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Biology

Une description cartographique 3D de la cellule par cryo tomographie par rayons X mous

Published: March 15, 2021 doi: 10.3791/62190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1MISTRAL beamline, Alba Light Source, Cerdanyola del Valles, Spain, 2Beamline B24, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, UK

Summary

Ici, un protocole décrivant les étapes de préparation des échantillons et de collecte de données requises en cryomodensitométrie à rayons X mous (SXT) pour imager l’ultrastructure de cellules entières cryo-préservées à une résolution de 25 nm demi-pas, est présenté.

Abstract

Les techniques d’imagerie sont fondamentales pour comprendre l’organisation cellulaire et la machinerie dans la recherche biologique et les domaines connexes. Parmi ces techniques, la cryo tomographie par rayons X mous (SXT) permet d’imager des cellules entières cryo-préservées dans la gamme d’énergie des rayons X de la fenêtre d’eau (284-543 eV), dans laquelle les structures carbonées ont une absorption intrinsèquement plus élevée que l’eau, permettant la reconstruction 3D du coefficient d’absorption linéaire du matériau contenu dans chaque voxel. Des informations structurelles quantitatives au niveau de cellules entières jusqu’à 10 μm d’épaisseur sont alors réalisables de cette façon, avec un débit élevé et une résolution spatiale allant jusqu’à 25-30 nm demi-pas. Cryo-SXT s’est avéré pertinent pour la recherche biomédicale actuelle, fournissant des informations 3D sur les processus d’infection cellulaire (virus, bactéries ou parasites), les changements morphologiques dus à des maladies (telles que les maladies génétiques récessives) et nous aidant à comprendre l’action des médicaments au niveau cellulaire, ou à localiser des structures spécifiques dans l’environnement cellulaire 3D. En outre, en tirant parti de la longueur d’onde accordable dans les installations synchrotron, la spectro-microscopie ou son homologue 3D, la spectro-tomographie, peut également être utilisée pour imager et quantifier des éléments spécifiques de la cellule, tels que le calcium dans les processus de biominéralisation. Cryo-SXT fournit des informations complémentaires à d’autres techniques d’imagerie biologique telles que la microscopie électronique, la fluorescence X ou la fluorescence de la lumière visible, et est généralement utilisée comme méthode partenaire pour l’imagerie corrélative 2D ou 3D dans des conditions cryogéniques afin de lier la fonction, l’emplacement et la morphologie.

Introduction

Cryo-SXT peut jouer un rôle central dans la recherche en imagerie biologique car il fournit des volumes de résolution moyenne 3D (25-30 nm demi-pas) de cellules entières hydratées 1,2,3,4,5,6. Dans la gamme d’énergie de la fenêtre d’eau, entre les bords K d’absorption du carbone et de l’oxygène (4,4-2,3 nm), les structures cellulaires riches en carbone absorbent 10 fois plus que le milieu riche en oxygène qui les imprègne et les entoure. Dans cette gamme d’énergie, les cellules vitrifiées jusqu’à 10 μm d’épaisseur peuvent être imagées sans avoir besoin de sectionnement ou de coloration, ce qui conduit à des projections quantitatives de contraste à absorption élevée, qui, combinées à des capacités de rotation de l’échantillon, permettent la reconstruction tomographique de la structure cellulaire. Cryo-SXT remplit une niche en termes de dimensions d’échantillon et de résolution spatiale qui n’est facilement accessible par aucune autre technique d’imagerie.

En bref, le contraste d’absorption du cryo-SXT est quantitatif, car l’atténuation des photons à travers l’échantillon d’épaisseur t obéit à la loi de Beer-Lambert comme suit: Equation 1, où I0 représente l’intensité incidente et μl le coefficient d’absorption linéaire, qui dépend de la longueur d’onde λ et de la partie imaginaire β de l’indice de réfraction de l’échantillon (Equation 2 ). L’atténuation est fonction de la composition biochimique et de l’épaisseur des structures imagées, chaque composant biochimique ayant un coefficient d’absorption linéaire spécifique des rayons X μl (LAC). Cela signifie que chaque valeur de voxel de tomographie dépend des éléments chimiques et de leur concentration dans ce voxel7. Cela permet la discrimination naturelle de différents organites tels que les noyaux, les nucléoles, les corps lipidiques ou les mitochondries, ou différents états de compactage de la chromatine uniquement sur la base de leurs valeurs LAC inhérentes reconstruites 2,8,9.

De plus, le cryo-SXT est une technique à haut débit avec des tomogrammes collectés en quelques minutes. Cela permet spécifiquement l’imagerie à méso-échelle des populations cellulaires qui peuvent être capturées à des moments clés tels que la division, la différenciation et l’apoptose, mais aussi à différents états de réponse tels que ceux induits par l’exposition chimique à des traitements médicamenteux spécifiques ou à des infections pathogènes. Les données collectées à ces points clés fourniront une description 3D du système avec un enregistrement fidèle de l’organisation spatiale des différents organites cellulaires à ces moments spécifiques.

Habituellement, la cryo-SXT est utilisée en combinaison avec d’autres techniques suivant des approches corrélatives qui permettent de localiser des caractéristiques, des événements ou des macromolécules spécifiques dans l’environnement cellulaire 3D 4,10,11,12,13,14,15,16, ou des données de fluorescence X dure17,18 . Les approches corrélatives dans des conditions cryogéniques sont d’une importance capitale afin d’obtenir l’image la plus complète et la plus précieuse du système d’intérêt. Un résumé succinct du flux de travail typique des lignes de faisceau cryo-SXT Mistral (Alba) et B24 (Diamond) est esquissé à la figure 1.

De plus, en tirant parti de la capacité de réglage de la longueur d’onde dans les installations synchrotrons, des informations spectroscopiques peuvent être obtenues en plus de l’information structurelle en utilisant l’absorption différentielle spécifique d’éléments particuliers contenus dans l’échantillon. Un exemple de ceci serait la localisation du calcium dans l’étude des processus de biominéralisation dans les cellules 19,20,21. En prenant des images 2D à différentes énergies de photons (spectres) ou tomogrammes en dessous et au bord d’absorption des rayons X d’intérêt, les pixels ou voxels contenant l’élément sélectionné peuvent être identifiés. Les spectres permettent également de différencier les états chimiques (c’est-à-dire l’évolution du calcium amorphe en hydroxyapatite comme dans l’exemple de biominéralisation précédent20). La quantification de différents éléments est possible en 2D et 3D. L’imagerie spectroscopique des cellules vitrifiées est généralement effectuée dans la fenêtre d’eau, mais elle est également possible dans d’autres plages d’énergie si la teneur en eau est suffisamment faible ou si d’autres protocoles de préparation des échantillons, y compris la déshydratation, sont utilisés22. Un protocole de spectroscopie détaillé étape par étape est au-delà de l’objet du protocole ici.

Dans ce qui suit, le protocole se concentre sur la synthèse brève des principales étapes de préparation des échantillons, bien que chaque système puisse nécessiter un raffinement individuel, suivi d’une procédure détaillée de collecte de données étape par étape pour la cryomodensitométrie à rayons X mous.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon

  1. Préparation du support de grille
    1. Irradier les grilles avec des UV pendant 3 h avec le film de carbone tourné vers le haut pour la stérilisation.
    2. Facultatif : En cas de problèmes avec des cellules qui ne se fixent pas à la grille, procédez comme suit.
      1. Hydrophiliser la feuille de support en carbone par traitement plasma des grilles pour augmenter la propagation des échantillons et une meilleure adhérence cellulaire.
        1. Placez les grilles côté carbone vers le haut dans l’équipement de la chambre de décharge lumineuse et exposez la grille au plasma pendant 30 s à 15 min (en utilisant Ar ou / et O2) selon l’équipement.
      2. Fonctionnaliser les grilles avec de la Poly-L-lysine (PLL)
        1. Ajouter des gouttes individuelles de 60 μL de PLL dans une boîte de Petri et placer la grille au-dessus de la goutte de PLL avec le film de carbone vers le bas. Incuber pendant 30 min à 37 °C et éponger la LPL à l’aide d’un papier filtre.
      3. Fonctionnaliser les grilles avec du sérum bovin fœtal (FBS).
        1. Immergez les grilles dans FBS pendant la nuit. Trempez les grilles dans une solution tampon pour laver et laissez la grille sur un papier filtre pour éliminer l’excès de liquide.
  2. Cultiver des cellules adhérentes sur des grilles
    1. Cultiver des cellules dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm pour atteindre une confluence de 80 % à 90 % (figure 2A).
    2. Ensemencer 1-5 x 105 cellules/mL (ajuster la valeur au système) au-dessus des grilles Au dans une boîte de Petri P60 (3 mL au total).
      NOTE: L’ajout de la suspension cellulaire doit être fait très soigneusement avec le film de carbone de la grille tourné vers le haut dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm. Préparez plusieurs grilles par condition, une condition par boîte de Petri P60 (Figure 2B).
    3. Laissez les cellules se déposer jusqu’à ce que la confluence sur la grille atteigne plusieurs cellules (1 à 10 selon la taille de la cellule) dans chaque carré de maillage (selon la lignée cellulaire, cela peut prendre jusqu’à 24 h).
      NOTE: Avant la congélation, les grilles doivent être vérifiées à l’aide d’un microscope à lumière visible (VLM), en évaluant l’intégrité du film de carbone ainsi que la confluence des cellules dans chaque grille (Figure 2C). Attendez que la densité de cellule appropriée sur la grille soit atteinte. Si la grille est trop confluente ou si la feuille de carbone est cassée, recommencez.
  3. Dépôt de cellules en suspension sur des grilles
    1. Choisissez une grille Au ou Cu préparée à l’aide de la pince du congélateur plongeant (voir rubrique 1.6).
    2. Préparer une suspension à 5 cellules de 1 à5 x 10 (absorbance de densité optique de 0,3 dans le cas de bactéries) et ajouter 4 μL de la suspension préparée à la grille.
    3. Incuber la grille avec la goutte pendant quelques minutes horizontalement pour permettre le dépôt des cellules, puis placer la pince qui maintient la grille à l’intérieur de la chambre de vitrification climatisée réglée sur les conditions de température et d’humidité appropriées (étape 1.6.1).
  4. Facultatif : marquage fluorescent des échantillons
    NOTE: Il peut être bénéfique de marquer par fluorescence certains organites de l’échantillon. Selon l’intérêt, des fluorophores ou des cellules spécifiques exprimant de manière stable une protéine fluorescente ou transfectées pour l’expression transitoire d’une protéine d’intérêt peuvent être utilisées. Cela permet une détection facile des cellules à l’aide de la cryo-épifluorescence microscopique et aide à trouver des cellules d’intérêt pour l’imagerie ultérieure aux rayons X. Dans ce qui suit, le protocole ne détaille que l’utilisation de fluorophores.
    1. Préparez une solution de travail pour le fluorophore (voir la recommandation du fabricant) et suivez le protocole spécifique.
    2. Ajouter les fluorophores à la boîte de Petri contenant les grilles et mélanger doucement.
    3. Laisser incuber dans un environnement sombre et passer directement à l’étape 1.6 une fois l’incubation terminée.
      REMARQUE: Il est important d’être prêt à vitrifier une fois l’incubation terminée pour éviter un marquage non spécifique et, par conséquent, un signal fluorescent flou.
  5. Préparation des nanoparticules Au (NP) pour l’alignement de la projection du tomogramme
    1. Prendre une aliquote de 1mL de la solution mère fiduciale Au (100 nm au Mistral ou 250 nm au B24) et centrifuger à basse vitesse (pour éviter l’agrégation) pendant 1 min pour permettre aux NP de granuler.
      NOTE: Si possible, il est préférable de laisser les fiduciaires s’installer naturellement du jour au lendemain ou plus, pour éviter l’agrégation.
    2. Retirez le surnageant. Immédiatement avant la congélation, suspendre à nouveau les NP dans un milieu sans sérum de 20 μL ou une solution tampon pour obtenir une solution homogène.
      NOTE: La sonication et le vortex sont recommandés pour aider à homogénéiser la solution.
  6. Grilles de congélation plongeante
    ATTENTION: L’azote liquide peut causer des brûlures à froid et un équipement de protection approprié doit être porté (manteau de laboratoire long, lunettes de sécurité, gants, pantalons longs et chaussures fermées). L’éthane est hautement explosif et doit être tenu à l’écart de toute étincelle ou feu ouvert.
    1. Suivez les instructions du fabricant pour préparer et utiliser l’instrument de congélation à piston.
      NOTE: L’humidité est généralement réglée à 80% -90%; la température dépendra du type de cellule (levure 30 °C maximum, cellules de mammifères 37 °C, cellules d’insectes 28 °C, etc.).
    2. Prenez une grille avec la pince à épiler de montage de la boîte de Petri par le bord, en prenant grand soin de ne pas plier la grille et de la monter sur le dispositif de congélation à piston. Assurez-vous que les cellules sont éloignées du papier buvard.
    3. Facultatif : laver la grille trois fois dans un tampon dans le cas de cellules adhérentes.
    4. Ajouter 1,5 μL de fiduciales Au NP sur le dessus des cellules (à travers le trou du côté droit de la chambre) et laisser reposer pendant 30 s avant d’éponger et de plonger la grille.
      NOTE: Dans le cas des cellules en suspension, ajoutez des fiducials Au NP à la grille alors qu’elle est encore en position horizontale avant de monter la pince et laissez-les se déposer pendant 30 s. Le blotting est crucial pour les grilles de haute qualité. La distance de transfert doit être calibrée avant de commencer; la planéité du papier buvard est importante pour un buvard reproductible (suivez les instructions du fabricant). Le temps de transfert doit être évalué pour chaque type de cellule.
    5. Préparez plusieurs grilles par condition. Transférez la grille et stockez-la à des températures cryogéniques pour préserver la vitrification.
  7. Grilles de criblage avec cryo microscopie à lumière visible
    1. Transférer les grilles sous azote liquide des cryo-boîtes vers une cryo-cassette standard (trois positions pour les grilles TEM de 3 mm) à l’intérieur d’une cryo-scène pré-refroidie (voir les instructions du fabricant).
    2. La cryo-cassette est placée sur le pont de cryo-étage et le cryo-étage est monté sur un microscope optique à épifluorescence à large champ.
    3. Imagez les grilles à -196,5 °C à l’aide d’un objectif à longue distance de travail (10x, 50x, 100x) afin de localiser les cellules appropriées pour l’imagerie cryo-SXT et d’évaluer la qualité de la grille (présence de glace épaisse, intégrité du film de support carbone, présence de signal fluorescent, etc.).
    4. Localisez les cellules d’intérêt à l’aide de l’imagerie en champ lumineux et/ou en fluorescence.
      REMARQUE: À ce stade, capturez les images si une caméra liée est présente sur le microscope. Utilisez-le pour la corrélation d’images.
    5. Après le criblage, retournez les grilles dans les cryo-boîtes dans un dewar de stockage d’azote liquide.
      NOTE: Si aucun bon échantillon n’est trouvé, répétez les étapes de préparation de l’échantillon en modifiant l’un des paramètres. Habituellement, les paramètres qui nécessitent une modification sont le temps d’effacement, dans le cas où la glace est trop épaisse ou la confluence, s’il y a trop de cellules par carré de maillage.

2. Chargement dans le microscope à rayons X à transmission (TXM)

  1. Refroidir la chambre de transfert avec de l’azote liquide jusqu’à ce qu’elle atteigne <100 K, refroidir le poste de travail (Figure 3A) et allumer le chauffage du bord du poste de travail. Attendez qu’il cesse de bouillir.
  2. Placez les cryo-boîtes contenant des grilles nécessaires aux emplacements correspondants du poste de travail (Figure 3A). Faites attention à les transférer en toute sécurité dans des conditions cryogéniques.
  3. Charger les grilles sélectionnées dans les porte-échantillons préalablement refroidis (Figure 3B) ; chargez les supports sur la navette et protégez-les avec les couvercles (Figure 3C).
  4. Chargez la navette dans la chambre de transfert à <100 K et pompez-la jusqu’à un vide faible (Figure 3D).
  5. Fixez la chambre de transfert au TXM (Figure 4A) et chargez la navette de la chambre de transfert dans le TXM en suivant la procédure de vide à l’écran (Figure 4B).
  6. Une fois que la navette est à l’intérieur avec les échantillons, le bras du robot TXM peut amener un porte-échantillon à la fois à l’étape de l’échantillon (Figure 4C).

3. Imagerie à l’aide du logiciel TXM

REMARQUE: Les grilles à l’étape de l’échantillon sont d’abord imagées à l’aide d’un microscope à lumière visible (VLM) en ligne pour cartographier la grille en mode champ clair et / ou fluorescence avant d’être imagées avec des rayons X. Utilisez l’icône du joystick correspondant à l’onglet Contrôle de mouvement sur le panneau supérieur gauche pour ouvrir le Contrôle de mouvement.

  1. Imagerie de la grille avec le VLM en ligne.
    1. Acquisition de mosaïques en champ lumineux
      1. Sélectionnez la caméra VLM (loupe > VLM) et allumez la source LED VLM pour l’imagerie en champ lumineux (Paramètres d’acquisition > > du microscope > > Paramètres de la source et sélectionnez Transmission).
      2. Faites pivoter l’échantillon à -60 degrés afin de faire face à l’objectif VLM (Motion Control > Sample > Sample θ) et déplacez l’échantillon vers les positions centrées attendues (Motion Control > Sample et changez Sample X, Sample Y).
      3. Tout en acquérant des images par étapes de 20 à 50 μm d’abord pour mettre la grille à peu près au point (> paramètres d’acquisition > d’acquisition > modes d’acquisition > démarrage > continu; Motion Control > Exemple et modification de l’exemple Z).
      4. Affinez la mise au point avec des pas plus petits jusqu’à 5 μm jusqu’à ce que les cellules et/ ou les trous du film de support en carbone soient mis au point (microscope > paramètres d’acquisition > paramètres d’acquisition > modes d’acquisition > démarrage > continu; Motion Control > Sample and change Sample Z) et commence l’acquisition d’une carte mosaïque complète de la grille en mode champ lumineux. Utilisez les valeurs par défaut de la mosaïque. (Paramètres d’acquisition > d’acquisition > de microscope > modes d’acquisition > > démarrage de la mosaïque).
        NOTE: Une carte en mosaïque est faite d’images uniques. Le nombre d’images (nombre de colonnes, de lignes et taille des étapes en X et Y) doit être défini pour visualiser l’ensemble de la grille. La taille du pas dépend de la taille du champ de vision (FoV). Les valeurs par défaut sont utilisées ici. Si la grille n’est pas bien centrée dans le plan X-Y par rapport à la mosaïque complète FoV, arrêtez l’acquisition, corrigez les coordonnées X et Y de l’échantillon et répétez l’acquisition.
    2. Acquisition de mosaïque en mode fluorescence
      1. Éteignez la source LED VLM pour l’imagerie en champ lumineux (Microscope > Paramètres d’acquisition > Acquisition > Paramètres source et désélectionnez Transmission) et sélectionnez manuellement la source lumineuse LED correspondant à la longueur d’onde d’excitation souhaitée (rouge, vert ou bleu) et le filtre optique correspondant sur la configuration.
      2. Affiner la mise au point sur l’image de fluorescence (paramètres d’acquisition > d’acquisition > au microscope > modes d’acquisition > démarrage continu >; Motion Control > Échantillon et modifier l’échantillon Z), puis acquérir une carte mosaïque conservant les paramètres de position (X et Y) de la mosaïque de champ lumineux (Paramètres d’acquisition > de > de microscope > Modes d’acquisition > Mosaïque > Démarrer).
      3. Éteignez la source lumineuse LED
      4. Facultatif : Sur la base des cartes mosaïques de champ lumineux et de fluorescence, annoter les régions d’intérêt (ROI) identifiées précédemment (étape 1.7.4) ou les nouveaux ROI (positions X-Y dans l’image).
  2. Acquisition de mosaïques de rayons X
    1. Sélectionnez le détecteur de rayons X CCD (loupe > sélectionnez Pixis), amenez l’échantillon à une rotation de 0 degré (Motion Control > Sample et changez l’échantillon θ) et déplacez l’optique des rayons X (condenseur et plaque de zone) aux positions alignées (Motion Control > Condenseur > changez Condenseur z; Motion Control > plaque de zone et changer de plaque de zone Z).
      NOTE: Refroidissez la puce CCD à -65 °C avant l’imagerie (microscope > température de la caméra > Pixis et modifiez la température réglée à -65 °C et cliquez sur Appliquer).
    2. Déplacez l’échantillon au centre du carré de maillage de l’un des ROI sélectionnés (Motion Control > Sample et modifiez Sample X, Sample Y).
    3. Utilisez le binning 2 et la fente de sortie à 5 μm pour minimiser l’irradiation et l’exposition à 1 s au Mistral, et le binning 1 et 60 μm au B24, ajustez la mise au point à l’aide de la translation de l’échantillon Z (microscope > Paramètres d’acquisition > d’acquisition > paramètres de l’appareil photo et modifiez le binning; Motion Control > XS et changez XS; Paramètres > d’acquisition > > d’acquisition du microscope> modes d’acquisition > démarrage continu > ; Motion Control > Exemple et modifier l’exemple Z). Commencez par étapes de 5 μm et affinez-le jusqu’à des étapes de 0,5 μm, jusqu’à ce que la cellule ou les trous de feuille de carbone soient bien mis au point.
    4. Acquérir une carte mosaïque du carré de maillage (Paramètres d’acquisition > d’acquisition > de microscope > mode d’acquisition > Mosaïque > Démarrer).
      NOTE: Les paramètres d’acquisition de mosaïques peuvent être déterminés de la même manière que pour les mosaïques VLM (section 3.1.1.4). La taille du pas dépend du grossissement présélectionné par le personnel de la ligne de faisceau.
    5. Déplacez l’échantillon en position de champ plat (FF) (une zone vide dans la grille, de préférence un trou dans le support en carbone) (Motion Control > Sample et changez Sample X, Sample Y).
    6. Réglez le temps d’exposition sur 1 s au Mistral et 0,5 s au B24 (Paramètres d’acquisition > d’acquisition > au microscope > Paramètres de l’appareil photo et modifier le temps d’exposition) et acquérez une seule image (Modes d’acquisition > d’acquisition > au microscope > Démarrage > unique).
    7. Normalisez (divisez) la mosaïque acquise par l’image FF pour obtenir la transmission (avec des valeurs comprises entre 0 et 1) et enregistrez la mosaïque normalisée (cliquez sur la première icône du coin supérieur droit sur le côté droit de l’image pour ouvrir le menu>choisissez l’onglet Référence> cliquez sur Référence unique et parcourez le FF spécifique).
  3. Préparation de la collecte d’une série d’inclinaison à rayons X
    NOTE: Recherchez l’axe de rotation de chaque région d’intérêt faisant l’objet de l’image.
    1. Faites une sélection de zones dans les mosaïques pour effectuer la tomographie, c’est-à-dire en plaçant une forme carrée (cliquez sur Outil sur le côté gauche de la fenêtre d’image) avec la taille du FoV dans la carte de mosaïque à rayons X.
      NOTE: Lors de la sélection des zones, tenez compte de la distance entre la bordure (≥10 μm) et d’autres cellules, afin d’éviter le chevauchement des cellules pendant la rotation. De plus, vérifiez l’état de la cellule (forme cellulaire attendue, épaisseur de la glace, succès de la vitrification, propagation fiduciale, etc.).
    2. Alignement de l’échantillon sur l’axe de rotation
      NOTE: La procédure signalée est itérative. L’itération converge plus rapidement en utilisant des angles de ± 60° comme angles de rotation maximaux (θM). S’ils ne sont pas accessibles, utilisez des angles aussi proches que possible de ± 60°.
      1. Réglez l’appareil photo sur 2, temps d’exposition 1 s (> Paramètres d’acquisition > d’acquisition > Paramètres de l’appareil photo et modifiez le temps d’exposition; modifiez Binning; Microscope > Modes d’acquisition > d’acquisition > Continuous > Start), réglez la fente de sortie à 5 μm.
        NOTE: Minimisez la dose autant que possible en travaillant avec une ouverture minimale de la fente de sortie.
      2. Avec la rotation à 0°, déplacez-vous vers la zone précédemment sélectionnée à l’aide de la translation de l’échantillon X et de l’échantillon Y et concentrez-vous sur la caractéristique de la cellule à placer dans l’axe de rotation à l’aide de la translation Z de l’échantillon (contrôle de mouvement > Échantillon et modifiez l’échantillon x; Échantillon y; Exemple z).
      3. Faites pivoter l’échantillon à + θM (Motion Control > Sample et modifiez Sample θ) et tracez une ligne (L+) (cliquez sur le bouton de l’outil de ligne sur le côté droit de la fenêtre d’image) sur la fonction de la cellule à placer sur l’axe de rotation.
      4. Faites pivoter jusqu’à -θM (Motion Control > Sample et modifiez Sample θ) et tracez une ligne (L-) (cliquez sur le bouton de l’outil de ligne sur le côté droit de la fenêtre d’image) sur la fonction de la cellule que vous souhaitez placer sur l’axe de rotation.
      5. À +θM ou -θM, utilisez la translation de l’échantillon Z pour déplacer la fonction sélectionnée vers la position centrale entre les deux lignes (Motion Control > Sample et changez Sample Z).
      6. Répétez la procédure de l’étape 3.3.2.3 de manière itérative jusqu’à ce qu’une distance minimale L+ à L- soit atteinte.
        NOTE: La distance entre les deux lignes L+ et L- doit être plus petite par rapport à l’itération précédente.
      7. À l’échantillon θ = 0 (Motion Control > Sample et change Sample θ), déplacez l’échantillon X deux fois la distance nécessaire pour placer la fonction sélectionnée au centre des deux lignes (Motion Control > Sample et change Sample X). Déplacez la plaque de zone (ZP) X pour ramener la fonction au centre du FoV (Motion Control > ZP et changez ZP X). Effectuez cette étape une seule fois par grille.
      8. Réoptimisez la position ZP Z par rapport au nouvel axe de rotation en enregistrant une série focale ZP Z (collections d’images à différentes positions ZP Z, généralement par pas de 0,3 μm) (Paramètres d’acquisition > d’acquisition > de microscope > Modes d’acquisition > Série focale > Démarrer) et déplacez le ZP Z à la position où l’échantillon est au point (contrôle de mouvement > plaque de zone et changer de plaque de zone z).
      9. Définissez les paramètres pour l’acquisition de la série d’inclinaison.
        NOTE: La plage angulaire maximale est finalement limitée par la distance focale du ZP (±70 ou ±65 degrés pour un ZP de 40 nm ou 25 nm pour un échantillon plat, respectivement). Optimisez le rapport signal/bruit (S/N) et les dommages causés par le rayonnement pour définir le temps d’exposition. Pour la tomographie, utilisez différents temps d’exposition à différentes plages angulaires.
      10. Déterminez la plage angulaire de rotation la plus élevée, au cas où des ombres se produiraient avant que l’angle de rotation maximal ne soit atteint.
      11. Réglez le binning de la caméra sur 1 (Paramètres d’acquisition > d’acquisition du microscope > > Paramètres de la caméra et modifiez Binning), ouvrez la fente de sortie à 15 μm au Mistral (Motion Control > XS et changez XS) et réglez la rotation sur 0° (Motion Control > Sample et changez Sample θ).
      12. Acquérir une seule image avec un temps d’exposition de 1 s (Paramètres d’acquisition > d’acquisition > > d’acquisition > Modes d’acquisition > Démarrage > unique) et estimez le temps d’exposition requis pour chaque angle d’inclinaison de la tomographie.
  4. Acquisition de la tomographie
    1. Passez à l’angle maximal négatif +0,1 (par exemple, pour ZP 25 nm, passez à -65,1°) (Motion Control > Sample et modifiez Sample θ).
    2. Définissez le nombre d’images comme nombre total d’angles (en tenant compte de l’image à l’angle 0) et la plage angulaire (Paramètres d’acquisition > d’acquisition > du microscope > Modes d’acquisition > Tomographie et modifiez le nombre d’images; puis, modifiez Angle Start et Angle End).
    3. Définissez le temps d’exposition défini et démarrez l’acquisition (Microscope > Paramètres d’acquisition > Paramètres d’acquisition > Paramètres de l’appareil photo et modifiez le temps d’exposition , puis cliquez sur Démarrer).
    4. Passez à la position FF (Motion Control > Sample et changez Sample X; puis changez Sample Y) et acquérez 10 images FF (Microscope > Acquisition > Modes d’acquisition > Average et modifiez le nombre d’images, puis cliquez sur Démarrer).
      NOTE: Chez Mistral, la spectromicroscopie ou la microscopie dépendante de l’énergie est possible lors de l’acquisition de projections tout en scannant l’énergie à travers un bord d’absorption d’intérêt. La sortie finale est une pile de projections 2D, qui contiendra un spectre d’absorption des rayons X (XAS) dans chaque pixel, c’est-à-dire des images contenant des informations chimiques. L’extension à la 3D combinant spectroscopie et tomographie est en principe possible. La dose totale requise peut être une limitation, puis des stratégies spécifiques telles que l’imagerie d’absorption différentielle peuvent être nécessaires.

4. Analyse des données

REMARQUE: Toutes les analyses de données sont effectuées avec des logiciels ouverts disponibles et des scripts développés avec des pipelines automatisés.

  1. Au Mistral
    1. Pipeline convertit les piles de tomographie de l’extension txrm (extension logicielle TXM) en hdf5 (format de données hiérarchique open source) avec toutes les métadonnées nécessaires, puis normalise la pile par la moyenne FF et le courant de la machine, et enfin déconvole les piles par la fonction d’étalement de points mesurés du système optique pour une lentille de plaque de zone de Fresnel (ZP) spécifique et l’énergie23, 24. Pour la déconvolution, trouvez la valeur k = 1/SNR appropriée (dépend de l’épaisseur de l’échantillon). Pour le script développé chez Mistral, tapez la commande: txrm2deconv « input tomo » « input FF » -zp="ZP used » - e= " energy " - dx= " pixel size " - k= " 1/SNR " - t=-1.
    2. Pour le script développé chez Mistral pour l’alignement automatique, tapez la commande: ctalignxcorr « normalized deconvolved stack.mrc » « normalized stack.hdf5 ».
      REMARQUE: Un certain nombre d’applications logicielles peuvent être utilisées pour l’alignement des projections sur un axe de rotation commun en utilisant les fiducials Au NP25,26. L’alignement des projections nécessite une précision de sous-pixel. L’alignement automatique ne peut être satisfaisant que lorsque les fiducials Au NP sont suffisants (>7) et bien répartis sur le champ de vision. L’alignement manuel est souvent nécessaire a posteriori pour corriger l’alignement automatique afin d’obtenir la plus grande précision possible.
    3. Pour reconstruire la pile normalisée alignée, utilisez l’un des nombreux algorithmes disponibles.
      REMARQUE: La pile alignée peut être reconstruite à l’aide de la projection arrière pondérée (WBP) ou des techniques de reconstruction itérative simultanée (SIRT) en quelques minutes. Cependant, afin de préserver les coefficients d’absorption linéaires (LAC), les techniques de reconstruction algébrique (ART) sontpréférées 27. ART nécessite plus de temps de calcul, donc SIRT28 est fait en premier pour une reconstruction rapide de la série d’inclinaison alignée automatiquement (30 itérations en quelques minutes). Une fois l’alignement satisfaisant, l’ART sera utilisé.
  2. Chez B24
    1. Un pipeline personnalisé convertit les fichiers de données txrm en Tiffs standard avec toutes les métadonnées nécessaires, puis les envoie à un flux de travail runtomo par lots qui traite les ensembles de données de trois manières : WBP, SIRT et patch.

Representative Results

La préparation d’échantillons pour la cryo-SXT peut être difficile. Même dans la même grille d’échantillon, il est possible d’avoir des zones idéales et des zones qui ne sont pas idéales, comme on peut le voir à la figure 5, qui montre deux carrés de la même grille de recherche Au. L’échantillon idéal devrait avoir des cellules uniques au centre d’un maillage carré, encastrées dans une fine couche de glace et entourées de marqueurs fiduciaux Au bien dispersés utilisés pour l’alignement des projections d’inclinaison avant la reconstruction par tomographie. La figure 5A montre une cellule de type fibroblaste (NIH 3T3) qui répond à bon nombre de ces critères. Une seule tranche d’une reconstruction 3D utilisant ART27 de la zone marquée de la case rouge indiquant le champ de vision (FoV) est représentée à la figure 5B. De nombreux organites différents tels que les mitochondries (M), le réticulum endoplasmique (ER), les vésicules (V) et le noyau (N) peuvent être distingués grâce à la reconstruction quantitative des LAC. De plus, le rapport signal/bruit de la reconstruction est très élevé permettant d’obtenir un contraste élevé des caractéristiques cellulaires. D’autre part, la figure 5C montre un carré avec une densité de cellules plus élevée. Pour cette raison, le buvard est généralement moins efficace, ce qui entraîne une couche de glace plus épaisse, voire des problèmes de vitrification. Dans certains cas, cela peut déjà être observé lors du criblage de la grille à l’aide de la cartographie de l’épifluorescence avant l’imagerie par rayons X, et ces grilles doivent être évitées à tout prix. Dans la figure 5C, on peut observer une fissure à l’intérieur de la grille et de la glace vitrifiée traversant tout le carré de maillage (marqué par les flèches rouges). Toute imagerie près des fissures doit être évitée en raison de l’instabilité probable de la grille lorsqu’elle est exposée au faisceau. De plus, les fissures peuvent être un signe de glace épaisse, comme ce fut le cas dans cette zone. Une série d’inclinaisons a été enregistrée dans la zone marquée de la boîte rouge. Dans la figure 5D, une seule tranche de la reconstruction 3D correspondante est montrée. Même si certaines structures plus grandes peuvent être reconnues, les détails fins sont perdus dans le bruit et la texture granuleuse en raison de la mauvaise qualité de vitrification de la glace épaisse, comme on peut le voir spécifiquement, par exemple, sur les mitochondries supérieures pointées par la flèche.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail. Flux de travail schématique suivi avant la collecte de données cryo-SXT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Cellules en croissance sur des grilles. (A) Cellules poussant dans une boîte de Petri P100 avec une confluence d’environ 80% à 90%. (B) Boîte de Petri P60 avec plusieurs grilles après l’ensemencement des cellules. (C) Cellules se développant au-dessus d’une grille après 24 h. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Grilles de chargement sur les porte-échantillons et dans la chambre de transfert. (A) Poste de travail rempli d’azote liquide avec la navette et les cryoboxes prêtes à charger les grilles. B) Porte-échantillon inséré dans le chargeur avec la grille chargée. (C) Navette avec le porte-échantillon en position 3 sans le couvercle. (D) Poste de travail avec la chambre de transfert fixée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Chargement des échantillons dans le TXM (A) Fixation de la chambre de transfert au TXM. (B) Navette à l’intérieur du TXM. (C) Bras robotisé TXM insérant le porte-échantillon dans l’étage d’échantillonnage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Exemple de tomogrammes cryo-doux à rayons X. Rangée supérieure : échantillon idéal, (A) vue en mosaïque 2D d’un carré quadrillé montrant une cellule isolée au centre. (B) Une tranche du volume 3D reconstruit montrant la zone marquée avec la case rouge (A). Par rapport à (D), l’image est beaucoup plus lisse et plus de détails sont visibles. Rangée inférieure : échantillons non idéaux, (C) vue en mosaïque 2D d’un carré de grille montrant une confluence cellulaire trop élevée et des fissures dans la glace et la feuille de grille (flèches rouges). (D) Une tranche du volume 3D reconstruit montrant la zone marquée de la case rouge en (C). La vitrification pauvre ou sous-optimale peut être identifiée par la texture granuleuse de l’image. N: Noyau; M: Mitochondries; ER: Réticulum endoplasmique; MV: Corps multivésiculaires; V: Vacuole; Barres d’échelle: A & C 20 μm; B & D 2 μm.VVeuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La préparation des échantillons est une étape critique pour obtenir des tomogrammes à rayons X mous de haute qualité, car leur qualité dépend directement de la qualité de la vitrification de l’échantillon et de l’épaisseur de la couche de glace dans laquelle la cellule est incorporée. Les projections avec un rapport signal/bruit élevé seront collectées dans des régions à couche de glace mince, ce qui permettra de minimiser la dose de rayonnement requise pour atteindre la résolution la plus élevée possible. En outre, la confluence cellulaire affectera également la qualité du tomogramme final, car il faut éviter que des cellules voisines pénètrent dans le FoV lors de la rotation. Enfin, la bonne dispersion des marqueurs fiducial Au déterminera la précision de l’alignement de la projection et déterminera finalement la qualité du volume final reconstruit en 3D. Notez qu’une répartition correcte des au fiducials sur la grille permet d’automatiser l’étape d’alignement de la projection, sans laquelle une grande expertise est nécessaire pour une étape aussi critique.

Le protocole ici ne décrit qu’une seule stratégie possible de préparation des échantillons, qui présente des similitudes avec celles utilisées en cryotomographie électronique (cryo-ET). Dans les deux cas, des protocoles améliorant la préparation exigeante des échantillons pour une meilleure reproductibilité seront fondamentaux pour le succès de ces techniques, et des efforts sont déployés pour atteindre cet objectif29. Il convient de mentionner qu’en plus de l’imagerie de cellules isolées, des sections de tissu peuvent également être visualisées à condition que le signal de transmission à travers la section soit suffisant à des angles d’inclinaison élevés. Typiquement, cela impliquera des sections de quelques microns (inférieures à 10 μm).

Pour imager une structure ou un événement spécifique à l’intérieur d’une cellule, il faut s’assurer que cette caractéristique particulière se trouve à l’intérieur du FoV de la série d’inclinaison. Comme le FoV dans cryo-SXT est limité à 10 x 10 μm2 à 15 x 15 μm2 selon l’objectif et en tenant compte d’un suréchantillonnage de pixels de la résolution à au moins un facteur 2, il est souvent plus petit que l’extension complète de la cellule (voir les carrés rouges indiqués à la figure 5). Par conséquent, le retour sur investissement doit être trouvé et correctement étiqueté. Cela se fait généralement au moyen d’étiquettes fluorescentes et d’approches corrélatives à la lumière visible. Les stratégies 2D combinant l’épifluorescence sont simples car le microscope à transmission à rayons X souple dispose d’un microscope à fluorescence de lumière visible en ligne intégré, mais d’autres approches pour le signal de fluorescence 2D ou 3D haute résolution sont également disponibles 4,12,13,15,16 . Dans ces cas, la grille doit d’abord être imagée dans des instruments spécifiques tels que les microscopes à super résolution. Notez que les approches corrélatives les plus efficaces sont celles impliquant la collecte de données dans des conditions cryogéniques. En effet, le laps de temps entre la température ambiante (RT), l’imagerie par fluorescence de la lumière visible et la vitrification des échantillons, par exemple, empêchera de détecter le bon événement cellulaire à temps; en outre, la procédure de vitrification pourrait détacher de la grille la cellule d’intérêt qui a été imagée à RT. Même si la plupart des approches d’imagerie corrélative peuvent impliquer que les grilles d’échantillons doivent être manipulées et transportées d’un instrument à l’autre, et malgré le risque accru de contamination ou de dommages de la grille que cela pose, la récompense est claire: être en mesure d’identifier des événements ou des molécules spécifiques dans le paysage cellulaire.

Lorsque l’imagerie de cellules entières est nécessaire, il est possible de coudre différents tomogrammes à condition que la dose totale appliquée ne dépasse pas la limite de dommages causés par le rayonnement. Habituellement, la dose déposée pour la collecte de quelques tomogrammes sur la même cellule est bien inférieure à la limite à la résolution réalisable (109 Gy) et, par conséquent, aucune stratégie spécifique n’est nécessaire pour réduire la dose, bien que cela dépende de l’échantillon et de l’expérience. Dans le cas d’une collecte intensive de données telles que la spectro-tomographie, il serait en effet nécessaire de minimiser la dose et une collecte de données pratique et des stratégies de traitement spécifiques devraient être appliquées.

Cryo-SXT a plusieurs limitations, qui doivent être mentionnées ici. Le premier est le coin manquant bien connu, qui est intrinsèque à l’utilisation de supports d’échantillon plats. Des supports d’échantillons capillaires permettant une rotation à 180 degrés ont été utilisés dans le passé et sont encore utilisés dans certaines installations, mais ils présentent également des inconvénients tels qu’un contraste appauvri en raison de l’absorption du verre et de la restriction de l’utilisation de cellules en suspension. Un moyen de diminuer l’effet du coin manquant consiste à effectuer une tomographie à double inclinaison. C’est en effet possible à la ligne de faisceau du Mistral de nos jours. La deuxième limitation est définie par la lentille de plaque de zone de Fresnel utilisée dans de tels microscopes. Cet objectif définit la résolution ultime réalisable et la profondeur de champ (DoF), les deux étant étroitement liées. Cela implique que l’augmentation de la résolution diminuera le DoF tandis que l’épaisseur de la cellule sera souvent plus grande. Par exemple, une lentille de 40 nm aura en théorie un DoF de 3 μm et une résolution de 24,4 nm demi-pas. Le compromis entre résolution et DoF est donc stratégique et le choix de l’objectif dépendra du type de cellule30,31. Enfin, les TXM opérationnels dans le monde entier sont loin d’être des microscopes idéaux et des efforts sont déployés pour améliorer les systèmes optiques afin d’atteindre les attentes théoriques. Enfin, la visualisation et la segmentation des volumes reconstruits peuvent être réalisées avec des outils logicielsspécifiques 25,32,33,34.

En résumé, cryo-SXT permet d’imager les cellules quantitativement à moyenne résolution (25-30 nm demi-pas) et en chiffres statistiques (quelques dizaines de tomogrammes par jour). Cela permet d’obtenir l’organisation, la distribution et la dimension des organites dans des conditions spécifiques, par exemple, lors d’infections ou de maladies pathogènes, à des moments précis ou après des traitements particuliers. Il s’agit donc d’une technique d’imagerie biologique complémentaire utile aux microscopies à électrons et à lumière visible les plus courantes, chacune d’entre elles abordant une gamme spécifique de dimensions et de résolution de l’échantillon. Cryo-SXT est fréquemment utilisé dans les approches corrélatives impliquant la fluorescence de la lumière visible, mais d’autres stratégies corrélatives cryogéniques sont également possibles.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce projet a reçu un financement du projet Horizon 2020 iNEXT-Discovery de la Commission européenne et du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 75439.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira Thermo Fisher Software for segmentation
Au Holey Carbon Films  finder grids (Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2 Au G200F1 Au Holey Carbon Films finder grids
Au nanoparticles  BBI Group, Cardiff, UK Au nanoparticles 100nm 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba)
Au nanoparticles  BBI Group, Cardiff, UK Au nanoparticles 250nm 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond)
Axio Scope A1 Zeiss 430035 9060 Fluorescence microscope
Blotting No.1 filter paper Whatman WHA10010155 Blotting filter
Bsoft Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008)
Chimera Software for segmentation (Pettersen et al. 2004)
Cryo-EM Glow Discharge Set PELCO easiGlow 91000S Glow Discharge Cleaning System
Cu Holey Carbon Films  finder grids (Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2Cu G200F1 Cu Holey Carbon Films finder grids
Fetal calf serum Sigma F9665 Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture
ImageJ Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)
IMOD Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996)
Leica EM GP Grid Plunger Leica 16706401 Automatic Plunge Freezer EM
LINKAM cryo-stage Linkam Scientific Instruments CMS 196 Cryo-Correlative Microscopy Stage
MIB Software for segmentation (Belevich et al. 2016)
P100 Petri dish Sigma P6106 Treated for cell culture and sterile
P60 Petri dish Sigma D8054 Treated for cell culture and sterile
Polylysin Sigma P4707 Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered
Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV Xradia NCT-SB Transmission soft X-Ray microscope
SURVOS Software for segmentation  (Luengo et al. 2017)
Tomo3d Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)
TomoJ Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007)
XM Data Explorer Zeiss TXM software

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References

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Groen, J., Sorrentino, A., Aballe, L., Oliete, R., Valcárcel, R., Okolo, C., Kounatidis, I., Harkiolaki, M., Pérez-Berná, A. J., Pereiro, E. A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography. J. Vis. Exp. (169), e62190, doi:10.3791/62190 (2021).

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