Summary
Qui descriviamo un protocollo per la coltivazione sistematica di sferoidi epidermici in coltura di sospensione 3D. Questo protocollo ha applicazioni ad ampio raggio per l'uso in una varietà di tipi di tessuto epiteliale e per la modellazione di diverse malattie e condizioni umane.
Abstract
La disregolazione epiteliale è un nodo per una varietà di condizioni e disturbi umani, tra cui ferite croniche, infiammazione e oltre l'80% di tutti i tumori umani. Come tessuto di rivestimento, l'epitelio cutaneo è spesso soggetto a lesioni e si è adattato evolutivamente acquisendo la plasticità cellulare necessaria per riparare il tessuto danneggiato. Nel corso degli anni, sono stati fatti diversi sforzi per studiare la plasticità epiteliale utilizzando modelli cellulari in vitro ed ex vivo. Tuttavia, questi sforzi sono stati limitati nella loro capacità di ricapitolare le varie fasi della plasticità cellulare epiteliale. Descriviamo qui un protocollo per la generazione di sferoidi epidermici 3D e cellule derivate da sferoidi epidermici da cheratinociti umani neonatali primari. Questo protocollo delinea la capacità delle colture sferoidi epidermiche di modellare funzionalmente stadi distinti della plasticità generativa dei cheratinociti e dimostra che la ri-placcatura sferoide epidermica può arricchire colture eterogenee normali di cheratinociti umani (NHKc) per sottopopolazioni di integrinaα6hi/ EGFRlo cheratinociti con caratteristiche staminali migliorate. Il nostro rapporto descrive lo sviluppo e il mantenimento di un sistema ad alto rendimento per lo studio della plasticità dei cheratinociti cutanei e della rigenerazione epidermica.
Introduction
L'epitelio stratificato dei mammiferi è l'architettura epiteliale più complessa in tutti i sistemi viventi ed è più spesso soggetto a danni e lesioni. Come tessuto protettivo, l'epitelio stratificato si è evoluto per generare una risposta complessa ed efficace al danno tissutale. In caso di lesione, queste cellule devono attivare programmi di plasticità di lignaggio, che consentono loro di migrare verso il sito ferito ed eseguire la riparazione1,2,3. Questa risposta sfaccettata si verifica in diversi passaggi sequenziali che rimangono poco compresi.
Uno dei principali ostacoli nello studio dell'intricato processo di rigenerazione epiteliale risiede nella scarsità di sistemi modello ad alto rendimento in grado di catturare attività cellulari dinamiche in fasi definite della rigenerazione cellulare. Mentre i modelli murini in vivo offrono informazioni rilevanti sulla guarigione delle ferite e ricapitolano più da vicino il processo rigenerativo umano, il loro sviluppo richiede sforzi laboriosi e costi significativi, limitando la loro capacità di produzione. Esiste, quindi, una necessità critica di stabilire sistemi che consentano l'indagine funzionale della rigenerazione del tessuto epiteliale umano ad alta scala di produttività.
Negli ultimi anni, sono stati fatti diversi tentativi per affrontare la sfida della scalabilità. Ciò è visto attraverso una grande espansione di modelli innovativi in vitro ed ex vivo basati su cellule che imitano da vicino il contesto rigenerativo in vivo. Ciò include i progressi in organ-on-chip4, sferoide5, organoide6e colture organotipiche7. Questi sistemi 3D basati su celle offrono vantaggi unici e presentano limiti sperimentali distinti. Ad oggi, la coltura sferoidale rimane il modello di coltura cellulare 3D più economico e ampiamente utilizzato. E mentre diversi rapporti hanno indicato che le colture sferoidi possono essere utilizzate per studiare le caratteristiche delle cellule staminali della pelle, questi studi sono stati in gran parte condotti con tessuto animale8,9o con fibroblastidermici 10, con praticamente nessun rapporto che caratterizzi a fondo le proprietà rigenerative delle colture sferoidi epidermiche umane. In questo protocollo descriviamo in dettaglio lo sviluppo funzionale, la coltura e il mantenimento di colture sferoidi epidermiche da cheratinociti umani normali (NHKc). Descriviamo anche l'utilità di questo sistema per modellare le fasi sequenziali della rigenerazione epidermica e la plasticità delle cellule staminali dei cheratinociti in vitro.
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Protocol
Il protocollo per la raccolta e la manipolazione di campioni cutanei e l'isolamento dei cheratinociti umani è stato rivisto dall'IRB dell'Università della Carolina del Sud (UofSC) e classificato come "ricerca che non coinvolge soggetti umani", in quanto i campioni di prepuzio erano scarti chirurgici prodotti durante le procedure chirurgiche di routine (circoncisione di ragazzi neonati) ed erano completamente privi di informazioni identificative. Il protocollo è stato anche rivisto e approvato dal Comitato per la biosicurezza dell'UofSC su base regolare e tutto il personale di laboratorio è stato sottoposto a formazione sulla biosicurezza del laboratorio. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con gli standard di sicurezza ed etici di UofSC.
1. Isolamento e coltura di cheratinociti umani dal tessuto del prepuzio neonatale
- Preparare il mezzo di lavaggio aggiungendo il tampone HEPES da 0,1 M a 500 ml di mezzo KSFM e regolarlo a un pH di 7,2. Sterilizzare il mezzo in un filtro a vuoto da 500 mL (dimensione dei pori di 0,22 μm). Il mezzo basale MCDB 153-LB può anche essere utilizzato come soluzione di lavaggio alternativa al posto di KSFM.
- In una cappa a flusso laminare, lavare il prepuzio neonatale con 5 ml di mezzi di lavaggio in un tubo conico da 50 ml. Ripeti due volte.
- Trasferire il prepuzio lavato in una capsula di Petri sterile. Usando un bisturi e una pinze, raschiare via i tessuti connettivi adiposi e sciolti dallo strato dermico. Lavare il prepuzio con 5 mL di mezzi di lavaggio in un tubo conico da 50 mL.
- Posizionare l'epidermide del prepuzio con il lato in alto in una piastra a 6 pozzetti contenente 2 mL di enzima dispasi diluito in mezzi di lavaggio (50 U/ mL).
- Trasferire la piastra in un incubatore per 4 ore (37 °C, 5% CO2, 95% di umidità).
- Rimuovere il prepuzio dall'incubatrice e, in condizioni sterili, trasferirlo in una capsula di Petri. Usando una pinna a punta fine, separare l'epidermide dallo strato del derma.
- Posizionare l'epidermide in un tubo conico da 15 ml contenente 2 mL di tripsina-EDTA 0,25%. Utilizzando un pipetto sierologico da 5 ml, schiacciare meccanicamente l'epidermide galleggiante. Incubare per 15 min a 37 °C con vortice periodico per 5 s ogni 5 min.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di inibitore della tripsina di soia e mescolare mediante pipettaggio per neutralizzare la tripsina.
- Centrifugare in sospensione cellulare per 2 min a 450 x g,e poi per 8 min a 250 x g.
- Rimuovere i detriti galleggianti con una pinp, facendo attenzione a non rimuovere il pellet cellulare. Aspirare con cura il surnatante dal pellet cellulare.
- Resuspend pellet in 12 mL di mezzo completo KSFM-scm e piastra in un piatto da 10 cm. Incubata piatto durante la notte (37 °C, 5% CO2, 95% di umidità).
- Il giorno seguente, rimuovere il mezzo utilizzando una pipetta aspirante e sostituire con 12 mL di KSFM-scm completo. Ripetere i giorni 4 e 7.
- Per mantenere la crescita ottimale delle normali colture di cheratinociti umani (NHKc), le cellule di passaggio 1:5 il giorno 10 per evitare che le cellule raggiungano una confluenza superiore all'80%.
2. Generazione di colture di epidermosfera cutanea in vitro
- Preparare una miscela di acarosio al 5% aggiungendo 2,5 g di agarose a 50 ml di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), in una bottiglia di vetro da 50 mL. Bottiglia in autoclave sotto ciclo liquido. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
- Per preparare i piatti, posizionare la bottiglia di vetro raffreddata contenente soluzione di agarose in un becher di plastica da 1 L riempito con 200 ml di acqua deionizzata (dH2O). Sciogliere la miscela di agarosio in un forno a microonde di qualità di ricerca per un massimo di 2 minuti, mescolando l'agar ogni 60 s inclinando delicatamente la bottiglia da un lato all'altro.
ATTENZIONE: la fusione dell'agar nel microonde farà sì che il contenitore del pallone diventi estremamente caldo con conseguente accumulo di pressione. Accumulo di pressione di rilascio ogni 30 s. Indossare adeguati dispositivi di protezione per prevenire lesioni. - Aggiungere 3 mL di agarosio fuso al 5% a 12 mL di KSFM-scm preriscaldato a 42 °C per una concentrazione finale di agarosio all'1% (wt/vol).
Opzionale: preriscaldare le pipette sierologiche e le punte delle pipette per evitare la polimerizzazione prematura dell'agar morbido. - Pipettare rapidamente 200 μL della miscela di agar all'1% in singoli pozzetti di una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti utilizzando un pipettor multicanale (Figura 1A). Lasciare la piastra in ambiente sterile a 25 °C per 4 ore per consentire all'agarose di polimerizzare completamente.
NOTA: la sperimentazione può essere interrotta qui e continuata il giorno successivo. Le piastre di agarose polimerizzato possono essere mantenute a 37 °C fino a 24 ore o a 4 °C fino a 48 ore se sigillate con un involucro di parafilm. Piastra calda a 37 °C in un incubatore umidificato per almeno 1 ora prima dell'uso. - Passaggio sferoide-formante NHKc aspirando mezzi e lavando le cellule in 2 ml di PBS. Aspirare PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA allo 0,25% alle cellule lavate. Incubare per 5 minuti a 37 °C o fino a quando tutte le cellule si staccano completamente. Aggiungere 2 ml di inibitore della tripsina di soia alla piastra e lavare via le cellule dalla piastra in un tubo da 15 ml. Centrifuga a 250 x g per 5 min.
- Resuspend pellet in 1 mL di PBS. Quantificare la vitalità cellulare utilizzando la colorazione blu tripano e un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
- Aliquota 2 x 104 NHKc in 100 μL di KSFM-scm e seme in singoli pozzetti di piastra a fondo tondo a 96 pozzetti precedentemente preparata. Incubare la piastra durante la notte (37 °C, 5% CO2,95% di umidità).
- Utilizzando un microscopio a contrasto a fase invertita, analizzare bene i seminati per la formazione dell'epidermosfera.
NOTA: Le epidermosfere umane da cheratinociti umani normali possono rimanere vitali in coltura di sospensione 3D fino a 96 ore, anche se con una notevole diminuzione della vitalità cellulare (Figura 2).
3. Saggio di ri-placcatura dello sferoide epidermico
- 24-48 ore dopo la formazione dell'epidermosfera 3D, aggiungere 4 mL di KSFM-scm preriscaldato a un piatto di 6 cm. Utilizzare una punta della pipetta da 1 mL ad ampio foro per trasferire un singolo sferoide alla piastra, assicurandosi di non romperlo. In alternativa, allargare una punta della pipetta da 1 mL utilizzando una lama di rasoio sterile per tagliare la punta.
- Incubare la piastra durante la notte (37 °C, 5% CO2, 95% di umidità).
- Analizzare lo sferoide seminato per l'attacco al fondo della piastra e osservare le cellule che si propagano utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertita (Figura 3). Alimenta le celle ogni 96 ore rimuovendo delicatamente 2 ml del supporto all'interno della piastra e aggiungendo lentamente 2 mL di supporti KSFM-scm freschi alla piastra.
- PASSAGGIO Sferoide derivato (SD) NHKc una volta raggiunto il 70-80% di confluenza e continuare con il test di scelta. Monitorare frequentemente SD-NHKc per impedire alle cellule di raggiungere la piena confluenza in coltura, poiché ciò si traduce in differenziazione prematura e arresto della crescita cellulare (Figura 3E-F).
- Il saggio di riposiccatura sferoide epidermica modella la riparazione della ferita mediata dai cheratinociti catturando ciascuna delle fasi sequenziali chiave della plasticità rigenerativa epidermica: a) mantenimento omeostatico, b) arresto/inversione della differenziazione c) mobilità del lignaggio dello stress e d) ripristino dei tessuti(Figura 1B; Tabella 2). Questo test può anche essere utilizzato per produrre popolazioni cellulari per colture di zattere organotipiche o per modellare la neoplasia mediata da HPV, come dimostrato nel nostro precedente lavoro 11,12.
4.3D tracciamento delle cellule a fluorescenza
- In un piatto di 6 cm, trasfettare colture NHKc monostrato 2D che formano sferoidi con 1 μg di vettore plasmidico pMSCV-IRES-EGFP che trasporta il gene della proteina fluorescente verde potenziata (eGFP). Microscopio con piastra di incubazione durante la notte (37 °C, 5% CO2,95% di umidità)(Figura 4A).
NOTA: È importante che la trasfezione sia completata in condizioni prive di siero senza antibiotici. - Senza rimuovere la miscela di trasfezione, aggiungere 2 ml di KSFM-scm preriscaldato alle cellule. Incubare la piastra durante la notte (37 °C, 5% CO2,95% di umidità).
- Aspirare tutti i mezzi di trasfezione da piastre e cellule di alimentazione con 3 mL di KSFM-scm preriscaldato. Valutare la presenza di cellule che esprimono EGFP sotto il canale FITC di un microscopio fluorescente.
- Passaggio e semina 2 x 104 cellule trasfettate EGFP in singoli pozzetti di una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti precedentemente preparata. Incubare la piastra durante la notte (37 °C, 5% CO2,95% di umidità). Visualizzare e monitorare il movimento delle cellule sferoidipos EGFP sotto il canale FITC di un microscopio a fluorescenza (Figura 4B-C).
- 24 ore dopo la placcatura, aggiungere 3 ml di KSFM-scm preriscaldato a un piatto da 6 cm. Utilizzare una punta della pipetta da 1 mL ad ampio foro per trasferire un singolo sferoide alla piastra, assicurandosi di non romperlo. Incubare la piastra durante la notte (37 °C, 5% CO2,95% di umidità).
- Osservare e analizzare la propagazione di SD-NHKcEGFP utilizzando un microscopio a fluorescenza. Alimentare le celle ogni 96 ore rimuovendo delicatamente 2 mL del supporto all'interno della piastra e aggiungendo lentamente 2 mL di materiale KSFM-scm fresco alla piastra.
- Harvest SD-NHKCEGFP per isolamento FACS o saggi di scelta.
5. Caratterizzazione di sotto-popolazioni derivate da sferoidi (SD) mediante FACS
- Passaggio SD-NHKc e corrispondenti colture monostrato 2D autologhe aspirando vecchi mezzi e celle di lavaggio in 2 ml di PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA allo 0,25% alle cellule lavate. Incubare a 37 °C per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule si staccano completamente.
- Aggiungere 2 mL di inibitore della tripsina di soia alla piastra e trasferire le cellule in un tubo da 15 ml. Centrifuga a 250 x g per 5 min.
- Resuspend pellets in 1 mL di PBS. Quantificare la vitalità cellulare utilizzando il tripano blu e un contatore cellulare automatizzato di emocitometro.
- Aliquota 100 μL contenente 0,1-4 x 106 celle NHKc a tubi microcentrifuga da 1,5 mL. Posizionare il tubo sul ghiaccio in un ambiente buio, creato spegnendo le luci brillanti all'interno del cappuccio laminare.
- Aggiungere 2 μL di anti-integrinα6 coniugato CON FITC e 2 μL di anti-EGFR coniugato con PE ai tubi per ottenere una diluizione 1:50. Preparare un tubo senza anticorpi aggiunti per servire come controllo non macchiato. Incubare i tubi su ghiaccio al buio o a 4 °C per 30 min. L'uso di perline o di una linea SCC cutanea può servire come controllo positivo, poiché le cellule SCC della pelle esprimono livelli elevati di integrinaα6 ed EGFR.
- Eseguire analisi di citometria a flusso utilizzando citometro a flusso di scelta contenente con opportuni laser.
- Usa i controlli negativi e positivi per stabilire i cancelli. Ordinare la sottopopolazione di integrinα6hi/EGFRlo cells; queste sono la frazione epidermica delle cellule staminali. Le cellule integrinα6hi/EGFRhi sono la frazione cellulare proliferativa progenitrice. Le cellule integrinα6lo/EGFRhi sono la frazione cellulare progenitrice impegnata (Figura 4D). Lo smistamento dei tubi FACS deve contenere almeno 1 mL di KSFM-scm ghiacciato.
- Testare la capacità proliferativa delle sottopopolazioni cellulari ordinate trasferendo il contenuto di ciascun tubo di smistamento in un tubo conico da 15 ml contenente 10 volte il volume delle celle ordinate in PBS. NOTA: è importante rimuovere tutte le cellule attaccate al cerchio pipettando più volte la parete del tubo FACS di smistamento, poiché i cheratinociti possono spesso aderire lì.
- Centrifuga tubi da 15 mL a 250 x g per 5 min. Rimuovere il pellet surnatante e riconsoso in 12 mL di KSFM-scm. Trasferire le cellule riconsospese in una piastra di 6 cm e incubare durante la notte (37 °C, 5% CO2, 95% di umidità).
- Il giorno successivo, rimuovere i supporti in piastre e aggiungere 8 mL di KSFM-scm preriscaldati. Incubare a 37 °C, 5% CO2,95% di umidità. Ripier alimentare le cellule con 12 mL di terreno ogni 3 giorni fino al 70-80% di confluente (Figura 4E).
6. Immunofluorescenza e colorazione delle epidermosfere per marcatori di cellule staminali basali
- Trasferire le epidermosfere su coverslip rivestiti di polilisina. Lasciare che SD-NHKc si propaghe fino al 75% di confluente.
- Lavare le celle due volte in PBS (4 °C) per 5 minuti ciascuna.
- Fissare le celle con il 4% di paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Permeabilizzare le cellule con lo 0,5% di Triton X-100 in 1% di glicina. Bloccare utilizzando lo 0,5% di BSA e il 5% di siero di capra per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare campioni con anticorpi contro P63 (1:200) e citocheratina 14 (1:200) in soluzione bloccante durante la notte a 4 °C.
- Lavare tre volte con PBS (4 °C) contenente Tween 20 (PBST), seguito da incubazione con anticorpi secondari coniugati FITC e Alexa 568 (diluizione 1:1000).
- Nuclei di colorazione con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (diluizione 1:5000) prima di montare le cellule.
- Osservare le cellule utilizzando un microscopio fluorescente con linee laser FITC e PE (Figura 4F).
7. Analisi trascrizionale di colture epidermosfereche
- Impostare piastre triplicate di colture NHKc a basso passaggio per isolare l'RNA può essere da colture monostrato, sferoidi e derivate da sferoidi dalla stessa linea cellulare autologa.
- Pool 3-5 epidermosfere corrispondenti in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Raccogliere separatamente colture autologhe SD-NHKc e monostrato 2D.
- Isolare l'RNA totale da tutti e tre i gruppi.
- Eseguire la trascrizione inversa con 1 μg di RNA totale.
- Utilizzando cDNA, eseguire PCR in tempo reale, utilizzando GAPDH come controllo interno (Tabella 1).
- Convalidare le dimensioni del prodotto amplicon mediante elettroforesi su gel di agarose (2% v / v).
NOTA: Per la profilazione trascrittomica di colture di epidermosfera utilizzando l'analisi di microarray dell'intero genoma, isolare l'RNA totale da colture di massa di un singolo donatore di NHKc e il corrispondente SD-NHKc dello stesso donatore, in sei repliche ciascuna. - Valutare la qualità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore per ottenere numeri di integrità dell'RNA (RIN) che vanno da almeno 9,0 a 9,1.
- Eseguire esperimenti di microarray amplificando e biotinilizzando campioni di RNA totale.
- Trascrivere inversamente 100 ng di RNA totale per campione in ds-cDNA utilizzando primer casuali NNN contenenti una sequenza di promotori della T7 RNA polimerasi.
- Aggiungere T7 RNA polimerasi ai campioni di cDNA per amplificare l'RNA, quindi copiare l'RNA in ss-cDNA. Degradare l'RNA in eccesso utilizzando RNasi H.
- Frammentare le molecole di sscDNA ed etichettare con biotina.
- Amplificare i campioni etichettati per 16 ore a 45 °C.
- Ibridare i campioni utilizzando un forno di ibridazione e un kit di lavaggio e macchie.
- Lavare e macchiare gli array ibridi.
- Scansione di array utilizzando un sistema e una workstation di computer.
- Dopo il completamento delle scansioni dell'array, importare i file CEL (Probe Cell Intensity) nel software della console di espressione ed elaborare a livello genetico utilizzando il file di libreria e l'algoritmo RMA (Robust Multichip Analysis) per generare file CHP.
- Dopo aver confermato la qualità dei dati in Expression Console, importare i file CHP contenenti segnali di espressione log2 per ogni sonda in un software di analisi del trascrittoma per analizzare le risposte trascrizionali specifiche del tipo di cella utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza tra soggetti.
8. Valutazione dell'efficienza di formazione delle colonie SD-NHKc
- Aspirare i mezzi dalle piastre quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza. Lavare le celle tre volte in PBS (4 °C) per 5 minuti ciascuna.
- Fissare le celle con 3 mL di metanolo al 100% (4 °C) per 15 min. Lavare tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
- Macchie di cellule in 3 mL di Giemsa al 10% per 30 min. Lavare tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno. Lasciare asciugare le cellule all'aria durante la notte.
- Analizzare la formazione delle colonie il giorno seguente e quantificare il numero di colonie ottenute
9. Determinare il raddoppio della popolazione SD-NHKc
- Passaggio SD-NHKc e corrispondenti colture monostrato 2D autologhe aspirando vecchi mezzi e celle di lavaggio in PBS da 2 ml. Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml 0,25% di tripsina-EDTA alle cellule lavate. Incubare per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule si staccano completamente (37 °C, 5% CO2, 95% di umidità).
- Aggiungere 2 mL di inibitore della tripsina di soia alla piastra e trasferire le cellule in un tubo da 15 ml.
- Centrifuga a 250 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e il pellet di ripresa in 12 ml di KSFM-scm.
- Seminare cellule a bassa densità 1-2 x 104 NHKc in singoli piatti da 10 cm e incubare durante la notte (37 °C, 5% CO2,95% di umidità).
- Piastre di alimentazione con 8 mL KSMF-scm il giorno seguente. Nutrire ogni 4 giorni fino a quando almeno il 25% confluente, quindi nutrire ogni 2 giorni.
- Celle di passaggio seriale 1:5 in piatti da 60 cm fino ad esaurimento della capacità proliferativa cellulare. Quantificare la vitalità cellulare mediante colorazione blu tripano. Determinare i raddoppi della popolazione ad ogni passaggio usando la formula: log(N/N0) / log2, dove N rappresenta il numero totale di celle ottenuto ad ogni passaggio e N0 rappresenta il numero di cellule placcate all'inizio dell'esperimento.
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Representative Results
Durante il test dell'epidermosfera cutanea, le colture NHKc vengono seminate in pozzetti rivestiti di agarose di una piastra a 96 pozzetti (Figura 1A). Le cellule che formano sferoidi dovrebbero auto-aggregarsi entro 48 ore. La formazione autonoma di sferoidi può essere valutata già a 24 ore utilizzando un microscopio standard a contrasto di fase invertito. modello di analisi della formazione dell'epidermosfera cutanea e ri-placcatura di varie fasi della rigenerazione del tessuto epidermico (Figura 1B). La Figura 2 mostra immagini ad alta risoluzione di vari ceppi nhKc analizzati per la capacità di formazione di sferoidi epidermici in coltura 3D. È importante esaminare le cellule per l'aggregazione densa a forma di sfera, poiché questo è un segno distintivo della formazione spontanea di sferoidi. Abbiamo trovato necessario utilizzare più di 2 x 104 cellule per garantire una corretta aggregazione spontanea. L'aggregazione cellulare non sferica, come si vede nei ceppi Figura 2A,non è considerata un'adeguata formazione di epidermosfera. La placcatura di sospensioni cellulari non sferoidi in coltura monostrato 2D raramente si traduce in una crescita vitale delle cellule NHKc. Tuttavia, la placcatura di epidermosfere in coltura 2D provoca la proliferazione di NHKc vitali di piccole dimensioni (Figura 3). Le immagini di epidermosfere e SD-NHKc possono essere visualizzate e monitorate utilizzando un microscopio standard a contrasto di fase invertito. È importante mantenere queste colture al di sotto della confluenza del 100% in quanto ciò può migliorare considerevolmente la loro crescita e lo stato delle cellule staminali in coltura (Figura 3E-F). Il processo di formazione di sferoidi epidermici può essere monitorato funzionalmente a livello di singola cellula trasfezionando le cellule con un reporter fluorescente (Figura 4A-C). In condizioni ottimali, la sottopopolazione di cheratinociti principalmente arricchita in colture SD-NHKc sono cellule integrinα6hi/EGFRlo. Queste cellule costituiscono generalmente circa il 25% di tutte le colture SD-NHKc e possono essere facilmente isolate da FACS (Figura 4D). Tuttavia, è importante stabilire le porte dell'area di dispersione laterale in avanti (FSC-A) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A) per escludere i doppietti (Figura 4D). Un'ulteriore caratterizzazione di questa sottopopolazione di cheratinociti staminali può essere ottenuta mediante l'analisi della colorazione immunofluorescente dell'espressione di marcatori epidermici delle cellule staminali, come la citocheratina basale 14 (K14) e la proteina tumorale 63 (P63) (Figura 4F; Tabella 2).
Figura 1: Coltivazione di epidermosfere NHKc in sospensione 3D. (A) Rappresentazione schematica del saggio di riregolamentazione sferoide epidermica adattato da 11. (B) Immagini rappresentative di contrasto di fase di colture NHKc, sferoidi epidermici e SD-NHKc in ogni fase sequenziale del test di ri-placcatura dello sferoide epidermico. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione della crescita dell'epidermosfera cutanea. (A) Immagini di sei singoli ceppi nhKc sferoidi non formanti e (B) sferoidi in sospensione 3D flottante. (C) Epidermosfere ottenute utilizzando varie quantità di NHKc. (D) Quantificazione della dimensione media dell'epidermosfera ottenuta utilizzando diverse quantità di NHKc in coltura di sospensione 3D galleggiante. Le barre indicano la deviazione standard. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colture derivate da sferoidi in crescita. (A) Imaging a contrasto di fase del corso temporale di colture monostrato SD-NHKc che si propagano da un'epidermosfera attaccata 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h e (D) 96 h dopo la ri-placcatura in coltura plastica 2D. (E) Colture SD-NHKc all'80% di confluenza e (F) confluenza al 100% rispettivamente 15 e 20 giorni dopo la ripasiccatura in coltura plastica 2D. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratterizzazione di sotto-popolazioni derivate da sferoidi (SD). (A) Rappresentazione schematica del saggio di tracciamento cellulare 3D di epidermosfere in vitro come descritto da Woappi et al. 202012. (B) Epidermosfere che esprimono EGFP 2 ore e (C) 24 ore dopo la semina in coltura 3D. (D) Selezione cellulare attivata a fluorescenza (FACS) di sottopopolazioni SD-NHKc. Circa 1/4 di tutte le cellule dovrebbe essere integrinα6hi/EGFRlo. (E) Integrinα6hi/EGFRle sottopopolazioni producono olocloni cheratinociti. (F) Analisi immunofluorescente della colorazione dell'espressione di marcatori di cellule staminali epiteliali basali in cellule Integrinα6hi/EGFRlo . Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sequenza di primer (5'-3') | ||
| Nome del gene | Primer in avanti | Primer inverso |
| ALDH1 · | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| EGFR | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH · | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 · | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 · | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actina | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tabella 1. Delinea le sequenze di primer PCR utilizzate per il rilevamento di geni selezionati coinvolti nella plasticità dei cheratinociti neonatali.
| Condizione della coltura | Aspetto a contrasto di fase | Immunostaining | Analisi FACS | Firma trascrittamica | |
| Manutenzione omeostatica | Monostrato 2D | Celle di piccole dimensioni < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Manutenzione epidermica (K14, P63, IVL, K10) |
| Arresto/inversione della differenziazione | Sferoide 3D | Aggregato multicellulare compatto > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | N/D | De-differenziazione: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Mobilità del lignaggio dello stress | Attacco sferoide da 3D a 2D | Diffusione di celle di piccole dimensioni (< 20 μm) dal bordo sferoide | K14, P63, Ki-67 | ITGα6hi/EGFPmed | Proliferazione delle cellule della pelle: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Restauro tissutale | Monostrato sferoide da 3D a 2D | Propagazione di cellule di piccole dimensioni < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo e ITGα6hi/EGFPhi | Formazione di epidermide: K14, IVL, FLG |
Tabella 2. Strategie per la caratterizzazione fenotipica e molecolare del saggio di replating sferoide epidermico.
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Discussion
L'uso di sistemi di coltura sferoidale 3D ha avuto un'ampia utilità nella valutazione della staminalità delle cellule. Questi sistemi hanno dimostrato di migliorare l'arricchimento delle cellule staminali tissutali13, ma la loro utilità per lo studio delle cellule staminali epidermiche umane è stata esplorata in modo limitato. Qui, descriviamo una strategia per arricchire le cellule staminali dei cheratinociti umani utilizzando tecniche di coltura 3D. In questo sistema, gli NHKc sono coltivati come sospensioni sferoidi multicellulari autoassemblanti, composte da diversi sottotipi di cheratinociti sospesi sopra letti di agarose contenenti KSFM-scm. La configurazione di questo protocollo è sensibile al tempo in quanto l'agar polimerizza rapidamente a temperatura ambiente. Il preriscaldamento delle pipette sierologiche, le punte delle micropipette e il tubo di miscelazione agar/cella, così come il mezzo a 42 °C, possono ridurre drasticamente la polimerizzazione prematura. Abbiamo osservato che posizionare la piastra a 96 pozzetti a 4 °C poco dopo l'aggiunta della miscela di agar/media ai pozzetti può accelerare notevolmente la polimerizzazione e garantire che il cuscino di agar sia sufficientemente solido per la successiva semina delle cellule. È importante mantenere il livello della piastra in ogni momento durante il processo di polimerizzazione, poiché una scarsa polimerizzazione della miscela agar / media comporterà la semina o la crescita delle cellule all'interno dell'agar morbido, annullando il test.
Delineato anche in questo protocollo, presentiamo una strategia per la propagazione di epidermosfere in coltura monostrato 2D per generare cellule derivate da sferoidi simili a staminali. Il saggio di ri-placcatura epidermica degli sferoidi arricchisce per una sottopopolazione simile a una cellula staminale di integrinα6hi/EGFRlo cheratinociti. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare la ricostruzione epidermica, la psoriasi o la neoplasia cellulare11,12,14. Integrinα6hi/EGFRlo cheratinociti possono anche essere facilmente isolati da FACS e caratterizzati da colorazione immunofluorescente. Quando si conducono tali esperimenti, abbiamo trovato utile utilizzare cellule monostrato 2D autologhe non ordinate come controlli., le linee cellulari SCC della pelle sono una buona alternativa Se queste non sono disponibili.
In sintesi, questo rapporto dimostra che la ri-placcatura sferoide epidermica umana modella la plasticità rigenerativa dei cheratinociti in vitro, inquanto cattura ciascuna delle quattro fasi della rigenerazione: mantenimento omeostatico, inversione della differenziazione, mobilità del lignaggio dello stress e ripristino dei tessuti. Tuttavia, una limitazione dell'autoassemblaggio sferoide a base di agar è che non tutte le macchie di NHKc sono in grado di formare spontaneamente sferoidi. Il metodo15 è una buona strategia alternativa per superare questa sfida e per indurre forzatamente la formazione di sferoidi multicellulari. Questo test può anche essere multiplexato con cellule muscolari, stromali o immunitarie per ottenere ulteriori informazioni sul contributo di varie popolazioni cellulari sulla rigenerazione epidermica. sarebbe interessante esplorare se l'aggiunta di Matrigel nell'agar potrebbe migliorare la sopravvivenza e la potenza dell'epidermosfera.
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Disclosures
Gli autori non hanno relazioni finanziarie da divulgare.
Acknowledgments
La UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) ha fornito l'accesso alle apparecchiature di imaging e smistamento cellulare e all'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione 1R21CA201853. L'MCF e l'IRF ricevono un sostegno parziale dalla sovvenzione NIH P20GM103499, SC INBRE. L'MCF riceve anche il supporto della sovvenzione NIH P20GM109091. Yvon Woappi è stato supportato in parte dalle sovvenzioni NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) e R25GM076277 (IMSD) e da una borsa di studio del Grace Jordan McFadden Professors Program presso uofSC. Geraldine Ezeka e Justin Vercellino sono stati supportati dalle sovvenzioni NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) presso UofSC. Sean M. Bloos è stato supportato dal Magellan Scholar Award 2016 presso l'UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
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