Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी द्वारा सेल का एक 3 डी कार्टोग्राफिक विवरण

Published: March 15, 2021 doi: 10.3791/62190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1MISTRAL beamline, Alba Light Source, Cerdanyola del Valles, Spain, 2Beamline B24, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, UK

Summary

यहां, क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी (एसएक्सटी) में आवश्यक नमूना तैयारी और डेटा संग्रह चरणों का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल 25 एनएम हाफ पिच के रिज़ॉल्यूशन पर पूरे क्रायो-संरक्षित कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर की छवि के लिए प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

जैविक अनुसंधान और संबंधित क्षेत्रों में सेल संगठन और मशीनरी को समझने के लिए इमेजिंग तकनीकें मौलिक हैं। इन तकनीकों में से, क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी (एसएक्सटी) पानी की खिड़की एक्स-रे ऊर्जा रेंज (284-543 ईवी) में पूरे क्रायो-संरक्षित कोशिकाओं को इमेजिंग करने की अनुमति देता है, जिसमें कार्बन संरचनाओं में पानी की तुलना में आंतरिक रूप से उच्च अवशोषण होता है, जिससे प्रत्येक वोक्सेल में निहित सामग्री के रैखिक अवशोषण गुणांक के 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति मिलती है। 10 μm मोटी तक पूरी कोशिकाओं के स्तर पर मात्रात्मक संरचनात्मक जानकारी तब इस तरह से प्राप्त की जा सकती है, जिसमें उच्च थ्रूपुट और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन 25-30 एनएम हाफ-पिच तक नीचे है। क्रायो-एसएक्सटी ने वर्तमान बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए खुद को प्रासंगिक साबित किया है, सेलुलर संक्रमण प्रक्रियाओं (वायरस, बैक्टीरिया, या परजीवी) पर 3 डी जानकारी प्रदान करता है, बीमारियों (जैसे अप्रभावी आनुवंशिक रोगों) के कारण रूपात्मक परिवर्तन और सेलुलर स्तर पर दवा की कार्रवाई को समझने में हमारी मदद करता है, या 3 डी सेलुलर वातावरण में विशिष्ट संरचनाओं का पता लगाता है। इसके अलावा, सिंक्रोट्रॉन सुविधाओं में ट्यूनेबल तरंग दैर्ध्य का लाभ उठाकर, स्पेक्ट्रो-माइक्रोस्कोपी या इसके 3 डी समकक्ष, स्पेक्ट्रो-टोमोग्राफी का उपयोग सेल में विशिष्ट तत्वों की छवि और मात्रा निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि जैवखनिजीकरण प्रक्रियाओं में कैल्शियम। क्रायो-एसएक्सटी अन्य जैविक इमेजिंग तकनीकों जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एक्स-रे प्रतिदीप्ति या दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति के लिए पूरक जानकारी प्रदान करता है, और आमतौर पर कार्य, स्थान और आकृति विज्ञान को जोड़ने के लिए क्रायोजेनिक स्थितियों में 2 डी या 3 डी कोरिलेटिव इमेजिंग के लिए एक साथी विधि के रूप में उपयोग किया जाता है।

Introduction

क्रायो-एसएक्सटी जैविक इमेजिंग अनुसंधान में एक केंद्रीय भूमिका निभा सकता है क्योंकि यह हाइड्रेटेड पूरी कोशिकाओं के 1,2,3,4,5,6 के 3 डी मध्यम रिज़ॉल्यूशन (25-30 एनएम आधा पिच) वॉल्यूम प्रदान करता है। पानी की खिड़की ऊर्जा सीमा में, कार्बन और ऑक्सीजन अवशोषण के किनारों (4.4-2.3 एनएम) के बीच, कार्बन समृद्ध सेलुलर संरचनाएं ऑक्सीजन-समृद्ध माध्यम की तुलना में 10 गुना अधिक अवशोषित करती हैं जो उन्हें घेरती हैं और उन्हें घेरती हैं। इस ऊर्जा सीमा में, 10 μm मोटाई तक विट्रीफाइड कोशिकाओं को सेक्शनिंग या धुंधला होने की आवश्यकता के बिना चित्रित किया जा सकता है, जिससे मात्रात्मक उच्च अवशोषण विपरीत अनुमान होते हैं, जो नमूना रोटेशन क्षमताओं के साथ संयुक्त, सेलुलर संरचना के टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण की अनुमति देते हैं। क्रायो-एसएक्सटी नमूना आयामों और स्थानिक संकल्प के मामले में एक आला भरता है जो किसी भी अन्य इमेजिंग तकनीक द्वारा आसानी से सुलभ नहीं है।

संक्षेप में, क्रायो-एसएक्सटी का अवशोषण कंट्रास्ट मात्रात्मक है, क्योंकि मोटाई टी के नमूने के माध्यम से फोटॉनों का क्षीणन बीयर-लैम्बर्ट कानून का पालन करता है: Equation 1, जहां मैं0 घटना की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है और रैखिक अवशोषण गुणांक μ करता है, जो तरंग दैर्ध्य और नमूने के अपवर्तक सूचकांक के β काल्पनिक भाग पर निर्भर करता है (Equation 2 ). क्षीणन जैव रासायनिक संरचना का एक कार्य है और संरचनाओं की मोटाई को चित्रित किया जा रहा है, जिसमें प्रत्येक जैव रासायनिक घटक में एक विशिष्ट एक्स-रे रैखिक अवशोषण गुणांक होता है μएल (एलएसी)। इसका मतलब यह है कि प्रत्येक टोमोग्राफी वोक्सेल मान रासायनिक तत्वों और उस वोक्सेल 7 में उनकी एकाग्रता पर निर्भर करताहै। यह नाभिक, न्यूक्लियोली, लिपिड निकायों या माइटोकॉन्ड्रिया, या क्रोमैटिन के विभिन्न संघनन राज्यों जैसे विभिन्न ऑर्गेनेल के प्राकृतिक भेदभाव के लिए अनुमति देता है जो केवल उनके अंतर्निहित एलएसी मूल्यों के आधार पर 2,8,9 पुनर्निर्मित होते हैं।

इसके अलावा, क्रायो-एसएक्सटी एक उच्च थ्रूपुट तकनीक है जिसमें टोमोग्राम कुछ ही मिनटों में एकत्र किए जाते हैं। यह विशेष रूप से सेल आबादी के मेसोस्केल इमेजिंग को सक्षम बनाता है जिसे विभाजन, भेदभाव और एपोप्टोसिस जैसे प्रमुख समय बिंदुओं पर कब्जा किया जा सकता है, लेकिन विभिन्न प्रतिक्रिया राज्यों में भी जैसे कि विशिष्ट दवा उपचारों या रोगजनक संक्रमणों के लिए रासायनिक जोखिम से प्रेरित। उन प्रमुख बिंदुओं पर एकत्र किए गए डेटा उन विशिष्ट क्षणों में विभिन्न सेलुलर ऑर्गेनेल के स्थानिक संगठन के एक वफादार रिकॉर्ड के साथ सिस्टम का 3 डी विवरण प्रदान करेंगे।

आमतौर पर, क्रायो-एसएक्सटी का उपयोग अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में किया जाता है जो कि 3 डी सेलुलर वातावरण 4,10,11,12,13,14,15,16, या हार्ड एक्स-रे प्रतिदीप्ति डेटा 17,18 के भीतर विशिष्ट विशेषताओं, घटनाओं या मैक्रोमोलेक्यूल्स का पता लगाने की अनुमति देता है। . क्रायोजेनिक स्थितियों में correlative दृष्टिकोण ब्याज की प्रणाली की सबसे पूर्ण और मूल्यवान तस्वीर प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि महत्व के हैं। मिस्ट्रल (अल्बा) और बी 24 (डायमंड) क्रायो-एसएक्सटी बीमलाइनों पर विशिष्ट वर्कफ़्लो का एक संक्षिप्त सारांश चित्र 1 में स्केच किया गया है।

इसके अलावा, सिंक्रोट्रॉन सुविधाओं में तरंग दैर्ध्य ट्यूनिंग क्षमता का लाभ उठाते हुए, स्पेक्ट्रोस्कोपिक जानकारी नमूने में निहित विशेष तत्वों के विशिष्ट विभेदक अवशोषण का उपयोग करके संरचनात्मक एक के अलावा प्राप्त की जा सकती है। इसका एक उदाहरण19,20,21 कोशिकाओं में जैवखनिजीकरण प्रक्रियाओं के अध्ययन में कैल्शियम का स्थान होगा। विभिन्न फोटॉन ऊर्जा (स्पेक्ट्रा) या टोमोग्राम पर 2 डी छवियों को नीचे और ब्याज के एक्स-रे अवशोषण किनारे पर लेने से, चयनित तत्व वाले पिक्सेल या वोक्सेल की पहचान की जा सकती है। स्पेक्ट्रा रासायनिक राज्यों को अलग करने की भी अनुमति देता है (यानी, हाइड्रोक्सियापैटाइट के लिए अनाकार कैल्शियम का विकास जैसा कि पिछले जैव खनिजीकरण उदाहरण20 में है)। 2डी और 3डी में विभिन्न तत्वों का परिमाणीकरण संभव है। विट्रीफाइड कोशिकाओं की स्पेक्ट्रोस्कोपिक इमेजिंग आमतौर पर पानी की खिड़की में की जाती है, लेकिन अन्य ऊर्जा श्रेणियों में भी संभव है यदि पानी की मात्रा पर्याप्त रूप से कम है या यदि निर्जलीकरण सहित अन्य नमूना तैयारीप्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है। एक विस्तृत स्पेक्ट्रोस्कोपी चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल के फोकस से परे है।

इस प्रकार, प्रोटोकॉल प्रमुख नमूना तैयारी चरणों को संक्षेप में सारांशित करने पर केंद्रित है, हालांकि प्रत्येक प्रणाली को व्यक्तिगत शोधन की आवश्यकता हो सकती है, इसके बाद क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण डेटा संग्रह प्रक्रिया हो सकती है।

Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. ग्रिड समर्थन तैयार करना
    1. यूवी के साथ ग्रिड को 3 ज के लिए विकिरणित करें, जिसमें कार्बन फिल्म नसबंदी के लिए ऊपर की ओर सामना कर रही है।
    2. वैकल्पिक: ग्रिड से अनुलग्न नहीं करने वाले कक्षों के साथ समस्याओं के मामले में, निम्न चरणों में से किसी एक का उपयोग करें।
      1. नमूना प्रसार और बेहतर सेल आसंजन बढ़ाने के लिए ग्रिड के प्लाज्मा उपचार द्वारा कार्बन समर्थन पन्नी hydrophilize.
        1. चमक निर्वहन कक्ष उपकरण में ग्रिड कार्बन पक्ष ऊपर रखें और उपकरण के आधार पर 30 s से 15 मिनट (Ar या / और O2 का उपयोग करके) के लिए प्लाज्मा के लिए ग्रिड को उजागर करें।
      2. Poly-L-lysine (PLL) के साथ ग्रिड को कार्यात्मक बनाना
        1. एक पेट्री डिश में 60 μL पीएलएल की अलग-अलग बूंदें जोड़ें और कार्बन फिल्म के साथ PLL ड्रॉप के शीर्ष पर ग्रिड रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और एक फिल्टर पेपर का उपयोग करके पीएलएल को धब्बा करें।
      3. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ ग्रिड functionalize.
        1. रात भर FBS में ग्रिड डुबोएं। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए ग्रिड को धोने और फ़िल्टर पेपर पर छोड़ने के लिए एक बफर समाधान में ग्रिड को डुबोएं।
  2. ग्रिड पर अनुयायियों की कोशिकाओं को बढ़ाना
    1. 80% -90% confluency (चित्रा 2A) तक पहुंचने के लिए 100 मिमी के सेल कल्चर डिश में कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. बीज 1-5 x 105 कोशिकाओं / mL (सिस्टम के लिए मूल्य समायोजित) एक P60 पेट्री डिश (3 एमएल कुल) में Au ग्रिड के शीर्ष पर।
      नोट: सेल निलंबन के अलावा ग्रिड की कार्बन फिल्म के साथ बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए जो 60 मिमी के सेल कल्चर डिश में ऊपर की ओर सामना कर रहा है। प्रति शर्त कई ग्रिड तैयार करें, P60 पेट्री डिश प्रति एक शर्त (चित्रा 2 बी)।
    3. कोशिकाओं को तब तक व्यवस्थित होने की अनुमति दें जब तक कि ग्रिड पर confluency कई कोशिकाओं तक नहीं पहुंच जाती (सेल के आकार के आधार पर 1 से 10) प्रत्येक जाल वर्ग में (सेल लाइन के आधार पर, इसमें 24 घंटे तक का समय लग सकता है)।
      नोट: ठंड से पहले, ग्रिड को एक दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप (वीएलएम) के साथ जांचा जाना चाहिए, जो कार्बन फिल्म अखंडता के साथ-साथ प्रत्येक ग्रिड (चित्रा 2 सी) में सेल कॉन्फ्लुएंसी का मूल्यांकन करता है। ग्रिड पर उचित सेल घनत्व तक पहुँचने तक पहुँचने तक प्रतीक्षा करें। यदि ग्रिड बहुत confluent है या कार्बन पन्नी टूट गया है, तो शुरू करें।
  3. ग्रिड पर निलंबन में कोशिकाओं का निक्षेपण
    1. डुबकी फ्रीजर से चिमटी का उपयोग करके एक तैयार Au या Cu ग्रिड चुनें (अनुभाग 1.6 देखें)।
    2. एक 1-5 x 105 सेल निलंबन (बैक्टीरिया के मामले में 0.3 का ऑप्टिकल घनत्व अवशोषण) तैयार करें और ग्रिड में तैयार निलंबन के 4 μL जोड़ें।
    3. कोशिकाओं के जमाव की अनुमति देने के लिए कुछ मिनटों के लिए ड्रॉप के साथ ग्रिड को क्षैतिज रूप से इनक्यूबेट करें और फिर जलवायु-नियंत्रित विट्रीफिकेशन चैंबर के अंदर ग्रिड को रखने वाले चिमटी को उचित तापमान और आर्द्रता की स्थिति (चरण 1.6.1) पर सेट करें।
  4. वैकल्पिक: नमूनों की फ्लोरोसेंट टैगिंग
    नोट: नमूने के कुछ ऑर्गेनेल को फ्लोरोसेंटली लेबल करना फायदेमंद हो सकता है। ब्याज के आधार पर, विशिष्ट fluorophores या कोशिकाओं को स्थिर रूप से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त या ब्याज के एक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए transfected इस्तेमाल किया जा सकता है. यह क्रायो-एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिकाओं का आसान पता लगाने की अनुमति देता है और बाद के एक्स-रे इमेजिंग के लिए ब्याज की कोशिकाओं को खोजने में सहायता करता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल केवल फ्लोरोफोरस के उपयोग का विवरण देता है।
    1. फ्लोरोफोर के लिए एक कामकाजी समाधान तैयार करें (निर्माता की सिफारिश देखें) और विशिष्ट प्रोटोकॉल का पालन करें।
    2. ग्रिड युक्त पेट्री डिश में फ्लोरोफोर्स जोड़ें और धीरे से मिलाएं।
    3. एक अंधेरे वातावरण में इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दें और इनक्यूबेशन समाप्त होने के बाद सीधे चरण 1.6 पर जाएं।
      नोट: एक बार जब इनक्यूबेशन समाप्त हो जाता है तो अविशिष्ट टैगिंग और परिणामस्वरूप धुंधले फ्लोरोसेंट सिग्नल से बचने के लिए तैयार रहना महत्वपूर्ण है।
  5. Tomogram प्रक्षेपण संरेखण के लिए Au नैनोकणों (NPs) तैयारी
    1. Au fiducial स्टॉक समाधान के 1mL का एक एलीकोट लें (मिस्ट्रल में 100 एनएम या B24 पर 250 एनएम) और कम गति पर सेंट्रीफ्यूज (एकत्रीकरण से बचने के लिए) 1 मिनट के लिए एनपी को गोली मारने की अनुमति देने के लिए।
      नोट: यदि संभव हो, तो एकत्रीकरण से बचने के लिए स्वाभाविक रूप से रातोंरात या उससे अधिक बसने के लिए फिड्यूशियल्स को छोड़ना पसंद किया जाता है।
    2. supernatant निकालें. ठंड से ठीक पहले, एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए 20 μL सीरम-मुक्त माध्यम या बफर समाधान में एनपी को फिर से निलंबित करें।
      नोट: Sonication और भंवर समाधान homogenize मदद करने के लिए सिफारिश की है.
  6. डुबकी-फ्रीजिंग ग्रिड
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन ठंड-जलन का कारण बन सकता है और उचित सुरक्षात्मक उपकरण पहने जाने चाहिए (लंबे प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मे, दस्ताने, लंबी पैंट और बंद जूते)। एथेन अत्यधिक विस्फोटक है और इसे किसी भी स्पार्क्स या खुली आग से दूर रखा जाना चाहिए।
    1. प्लंज फ्रीजर उपकरण को तैयार करने और उपयोग करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
      नोट: आर्द्रता आमतौर पर 80% -90% पर सेट होती है; तापमान सेल प्रकार (खमीर 30 डिग्री सेल्सियस अधिकतम, स्तनधारी कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस, कीट कोशिकाओं 28 डिग्री सेल्सियस, आदि) पर निर्भर करेगा।
    2. रिम द्वारा पेट्री डिश से बढ़ते चिमटी के साथ एक ग्रिड लें, ग्रिड को मोड़ने और इसे डुबकी फ्रीजर डिवाइस पर माउंट न करने के लिए बहुत ध्यान रखें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं ब्लोटिंग पेपर से दूर होती हैं।
    3. वैकल्पिक: अनुयायी कोशिकाओं के मामले में बफर में ग्रिड को तीन बार धोएं।
    4. कोशिकाओं के शीर्ष पर Au NP fiducials के 1.5 μL जोड़ें (कक्ष के दाईं ओर छेद के माध्यम से) और ग्रिड को ब्लोटिंग और डुबोने से पहले 30 s के लिए बसने के लिए छोड़ दें।
      नोट: निलंबन में कोशिकाओं के मामले में, ग्रिड में Au NP fiducials जोड़ें, जबकि यह चिमटी को माउंट करने से पहले अभी भी क्षैतिज स्थिति में है और उन्हें 30 s के लिए बसने दें। ब्लोटिंग उच्च गुणवत्ता वाले ग्रिड के लिए महत्वपूर्ण है। ब्लोटिंग दूरी को शुरू करने से पहले कैलिब्रेट करने की आवश्यकता होती है; ब्लोटिंग पेपर की सपाटता पुनरुत्पादक ब्लोटिंग के लिए महत्वपूर्ण है (निर्माता द्वारा निर्देशों का पालन करें)। ब्लोटिंग समय को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है।
    5. प्रति शर्त कई ग्रिड तैयार करें। vitrification को संरक्षित करने के लिए क्रायोजेनिक तापमान पर ग्रिड और स्टोर को स्थानांतरित करें।
  7. क्रायो दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ स्क्रीनिंग ग्रिड
    1. क्रायो-बक्से से तरल नाइट्रोजन के तहत ग्रिड को एक मानक क्रायो-कैसेट (3 मिमी टीईएम ग्रिड के लिए तीन पदों) में एक पूर्व-ठंडा क्रायो-चरण के अंदर स्थानांतरित करें (निर्माता से निर्देश देखें)।
    2. क्रायो-कैसेट को क्रायो-स्टेज ब्रिज पर रखा जाता है और क्रायो-स्टेज को एक विस्तृत क्षेत्र एपिफ्लोरेसेंस लाइट माइक्रोस्कोप पर रखा जाता है।
    3. क्रायो-एसएक्सटी इमेजिंग के लिए उपयुक्त कोशिकाओं का पता लगाने और ग्रिड की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक लंबी काम करने वाली दूरी के उद्देश्य (10x, 50x, 100x) का उपयोग करके -196.5 डिग्री सेल्सियस पर ग्रिड की छवि बनाएं और ग्रिड की गुणवत्ता का आकलन करें (मोटी बर्फ की उपस्थिति, कार्बन समर्थन फिल्म की अखंडता, फ्लोरोसेंट सिग्नल की उपस्थिति, आदि)।
    4. उज्ज्वल क्षेत्र या / और प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके ब्याज की कोशिकाओं को स्थानीयकृत करें।
      नोट:: इस स्तर पर, छवियों को कैप्चर करें यदि कोई लिंक किया गया कैमरा माइक्रोस्कोप पर मौजूद है। छवि सहसंबंध के लिए इसका उपयोग करें।
    5. स्क्रीनिंग के बाद, ग्रिड को तरल नाइट्रोजन भंडारण देवर में क्रायो-बक्से में वापस कर दें।
      नोट: यदि कोई अच्छा नमूना नहीं मिला है, तो किसी भी पैरामीटर को संशोधित करने वाले नमूना तैयारी चरणों को दोहराएं। आमतौर पर, जिन मापदंडों को संशोधन की आवश्यकता होती है, वे ब्लोटिंग समय होते हैं, यदि बर्फ बहुत मोटी है या confluency है, यदि प्रति जाल वर्ग बहुत अधिक कोशिकाएं हैं।

2. ट्रांसमिशन एक्स-रे माइक्रोस्कोप (TXM) में लोड हो रहा है

  1. तरल नाइट्रोजन के साथ स्थानांतरण कक्ष को ठंडा करें जब तक कि यह <100 K तक नहीं पहुंच जाता है, वर्कस्टेशन (चित्रा 3 ए) को ठंडा करें और वर्कस्टेशन रिम के हीटर को चालू करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह उबलना बंद न हो जाए।
  2. वर्कस्टेशन (चित्रा 3ए) में संबंधित स्थानों में ग्रिड युक्त आवश्यक क्रायो-बक्से रखें। क्रायो परिस्थितियों में उन्हें सुरक्षित रूप से स्थानांतरित करने पर ध्यान दें।
  3. चयनित ग्रिड को पहले ठंडा किए गए नमूना धारकों में लोड करें (चित्रा 3 बी); शटल पर धारकों लोड और कवर के साथ उन्हें की रक्षा (चित्रा 3 सी).
  4. <100 K पर स्थानांतरण कक्ष में शटल लोड करें और इसे कम वैक्यूम (चित्रा 3 डी) तक पंप करें।
  5. TXM (चित्रा 4A) के लिए स्थानांतरण कक्ष अनुलग्न करें और स्क्रीन पर वैक्यूम प्रक्रिया (चित्रा 4B) के बाद TXM में स्थानांतरण कक्ष से शटल लोड करें।
  6. एक बार शटल नमूनों के साथ अंदर है, TXM रोबोट हाथ नमूना चरण (चित्रा 4 C) के लिए एक समय में एक नमूना धारक ला सकते हैं।

3. TXM सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इमेजिंग

नोट: नमूना चरण में ग्रिड को पहले एक ऑन-लाइन दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप (वीएलएम) का उपयोग करके छविबद्ध किया जाता है ताकि एक्स-रे के साथ चित्रित होने से पहले ब्राइटफील्ड और / या प्रतिदीप्ति मोड में ग्रिड को मैप किया जा सके। मोशन कंट्रोल को खोलने के लिए शीर्ष बाएँ पैनल पर मोशन कंट्रोल टैब के अनुरूप जॉयस्टिक आइकन का उपयोग करें।

  1. ऑन-लाइन VLM के साथ ग्रिड इमेजिंग।
    1. उज्ज्वल क्षेत्र मोज़ेक अधिग्रहण
      1. VLM कैमरा (आवर्धक लेंस > VLM) का चयन करें और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > स्रोत सेटिंग्स > स्रोत सेटिंग्स) के लिए VLM नेतृत्व स्रोत को चालू करें।
      2. VLM उद्देश्य (गति नियंत्रण > नमूना > नमूना π) का सामना करने के लिए नमूना -60 डिग्री के लिए घुमाएँ और नमूना को अपेक्षित केंद्रित पदों (गति नियंत्रण > नमूना और परिवर्तन नमूना X, नमूना Y) के लिए नमूना ले जाएँ।
      3. ग्रिड को मोटे तौर पर ध्यान में लाने के लिए पहले 20 से 50 μm के चरणों में छवियों को प्राप्त करते समय (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > निरंतर > प्रारंभ; गति नियंत्रण > नमूना और परिवर्तन नमूना Z).
      4. 5 μm तक छोटे चरणों के साथ फ़ोकस को परिष्कृत करें जब तक कि कोशिकाओं और / या कार्बन समर्थन फिल्म के छेद फोकस में न हों (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > निरंतर > शुरू >; मोशन कंट्रोल > नमूना और परिवर्तन नमूना जेड) और उज्ज्वल क्षेत्र मोड में ग्रिड के एक पूर्ण मोज़ेक मानचित्र का अधिग्रहण शुरू करते हैं। मोज़ेक के लिए डिफ़ॉल्ट मानों का उपयोग करें। (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > मोज़ेक > स्टार्ट) का अधिग्रहण)।
        नोट: एक मोज़ेक मानचित्र एकल छवियों से बना है। छवियों की संख्या (स्तंभों, पंक्तियों की संख्या, और X और Y में चरण आकार) को पूरे ग्रिड को विज़ुअलाइज़ करने के लिए सेट किया जाना चाहिए। चरण का आकार दृश्य के फ़ील्ड (FoV) के आकार पर निर्भर करता है. डिफ़ॉल्ट मान यहाँ उपयोग किए जाते हैं। यदि ग्रिड पूर्ण मोज़ेक FoV के संबंध में X-Y विमान में अच्छी तरह से केंद्रित नहीं है, तो अधिग्रहण को रोकें, नमूना X और Y निर्देशांक को सही करें और अधिग्रहण को दोहराएं।
    2. प्रतिदीप्ति मोड मोज़ेक अधिग्रहण
      1. उज्ज्वल फ़ील्ड इमेजिंग (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > स्रोत सेटिंग्स और डी-सेलेक्ट ट्रांसमिशन) के लिए VLM-नेतृत्व वाले स्रोत को बंद करें और वांछित उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (लाल, हरा, या नीला) और सेट-अप पर मैन्युअल रूप से संबंधित ऑप्टिकल फ़िल्टर के अनुरूप एलईडी प्रकाश स्रोत का चयन करें।
      2. प्रतिदीप्ति छवि (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > निरंतर > प्रारंभ > पर ध्यान केंद्रित परिष्कृत; मोशन कंट्रोल > नमूना और परिवर्तन नमूना Z), और फिर एक मोज़ेक मानचित्र प्राप्त उज्ज्वल क्षेत्र मोज़ेक (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > मोज़ेक > प्रारंभ) से स्थितीय मापदंडों (एक्स और वाई) को बनाए रखने के लिए।
      3. एलईडी लाइट-सोर्स को बंद करें
      4. वैकल्पिक: उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति मोज़ेक मानचित्रों के आधार पर, पहले से पहचाने गए ब्याज (ROI) के क्षेत्रों (चरण 1.7.4) या नए ROI (छवि में X-Y पदों) को एनोटेट करें।
  2. एक्स-रे मोज़ेक अधिग्रहण
    1. सीसीडी एक्स-रे डिटेक्टर का चयन करें (आवर्धक लेंस > Pixis का चयन करें), नमूना 0 डिग्री रोटेशन (नमूना > गति नियंत्रण और परिवर्तन नमूना π) के लिए नमूना लाने के लिए और एक्स-रे प्रकाशिकी (संघनित्र और ज़ोन प्लेट) संरेखित पदों (गति नियंत्रण > संघनित्र > कंडेंसर z बदलने के लिए) स्थानांतरित; गति नियंत्रण > ज़ोन प्लेट और बदलें ज़ोन प्लेट Z)।
      नोट: इमेजिंग से पहले सीसीडी चिप को -65 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें (माइक्रोस्कोप > कैमरा तापमान pixis > और सेट तापमान को -65 डिग्री सेल्सियस पर बदलें और लागू करें पर क्लिक करें)।
    2. नमूना चयनित ROI (गति नियंत्रण > नमूना और बदलें नमूना X, नमूना Y) में से एक के जाल वर्ग के केंद्र के लिए नमूना ले जाएँ।
    3. Binning 2 का उपयोग करें और 5 μm पर बाहर निकलें भट्ठा विकिरण और 1 s Mistral में जोखिम को कम करने के लिए, और B24 पर 1 और 60 μm binning, नमूना Z अनुवाद (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > कैमरा सेटिंग्स और binning बदलने का उपयोग कर फोकस को समायोजित; गति नियंत्रण एक्सएस > और एक्सएस को बदलने के लिए; माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स> अधिग्रहण मोड > निरंतर > प्रारंभ; गति नियंत्रण > नमूना और परिवर्तन नमूना Z). 5 μm के चरणों में शुरू करें और इसे 0.5 μm के चरणों तक परिष्कृत करें, जब तक कि सेल या कार्बन पन्नी छेद अच्छी तरह से ध्यान में न हों।
    4. जाल वर्ग का एक मोज़ेक मानचित्र प्राप्त करें (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > मोज़ेक > प्रारंभ) का एक मोज़ेक मानचित्र प्राप्त करें।
      नोट: मोज़ेक अधिग्रहण पैरामीटर को उसी तरह से निर्धारित किया जा सकता है जैसे कि वीएलएम मोज़ेक (अनुभाग 3.1.1.4) के लिए। चरण का आकार बीमलाइन कर्मचारियों द्वारा पूर्व-चयनित आवर्धन पर निर्भर करता है।
    5. नमूना को एक फ्लैट-फील्ड (एफएफ) स्थिति (ग्रिड के भीतर एक खाली क्षेत्र, अधिमानतः कार्बन समर्थन में एक छेद) (नमूना > गति नियंत्रण और नमूना एक्स, नमूना वाई बदलने) में ले जाएँ।
    6. Mistral पर 1 s और B24 पर 0.5 s के लिए एक्सपोज़र समय सेट करें (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > कैमरा सेटिंग्स और एक्सपोज़र समय बदलें) और एक एकल छवि (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण मोड > एकल > प्रारंभ) प्राप्त करें।
    7. संचरण प्राप्त करने के लिए (0 और 1 के बीच के मूल्यों के साथ) और सामान्यीकृत मोज़ेक को बचाने के लिए एफएफ छवि द्वारा अधिग्रहित मोज़ेक को सामान्य (विभाजित करें) (मेनू को खोलने के लिए छवि के दाईं ओर पहले दाएं ऊपरी कोने के आइकन पर क्लिक करें>अनुवाद टैब को खोलें> एकल संदर्भ क्लिक करें और विशिष्ट एफएफ ब्राउज़ करें)।
  3. एक्स-रे झुकाव-श्रृंखला एकत्र करने की तैयारी
    नोट: प्रतिबिंबित किए जा रहे ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए रोटेशन अक्ष ज्ञात कीजिये।
    1. टोमोग्राफी करने के लिए मोज़ेक के भीतर क्षेत्रों का चयन करें, यानी, एक्स-रे मोज़ेक मानचित्र में एफओवी के आकार के साथ एक वर्ग आकार (छवि विंडो के बाईं ओर टूल पर क्लिक करें) रखकर।
      नोट: क्षेत्रों का चयन करते समय, रोटेशन के दौरान कोशिकाओं के ओवरलैप से बचने के लिए सीमा (≥10 μm) और अन्य कोशिकाओं से दूरी पर विचार करें। इसके अलावा, सेल की स्थिति की जांच करें (अपेक्षित सेल आकार, बर्फ की मोटाई, विट्रीफिकेशन की सफलता, फिड्यूशियल स्प्रेड, आदि)।
    2. रोटेशन अक्ष पर नमूना संरेखण
      नोट: रिपोर्ट की गई प्रक्रिया पुनरावर्ती है। पुनरावृत्ति अधिकतम घूर्णन कोणों के रूप में ± 60° कोणों का उपयोग करके तेजी से अभिसरण करती है (πM). यदि वे सुलभ नहीं हैं, तो 60 डिग्री ± के लिए जितना संभव हो उतना करीब कोणों का उपयोग करें।
      1. कैमरा binning 2, एक्सपोजर समय 1 s (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स कैमरा सेटिंग्स > और एक्सपोज़र समय बदलने के लिए कैमरा सेट करें; Binning बदलें; माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण मोड > निरंतर > प्रारंभ), 5 μm करने के लिए निकास भट्ठा सेट।
        नोट: बाहर निकलें भट्ठा के न्यूनतम एपर्चर के साथ काम करके जितना संभव हो उतना खुराक को कम करें।
      2. 0 ° पर रोटेशन के साथ, नमूना X और नमूना Y अनुवाद का उपयोग करके पहले से चयनित क्षेत्र में जाएं और नमूना Z अनुवाद (मोशन कंट्रोल > नमूना का उपयोग करके रोटेशन अक्ष में डालने के लिए सेल की सुविधा पर ध्यान केंद्रित करें और नमूना x बदलें; नमूना y; नमूना z)।
      3. नमूना को + πM (मोशन कंट्रोल > नमूना और परिवर्तन नमूना π) पर घुमाएं और रोटेशन अक्ष पर रखने के लिए सेल की सुविधा पर एक रेखा (L+) (छवि विंडो के दाईं ओर लाइन टूल बटन पर क्लिक करें) खींचें।
      4. -πM (मोशन कंट्रोल > नमूना और बदलें नमूना) पर घुमाएं और उस कक्ष की सुविधा पर एक रेखा (L-) (छवि विंडो के दाईं ओर लाइन टूल बटन पर क्लिक करें) खींचें जिसे आप रोटेशन अक्ष पर रखना चाहते हैं।
      5. जबकि +πM या -πM पर, चयनित सुविधा को दोनों लाइनों के बीच केंद्र की स्थिति में ले जाने के लिए नमूना Z अनुवाद का उपयोग करें (गति नियंत्रण > नमूना और नमूना Z परिवर्तित करें)।
      6. चरण 3.3.2.3 से प्रक्रिया को दोहराएँ पुनरावर्ती रूप से जब तक कि L+ से L- तक न्यूनतम दूरी तक नहीं पहुँच जाता.
        नोट: दो लाइनों L+ और L के बीच की दूरी पिछले पुनरावृत्ति के संबंध में छोटी होनी चाहिए।
      7. नमूना π = 0 (गति नियंत्रण > नमूना और परिवर्तन नमूना π) पर, नमूना X को दोनों लाइनों के केंद्र में चयनित सुविधा को रखने के लिए आवश्यक दूरी से दोगुना स्थानांतरित करें (गति नियंत्रण > नमूना और नमूना X बदलें)। सुविधा को वापस FoV (ZP > गति नियंत्रण और ZP X परिवर्तित) के केंद्र में लाने के लिए ज़ोन प्लेट ( ZP) X ले जाएँ। इस चरण को प्रति ग्रिड केवल एक बार करें।
      8. एक ZP Z फोकल श्रृंखला (विभिन्न ZP Z पदों पर छवियों के संग्रह, आमतौर पर 0.3 μm के चरणों में) (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > फोकल सीरीज़ > स्टार्ट) रिकॉर्ड करके नए रोटेशन अक्ष के संबंध में ZP Z स्थिति को फिर से अनुकूलित करें और ZP Z को उस स्थिति में ले जाएं जहां नमूना फोकस में है (मोशन कंट्रोल > ज़ोन प्लेट और ज़ोन प्लेट z बदलें)।
      9. झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण के लिए पैरामीटर सेट करें।
        नोट: अधिकतम कोणीय सीमा अंततः ZP की फोकल लंबाई द्वारा सीमित होती है (±70 या ±65 डिग्री क्रमशः एक फ्लैट नमूने के लिए 40 एनएम या 25 एनएम जेडपी के लिए)। एक्सपोज़र समय को परिभाषित करने के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एस / एन) और विकिरण क्षति को अनुकूलित करें। टोमोग्राफी के लिए, विभिन्न कोणीय श्रेणियों में अलग-अलग एक्सपोज़र समय का उपयोग करें।
      10. उच्चतम घूर्णन कोणीय श्रेणी निर्धारित करें, यदि अधिकतम घूर्णन कोण तक पहुंचने से पहले छायांकन होता है।
      11. कैमरा binning करने के लिए 1 (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > कैमरा सेटिंग्स और Binning बदलने के लिए सेट करें), Mistral (मोशन कंट्रोल > XS और परिवर्तन XS ) पर 15 μm के लिए निकास भट्ठा खोलें और रोटेशन को 0 ° (मोशन कंट्रोल > नमूना और परिवर्तन नमूना π) पर सेट करें।
      12. 1 s के एक एक्सपोजर समय के साथ एक एकल छवि प्राप्त करें (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड > एकल > प्रारंभ) और टोमोग्राफी के प्रत्येक झुकाव कोण के लिए आवश्यक एक्सपोज़र समय का अनुमान लगाएं।
  4. टोमोग्राफी अधिग्रहण
    1. नकारात्मक अधिकतम कोण +0.1 पर जाएँ (उदाहरण के लिए, ZP 25 nm के लिए -65.1°) पर जाएँ (गति नियंत्रण > नमूना और परिवर्तन नमूना π).
    2. कोणों की कुल संख्या के रूप में छवियों की संख्या सेट करें (कोण 0 पर छवि को ध्यान में रखते हुए) और कोणीय रेंज (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > अधिग्रहण मोड टोमोग्राफी > और छवियों की संख्या को बदलते हैं; फिर, कोण प्रारंभ और कोण अंत बदलें)।
    3. निर्धारित एक्सपोज़र समय सेट करें और अधिग्रहण (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण सेटिंग्स > कैमरा सेटिंग्स > प्रारंभ करें और एक्सपोज़र समय बदलें और फिर प्रारंभ पर क्लिक करें)।
    4. एफएफ स्थिति (नमूना > गति नियंत्रण और बदलें नमूना एक्स पर जाएँ ; फिर, नमूना Y बदलें) और 10 एफएफ छवियों (माइक्रोस्कोप > अधिग्रहण > अधिग्रहण मोड > औसत और छवियों की संख्या बदलने और फिर प्रारंभ पर क्लिक करें) प्राप्त करें।
      नोट: मिस्ट्रल में, स्पेक्ट्रोमाइक्रोस्कोपी या ऊर्जा-निर्भर माइक्रोस्कोपी संभव है जब ब्याज के अवशोषण किनारे पर ऊर्जा को स्कैन करते समय अनुमानों को प्राप्त किया जाता है। अंतिम आउटपुट 2 डी अनुमानों का एक ढेर है, जिसमें प्रत्येक पिक्सेल में एक एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रम (एक्सएएस) होगा, यानी, रासायनिक जानकारी के साथ छवियां। टोमोग्राफी के साथ स्पेक्ट्रोस्कोपी के संयोजन के लिए 3 डी का विस्तार सिद्धांत रूप में संभव है। आवश्यक कुल खुराक एक सीमा हो सकती है और फिर विशिष्ट रणनीतियों जैसे कि विभेदक अवशोषण इमेजिंग की आवश्यकता हो सकती है।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: सभी डेटा विश्लेषण उपलब्ध खुले सॉफ़्टवेयर और स्वचालित पाइपलाइनों के साथ विकसित स्क्रिप्ट के साथ किया जाता है।

  1. मिस्ट्रल में
    1. पाइपलाइन सभी आवश्यक मेटाडेटा के साथ txrm एक्सटेंशन (TXM सॉफ़्टवेयर एक्सटेंशन) से hdf5 (ओपन सोर्स पदानुक्रमित डेटा प्रारूप) तक टोमोग्राफी स्टैक को परिवर्तित करती है, फिर एफएफ औसत और मशीन वर्तमान द्वारा स्टैक को सामान्य करती है, और अंत में एक विशिष्ट फ्रेस्नेल ज़ोन प्लेट (ZP) लेंस और ऊर्जा23 के लिए ऑप्टिकल सिस्टम के मापा बिंदु प्रसार समारोह द्वारा स्टैक को डीकॉन्वॉल्व करती है, २४ । deconvolution के लिए, उचित k = 1/SNR मान ज्ञात कीजिये (नमूना मोटाई पर निर्भर करता है)। Mistral पर विकसित स्क्रिप्ट के लिए, कमांड टाइप करें: txrm2deconv "इनपुट टोमो" "इनपुट एफएफ" -zp = "ZP इस्तेमाल किया गया" - e = "ऊर्जा" - dx = " पिक्सेल आकार " - k = " 1 / SNR " - t = -1।
    2. स्वचालित संरेखण के लिए मिस्ट्रल में विकसित स्क्रिप्ट के लिए, कमांड टाइप करें: ctalignxcorr "normalized deconvolved stack.mrc" "normalized stack.hdf5"।
      नोट:: सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोगों की एक संख्या Au NP fiducials25,26 का उपयोग कर एक सामान्य रोटेशन अक्ष के लिए अनुमानों के संरेखण के लिए उपयोग किया जा सकता है। अनुमानों के संरेखण के लिए सबपिक्सेल सटीकता की आवश्यकता होती है। स्वचालित संरेखण केवल संतोषजनक हो सकता है जब Au NP fiducials पर्याप्त हैं (>7) और अच्छी तरह से दृश्य के क्षेत्र में फैल जाते हैं। मैनुअल संरेखण को अक्सर उच्चतम संभव सटीकता प्राप्त करने के लिए स्वचालित संरेखण को सही करने के लिए एक पश्चवर्ती की आवश्यकता होती है।
    3. संरेखित सामान्यीकृत स्टैक का पुनर्निर्माण करने के लिए, उपलब्ध कई एल्गोरिदम में से किसी का उपयोग करें।
      नोट:: संरेखित स्टैक कुछ ही मिनटों में भारित वापस प्रक्षेपण (WBP) या एक साथ पुनरावर्ती पुनर्निर्माण तकनीक (SIRT) का उपयोग कर पुनर्निर्माण किया जा सकता है। हालांकि, रैखिक अवशोषण गुणांक (एलएसी) को संरक्षित करने के लिए, बीजीय पुनर्निर्माण तकनीक (एआरटी)को प्राथमिकता दी जाती है। एआरटी को अधिक कंप्यूटिंग समय की आवश्यकता होती है, इसलिए SIRT28 को पहले एक तेज स्वचालित-संरेखित झुकाव श्रृंखला पुनर्निर्माण (कुछ मिनटों में 30 पुनरावृत्तियों) के लिए किया जाता है। एक बार संरेखण संतोषजनक होने के बाद, एआरटी का उपयोग किया जाएगा।
  2. B24 पर
    1. एक कस्टम-निर्मित पाइपलाइन txrm डेटा फ़ाइलों को आवश्यक सभी मेटाडेटा के साथ मानक Tiffs में कनवर्ट करती है और फिर उन्हें बैच रनटोमो वर्कफ़्लो में भेजती है जो डेटा को तीन तरीकों से सेट करती है: WBP, SIRT, और पैच।

Representative Results

क्रायो-एसएक्सटी के लिए नमूने तैयार करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यहां तक कि एक ही नमूना ग्रिड के भीतर, उन क्षेत्रों का होना संभव है जो आदर्श हैं, और ऐसे क्षेत्र जो गैर-आदर्श हैं, जैसा कि चित्रा 5 में देखा जा सकता है, जो एक ही एयू फाइंडर ग्रिड से दो वर्गों को दिखाता है। आदर्श नमूने में एक वर्ग जाल के केंद्र में एकल कोशिकाएं होनी चाहिए, जो बर्फ की एक पतली परत में एम्बेडेड होती हैं और टोमोग्राफी पुनर्निर्माण से पहले झुकाव अनुमानों के संरेखण के लिए उपयोग किए जाने वाले अच्छी तरह से बिखरे हुए एयू फिड्यूशियल मार्करों से घिरी होती हैं। चित्रा 5A एक फाइब्रोब्लास्ट-जैसे सेल (एनआईएच 3T3) को दर्शाता है जो इनमें से कई मानदंडों का अनुपालन करता है। लाल बॉक्स के साथ चिह्नित क्षेत्र के ART27 का उपयोग करके 3D पुनर्निर्माण से एक एकल स्लाइस दृश्य के क्षेत्र (FoV) को दर्शाता है , चित्र 5B में दिखाया गया है। माइटोकॉन्ड्रिया (एम), एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), पुटिकाओं (वी) और नाभिक (एन) जैसे कई अलग-अलग ऑर्गेनेल को एलएसी के मात्रात्मक पुनर्निर्माण के लिए धन्यवाद प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसके अलावा, पुनर्निर्माण का सिग्नल-टू-शोर अनुपात बहुत अधिक है जो सेलुलर सुविधाओं के उच्च विपरीत को प्राप्त करने की अनुमति देता है। दूसरी ओर, चित्रा 5C उच्च सेल घनत्व के साथ एक वर्ग दिखाता है। इस वजह से, ब्लोटिंग आमतौर पर कम कुशल होता है, जिससे एक मोटी बर्फ की परत, या यहां तक कि विट्रीफिकेशन के मुद्दे भी होते हैं। कुछ मामलों में, एक्स-रे इमेजिंग से पहले एपिफ्लोरेसेंस मैपिंग का उपयोग करके ग्रिड की स्क्रीनिंग करते समय यह पहले से ही देखा जा सकता है, और उन ग्रिडों को किसी भी कीमत पर टाला जाना चाहिए। चित्रा 5 C में, ग्रिड के भीतर एक दरार और विट्रिफाइड बर्फ को पूरे जाल वर्ग (लाल तीर द्वारा चिह्नित) के माध्यम से देखा जा सकता है। दरारों के पास किसी भी इमेजिंग को बीम के संपर्क में आने पर ग्रिड की संभावित अस्थिरता के कारण टाला जाना चाहिए। इसके अलावा, दरारें मोटी बर्फ का संकेत हो सकती हैं, जैसा कि इस क्षेत्र में हुआ था। लाल बॉक्स के साथ चिह्नित क्षेत्र में एक झुकाव श्रृंखला दर्ज की गई थी। चित्रा 5D में, संबंधित 3D पुनर्निर्माण से एक एकल टुकड़ा दिखाया गया है। भले ही कुछ बड़ी संरचनाओं को पहचाना जा सकता है, मोटी बर्फ की खराब विट्रीफिकेशन गुणवत्ता के कारण शोर और दानेदार बनावट के भीतर ठीक विवरण खो जाते हैं, जैसा कि विशेष रूप से देखा जा सकता है, उदाहरण के लिए, तीर द्वारा इंगित ऊपरी माइटोकॉन्ड्रिया पर।

Figure 1
चित्र 1: वर्कफ़्लो. क्रायो-SXT डेटा संग्रह से पहले योजनाबद्ध वर्कफ़्लो का पालन किया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्रिड पर बढ़ती कोशिकाएं। (ए) लगभग 80% -90% संगम के साथ एक P100 पेट्री डिश में बढ़ने वाली कोशिकाएं। (बी) कोशिकाओं को सीडिंग के बाद कई ग्रिड के साथ पी 60 पेट्री डिश। (C) 24 घंटे के बाद ग्रिड के शीर्ष पर बढ़ने वाली कोशिकाएं। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: नमूना धारकों पर और स्थानांतरण कक्ष में ग्रिड लोड हो रहा है। (ए) शटल के साथ तरल नाइट्रोजन से भरा वर्कस्टेशन और ग्रिड लोड करने के लिए तैयार क्रायोबॉक्स। (बी) नमूना धारक लोड ग्रिड लोड के साथ लोडर में डाला गया। (C) कवर के बिना स्थिति 3 में नमूना धारक के साथ शटल। (d) संलग्न स्थानांतरण कक्ष के साथ वर्कस्टेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: TXM (A) में नमूने लोड हो रहा है TXM करने के लिए स्थानांतरण कक्ष संलग्न. (बी) टीएक्सएम के अंदर शटल। (सी) टीएक्सएम रोबोट हाथ नमूना चरण में नमूना धारक डालने. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राम का उदाहरण। ऊपरी पंक्ति: आदर्श नमूना, (A) एक ग्रिड वर्ग का 2D मोज़ेक दृश्य केंद्र में एक अलग सेल दिखाता है। (बी) पुनर्निर्मित 3 डी वॉल्यूम से एक स्लाइस लाल बॉक्स (ए) के साथ चिह्नित क्षेत्र दिखा रहा है। (डी) की तुलना में छवि बहुत चिकनी है और अधिक विवरण दिखाई देते हैं। निचली पंक्ति: गैर-आदर्श नमूने, (सी) एक ग्रिड वर्ग के 2 डी मोज़ेक दृश्य बर्फ और ग्रिड पन्नी (लाल तीर) में बहुत अधिक सेल confluency और दरारें दिखा रहा है। (डी) पुनर्निर्मित 3 डी वॉल्यूम से एक स्लाइस (सी) में लाल बॉक्स के साथ चिह्नित क्षेत्र को दर्शाता है। गरीब या सबऑप्टिमल विट्रिफिकेशन को छवि की दानेदार बनावट द्वारा पहचाना जा सकता है। एन: नाभिक; एम: माइटोकॉन्ड्रिया; ईआर: एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एमवी: मल्टीवेसिकुलर निकाय; V: रिक्तिका; स्केल सलाखों: A & C 20 μm; B & D 2 μm.Vकृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

नमूना तैयारी उच्च गुणवत्ता वाले नरम एक्स-रे टोमोग्राम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि उनकी गुणवत्ता सीधे नमूना विट्रीफिकेशन की गुणवत्ता और बर्फ की परत की मोटाई पर निर्भर करती है जिसमें सेल एम्बेडेड है। उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात वाले अनुमानों को पतली बर्फ की परत वाले क्षेत्रों में एकत्र किया जाएगा, जिससे उच्चतम संभव रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए आवश्यक विकिरण खुराक को कम करने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, सेल confluency भी अंतिम tomogram गुणवत्ता को प्रभावित करेगा, क्योंकि एक पड़ोसी कोशिकाओं रोटेशन पर FoV में प्रवेश करने से बचना चाहिए। अंत में, Au fiducial मार्करों का सही फैलाव प्रक्षेपण संरेखण की सटीकता को निर्धारित करेगा और फिर अंततः अंतिम 3 डी पुनर्निर्मित मात्रा की गुणवत्ता निर्धारित करेगा। ध्यान दें कि ग्रिड पर Au fiducials का एक उचित प्रसार प्रक्षेपण संरेखण चरण के स्वचालितकरण को सक्षम बनाता है, जिसके बिना इस तरह के एक महत्वपूर्ण कदम के लिए एक उच्च विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।

यहां प्रोटोकॉल केवल एक संभावित नमूना तैयारी रणनीति को दर्शाता है, जिसमें क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) में उपयोग किए जाने वाले लोगों के साथ समानताएं हैं। दोनों मामलों में, बेहतर पुनरुत्पादन के लिए मांग नमूना तैयारी में सुधार करने वाले प्रोटोकॉल इन तकनीकों की सफलता के लिए मौलिक होंगे, औरइस लक्ष्य की ओर प्रयास किए जा रहे हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि अलग-अलग कोशिकाओं की इमेजिंग के अलावा, ऊतक के वर्गों को भी कल्पना की जा सकती है बशर्ते कि अनुभाग के माध्यम से संचरण संकेत उच्च झुकाव कोणों पर पर्याप्त हो। आमतौर पर, यह कुछ माइक्रोन (10 μm से नीचे) के वर्गों का मतलब होगा।

एक सेल के अंदर एक विशिष्ट संरचना या घटना की छवि बनाने के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि यह विशेष सुविधा झुकाव श्रृंखला के एफओवी के अंदर है। जैसा कि क्रायो-एसएक्सटी में एफओवी 10 x 10 μm2 से 15 x 15 μm 2 तक सीमित है, लेंस के आधार पर और कम से कम2 के कारक के लिए रिज़ॉल्यूशन के पिक्सेल ओवरसैम्पलिंग के लिए लेखांकन, यह अक्सर पूर्ण सेल एक्सटेंशन से छोटा होता है (चित्रा 5 में इंगित लाल वर्ग देखें)। इसलिए, ROI पाया जाना चाहिए और ठीक से लेबल किया जाना चाहिए। यह आमतौर पर फ्लोरोसेंट टैग और दृश्यमान प्रकाश correlative दृष्टिकोण के माध्यम से किया जाता है। एपिफ्लोरेसेंस के संयोजन वाली 2 डी रणनीतियां सीधी हैं क्योंकि नरम एक्स-रे ट्रांसमिशन माइक्रोस्कोप में एक एकीकृत ऑन-लाइन दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप होता है, लेकिन उच्च रिज़ॉल्यूशन 2 डी या 3 डी प्रतिदीप्ति संकेत के लिए अन्य दृष्टिकोण भी उपलब्ध हैं 4,12,13,15,16 . उन मामलों में, ग्रिड को पहले विशिष्ट उपकरणों जैसे सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप में चित्रित करने की आवश्यकता होती है। ध्यान दें कि सबसे कुशल correlative दृष्टिकोण वे हैं जो क्रायोजेनिक स्थितियों में डेटा संग्रह को शामिल करते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि कमरे के तापमान (आरटी), दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति इमेजिंग, और नमूना विट्रीफिकेशन के बीच समय अंतराल, उदाहरण के लिए, समय पर सही सेलुलर घटना को पकड़ने में बाधा डालेगा; इसके अलावा, vitrification प्रक्रिया ब्याज है कि ग्रिड से आरटी पर imaged किया गया है के सेल को अलग कर सकते हैं. यहां तक कि अगर अधिकांश correlative इमेजिंग दृष्टिकोण का मतलब यह हो सकता है कि नमूना ग्रिड को हेरफेर किया जाना चाहिए और एक उपकरण से दूसरे में ले जाया जाना चाहिए, और ग्रिड संदूषण या क्षति के बढ़ते जोखिम के बावजूद, इनाम स्पष्ट है: सेलुलर परिदृश्य के भीतर विशिष्ट घटनाओं या अणुओं को इंगित करने में सक्षम होने के लिए।

जब पूरे सेल इमेजिंग की आवश्यकता होती है, तो अलग-अलग टोमोग्राम सिलाई संभव है बशर्ते लागू की गई कुल खुराक विकिरण क्षति सीमा से अधिक न हो। आमतौर पर, एक ही सेल पर कुछ टोमोग्राम एकत्र करने के लिए जमा खुराक प्राप्त करने योग्य रिज़ॉल्यूशन (109 Gy) पर सीमा से नीचे है और इसलिए, खुराक को कम करने के लिए कोई विशिष्ट रणनीति की आवश्यकता नहीं है, हालांकि यह नमूना- और प्रयोग-निर्भर है। स्पेक्ट्रो-टोमोग्राफी जैसे गहन डेटा संग्रह के मामले में, खुराक को कम करने की वास्तव में आवश्यकता होगी और सुविधाजनक डेटा संग्रह और विशिष्ट प्रसंस्करण रणनीतियों को लागू करने की आवश्यकता होगी।

क्रायो-एसएक्सटी की कई सीमाएं हैं, जिनका उल्लेख यहां किया जाना चाहिए। पहला एक प्रसिद्ध लापता कील है, जो फ्लैट नमूना समर्थन का उपयोग करने के लिए आंतरिक है। केशिका नमूना 180 डिग्री रोटेशन की अनुमति देने का समर्थन करता है अतीत में उपयोग किया गया है और अभी भी कुछ सुविधाओं में उपयोग किया जाता है, लेकिन वे ग्लास अवशोषण और निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग करने के प्रतिबंध के कारण एक गरीब विपरीत जैसी कमियों को भी प्रस्तुत करते हैं। लापता कील के प्रभाव को कम करने का एक तरीका दोहरी झुकाव टोमोग्राफी करना है। यह वास्तव में आजकल मिस्ट्रल बीमलाइन पर संभव है। दूसरी सीमा इस तरह के माइक्रोस्कोप में उपयोग किए जाने वाले फ्रेस्नेल ज़ोन प्लेट लेंस द्वारा निर्धारित की जाती है। यह लेंस अंतिम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने योग्य और क्षेत्र (डीओएफ) की गहराई को सेट करता है, दोनों कसकर संबंधित हैं। इसका तात्पर्य यह है कि रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने से डीओएफ कम हो जाएगा जबकि सेल की मोटाई अक्सर बड़ी होगी। उदाहरण के लिए, एक 40 एनएम लेंस में सिद्धांत रूप में 3 μm का एक DoF और 24.4 एनएम आधा पिच का रिज़ॉल्यूशन होगा। संकल्प और डीओएफ के बीच समझौता इसलिए रणनीतिक है और लेंस की पसंद सेल30,31 के प्रकार पर निर्भर करेगी। अंत में, दुनिया भर में परिचालन टीएक्सएम आदर्श माइक्रोस्कोप होने से बहुत दूर हैं और सैद्धांतिक अपेक्षाओं तक पहुंचने के लिए ऑप्टिकल सिस्टम में सुधार करने के प्रयास किए जा रहे हैं। अंत में, पुनर्निर्मित संस्करणों के विज़ुअलाइज़ेशन और विभाजन को विशिष्ट सॉफ़्टवेयर टूल 25,32,33,34 के साथ किया जा सकता है।

संक्षेप में, क्रायो-एसएक्सटी इमेजिंग कोशिकाओं को मात्रात्मक रूप से मध्यम रिज़ॉल्यूशन (25-30 एनएम हाफ पिच) और सांख्यिकीय संख्याओं (प्रति दिन कुछ दसियों टोमोग्राम) में अनुमति देता है। यह विशिष्ट परिस्थितियों में ऑर्गेनेल के संगठन, वितरण और आयाम को प्राप्त करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, रोगज़नक़ संक्रमण या बीमारियों के दौरान, सटीक समय बिंदुओं पर या विशेष उपचार के बाद। इसलिए, यह अधिक सामान्य इलेक्ट्रॉन और दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपयोगी पूरक जैविक इमेजिंग तकनीक है, उनमें से प्रत्येक नमूना आयामों और संकल्प की एक विशिष्ट श्रृंखला से निपटता है। क्रायो-एसएक्सटी का उपयोग अक्सर दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति को शामिल करने वाले कॉरिलेटिव दृष्टिकोणों में किया जाता है, लेकिन अन्य क्रायो कोरिलेटिव रणनीतियां भी संभव हैं।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय आयोग क्षितिज 2020 iNEXT-डिस्कवरी परियोजना और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्क्लोडोस्का-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 75439 के तहत धन प्राप्त हुआ है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira Thermo Fisher Software for segmentation
Au Holey Carbon Films  finder grids (Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2 Au G200F1 Au Holey Carbon Films finder grids
Au nanoparticles  BBI Group, Cardiff, UK Au nanoparticles 100nm 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba)
Au nanoparticles  BBI Group, Cardiff, UK Au nanoparticles 250nm 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond)
Axio Scope A1 Zeiss 430035 9060 Fluorescence microscope
Blotting No.1 filter paper Whatman WHA10010155 Blotting filter
Bsoft Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008)
Chimera Software for segmentation (Pettersen et al. 2004)
Cryo-EM Glow Discharge Set PELCO easiGlow 91000S Glow Discharge Cleaning System
Cu Holey Carbon Films  finder grids (Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2Cu G200F1 Cu Holey Carbon Films finder grids
Fetal calf serum Sigma F9665 Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture
ImageJ Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)
IMOD Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996)
Leica EM GP Grid Plunger Leica 16706401 Automatic Plunge Freezer EM
LINKAM cryo-stage Linkam Scientific Instruments CMS 196 Cryo-Correlative Microscopy Stage
MIB Software for segmentation (Belevich et al. 2016)
P100 Petri dish Sigma P6106 Treated for cell culture and sterile
P60 Petri dish Sigma D8054 Treated for cell culture and sterile
Polylysin Sigma P4707 Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered
Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV Xradia NCT-SB Transmission soft X-Ray microscope
SURVOS Software for segmentation  (Luengo et al. 2017)
Tomo3d Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)
TomoJ Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007)
XM Data Explorer Zeiss TXM software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
  2. Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
  3. Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
  4. Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
  5. Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
  6. Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
  7. Natterer, F. The mathematics of computerized tomography. , Wiley. New York. (1986).
  8. Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
  9. Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
  10. Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
  11. Cinquin, B., et al. Putting molecules in their place. Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).
  12. Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
  13. Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
  14. Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
  15. Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
  16. Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
  17. Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
  18. Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
  19. Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
  20. Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
  21. Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
  22. Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
  23. Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
  24. Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
  25. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  26. Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
  27. Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
  28. Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
  29. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
  30. Attwood, D. Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , Cambridge University Press. Cambridge. (2000).
  31. Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , Springer. New York. (2007).
  32. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
  33. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  34. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).

Tags

जीव विज्ञान अंक 169 एक्स-रे इमेजिंग नरम एक्स-रे टोमोग्राफी क्रायोजेनिक तापमान पूरे सेल स्पेक्ट्रो-माइक्रोस्कोपी
क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी द्वारा सेल का एक 3 डी कार्टोग्राफिक विवरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Groen, J., Sorrentino, A., Aballe,… More

Groen, J., Sorrentino, A., Aballe, L., Oliete, R., Valcárcel, R., Okolo, C., Kounatidis, I., Harkiolaki, M., Pérez-Berná, A. J., Pereiro, E. A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography. J. Vis. Exp. (169), e62190, doi:10.3791/62190 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter