktioner, dCasRx, blev designet og brugt som negative kontroller. Allestedsnærværende RNA målretning i fluer opnås ved at krydse gRNA-udtrykke flyve linjer med allestedsnærværende CasRx-udtrykke flyve linjer. Afkommet, der udtrykker både gRNA-konstruktionen rettet mod en bestemt genudskrift og CasRx-proteinet, har en allestedsnærværende reduktion af målrettede genudskrifter. Vævsspecifik RNA-målretning i fluer opnås ved først at krydse gRNA-udtrykkende fluer med UASt-CasRx, der udtrykker fluer, opnå transheterozygous fluer, der bærer både gRNA og UASt-CasRx konstruktioner. Sådanne fluer krydses igen med vævsspecifikke GAL4-udtrykkende fluer, hvilket resulterer i generering af vævsspecifik CasRx-udtryk og RNA-målretning i fluer.

Den programmerbare karakter af CasRx-systemet giver mulighed for tilpasning og optimering for at hjælpe med at opnå høj effekt og lav off-target aktivitet for in vivo RNA målretning. Potentielle anvendelser af CRISPR-baseret RNA-målretning er talrige, herunder udskiftning af RNAi i laboratoriet og bidrag til insektvektorkontrol i naturen. Af sidstnævnte er et af de globale uopfyldte behov udviklingen af effektive værktøjer til bekæmpelse af infektioner af RNA-vira, der overføres via myg. Mange RNA-vira, såsom denguefeber, zika og chikungunyavirus, overføres via myg, påvirker menneskers sundhed og bidrager med dødelighed. Der er fremsat mange forslag til at fremstille mygpopulationer med virusresistens til sygdomsforebyggelse; ingen nuværende teknologi er imidlertid i stand til at gøre myg samtidig resistente over for alle signifikante RNA-vira18,19,20,21,22,23. RNA-målretning Cas systemer kan give et udgangspunkt for en sådan teknologi ved at muliggøre en programmerbar platform til målretning af alle myg-båret RNA-vira.

Protocol

1. Allestedsnærværende in vivo RNA målretning ved hjælp af en to-komponent CasRx System

  1. Generering af Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx udtryksvektor
    1. Forstærke CasRx sekvensen ved hjælp af en polymerase kædereaktion (PCR) med primer 1050E. C3 og 1050E. C4 og den oprindelige CasRx konstruktion pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx); og forstærke dCasRx-sekvensen ved hjælp af PCR med primer 1050E. C3 og 1050E. C4 og den oprindelige dCasRx konstruktion pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)4 (tabel 1). Gel-rense de forstærkede CasRx og dCasRx fragmenter bagefter ved hjælp af en gel rensning kit.
    2. Digest base vektor (Addgene plasmid # 112686) med begrænsning enzymer SwaI og PacI24. I de resulterende produkter skal du bruge et sæt til gelrense det større fragment, som kaldes basisvektorens rygrad.
    3. Saml Ubiq-CasRx-vektoren med basisvektorens rygrad og CasRx-fragmentet ved hjælp af Gibson-samlingsmetoden. Ubiq-dCasRx-vektoren med basisvektorens rygrad og dCasRx-fragmentet ved hjælp af Gibson-samlingsmetoden25.
      BEMÆRK: Addgene ID for Ubiq-CasRx vektor (OA-1050E) er #132416, og Addgene ID af Ubiq-dCasRx vektor (OA-1050R) er # 132417.
  2. Generering af gRNA-udtryksvektor
    1. Design hvert gRNA-fragment baseret på følgende kriterier: målsekvensen er 30 nukleotider i længden; poly-U's maksimale længde strækker sig i målsekvensen og er 4 basispar målsekvens GC-indholdet ligger i intervallet 30% - 70%; målsekvensen forudsagde ikke at danne stærke RNA hårnålestrukturer; og målsekvensen, der indeholder minimal forudsagt RNA-sekundær eller tertiær struktur5.
      BEMÆRK: Denne undersøgelse designet hver gRNA som 4 tandem sekvenser hver 30 nukleotider lang, fordelt med 36 nukleotid lange direkte gentagelser, og med en 7-thymine terminator på begge ender5. For det eksogene målgen, GFP, blev de samme kriterier som ovenfor fulgt med en tilføjelse af et OpIE2-GFP-fragment5.
    2. Forstærke U6:3 promotor sekvens ved hjælp af PCR med primere 1043.C1 og 1043.C23 og Addgene plasmid # 112688 (tabel 1)26. Gel-rense de forstærkede U6:3 fragmenter ved hjælp af gel rensning kit.
    3. Digest Addgene plasmid #112688 med restriktionsenzymet AscI og XbaI24. I de resulterende produkter skal du bruge et kit til gelrense de større fragmenter, som kaldes præ-base vektor rygraden.
    4. Saml basisvektoren med præbasenktorens rygrad og U6:3-fragmentet ved hjælp af Gibson-samlingsmetoden25. Basisvektoren hedder herefter OA-1043.
      BEMÆRK: Plasmid OA-1043's Addgene ID er #164586.
    5. Syntetisere målgenets gRNA-fragment ved hjælp af ekstern gensyntesetjeneste.
    6. Fordøje basisvektoren OA-1043 med restriktionsenzymet PstI og NotI24. Hold hele fordøjelsesproduktet, som kaldes fordøjet OA-1043.
    7. Saml gRNA-udtryksvektoren med den fordøjede OA-1043 og målgen gRNA-fragment ved hjælp af Gibson-samlingsmetoden25.
      BEMÆRK: Fire målgener blev undersøgt: tre var endogene (hvid, Hak, gul), en var eksogen (GFP). Deres Addgene-id'er er: #132420 (gRNAw), #132421(gRNAN), #132425 (gRNAy) og #133304 (gRNAGFP).
  3. Generering af transgene fluer
    1. Indsprøjt ekspressionsvektorer i flyvefostre ved hjælp af ekstern flyveembryoindsprøjtningstjeneste og embryoner fra fluer, der indeholder ØC31-integrationssteder. Bag de injicerede embryoner ved 26 °C.
      BEMÆRK: Attp40w (med integrationssteder på 2. kromosom) linje blev brugt til at generere CasRx linjer og 8622 (med integration sites på 3rd kromosom) linje blev brugt til at generere forskellige gRNA linjer.
    2. Hold fluerne enten som homozygoe linjer eller som afbalancerede heterozygoe linjer.
      BEMÆRK: Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx fluer blev holdt så heterozygot afbalancerede linjer med CyO som balancer. Derudover indeholder både Ubiq-CasRx- og Ubiq-dCasRx-vektorer en dsRed-markør. Som følge heraf har Ubiq-CasRx- og Ubiq-dCasRx-fluerne følgende tre fænotyper: dsRed-positive, krøllede vinger og hvide øjne. De gRNA-udtrykende fluer blev holdt som homozygoe linjer. Deres Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) flyve lager numre er: # 84118 (Ubiq-CasRx), # 84119 (Ubiq-dCasRx), # 84124 (gRNAw), # 84122 (gRNAN), # 84123 (gRNAy), # 84986 (gRNAGFP).
  4. Flyvegenetik (Figur 1A)
    1. Saml 10 jomfruelige voksne kvindelige fluer fra den homozygoe gRNA linje og indsamle 5 voksne mandlige fluer fra afbalanceret heterozygot Ubiq-CasRx / CyO linje. Sæt de indsamlede kvindelige og mandlige fluer, som kaldes forældrenes fluer, i et hætteglas suppleret med tørt gærpulver (Figur 1A).
    2. Gentag det forrige trin 3 gange for at generere 3 repliker. For kontrolgruppen skal du bruge Ubiq-dCasRx/CyO-linjen, samtidig med at alt andet er ens.
      BEMÆRK: For et almindeligt glasglas af fødevarer er 0,1 g tørt gærpulver tilstrækkeligt. BDSC's fluemad opskrift bruges.
    3. Bag hætteglassene, der indeholder forældrenes fluer, ved 26 °C i 48 timer. Fjern derefter alle forældrefluer fra hvert hætteglas. Hold derefter hætteglassene ved 26 °C i mindst 20 dage.
    4. Overhold hætteglassene hver dag for at se, om der opstod nye voksne afkom fra pupper af F1-generation. Hvis det er tilfældet, bedøve dem med kuldioxid ved at indsætte et rør tilsluttet en kuldioxidtank inde i flyveglassene og derefter tænde strømningskontakten i 10 sekunder.
    5. Når fluerne bliver immobile, tømmes de fra hætteglasset på en flyvepude, som også er forbundet med kuldioxidtanken, og kuldioxid strømmer kontinuerligt ud gennem flyvepuden.
    6. Score bedøvet fluer 'fænotype og billede dem ved hjælp af farve kamera-tilsluttet en fluorescerende stereomikroskop. Tæl antallet af afkom med forskellige fænotyper. Brug billedbehandlingssoftware til billedbehandling og kompilering (Figur 2A - 2D).
      BEMÆRK: Baseret på mendelian genetik forventes to typer fluer blandt afkomene for hvert kryds (Figur 1A).
  5. RNA-Seq (Figur 2E – 2G)
    1. Eksempelsamling
      BEMÆRK: Vælg en passende prøveindsamlingsmetode blandt de tre eksempler nedenfor. 3 gentagelser for hver enkelt stikprøvetype er påkrævet.
      1. Voksen fluehoved prøve samling
        1. Saml 10 jomfru voksne kvindelige fluer fra den homozygoe gRNA linje. Saml 5 voksne hanfluer fra den afbalancerede heterozygode Ubiq-CasRx/CyO-linje. Sæt de indsamlede kvindelige og mandlige fluer, som er forældrenes fluer, i et hætteglas suppleret med tørt gærpulver.
        2. Gentag det forrige trin 3 gange for 3 replikeringer. For kontrolgruppen skal du bruge Ubiq-dCasRx/CyO-linjen, samtidig med at alt andet er ens.
        3. Bag hætteglassene, der indeholder forældrenes fluer, ved 26 °C i 48 timer. Fjern derefter alle forældrefluer fra hvert hætteglas. Hold derefter hætteglassene ved 26 °C, indtil der kommer afkom ud af pupperne.
        4. Saml 10 1-dages gamle voksne fluer med den korrekte fænotype. Bedøve fluer med kuldioxid, derefter afskære flyvehovedet og sætte hovedet i en 1,5 mL centrifuge rør på tøris. Centrifugerøret opbevares ved -80 °C. Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker.
      2. 17 – 20 timer gammel indsamling af embryoner
        1. Saml 8-10 jomfru voksne kvindelige fluer fra den homozygode gRNA linje. Saml 4-5 voksne hanfluer fra den afbalancerede heterozygode Ubiq-CasRx/CyO-linje. Sæt de indsamlede kvindelige og mandlige fluer, som er forældrenes fluer, i et hætteglas suppleret med tørt gærpulver.
        2. Gentag det forrige trin 3 gange for 3 replikeringer. For kontrolgruppen skal du bruge Ubiq-dCasRx/CyO-linjen, samtidig med at alt andet er ens.
        3. Bag hætteglassene, der indeholder forældrenes fluer, ved 26 °C i 48 timer.
        4. Forbered et druesaft embryo indsamling kammer for hver replika efter denne opskrift: 376 mL vand, 126 mL druesaft, 15 g agar, og 6 g saccharose. Sæt medierne i et 1 L-bægerglas og mikroovn det højt i 5-6 minutter, mens du holder et vågent øje med medierne i bægeret for at kontrollere, om bobler / skum vises. Hvis det er tilfældet, skal du stoppe mikrobølgeovnen og lade boblen / skummet slå sig ned. Fortsæt microwaving på denne måde, indtil boblen bliver klar. Hvirvle, før alle bobler er klare. Endelig tilsættes 10 ml 100% alkohol og 5 ml eddikesyre. Bland godt, og rør derefter mediet i 35 mm Petriskåle med en 25 mL serologisk pipet. Når mediet størkner i petriskålen, er det klar til brug.
        5. Ved afslutningen af inkubationen på 48 timer overføres forældrefluer til kamre til indsamling af embryoner til druesaft og inkuberede dem ved 26 °C i 3 timer. Fjern derefter de voksne fluer, mens du holder de nylagte embryoner på druesaftpladerne i yderligere 17 timer ved 26 °C.
        6. Efter inkubation opsamles de 50 - 100 embryoner fra druesaftpladerne, rengør embryooverfladen ved at nedsænke dem i deioniseret vand og overfør dem derefter til et 1,5 mL centrifugerør på is. Opbevar dem ved -80 °C. Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker.
      3. Første instar larver prøve indsamling
        1. Saml 8-10 jomfru voksne kvindelige fluer fra den homozygode gRNA linje. Saml 4-5 voksne hanfluer fra den afbalancerede heterozygode Ubiq-CasRx/CyO-linje. Sæt de indsamlede kvindelige og mandlige fluer, som er forældrenes fluer, i et hætteglas suppleret med tørt gærpulver. Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker. For kontrolgruppen skal du bruge Ubiq-dCasRx/CyO-linjen, samtidig med at alt andet er ens.
        2. Bag hætteglassene, der indeholder forældrenes fluer, ved 26 °C i 48 timer. Overfør derefter de voksne fluer til et andet nyt almindeligt madglas til inkubation natten over (16 timer) ved 26 °C. Fjern derefter de voksne fluer.
        3. Hold det embryoholdige hætteglas ved 26 °C i 24 timer, og scor derefter de transheterozygøse først instarlarver under mikroskopet ved hjælp af baserede forskellige markører. Saml 15-30 larver med korrekte fænotyper og læg dem i et 1,5 mL centrifugerør og opbevar dem ved -80 °C. Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker.
    2. Sekventering
      1. RNA-ekstraktion: Brug et kommercielt tilgængeligt RNA-ekstraktionssæt, og følg sættets instruktion til at behandle alle prøver. Inkuber derefter de ekstraherede RNA-prøver med kommercielt tilgængelig deoxyribonuclease og følg dens instruktion om at fjerne ethvert forurenende DNA fra prøverne.
      2. Mål RNA-koncentrationen ved hjælp af uv-vis-spektrofotometer, der er kommercielt tilgængeligt. Mål RNA-integriteten i prøverne ved hjælp af kommercielt tilgængelig RNA-integritetsanalyseopsætning.
      3. Byg RNA-seq-bibliotekerne ved hjælp af RNA-biblioteksforberedelsessæt, der er kommercielt tilgængelige.
      4. Brug ekstern sekventeringstjeneste til bibliotekssekvensering med følgende indstillinger: enkelt læsetilstand; læselængde: 50nt, dybde: 20 millioner læser pr bibliotek. Udfør basisopkald med RTA 1.18.64, og konverterede derefter dataene til FASTQ ved hjælp af bcl2fastq 1.8.4.
        BEMÆRK: Rå sekventeringsdata kan findes i National Center for Biotechnology Information Sekventering Læs Arkiv (indsendelses-id: SUB6818910 [BioProject: PRJNA600654]).
    3. Bioinformatik
      1. Kort læser fra sekventering data til Release 6 Drosophila melanogaster genomet fra Berkeley Drosophila Genome Project (GenBank tiltrædelsesnummer: GCA_000001215.4) og de udefrakommende CasRx og GFP sekvenser ved hjælp af standard parameter indstilling star aligner28 med tilføjelsen af "-outFilterType BySJout" filter mulighed og "-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster. BDGP6.22.97.gtf" genoverførselsformatfil fra ENSEMBL.
      2. Bestem de rå udskrifter for hver kommenteret udskrift med funktionen Tæller35 ved hjælp af indstillingerne "-t exon -g gene_id -M -O --brøk". Derefter normaliserer rå udskrift tæller ved hjælp af samlede udskrift tæller ved hjælp af "addTpmFpkmToFeatureCounts.pl" Perl script.
      3. Brug den maksimale efterfølgende metode sammen med den oprindelige krympningsestimator i DESeq2-rørledningen til at estimere hvert gens udskrifters logaritmisk foldændring (LFC).

2. Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretning ved hjælp af en tre-komponent CasRx System

  1. Generering af eksogen målvektor for allestedsnærværende udtryk
    1. PCR forstærker Ubiq-promotorfragmentet ved hjælp af primere 1052B. C1 og 1052B. C2 og Addgene plasmid # 112686 26. Derefter forstærker PCR T2A-eGFP-fragmentet forstærket fra Addgene plasmid #112686 med primere 908A.1 og 908A.2 (tabel 1)26. Derefter forstærker PCR Ubiq-promotorfragmentet som omvendt sekvens ved hjælp af Addgene plasmid # 112686 med primere 908A.3 og 908A.4 (tabel 1)26. Gel-rense Ubiq promotor fragment, T2A-eGFP fragment, og den omvendte Ubiq promotor fragment ved hjælp af gel rensning kit.
    2. Bestil en brugerdefineret firefly luciferase kodning sekvens og en brugerdefineret fragment, der indeholder en p10 3'UTR fragment, vendt renilla luciferase efterfulgt af en SV40 3'UTR fragment.
    3. Digest Addgene plasmid #112688 med restriktionsenzymet AscI og XbaI24. I de resulterende produkter renser gel-de større fragmenter ved hjælp af gelrensningssæt, som kaldes basisvektorens rygrad.
    4. Brug Gibson-samlingsmetoden til at samle basisvektoren med basisvektorens rygrad og følgende fragmenter: Ubiq promotorfragment, T2A-eGFP-fragmentet, det omvendte Ubiq-promotorfragment, brandflue luciferase-kodningssekvensen og den omvendte renilla luciferase efterfulgt af et SV40 3'UTR fragment25.
      BEMÆRK: Addgene ID for den resulterende dual-luciferase udtryksvektor (OA-1052B) er #132426.
  2. Generering af gRNA-udtryksvektor
    1. PCR forstærker U6:3 promotor sekvens ved hjælp af primere 1043.C1 og 1043.C23 og Addgene plasmid # 112688 (tabel 1)26. Gel-rense de forstærkede U6:3 fragmenter ved hjælp af gel rensning kit.
    2. Digest Addgene plasmid #112688 med restriktionsenzymet AscI og XbaI24. I de resulterende produkter renser gel-de større fragmenter, som kaldes præbasenvegraden, ved hjælp af gelrensningssæt.
    3. Saml basisvektoren med rygraden før basisvektoren og U6:3-fragmentet ved hjælp af Gibson-samlingsmetoden25. Basisvektoren hedder herefter OA-1043.
    4. Syntetisere målgenets gRNA-fragment ved hjælp af ekstern gensyntesetjeneste.
    5. Fordøje basisvektoren OA-1043 med restriktionsenzymet PstI og NotI24. Hold hele fordøjelsesproduktet, som kaldes fordøjet fordøjet OA-1043.
    6. Saml gRNA-udtryksvektoren med den fordøjede OA-1043 og målgen gRNA-fragment ved hjælp af Gibson-samlingsmetoden25.
      BEMÆRK: Addgene ID for den resulterende plasmid (OA-1052K) er #132422.
  3. Generering af transgene fluer
    1. Indsprøjt OA-1052B vektor i flyve embryoner ved hjælp af embryoner fra fluer, der indeholder ØC31 integration site på 3rd kromosom, BDSC flyve lager nummer 9744, via ekstern flyve embryo injektion service. Tilsvarende injicere OA-1052K vektor i flyve embryoner ved hjælp af embryoner fra fluer, der indeholder ØC31 integration site på 3rd kromosom, BDSC flyve lager nummer 8622. Bag de injicerede embryoner ved 26 °C.
    2. Hold de dobbelt luciferase-udtrykkende fluer og gRNA fluer som homozygoe linjer; holde Ubiq-CasRx linjer som dobbelt-afbalanceret heterozygode linjer ved at krydse den en afbalanceret heterozygot Ubiq-CasRx linje genereret i afsnit 1 til balancer linjer transporterer TM6 balancer kromosom med skægstubbe (Stb) markør og bevarer kun dobbelt-afbalanceret afkom med hvid-eyed, krøllede vinger, og dsRed-fluorescerende fænotyper samtidigt.
      BEMÆRK: BDSC flyve lager numre er: # 84127 (Ubiq-Fluc-Rluc), # 84125 (gRNAFluc).
  4. Flyvegenetik (figur 1B og figur 3A)
    1. Saml 8-10 jomfruelige voksne kvindelige fluer fra den dobbelte luciferase-udtrykkende linje. Saml 4-5 voksne mandlige fluer fra den afbalancerede heterozygode Ubiq-CasRx/CyO; +/TM6, Stb linje, der viser hvidøjede, krøllede vinger, og dsRed fluorescens samtidigt. Sæt de indsamlede kvindelige og mandlige fluer, som er forældrenes fluer, i et hætteglas suppleret med tørt gærpulver (i det følgende kaldet Trin 1 Cross).
    2. Gentag det forrige trin 3 gange for 3 replikeringer. Til kontrolgruppen skal du bruge Ubiq-dCasRx/CyO. +/TM6, Stb linje og samtidig holde alt andet det samme.
    3. Bag trin 1-krydsglasset, der indeholder forældrenes fluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern derefter alle forældrefluer fra hvert hætteglas. Hold derefter hætteglassene ved 26 °C i mindst 14 dage. I løbet af denne tid, indsamle 8-10 kvindelige jomfruer fra homozygot firefly luciferase-målretning gRNA linje. Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker.
    4. Overhold trin 1 cross hætteglas hver dag for at se, om nogen ny voksen flyve kommer ud af pupper. Hvis ja, bedøve dem med kuldioxid, indsamle 5 mandlige fluer udtrykker både Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og dual-luciferase reporter fra progenies og sætte dem ind i et nyt hætteglas sammen med 10 jomfru hunner fra firefly luciferase-målretning gRNA linje (herefter kaldet Step 2 Cross). Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker.
    5. Saml en anden 5 en-dags gammel mand, der udtrykker både Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og den dobbelte luciferase reporter fra Trin 1 Cross hætteglas og inkubere dem i 2 - 4 dage ved 26 °C. Overfør dem derefter til 1,5 mL centrifugerør og opbevar dem ved -80 °C. Gentag dette trin 3 gange for tre replikeringer.
    6. Bag trin 2-krydsglasset, der indeholder forældrenes fluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern derefter alle forældrefluer fra hvert hætteglas. Hold derefter hætteglassene ved 26 °C i mindst 20 dage.
    7. Overhold trin 2 cross hætteglas hver dag for at se, om der opstod nye voksne afkom fra pupper. Hvis det er tilfældet, bedøve dem med kuldioxid, score de bedøvede fluers fænotyper og billede dem ved hjælp af farvekamera udstyret med et fluorescerende stereomikroskop. Tæl antallet af afkom med forskellige fænotyper. Brug billedbehandlingssoftware til billedbehandling og kompilering (Figur 3B – 3C).
      BEMÆRK: Mendelian genetik tyder på, at hvis fluer alle er levedygtige, forventes 4 typer fluer blandt afkomene fra Trin 2 Cross, der hver tegner sig for 25% af befolkningen (figur 1B og figur 3A).
  5. Luciferase assay (Figur 3D)
    1. Generer de tredobbelte transheterozygous fluer samt kontrol fluer ved at gentage trin 2.4.1-2.4.5. Saml mandlige fluer ved fødslen og alder dem indtil 3 dage gamle.
    2. Overfør de 3-dages gamle fluer i 1,5 mL centrifugerør og lys dem ved hjælp af en støder og luciferase lysis buffer af kommercielt tilgængelige luciferase assay kit.
    3. Brug 5 μL lysvæv fra hver prøve til at måle både firefly og renilla luciferase aktivitet ved hjælp af kommercielt tilgængelige luciferase assay kit og luminometer.

3. Vævsspecifik in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med tre komponenter

  1. Generering af UASt-CasRx og UASt-dCasRx Expression Vector
    1. PCR forstærker UASt promotorsekvensen ved hjælp af plasmid pJFRC81 og primere 1041.C9 og 1041.C11; derefter forstærker PCR CasRx fragment ved hjælp af plasmid OA-1050E (Addgene ID # 132416) og primere 1050L. C1 og 1050E. C4; og derefter pcr forstærke dCasRx fragmenter ved hjælp af plasmid OA-1050R (Addgene ID # 132417) og primere 1050L. C1 og 1050E. C4 (tabel 1)26. Gel-rense den forstærkede UASt promotor sekvens, CasRx, og dCasRx fragmenter ved hjælp af gel rensning kit.
    2. Digest base vektor (Addgene plasmid # 112686) med begrænsning enzymer NotI og PacI24. I de resulterende produkter renser gel-det større fragment, som kaldes basisvektorens rygrad, ved hjælp af gelrensningssæt.
    3. Saml UASt-CasRx-vektoren med basisvektorens rygrad, UASt-promotorsekvensen og CasRx-fragmentet ved hjælp af Gibson-samlingen. derefter samle UASt-dCasRx vektor med basen vektor rygrad, UASt promotor sekvens, og dCasRx fragment ved hjælp af Gibson samling metode25.
      BEMÆRK: UASt-CasRx vektoren er Addgene plasmid #132418, og UASt-dCasRx vektoren er Addgene plasmid #132419
  2. Generering af transgene fluer
    1. Indsprøjt UASt-CasRx vektor i flyve embryoner ved hjælp af flyve embryo injektion service og embryoner fra fluer ØC31 integration site 8621 på deres 2nd kromosomer; derefter injicere UASt-dCasRx vektor i flyve embryoner ved hjælp af flyve embryo injektion service og embryoner fra fluer ØC31 integration site 8621 på deres 2nd kromosomer. Bag de injicerede embryoner ved 26 °C.
    2. Hold fluerne som dobbelt afbalancerede heterozygode linjer med CyO og Sb markører. BEMÆRK: Id'erne for flyvelinjerne i BDSC er 84121 (UASt-CasRx) og 84120 (UASt-dCasRx).
  3. Fluegenetik (Figur 1C)
    1. Bestil ønskede GAL4-linjer fra BDSC; Opnå relevante gRNA-linjer fra trin 3.2.2 (eller fra BDSC).
      BEMÆRK: Følgende 2 GAL4 fluer fra BDSC blev brugt: GAL4-GMR (BDSC ID: # 29967), GAL4-y (BDSC ID: # 44373). De samme 3 gRNA linjer genereret i det første afsnit blev brugt: gRNAw (BDSC ID: # 84124), gRNAN (BDSC ID # 84122), gRNAy (BDSC ID: # 84123).
    2. Saml 5-10 jomfru voksne kvindelige fluer fra gRNA linje. Saml 2-4 voksne mandlige fluer fra den dobbelt afbalancerede heterozygot UASt-CasRx/CyO; +/TM6, Sb linje, der viser hvidøjede, krøllede vinger, og dsRed fluorescens samtidigt. Sæt de indsamlede kvindelige og mandlige fluer, som er forældrenes fluer, i et almindeligt madglas (i det følgende kaldet Trin 1 Cross). Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker. Brug UASt-dCasRx/CyO til kontrolgruppen. +/TM6, Sb linje og samtidig holde alt andet det samme.
    3. Bag trin 1-krydsglasset, der indeholder forældrenes fluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern derefter alle forældrefluer fra hvert hætteglas. Hold derefter hætteglassene ved 26 °C i mindst 14 dage. I løbet af denne tid skal du samle 5-10 kvindelige jomfruer fra GAL4-linjen. Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker.
    4. Overhold trin 1 cross hætteglas hver dag for at se, om nogen ny voksen flyve kommer ud af pupper. Hvis ja, bedøve dem med kuldioxid, indsamle 2-4 mandlige fluer udtrykker både UASt-CasRx (eller UASt-dCasRx) og gRNA vektor fra progenies, som samtidig har dsRed-fluorescerende og stub phenotyper. Sæt de indsamlede hanner fra Trin 1 Cross i et nyt hætteglas sammen med 5-10 indsamlede jomfrukvinde fra GAL4-linjen (herefter kaldet Trin 2 Cross). Gentag dette trin 3 gange for 3 repliker.
    5. Bag trin 2-krydsglasset, der indeholder forældrenes fluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern derefter alle forældrefluer fra hvert hætteglas. Hold derefter hætteglassene ved 26 °C i mindst 20 dage.
    6. Overhold trin 2 cross hætteglas hver dag for at se, om nogen nye voksne flyver emergs fra pupper. Hvis det er tilfældet, bedøve dem med kuldioxid, score de bedøvede fluers fænotyper og billede dem ved hjælp af farvekamera udstyret med et fluorescerende stereomikroskop. Tæl antallet af afkom med forskellige fænotyper. Brug billedbehandlingssoftware til billedbehandling og kompilering (figur 4).
      BEMÆRK: Mendelian genetik tyder på, at hvis fluer alle er levedygtige, forventes 4 typer fluer blandt afkomene fra Trin 2 Cross, der hver tegner sig for 25% af befolkningen (Figur 1C).

Representative Results

Allestedsnærværende in vivo RNA målretning ved hjælp af en to-komponent CasRx System
F1 transheterozygous fluer udtrykker både Ubiq-CasRx og gRNA (rettet mod både endogene og udefrakommende gener) konstruktioner viste markante fænotyper i forhold til kontrol fluer udtrykker Ubiq-dCasRx og gRNA konstruktioner (Figur 2 og figur 4). Specifikt har de transheterozygous CasRx fluer betydeligt lavere overlevelsesrate sammenlignet med de transheterozgyous dCasRx fluer, hvilket indikerer toksiciteten af Ubiq-CasRx-systemet (Figur 2A og figur 4A). Det er værd at bemærke, at både transheterozygous CasRx og dCasRx fluer har mindre end 50% arv sats, som er det forventede forhold baseret på Mendelian genetik. Af de tre målgener, Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ fluer og Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ fluer er ikke-levedygtige (0% arv) og voksede ikke ud over det andet instar larverstadie (Figur 2A-2B). Den overlevende Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ fluer, hvis arv var 12,9%, viste en tydelig fuldt penetrant hvidøjet fænotype (figur 2B). Ud over observerbare træk forbundet med CasRx var vi i stand til at bekræfte signifikant reduktion af målgenudskrifter for 3 målgener: Hak, gul og GFP (Figur 2E-2G). Reduktion af hvide genudskrifter blev observeret i Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ fluer sammenlignet med kontrollen Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ fluer, selvom reduktionen ikke var statistisk signifikant (Figur 2E - 2F). Der blev fundet tegn på off-target-aktivitet forårsaget af CasRx, når man sammenlignede de forskelligt udtrykte udskrifter mellem prøver fra CasRx-udtrykkende fluer og prøver fra dCasRx-udtrykkende fluer (Figur 2E, 2G). Antallet af ikke-mål udskrifter betydeligt differentieret udtrykt er som følger: hvid, 253 (1,4% af de samlede udskrifter); Hak, 300 (1,7%); gul, 41 (0,23%); GFP, 5.880 (33%) (Figur2G). Ud af de i alt 17.779 forskellige udskrifter blev 6 ikke-måludskrifter signifikant differentieret udtrykt i alle 4 grupper af prøver. En af de 6 udskrifter identificeret var Gadd45, et gen involveret i apoptose og cellulær anholdelse i fluer, hvilket øger muligheden for, at den enzymatiske virkning af CasRx enten direkte kan udløse cellulær apoptose eller indirekte udløse misekspression af andre gener, hvilket igen fører til apoptose. Endelig er det værd at bemærke, at fluerne Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx ikke blev etableret som homozygote bestande, formodentlig på grund af toksicitet, der var tillagt ved højt allestedsnærværende udtryk. Som følge heraf blev heterozygoe Ubiq-CasRx/CyO og Ubiq-dCasRx/CyO fluer brugt til krydsning med homozygoe gRNA flyvelinjer. Alt i alt er det tokomponentiske Ubiq-CasRx-system i stand til at opnå allestedsnærværende RNA-målretning for både endogene og eksogene mål, hvilket resulterer i observerbare fænotyper og udskriftsreduktion. Disse resultater viste også, at CasRx-medieret RNA-målretning kan indføre toksicitet in vivo.

Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretning ved hjælp af en tre-komponent CasRx System
Resultaterne fra totrinskrydset viste, at på trods af målgenets udefrakommende karakter (dvs. Fluc), der udtrykker alle tre transgener i F2 triple transheterozygotes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resulterede i 100% dødelighed sammenlignet med kontrolkryds, der involverede Ubiq-dCasRx, hvor der ikke blev observeret dødelighed i F2 triple transheterozygotes (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (Figur 3B-C ). Mere specifikt resulterede kun kombinationen af alle tre transgener (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) i 100% dødelighed (figur 3B og D), mens (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) og (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) genotyper var levedygtige og manglede fænotyper med deres arveprocenter, der matchede de forventede mendlianske transmissionshastigheder, hvilket tyder på, at tilgængeligheden af målsekvensen (dvs. firefly luciferase) i kombination med Ubiq-CasRx/+ og gRNAFluc er det, der resulterede i de observerede dødelighedsfænotyper, der formodentlig stammer fra Cas13-enzymernes indirekte aktivitet2,8 . Hertil kommer, at ingen skelnes fænotyper eller dramatisk indflydelse på arv i F1 transheterozygotes (Ubiq-CasRx /+; gRNAFluc /+ eller Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) blev observeret sammenlignet med Ubiq-dCasRx-kontroller (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ eller Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Figur 3B), hvilket indikerer, at et katalytisk aktivt enzym er afgørende for at opnå de observerede dødelighedsfænotyper. Desuden viste Fluc og Rluc udtryksniveauer i fluer af alle levedygtige genotyper ikke signifikant reduktion i Fluc-ekspressionen i Ubiq-dCasRx triple transheterozygotes (Ubiq-dCasRx /+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) sammenlignet med dobbelt luciferase reporter kontrol. Dette tyder på, at Fluc protein ekspression niveauer ikke blev reduceret ved dCasRx målretning (Figur 3D). Tilsammen viser den fælles dødelighedsfænotype i de to forskellige CasRx-medierede allestedsnærværende RNA-målretningsforsøg, at når de anvendes på væv allestedsnærværende, kan CasRx-medieret RNA-målretning være giftig for organismen.

Vævsspecifik in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med tre komponenter
Det høje toksicitetsniveau, der blev observeret i allestedsnærværende RNA-målretningsforsøg, fik os til at udforske den vævsspecifikke RNA-målretning ved hjælp af et trekomponent CasRx-systemdesign, der er beskrevet i metodeafsnittet. Faktisk blev det observerede toksicitetsniveau reduceret, da det samlede CasRx-udtryk blev sænket ved hjælp af UASt-promotoren sammenlignet med Ubiq-promotorens, dette eksemplificeret i tre aspekter: 1) UASt-CasRx- og UASt-dCasRx-linjerne blev opretholdt som homozygote linjer, men baseret på totrins krydsordningen blev dobbeltbalanceret UASt-CasRx og UASt-dCasRx-linjerne brugt til at udføre krydsningerne, 2) alle F2 generation dCasRx tredobbelt transheterozygous arv satser matchede den forventede 25% Mendelian arv sats, og 3) F2 generation CasRx tredobbelt transheterozygous dødelighed fænotype blev moderat reduceret. I det hvide målretningseksperiment blev der kun observeret 0,57 % levedygtige voksne fluer (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4), som alle udviste alvorlig øjenspecifik pigmentering og morfologifænotyper (figur 4A og 4B). For den hvide målretning kryds, casRx-udtrykke tredobbelt transheterozygous F2 arveprocent var betydeligt lavere end for dCasRx-udtrykke tredobbelt transheterozygous kontrolgruppe (27,6%) (Figur 4A). I Notch-målretningseksperimentet var CasRx-udtrykkende tredobbelt tranheterozygous, der transporterede alle tre transgener, 100% dødelige, mens dCasRx-kontrolarven var 29,3% (figur 4A). I den gule målretning eksperiment, F2 tredobbelt transheterozygous CasRx-udtrykke, gRNAy, og y-GAL4 viste marginal chitin pigment reduktion som små pletter af gul kutikula på brystkassen og maven med en arv på 2,67%, meget lavere end for dCasRx kontrolgruppe (25,2%) (Figur4A ). Alle dCasRx kontrol tredobbelt transheterozygous fluer ikke præsentere indlysende fænotyper som CasRx-udtrykkende fluer, hvilket indikerer, at katalytisk aktivitet CasRx bidraget til de observerede fænotyper. Den lave arveprocent i CasRx triple transheterozygous-gruppen antydede, at der findes to kilder til toksicitet i CasRx RNA-målretning: den ene er forbundet med et højt udtryk for CasRx, hvis toksicitet blev reduceret ved restriktivt CasRx-udtryk, den anden er forbundet med sikkerhedsaktiviteten. Samlet set viste disse resultater, at CasRx-systemet kan opnå vævsspecifik in vivo RNA-målretning ved at udnytte det klassiske Gal4/UASt-system og i mellemtiden reducere toksiciteten. Toksicitet og lejlighedsvis dødelighed fænotyper blev dog stadig observeret på et lavere niveau af sværhedsgrad i forhold til de allestedsnærværende tilgange, hvilket tyder på, at sikkerhedsstillelse kavalergang aktivitet er forbundet med toksicitet.

Figure 1
Figur 1: Generel oversigt over RNA-målretning ved hjælp af et Cas13D-system. (A) Skemaer over det et-trins genetiske kors i den allestedsnærværende in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med to komponenter. (B) Skemaer af en to-trins genetisk kors i allestedsnærværende in vivo eksogene RNA målretning ved hjælp af tre-komponent CasRx system. (C) Skemaer af et to-trins genetisk kryds i det vævsspecifikke in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med tre komponenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Allestedsnærværende in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med to komponenter (genoptrykt5). (A) Samlet arveprocent af transheterozygous fluer, der arver Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og gRNAs. Blå skygge i kasseplottet angiver fænotypepenetrance. (B) Fænotyper af transheterozygous fluer. Pile indikerer vævsnekrose i øjet. Sort-hvid flue markeret med ''X'' repræsenterer dødelighed. (C) Samlet arveprocent af transheterozygous fluer af tovejskryds mellem Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og gRNAGFP-OpIE2-GFP fluer. M, moderarv af CasRx; P, Faderlig arv af CasRx. (D) F1 larver afkom i faderkorset. (E) Udskrifter 'maksimum en posteriori skøn for logaritmisk fold forandring. DESeq2-rørledningen blev anvendt. (F) Udskrifter pr. million (TPM), der er målrettet casRx eller dCasRx. (G) CasRx-depentent differentieret udtrykt udskrift procentdel af udskrifter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretning ved hjælp af en tre-komponent CasRx system. (A) Skemaer af de to-trins genetiske kors. (B) Samlet arveprocenter for alle genotyper, der opstår i F2-generationen . Nedarvning af alle tre transgener (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc og gRNAFLuc) i F2-afkom resulterede i 100% dødelighed og var betydeligt lavere sammenlignet med Ubiq-dCasRx triple transheterozygotes kontrolgruppe (p = 0,001, t-test). (C) Alene at transportere Ubiq-CasRx/gRNAFluc alene eller Ubiq-CasRx og Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc førte ikke til alvorlig dødelighed, og arveforholdet mellem henholdsvis Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx transheterozygotes var ikke signifikant forskellige (p = 0,41 og p = 0,51, henholdsvis t-test). (D) Luciferase nøgletal normalisere Fluc aflæsninger til Rluc aflæsninger. Triple transheterozygous fluer udtrykker Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc var embryonale dødelige, som var repræsenteret af en flue med et "X", og som følge heraf luciferase udtryk blev ikke målt. Fluc/Rluc-forholdet mellem Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygotes var betydeligt lavere end for de andre Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-udtrykkende grupper (p = 1,2e-06 eller lavere, t-test). Resultaterne fra gRNAFLuc-gruppen var signifikant lavere end for alle andre grupper (p = 1,2e-06 eller lavere t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Vævsspecifik in vivo RNA-målretning ved hjælp af et casRx-system med tre komponenter (genoptrykt5). (A) Samlet arveprocent af tredobbelte transheterozygous fluer med tre transgener (UASt-CasRx eller UASt-dCasRx, gRNAs og Gal4-driver. (B) Fænotyper af de tredobbelte transheterozygous fluer. Den hvide pil angiver chitin pigment reduktion i brystkassen. Sort-hvid flue markeret med ''X'' repræsenterer dødelighed. Klik her for at se en større version af dette tal.

Konstruere Beskrivelse Primer PrimerSekvens (5' til 3') PCR-skabelon
OA-1050E CasRx 1050E. C3 TACTAATTTTCCAC
ATCTCTATTTTGAC
CCGCAGATTAATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		 pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)
1050E. C4 CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTGG
AACA
OA-1050R dCasRx 1050E. C3 TACTAATTTTCCAC
ATCTCTATTTTGAC
CCGCAGATTAATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		 pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)
1050E. C4 CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTG
GAACA
OA-1050L UASt promotor 1041.C9 GCGGGTTCTCGA
CGGTCACGGCGG
GCATGTCGACGCC
GGCCGCAACCAA
CAACACTAG		 pJFRC81
1041.C11 CTGGCCTCCACC
TTTCTCTTCTTCTTCTTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
TGGGGCTCATGT
TTAAACCCAATT
FKSSCTATTCAGA
CasRx 1050L. C1 AATACAAGAAGA
GAACTCTGAATA
GGGAATTGGGT
TTAAACATGAGC
CCCAAGAAGAA		 pCasRx
1050E. C4 CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTCTA
GCTAGCTTAAG
CGTAATCTGGA
ACA
OA-1050'erne UASt promotor 1041.C9 GCGGGTTCTC
GACGGTCACG
GCGGGCATGT
CGACGCGGCC
GCAACCAACAA
CACTAGTAG		 pJFRC81
1041.C11 CTGGCCTCCA
CCTTTCTCTTC
TTCTTGGGGCT
CATGTTTAAAC
CCAATTCCCTA
TTCAGA
dCasRx 1050L. C1 AATACAAGAAG
AGAACTCTGAAT
AGGGAATTGGG
TTTAAACATGAG
CCCCAAGAAGAA		 pdCasRx
1050E. C4 CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTCTAG
CTAGCTTAAGCG
TAATCTGGAACA
OA-1043 U6:3 promotor 1043.C1 GGGAATTGGGA
ATTGGGCAATAT
TTAAATGGCGGC
GCGCCGAATTCT
TTTTTGCTCACCT		 Addgene plasmid #164586
1043.C23 ACACTAGTGGAT
CTCTAGAGGTAC
CGTTGCGGCCG
CAAAAAAGTTGT
AATAGCCCCTCA
AAACTGGACCTT
CCACAACTGCAG
CCGACGTTAAAT
TGAAA
OA-1052B Ubiq promotor 1052B. C1 GGGAATTGGGCA
ATATTTAAATGGC
GGCTGCAGCGCCC
GCAGATCGCCGAT		 Addgene plasmid #112686
1052B. C2 TTTCTTTATGTTT
TTGGCGTCTTCC
ATCCTAGGTCTG
CGGGTCAAAATA
GAGATG
T2A-eGFP 908A1 ATAAAGGCCAAG
AAGGGCGGAAA
GATCGCCGTGG
AGGGCAGAGGA
AGTCTTCTAACAT
GC		 Addgene plasmid #112686
908A2 TTGTTATTTTAAAA
ACGATTCATTCTA
GGCGATCGCTTA
CTTGTACAGCTC
GTCCATGCC
Omvendt Ubiq promotor 908A3 ACCGTGACCTAC
ATCGTCGACACTA
GTGGATCTCTAGA
CGCGCAGATCGC
CGATG		 Addgene plasmid #112686
908A4 GGATCATAAACTT
TCGAAGTCATGC
GGCCGCTCTGCG
GGTCAAAATAGAG
ATGT

Tabel 1: Liste over molekylær konstruktion og primere, der anvendes i denne undersøgelse. Denne liste indeholder alle konstruktioner (både id og beskrivelse) og hver konstruktions tilknyttede primere (både id'et og sekvenserne (5' til 3')) og de anvendte skabeloner.

Discussion

Med tre forskellige applikationsdesign af CasRx-systemet demonstrerede dette arbejde in vivoprogrammable RNA-målretning i fluer. De forskellige strategier imødekommer forskellige projektbehov, såsom endogene versus udefrakommende genmålretning og allestedsnærværende versus vævsspecifik RNA-målretning. Virkningerne af RNA målretning omfattede mål gen specifikke fænotypiske ændringer, mål RNA udskrift reduktion, og lejlighedsvis dødelighed fænotyper forbundet med højt udtryk for CasRx protein og sikkerhedsstillelse aktivitet. Samlet set viste disse resultater, at CasRx-systemet er i stand til at målrette RNA-udskriftsreduktion på organismeniveau på en programmerbar og effektiv måde.

En af de vigtigste faktorer i en vellykket tilpasning af CasRx-systemet er designet af gRNAs. Specifikt skal følgende råd tages i agt: Målsekvensen er omkring 30 nukleotider i længden, længden af poly-U-strækninger i målsekvensen er 4 basispar eller mindre, målsekvensens GC-indhold ligger i intervallet 30% - 70%, målsekvensen forventes ikke at danne stærke RNA-hårnålstrukturer, og målsekvensen indeholder minimal forudsagt RNA-sekundær eller tertiær struktur5.

Ud over gRNA-designene er flyvegenetiktrinnet i hver protokol også afgørende for en vellykket implementering. Tilstedeværelsen eller manglen på de definerede fænotyper, der er gået ned fra forældrene i afkomene, er vigtige for at identificere og kvantificere fænotyper forårsaget af CasRx-systemet i de transheterozygous afkom. Også, opsætning af kontrol kors ved hjælp af dCasRx fluer parallelt er også nyttige i at udelukke ikke-specifikke fænotyper i transheterozygous afkom.

Det er værd at bemærke, at disse resultater afslørede toksicitet spørgsmål indført ved allestedsnærværende udtrykke CasRx og dCasRx protein i farten, en begrænsning af CasRx system. Allestedsnærværende udtryk for CasRx eller dCasRx under Ubiq promotor alene, uden gRNAs, kom med nontrivial fitness omkostninger, som hverken Ubiq-CasRx eller Ubiq-dCasRx fluer kunne etableres som homozygot linjer. Tværtimod kan UASt-CasRx- og UASt-dCasRx-fluer etableres som sunde homozygoøse bestande, selv om de på grund af udformningen af krydsordningen blev holdt som dobbelt afbalancerede bestande, et faktum, der understøtter eksistensen af toksicitet forårsaget af allestedsnærværende CasRx-proteinudtryk. Et andet bevis er, at i kontrolforsøg, der involverer dCasRx, som er katalytisk inaktiv, var procentdelen af fluer, der bærer både dCasRx og gRNA-konstruktioner ud af det samlede antal fluer i F1-generationen, konsekvent lavere end 50%, det forhold, der forventes baseret på mendelian genetik, hvis der ikke var nogen dCasRx-associeret toksicitet til stede. Dette indikerede, at allestedsnærværende udtryk dCasRx, sammen med gRNAs, fremkalder toksicitet i farten, hvilket resulterer mindre end forventet arveforhold. Arveforholdet for transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 fluer fulgte Mendelian genetik, hvilket igen tyder på toksicitet induceret specifikt ved allestedsnærværende udtryk for CasRx og dCasRx proteiner. Toksicitet i CRISPR/Cas-systemet er ikke nyt. Store mængder Cas9 protein har vist sig at være giftige i flere organismer, herunder fluer29,30,31,32. En nylig undersøgelse har udviklet et tilpasset GAL4 /UAS-system, der kan tune mængden af Cas9-protein udtrykt i fluer ved at tilføje en åben læseramme af varierende længde mellem UAS-sekvensen og Cas9-sekvensen i UAS-Cas9-konstruktionen33. Derfor er det værd at udforske måder at reducere CasRx-induceret toksicitet ved tuning Af CasRx protein udtryk niveau.

Bortset fra toksiciteten forårsaget af allestedsnærværende udtryk for CasRx og dCasRx proteiner, resultaterne viste også dødelighed forbundet med CasRx systemets ikke-specifikke sikkerhedsstillelse off-target effekter, en funktion af mange CRISPR-systemer1,2,7,34. I nogle af de CasRx og ikke-væsentlige gen gRNA-udtrykke dobbelt eller tredobbelt transheterozygous fluer, for eksempel når rettet mod Hak, transheterozygous CasRx fluer har betydeligt lavere niveauer af overlevelsesrate i forhold til transheterozgyous dCasRx fluer. I RNA-seq-analysen af disse CasRx- og gRNA-udtrykkende transheterozygous fluer blev der observeret både reduktion af målgenudskriftsniveauer og reduktionen af ikke-målgeneudskrifter. Disse følgevirkninger var CasRx-afhængige og målafhængige, da de kun blev observeret i transheterozygous fluer, der udtrykte både CasRx-proteinet og gRNA'et. Det er værd at påpege, at et af målgener, hvid, kun viste en begrænset, ikke-statistisk signifikant reduktion i udskrifter, da det hvide gen blev målrettet af CasRx, hvilket var i modsætning til den klare pigmentreduktionsfænotype. Det er en hypotese, at dette kan skyldes, at 1) timingen af RNA-seq prøveindsamling ikke var godt afstemt med timingen, når det hvide gen når sit højeste udtryk under tidlig udvikling, og 2) det lokaliserede udtryk for det hvide gen i øjnene gør det udfordrende at indsamle de relevante væv i den tidlige udviklingsfase, når kun helkropsprøveindsamling er mulig. For at reducere aktiviteten af sikkerhedsstillelse i CasRx-systemet er der brug for fremtidige undersøgelser for fuldt ud at forstå de mekanismer, der ligger til grund for fænomensystemet uden for målgruppen på organismeniveau.

Interessant, en nylig undersøgelse35 beskriver RNA-målretning Cas13 værktøjer i fluer syntes at forbedre den generelle toksicitet forbundet med CasRx udtryk, for flere mulige årsager. For det første omkodede forfatterne Cas13 transgenes for at optimere udtrykket i Drosophila og udnyttede en mere svagt udtrykkende promotor (actin 5C) sammenlignet med den allestedsnærværende promotor, der anvendes i denne undersøgelse, hvilket sandsynligvis fører til lavere niveauer af Cas13-udtryk og dermed mindre toksicitet. Dette understøttes faktisk af bemærkningerne om, at UASt-drevet CasRx- og dCasRx-udtryk ikke i sig selv var giftigt, da denne undersøgelse (og forfatterne i 35) ikke observerede nogen åbenlys dødelighed i UASt-CasRx-fluer. Desuden kodede disse forfattere deres gRNAs forskelligt sammenlignet med denne undersøgelse, som kan have påvirket deres udtryk og reduceret toksiciteten af systemet i transheterozygous Cas13/gRNA fluer. For eksempel blev to GRNAs i deres undersøgelse udtrykt ved hjælp af U6:3-promotoren og flankeret af tRNAs for at muliggøre gRNA-behandling ved tRNA-modning uden at kræve CasRx35. Omvendt blev gRNAs kodet som arrays rettet mod op til 4 steder pr. gen og efterlignede den endogene Cas13 arraystruktur, der findes i bakterier, hvilket kræver, at Cas13-enzymet behandler hvert gRNA. Disse forskellige tilgange kan have ført til forskelle i gRNA-udtryksniveauer og andre faktorer, der kan have iboende virkninger på hele systemets toksicitet. Endelig var Huynh et al. målrettet mod forskellige gener end dem, der er rettet mod i denne undersøgelse, hvilket resulterer i forskelle i interaktion mellem mål-Cas og gRNA og følgeaktivitet og kan have virkninger på de observerede niveauer af dødelighed. Disse forskelle i observeret toksicitet berettiger yderligere undersøgelser for at identificere, hvordan de samlede systemer kan forbedres.

Samlet set er denne undersøgelse den første demonstration af en funktionel genetisk kodet programmerbar RNA-målretning Cas system i D. melanogaster, omend yderligere optimering af CasRx system (i overensstemmelse med, hvad der er rapporteret35) vil være forpligtet til yderligere at reducere off-target-associeret dødelighed og øge effekten af CasRx on-target kavalergang. RNA-målretning med Cas enzymer er et hurtigt udviklende felt med mange potentielle applikationer lige fra insektvektorkontrol til terapeutisk brug1,2,3,4,5,6,7, og denne protokol tilbyder en startpakke til alle, der er interesseret i at designe deres første CasRx-system i fluer, samtidig med at de er kompatible med tilpasning og yderligere optimering af systemet. De eksempler, der præsenteres her, viser en række resultater, man kan støde på under gennemførelsen af dette system in vivo og kan tjene som benchmarks for andre brugere i evalueringen af CasRx-systemets ydeevne i deres applikationer.

Disclosures

O.S.A er grundlægger af Agragene, Inc., har en egenkapital interesse, og tjener på selskabets Videnskabelige Advisory Board. Vilkårene i denne ordning er blevet gennemgået og godkendt af University of California, San Diego i overensstemmelse med sin interessekonflikt politikker. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af finansiering fra et DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) og NIH-priser (R21RAI149161A, DP2AI152071), der blev tildelt O.S.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Grape Juice Welch Foods Inc. N/A
Active Dry Yeast (908g) Red Star Yeast Company, LLC N/A
DMC4500 color camera Leica Microsystems DMC4500
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
GAL4-GMR flies Bloomington Drosophila Stock Center 29967
GAL4-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 44373
Glomax 20/20 Luminometer Promega E5331
Illumina HiSeq2500 Sequencer Illumina, Inc. HiSeq2500
M165FC fluorescent stereomicroscope Leica Microsystems M165FC
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer ThermoFisher NDONEC-W
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit New England Biolabs, Inc. E7770
plasmid # 112686 Addgene 112686
plasmid # 112688 Addgene 112688
plasmid # 132416 Addgene 132416
plasmid # 132417 Addgene 132417
plasmid # 132419 Addgene 132419
plasmid # 132420 Addgene 132420
plasmid # 132421 Addgene 132421
plasmid # 132422 Addgene 132422
plasmid # 132425 Addgene 132425
plasmid # 132426 Addgene 132426
plasmid # 133304 Addgene 133304
plasmid # 164586 Addgene 164586
plasmid #132418 Addgene 132418
plasmid pJFRC81 Addgene 36432
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Restriction endonucleases AscI New England Biolabs Inc. R0558L
Restriction endonucleases NotI New England Biolabs Inc. R0189L
Restriction endonucleases PacI New England Biolabs Inc. R0547L
Restriction endonucleases PstI New England Biolabs Inc. R0140L
Restriction endonucleases SwaI New England Biolabs Inc. R0604L
Restriction endonucleases XbaI New England Biolabs Inc. R0145L
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer Agilent Technologies 5067-1513
Turbo DNase Invitrogen AM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc flies Bloomington Drosophila Stock Center 84125
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies Bloomington Drosophila Stock Center 84986
U6-3:4-gRNA-N flies Bloomington Drosophila Stock Center 84122
U6-3:4-gRNA-w flies Bloomington Drosophila Stock Center 84124
U6-3:4-gRNA-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 84123
UASt-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84121
UASt-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84120
Ubiq-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84118
Ubiq-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies Bloomington Drosophila Stock Center 84127
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits Zymo Research Corporation D4007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Communications. 9, 1911 (2018).
  2. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), 5573 (2016).
  3. East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes. Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).
  4. Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 173 (3), 665-676 (2018).
  5. Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies. The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).
  6. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  7. Abudayyeh, O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550, 280-284 (2017).
  8. Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. In vivo RNAi: today and tomorrow. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).
  9. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
  10. Ni, J., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  11. Ni, J., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature Methods. 8, 405-407 (2011).
  12. Ni, J., et al. Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5, 49-51 (2008).
  13. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).
  14. Kulkarni, M., et al. Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays. Nature Methods. 3, 833-838 (2006).
  15. Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens. Nature. 443, 359-363 (2006).
  16. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila. Fly. 1 (1), 1-5 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).
  18. Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).
  19. Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).
  20. Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).
  21. Franz, A., et al. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).
  22. Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti. Communications Biology. 1, 11 (2018).
  23. Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  24. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/ (2020).
  25. Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr/ (2020).
  27. Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL (2020).
  28. Dobin, A., et al. STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  29. Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).
  30. Poe, A., et al. Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila. Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).
  31. Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  32. Yang, S., Li, S., Li, X. Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).
  33. Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. eLife. 9, 53865 (2020).
  34. Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).
  35. Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. Genome Biology. 21, 279 (2020).

Tags

Immunologi og infektion Problem 168 CRISPR Cas enzym Ribonuclease CasRx Drosophila melanogaster allestedsnærværende RNA målretning vævsspecifik RNA målretning
Allestedsnærværende og vævsspecifik RNA-målretning i <em>Drosophila Melanogaster</em> ved hjælp af CRISPR/CasRx
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, R., Brogan, D., Buchman, A.,… More

Sun, R., Brogan, D., Buchman, A., Yang, T., Akbari, O. S. Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx. J. Vis. Exp. (168), e62154, doi:10.3791/62154 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter