Summary
Här presenteras ett protokoll som beskriver provberedningen och datainsamlingsstegen som krävs i kryo mjuk röntgentomografi (SXT) för att avbilda ultrastrukturen hos hela kryobevarade celler med en upplösning av 25 nm halv tonhöjd.
Abstract
Avbildningstekniker är grundläggande för att förstå cellorganisation och maskiner inom biologisk forskning och relaterade områden. Bland dessa tekniker tillåter kryo mjuk röntgentomografi (SXT) avbildning av hela kryokonserverade celler i vattenfönstrets röntgenenergiområde (284-543 eV), där kolstrukturer i sig har högre absorption än vatten, vilket möjliggör 3D-rekonstruktion av den linjära absorptionskoefficienten för materialet i varje voxel. Kvantitativ strukturell information på nivån av hela celler upp till 10 μm tjock kan sedan uppnås på detta sätt, med hög genomströmning och rumslig upplösning ner till 25-30 nm halvhöjd. Cryo-SXT har visat sig vara relevant för aktuell biomedicinsk forskning, vilket ger 3D-information om cellulära infektionsprocesser (virus, bakterier eller parasiter), morfologiska förändringar på grund av sjukdomar (såsom recessiva genetiska sjukdomar) och hjälper oss att förstå läkemedelsverkan på cellulär nivå eller lokalisera specifika strukturer i 3D-cellulär miljö. Dessutom, genom att dra nytta av den avstämbara våglängden vid synkrotronanläggningar, kan spektromikroskopi eller dess 3D-motsvarighet, spektrotomografi, också användas för att avbilda och kvantifiera specifika element i cellen, såsom kalcium i biomineraliseringsprocesser. Cryo-SXT ger kompletterande information till andra biologiska avbildningstekniker såsom elektronmikroskopi, röntgenfluorescens eller synligt ljusfluorescens och används vanligtvis som en partnermetod för 2D- eller 3D-korrelativ avbildning vid kryogena förhållanden för att länka funktion, plats och morfologi.
Introduction
Cryo-SXT kan spela en central roll i biologisk bildforskning eftersom det ger 3D-medelupplösning (25-30 nm halv tonhöjd) volymer av hydratiserade hela celler 1,2,3,4,5,6. I vattenfönstrets energiområde, mellan kol- och syreabsorptionen k-kanter (4,4-2,3 nm), absorberar kolrika cellulära strukturer 10 gånger mer än det syrerika mediet som genomtränger och omger dem. I detta energiområde kan förglasade celler upp till 10 μm tjocklek avbildas utan behov av sektionering eller färgning, vilket leder till kvantitativa kontrastprojektioner med hög absorption, vilket i kombination med provrotationsförmåga möjliggör tomografisk rekonstruktion av den cellulära strukturen. Cryo-SXT fyller en nisch när det gäller provdimensioner och rumslig upplösning som inte är lättillgänglig med någon annan bildteknik.
I korthet är absorptionskontrasten för kryo-SXT kvantitativ, eftersom dämpningen av fotonerna genom provet av tjocklek t följer Beer-Lambert-lagen enligt följande: 
, där I0 representerar infallande intensitet och μl den linjära absorptionskoefficienten, som beror på våglängden λ och den imaginära delen β av provets brytningsindex (
). Dämpningen är en funktion av den biokemiska sammansättningen och tjockleken på strukturerna som avbildas, där varje biokemisk komponent har en specifik röntgenlinjär absorptionskoefficient μl (LAC). Detta innebär att varje tomografi voxelvärde beror på de kemiska elementen och deras koncentration i den voxel7. Detta möjliggör naturlig diskriminering av olika organeller såsom kärnor, nukleoler, lipidkroppar eller mitokondrier, eller olika komprimeringstillstånd av kromatin enbart baserat på deras inneboende LAC-värden rekonstruerade 2,8,9.
Dessutom är kryo-SXT en teknik med hög genomströmning med tomogram som samlas in på några minuter. Detta möjliggör specifikt mesoskala avbildning av cellpopulationer som kan fångas vid viktiga tidpunkter som delning, differentiering och apoptos, men också vid olika svarstillstånd som de som induceras av kemisk exponering för specifika läkemedelsterapier eller patogena infektioner. Data som samlas in vid dessa nyckelpunkter kommer att leverera 3D-beskrivning av systemet med en trogen registrering av den rumsliga organisationen av de olika cellulära organellerna vid dessa specifika ögonblick.
Vanligtvis används kryo-SXT i kombination med andra tekniker som följer korrelativa tillvägagångssätt som gör det möjligt att lokalisera specifika egenskaper, händelser eller makromolekyler inom 3D-cellulär miljö 4,10,11,12,13,14,15,16 eller hårda röntgenfluorescensdata 17,18 . Korrelativa tillvägagångssätt vid kryogena förhållanden är av största vikt för att få den mest kompletta och värdefulla bilden av det intressanta systemet. En kortfattad sammanfattning av det typiska arbetsflödet vid Kryo-SXT-strållinjerna Mistral (Alba) och B24 (Diamond) skisseras i figur 1.
Genom att utnyttja våglängdsinställningsförmågan vid synkrotronanläggningar kan spektroskopisk information erhållas utöver den strukturella med användning av den specifika differentiella absorptionen av specifika element som ingår i provet. Ett exempel på detta skulle vara placeringen av kalcium i studien av biomineraliseringsprocesser i celler 19,20,21. Genom att ta 2D-bilder vid olika fotonenergier (spektra) eller tomogram nedanför och vid röntgenabsorptionskanten av intresse kan pixlarna eller voxlarna som innehåller det valda elementet identifieras. Spektra tillåter också differentiering av kemiska tillstånd (dvs utvecklingen av amorft kalcium till hydroxiapatit som i föregående biomineraliseringsexempel20). Kvantifiering av olika element är möjlig i 2D och 3D. Spektroskopisk avbildning av förglasade celler görs vanligtvis i vattenfönstret, men är också möjlig vid andra energiområden om vattenhalten är tillräckligt låg eller om andra provberedningsprotokoll, inklusive uttorkning, används22. Ett detaljerat spektroskopi steg-för-steg-protokoll ligger utanför protokollets fokus häri.
I det följande fokuserar protokollet på att kortfattat sammanfatta de viktigaste provberedningsstegen, även om varje system kan behöva individuell förfining, följt av en detaljerad steg-för-steg-datainsamlingsprocedur för kryo mjuk röntgentomografi.
Protocol
1. Provberedning
- Förbereda nätstödet
- Bestråla gallret med UV i 3 timmar med kolfilmen vänd uppåt för sterilisering.
- Valfritt: Vid problem med celler som inte är kopplade till rutnätet använder du något av följande steg.
- Hydrofilisera kolstödfolien genom plasmabehandling av gallren för att öka provspridningen och bättre cellvidhäftning.
- Placera galler med kolsidan uppåt i glödutloppskammarens utrustning och utsätt gallret för plasma i 30 s till 15 minuter (med Ar eller /ochO2) beroende på utrustningen.
- Funktionalisera gallren med poly-L-lysin (PLL)
- Tillsätt enskilda droppar på 60 μL PLL i en petriskål och placera gallret ovanpå PLL-droppen med kolfilmen vänd nedåt. Inkubera i 30 min vid 37 °C och torka av PLL med ett filterpapper.
- Funktionalisera gallret med fetalt bovint serum (FBS).
- Sänk ner gallren i FBS över natten. Doppa gallret i en buffertlösning för att tvätta och lämna gallret på ett filterpapper för att avlägsna överflödig vätska.
- Hydrofilisera kolstödfolien genom plasmabehandling av gallren för att öka provspridningen och bättre cellvidhäftning.
- Växande vidhäftande celler på galler
- Odla celler i en cellodlingsskål på 100 mm för att nå 80% -90% sammanflöde (figur 2A).
- Frö 1-5 x 105 celler/ml (justera värdet till systemet) ovanpå Au-rutnäten i en P60 petriskål (totalt 3 ml).
NOT: Tillsatsen av cellsuspensionen måste göras mycket noggrant med kolfilmen i gallret vänd uppåt i en cellodlingsskål på 60 mm. Förbered flera galler per villkor, ett villkor per P60 petriskål (figur 2B). - Låt cellerna sätta sig tills sammanflödet på gallret når flera celler (1 till 10 beroende på cellstorleken) i varje maskkvadrat (beroende på cellinjen kan detta ta upp till 24 timmar).
NOT: Före frysning bör gallren kontrolleras med ett synligt ljusmikroskop (VLM), som utvärderar kolfilmens integritet samt cellkonfluens i varje rutnät (figur 2C). Vänta tills rätt celldensitet på gallret har uppnåtts. Om gallret är för sammanflytande eller kolfolien är trasig, börja om.
- Deponering av celler i suspension på galler
- Välj ett preparerat Au- eller Cu-galler med pincetten från avsvalkningsfrysen (se avsnitt 1.6).
- Förbered en 1-5 x 105 cellsuspension (optisk densitetsabsorbering på 0,3 vid bakterier) och tillsätt 4 μL av den beredda suspensionen till gallret.
- Inkubera gallret med droppen i några minuter horisontellt för att tillåta avsättning av cellerna och placera sedan pincetten som håller gallret inuti den klimatstyrda förglasningskammaren inställd på lämpliga temperatur- och fuktighetsförhållanden (steg 1.6.1).
- Valfritt: fluorescerande märkning av proverna
NOT: Det kan vara fördelaktigt att fluorescerande märka vissa organeller i provet. Beroende på intresset kan specifika fluoroforer eller celler som stabilt uttrycker ett fluorescerande protein eller transfekteras för övergående uttryck av ett protein av intresse användas. Detta möjliggör enkel upptäckt av celler med kryo-epifluorescensmikroskopi och hjälper till att hitta celler av intresse för efterföljande röntgenavbildning. I det följande beskriver protokollet endast användningen av fluoroforer.- Förbered en arbetslösning för fluoroforen (se tillverkarens rekommendation) och följ det specifika protokollet.
- Tillsätt fluoroforerna i petriskålen som innehåller gallret och blanda försiktigt.
- Låt inkubera i en mörk miljö och gå direkt till steg 1.6 efter att inkubationen är klar.
OBS: Det är viktigt att vara redo att förglasa när inkubationen är klar för att undvika ospecifik märkning och därmed suddig fluorescerande signal.
- Au nanopartiklar (NPs) förberedelse för tomogram projektionsinriktning
- Ta en alikvot på 1 ml av Au fiducial stamlösning (100 nm vid Mistral eller 250 nm vid B24) och centrifug vid låg hastighet (för att undvika aggregering) i 1 min för att tillåta NPs att pelletera.
NOT: Om möjligt är det att föredra att låta fiducialerna bosätta sig naturligt över natten eller mer, för att undvika aggregering. - Ta bort supernatanten. Omedelbart före frysning, suspendera IP: erna igen i 20 μL serumfritt medium eller buffertlösning för att erhålla en homogen lösning.
NOT: Ultraljudsbehandling och virvelbehandling rekommenderas för att hjälpa homogenisera lösningen.
- Ta en alikvot på 1 ml av Au fiducial stamlösning (100 nm vid Mistral eller 250 nm vid B24) och centrifug vid låg hastighet (för att undvika aggregering) i 1 min för att tillåta NPs att pelletera.
- Störtdykningsfria galler
VARNING: Flytande kväve kan orsaka förkylningsbrännskador och korrekt skyddsutrustning bör bäras (lång labbrock, skyddsglasögon, handskar, långbyxor och slutna skor). Etan är mycket explosivt och bör hållas borta från gnistor eller öppen eld.- Följ tillverkarens instruktioner för att förbereda och använda doppfrysinstrumentet.
NOT: Luftfuktigheten är vanligtvis inställd på 80% -90%; temperaturen beror på celltyp (jäst 30 ° C maximalt, däggdjursceller 37 ° C, insektsceller 28 ° C, etc.). - Ta ett galler med monteringspincetten från petriskålen vid fälgen, var noga med att inte böja gallret och montera det på kolvfrysanordningen. Se till att cellerna är vända bort från blottpapperet.
- Valfritt: Tvätta gallret tre gånger i buffert när det gäller vidhäftande celler.
- Tillsätt 1,5 μL Au NP-fiducialer ovanpå cellerna (genom hålet på höger sida av kammaren) och låt stå i 30 s innan du blottar och kastar gallret.
NOT: När det gäller celler i suspension, tillsätt Au NP-fiducialer till gallret medan det fortfarande är i horisontellt läge innan du monterar pincetten och låt dem nöja sig med 30 s. Blotting är avgörande för högkvalitativa nät. Blotting avstånd måste kalibreras innan du börjar; platthet av blottpapper är viktigt för reproducerbar blotting (följ instruktionerna från tillverkaren). Blotting-tiden måste bedömas för varje celltyp. - Förbered flera galler per villkor. Överför gallret och förvara vid kryogena temperaturer för att bevara förglasning.
- Följ tillverkarens instruktioner för att förbereda och använda doppfrysinstrumentet.
- Screeninggaller med kryo synligt ljusmikroskopi
- Överför gallret under flytande kväve från kryoboxarna till en vanlig kryokassett (tre lägen för 3 mm TEM-galler) inuti ett förkylt kryosteg (se instruktioner från tillverkaren).
- Kryokassetten placeras på kryo-scenbron och kryo-scenen är monterad på ett brett fält epifluorescensljusmikroskop.
- Avbilda rutnäten vid -196,5 °C med hjälp av ett långdistansmål (10x, 50x, 100x) för att lokalisera lämpliga celler för kryo-SXT-avbildning och bedöma nätkvaliteten (förekomst av tjock is, kolstödfilmens integritet, närvaron av fluorescerande signal etc.).
- Lokalisera cellerna av intresse med hjälp av ljusfält eller / och fluorescensavbildning.
OBS: I detta skede, ta bilderna om en länkad kamera finns på mikroskopet. Använd den för bildkorrelation. - Efter screening, sätt tillbaka gallren till kryoboxarna i en lagringsdewar för flytande kväve.
NOT: Om inga bra prover hittas, upprepa provberedningsstegen och ändra någon av parametrarna. Vanligtvis är parametrarna som kräver modifiering blottningstid, om isen är för tjock eller sammanflödet, om det finns för många celler per maskkvadrat.
2. Laddning i transmissionsröntgenmikroskopet (TXM)
- Kyl överföringskammaren med flytande kväve tills den når <100 K, kyl arbetsstationen (figur 3A) och sätt på värmaren på arbetsstationens fälg. Vänta tills det slutar koka.
- Placera de nödvändiga kryoboxarna som innehåller galler på motsvarande platser i arbetsstationen (figur 3A). Var uppmärksam på att säkert överföra dem under kryoförhållanden.
- Ladda de valda gallren i de provhållare som tidigare kylts (figur 3B). ladda hållarna på skytteln och skydda dem med locken (figur 3C).
- Ladda skytteln i överföringskammaren vid <100 K och pumpa ner den till lågt vakuum (figur 3D).
- Fäst överföringskammaren på TXM (figur 4A) och ladda skytteln från överföringskammaren till TXM enligt vakuumproceduren på skärmen (figur 4B).
- När skytteln är inne med proverna kan TXM-robotarmen föra en provhållare i taget till provsteget (figur 4C).
3. Avbildning med TXM-programvaran
OBS: Rutnät i provsteget avbildas först med hjälp av ett on-line synligt ljusmikroskop (VLM) för att kartlägga rutnätet antingen i ljusfält och / eller fluorescensläge innan de avbildas med röntgenstrålar. Använd joystickikonen som motsvarar fliken Motion Control på den övre vänstra panelen för att öppna Motion Control.
- Avbildning av rutnätet med online-VLM.
- Ljust fältmosaikförvärv
- Välj VLM-kameran (förstoringslins > VLM) och slå på VLM-LED-källan för ljusfältsavbildning (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Source Settings och välj Transmission).
- Rotera provet till -60 grader för att möta VLM-målet (Motion Control > Sample > Sample θ) och flytta provet till de förväntade centrerade positionerna (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y).
- När du förvärvar bilder i steg om 20 till 50 μm först för att få rutnätet ungefär i fokus (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Continuous > Start; Rörelsekontroll > Prov och ändra prov Z).
- Förfina fokus med mindre steg ner till 5 μm tills cellerna och / eller hålen i kolstödfilmen är i fokus (Mikroskop > Förvärv > Förvärvsinställningar > Förvärvslägen > Kontinuerlig > Start; Motion Control > Sample and change Sample Z) och starta förvärvet av en fullständig mosaikkarta över rutnätet i ljust fältläge. Använd standardvärdena för mosaiken. (Mikroskop > förvärv > förvärvsinställningar > förvärvslägen > mosaic > start).
NOT: En mosaikkarta är gjord av enstaka bilder. Antalet bilder (antal kolumner, rader och stegstorleken i X och Y) ska ställas in för att visualisera hela rutnätet. Stegstorleken beror på storleken på synfältet (FoV). Standardvärdena används här. Om rutnätet inte är väl centrerat i X-Y-planet med avseende på hela mosaiken FoV, stoppa förvärvet, korrigera provet X- och Y-koordinaterna och upprepa förvärvet.
- Fluorescensläge mosaik förvärv
- Stäng av VLM-ledkällan för ljusfältsavbildning (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Source Settings och avmarkera Transmission) och välj den LED-ljuskälla som motsvarar önskad excitationsvåglängd (röd, grön eller blå) och motsvarande optiska filter manuellt vid uppställningen.
- Förfina fokus på fluorescensbilden (mikroskop > förvärvs- > förvärvsinställningar > förvärvslägen > kontinuerlig > start; Rörelsekontroll > Exempel och ändra prov Z) och hämta sedan en mosaikkarta som behåller positionsparametrarna (X och Y) från den ljusa fältmosaiken (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Mosaic > Start).
- Stäng av LED-ljuskällan
- Valfritt: Baserat på de ljusa fält- och fluorescensmosaikkartorna kommenterar du de intressanta regionerna (ROI) som identifierats tidigare (steg 1.7.4) eller ny ROI (X-Y-positioner i bilden).
- Ljust fältmosaikförvärv
- Röntgenmosaik förvärv
- Välj CCD-röntgendetektorn (förstoringslins > välj Pixis), för provet till 0 graders rotation (Rörelsekontroll > Prov och ändra prov θ) och flytta röntgenstrålningsoptiken (kondensor och zonplatta) till de inriktade positionerna (Rörelsekontroll > kondensor > ändra kondensor z; Rörelsekontroll > zonplattan och byt zonplatta Z).
NOT: Kyl ner CCD-chippet till -65 °C före avbildning (mikroskop > kameratemperatur > Pixis och ändra inställd temperatur till -65 °C och klicka på Apply). - Flytta provet till mitten av maskkvadraten på en av de valda ROI(Motion Control > Sample och ändra Sample X, Sample Y).
- Använd binning 2 och utgångsslits vid 5 μm för att minimera bestrålning och 1 s exponering vid Mistral och binning 1 och 60 μm vid B24, justera fokus med hjälp av exempel Z-översättning (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Camera Settings och ändra binning; Rörelsekontroll > XS och ändra XS; Mikroskop > förvärvs- > förvärvsinställningar> förvärvslägen > kontinuerlig > start; Rörelsekontroll > Prov och ändra prov Z). Börja i steg om 5 μm och förfina den ner till steg på 0,5 μm tills cellen eller kolfoliehålen är väl i fokus.
- Skaffa en mosaikkarta över nättorget (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Mode > Mosaic > Start).
NOT: Mosaikförvärvsparametrar kan bestämmas på samma sätt som för VLM-mosaikerna (avsnitt 3.1.1.4). Stegstorleken beror på förstoringen som förvalts av strålrörspersonalen. - Flytta provet till ett flatfältsläge (FF) (ett tomt område i gallret, helst ett hål i kolstödet) (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y).
- Ställ in exponeringstiden på 1 s vid Mistral och 0,5 s vid B24 (mikroskop > förvärvs- > förvärvsinställningar > kamerainställningar och ändra exponeringstid) och skaffa en enda bild (mikroskop > förvärv > förvärvslägen > enstaka > start).
- Normalisera (dela) den förvärvade mosaiken av FF-bilden för att få överföringen (med värden mellan 0 och 1) och spara den normaliserade mosaiken (klicka på den första högra övre hörnikonen till höger om bilden för att öppna menyn>välja fliken Referens> klicka på Enkel referens och bläddra i den specifika FF).
- Välj CCD-röntgendetektorn (förstoringslins > välj Pixis), för provet till 0 graders rotation (Rörelsekontroll > Prov och ändra prov θ) och flytta röntgenstrålningsoptiken (kondensor och zonplatta) till de inriktade positionerna (Rörelsekontroll > kondensor > ändra kondensor z; Rörelsekontroll > zonplattan och byt zonplatta Z).
- Förbereder sig för att samla in en röntgen-tilt-serie
NOT: Hitta rotationsaxeln för varje region av intresse som avbildas.- Gör ett urval av områden inom mosaikerna för att utföra tomografi, dvs genom att placera en fyrkantig form (klicka på Verktyg till vänster i bildfönstret) med storleken på FoV i röntgenmosaikkartan.
NOT: När du väljer områden, överväga avståndet från gränsen (≥10 μm) och andra celler för att undvika överlappning av celler under rotation. Kontrollera dessutom cellens tillstånd (förväntad cellform, istjocklek, framgång för förglasning, fiducial spridning etc.). - Exempel på justering på rotationsaxeln
NOT: Det rapporterade förfarandet är iterativt. Iterationen konvergerar snabbare med ± 60° vinklar som maximala rotationsvinklar (θM). Om de inte är tillgängliga, använd vinklar så nära ± 60 ° som möjligt.- Ställ in kameran på binning 2, exponeringstid 1 s (mikroskop > förvärvs- > förvärvsinställningar > kamerainställningar och ändra exponeringstid; ändra binning; Mikroskop > Förvärv > förvärvslägen > kontinuerlig > start), ställ in utgångsslitsen till 5 μm.
NOT: Minimera dosen så mycket som möjligt genom att arbeta med minimal bländare av utgångsslitsen. - Med rotationen vid 0 °, flytta till det tidigare valda området med hjälp av provet X och prov Y-översättningen och fokusera på cellens funktion för att sätta in rotationsaxeln med hjälp av provet Z-översättning (Rörelsekontroll > Prov och ändra prov x; Prov y; Prov z).
- Rotera provet till + θM (Motion Control > Sample and change Sample θ) och rita en linje (L+) (klicka på linjeverktygsknappen till höger om bildfönstret) på cellens funktion för att sätta på rotationsaxeln.
- Rotera till -θM (Motion Control > Sample and change Sample θ) och rita en linje (L-) (klicka på linjeverktygsknappen till höger om bildfönstret) på funktionen i cellen du vill sätta på rotationsaxeln.
- När du är vid +θM eller -θM använder du Z-exempelöversättning för att flytta den valda funktionen till mittpositionen mellan båda raderna (Rörelsekontroll > Sample och ändra Sample Z).
- Upprepa proceduren från steg 3.3.2.3 iterativt tills ett minsta avstånd L+ till L- har uppnåtts.
NOT: Avståndet mellan de två linjerna L+ och L- bör vara mindre i förhållande till föregående iteration. - Vid prov θ = 0 (Rörelsekontroll > Prov och ändra Prov θ), flytta prov X dubbelt så långt som det avstånd som behövs för att placera den valda funktionen i mitten av båda linjerna (Rörelsekontroll > Prov och ändra Prov X). Flytta zonplattan (ZP) X för att återföra funktionen till mitten av FoV (Motion Control > ZP och ändra ZP X). Gör det här steget bara en gång per rutnät.
- Optimera ZP Z-positionen med avseende på den nya rotationsaxeln genom att registrera en ZP Z-fokalserie (samlingar av bilder vid olika ZP Z-positioner, vanligtvis i steg om 0,3 μm) (Mikroskop > Förvärv > Förvärvsinställningar > Förvärvslägen > Focal Series > Start) och flytta ZP Z till den position där provet är i fokus (Rörelsekontroll > zonplatta och ändra zonplatta z).
- Ställ in parametrarna för förvärvet av lutningsserien.
NOT: Det maximala vinkelområdet begränsas slutligen av brännvidden för ZP (±70 eller ±65 grader för en 40 nm respektive 25 nm ZP för ett plant prov). Optimera signal-brusförhållandet (S/N) och strålskador för att definiera exponeringstiden. För tomografi, använd olika exponeringstider vid olika vinkelområden. - Bestäm det högsta rotationsvinkelområdet, om skuggning sker innan den maximala rotationsvinkeln uppnås.
- Ställ in kamerans binning på 1 (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Camera Settings och ändra Binning), öppna utgångsslitsen till 15 μm vid Mistral (Motion Control > XS och ändra XS) och ställ in rotationen på 0° (Motion Control > Sample and change Sample θ).
- Skaffa en enda bild med en exponeringstid på 1 s (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Single > Start) och uppskatta exponeringstiden som krävs för varje lutningsvinkel på tomografin.
- Ställ in kameran på binning 2, exponeringstid 1 s (mikroskop > förvärvs- > förvärvsinställningar > kamerainställningar och ändra exponeringstid; ändra binning; Mikroskop > Förvärv > förvärvslägen > kontinuerlig > start), ställ in utgångsslitsen till 5 μm.
- Gör ett urval av områden inom mosaikerna för att utföra tomografi, dvs genom att placera en fyrkantig form (klicka på Verktyg till vänster i bildfönstret) med storleken på FoV i röntgenmosaikkartan.
- Tomografi förvärv
- Flytta till den negativa maximala vinkeln +0,1 (till exempel för ZP 25 nm gå till -65,1 °) (Motion Control > Sample and change Sample θ).
- Ställ in antalet bilder som totalt antal vinklar (med hänsyn till bilden i vinkel 0) och vinkelområdet (Mikroskop > Förvärv > Förvärvsinställningar > Förvärvslägen > Tomografi och ändra antalet bilder; ändra sedan Vinkelstart och Vinkelslut).
- Ställ in den definierade exponeringstiden och starta förvärvet (Mikroskop > Förvärv > Förvärvsinställningar > Kamerainställningar och ändra Exponeringstid och klicka sedan på Start).
- Flytta till FF-positionen (Motion Control > Sample och ändra Sample X; ändra sedan Sample Y) och skaffa 10 FF-bilder (Microscope > Acquisition > Acquisition Modes > Average och ändra antalet bilder och klicka sedan på Start).
NOT: Vid Mistral är spektroskopi eller energiberoende mikroskopi möjlig när man förvärvar projektioner samtidigt som man skannar energin över en absorptionskant av intresse. Den slutliga utgången är en stapel med 2D-projektioner, som kommer att innehålla ett röntgenabsorptionsspektrum (XAS) i varje pixel, dvs. bilder med kemisk information. En utvidgning till 3D som kombinerar spektroskopi med tomografi är i princip möjlig. Den totala dosen som krävs kan vara en begränsning och då kan specifika strategier som differentiell absorptionsavbildning krävas.
4. Dataanalys
OBS: All dataanalys görs med tillgänglig öppen programvara och skript utvecklade med automatiserade pipelines.
- På Mistral
- Pipeline konverterar tomografistackar från txrm-förlängning (TXM-programvarutillägg) till hdf5 (hierarkiskt dataformat med öppen källkod) med alla nödvändiga metadata, normaliserar sedan stacken med FF-genomsnittet och maskinströmmen och dekonvolverar slutligen staplarna med det optiska systemets uppmätta punktspridningsfunktion för en specifik Fresnel-zonplatta (ZP) lins och energi23, 24. För dekonvolution, hitta rätt k = 1 / SNR-värde (beror på provtjocklek). För skriptet som utvecklats vid Mistral skriver du kommandot: txrm2deconv "input tomo" "input FF" -zp = "ZP used" - e = " energy " - dx = " pixel size " - k = " 1 / SNR " - t = -1.
- För skriptet som utvecklats på Mistral för automatisk justering skriver du kommandot: ctalignxcorr "normalized deconvolved stack.mrc" "normalized stack.hdf5".
OBS: Ett antal program kan användas för att anpassa projektionerna till en gemensam rotationsaxel med au NP-fiducialerna25,26. Justering av projektionerna kräver subpixelnoggrannhet. Automatisk justering kan endast vara tillfredsställande när Au NP-fiducialer är tillräckliga (>7) och väl spridda på synfältet. Manuell justering behövs ofta i efterhand för att korrigera automatisk justering för att uppnå högsta möjliga noggrannhet. - Om du vill rekonstruera den justerade normaliserade stacken använder du någon av de flera tillgängliga algoritmerna.
OBS: Den justerade stacken kan rekonstrueras med hjälp av Weighted Back Projection (WBP) eller Simultaneous Iterative Reconstruction Techniques (SIRT) på några minuter. För att bevara de linjära absorptionskoefficienterna (LAC) föredras emellertid algebraiska rekonstruktionstekniker (ART)27. ART kräver mer beräkningstid, så SIRT28 görs först för en snabb automatiskt inriktad tiltserierekonstruktion (30 iterationer på några minuter). När inriktningen är tillfredsställande kommer ART att användas.
- Vid B24
- En specialbyggd pipeline konverterar txrm-datafiler till standard-Tiffs med alla metadata som behövs och skickar dem sedan till ett batch-runtomo-arbetsflöde som bearbetar datauppsättningarna på tre sätt: WBP, SIRT och patch.
Representative Results
Att förbereda prover för kryo-SXT kan vara utmanande. Även inom samma provnät är det möjligt att ha områden som är idealiska och områden som inte är idealiska, vilket kan ses i figur 5, som visar två rutor från samma Au finder-rutnät. Det ideala provet bör ha enstaka celler i mitten av ett fyrkantigt nät, inbäddat i ett tunt islager och omgivet av väl dispergerade Au fiducialmarkörer som används för inriktning av lutningsprojektioner före tomografirekonstruktion. Figur 5A visar en fibroblastliknande cell (NIH 3T3) som uppfyller många av dessa kriterier. En enda skiva från en 3D-rekonstruktion med ART27 av det område som är markerat med den röda rutan som anger synfältet (FoV) visas i figur 5B. Många olika organeller som mitokondrier (M), endoplasmatisk retikulum (ER), vesiklar (V) och kärnan (N) kan särskiljas tack vare den kvantitativa rekonstruktionen av LAC: erna. Dessutom är signal-brusförhållandet för rekonstruktionen mycket högt vilket gör det möjligt att uppnå hög kontrast av de cellulära egenskaperna. Å andra sidan visar figur 5C en kvadrat med högre celldensitet. På grund av detta är blottningen vanligtvis mindre effektiv, vilket leder till ett tjockare islager eller till och med förglasningsproblem. I vissa fall kan detta redan observeras vid screening av nätet med hjälp av epifluorescenskartläggning före röntgenavbildningen, och dessa nät bör undvikas till varje pris. I figur 5C kan en spricka i gallret och den förglasade isen observeras som går genom hela maskrutan (markerad med de röda pilarna). Eventuell avbildning nära sprickor bör undvikas på grund av sannolik instabilitet i gallret när det utsätts för strålen. Dessutom kan sprickor vara ett tecken på tjock is, vilket var fallet i detta område. En lutningsserie registrerades i det område som var markerat med den röda rutan. I figur 5D visas en enda skiva från motsvarande 3D-rekonstruktion. Även om vissa större strukturer kan kännas igen, går fina detaljer förlorade i bullret och kornig konsistens på grund av den tjocka isens dåliga förglasningskvalitet, vilket kan ses specifikt, till exempel på de övre mitokondrierna som pekas av pilen.
Bild 1: Arbetsflöde. Schematiskt arbetsflöde följdes före insamlingen av kryo-SXT-data. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Växande celler på galler. (A) Celler som växer i en P100 petriskål med en sammanflöde runt 80% -90%. (B) P60 Petriskål med flera galler efter sådd av cellerna. (C) Celler som växer ovanpå ett galler efter 24 timmar. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Lastning av galler på provhållarna och in i överföringskammaren. (A) Arbetsstation fylld med flytande kväve med skytteln och kryoboxarna redo för lastning av gallret. (B) Provhållare som förs in i lastaren med gallret laddat. (C) Skyttel med provhållaren i position 3 utan locket. (D) Arbetsstation med överföringskammaren ansluten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ladda prover i TXM (A) Fäst överföringskammaren på TXM. (B) Skyttel inuti TXM. (C) TXM-robotarmen som sätter in provhållaren i provsteget. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Exempel på kryo mjuka röntgentomogram. Övre raden: idealiskt prov, (A) 2D-mosaikvy av en rutnätskvadrat som visar en isolerad cell i mitten. (B) En skiva från den rekonstruerade 3D-volymen som visar det markerade området med den röda rutan (A). Jämfört med (D) är bilden mycket mjukare och fler detaljer syns. Nedre raden: icke-idealiska prover, (C) 2D-mosaikvy av en rutnätskvadrat som visar för hög cellkonfluens och sprickor i isen och rutnätfolien (röda pilar). (D) En skiva från den rekonstruerade 3D-volymen som visar det område som är markerat med den röda rutan i (C). Den dåliga eller suboptimala förglasningen kan identifieras av bildens korniga struktur. N: Kärna; M: Mitokondrier; ER: Endoplasmatisk retikulum; MV: Multivesikulära kroppar; V: Vakuol; Skalstänger: A & C 20 μm; B & D 2 μm.VKlicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Provberedning är ett kritiskt steg för att erhålla högkvalitativa mjuka röntgentomogram, eftersom deras kvalitet direkt beror på kvaliteten på provförglasningen och isskiktets tjocklek i vilken cellen är inbäddad. Projektioner med högt signal-brusförhållande kommer att samlas in i områden med tunt islager, vilket gör det möjligt att minimera den stråldos som krävs för att uppnå högsta möjliga upplösning. Dessutom kommer cellkonfluensen också att påverka den slutliga tomogramkvaliteten, eftersom man bör undvika att angränsande celler kommer in i FoV vid rotation. Slutligen kommer den rätta dispersionen av Au fiducialmarkörer att bestämma noggrannheten för projektionsinriktningen och sedan slutligen bestämma kvaliteten på den slutliga 3D-rekonstruerade volymen. Observera att en korrekt spridning av Au fiducials på nätet möjliggör automatisering av projektionsjusteringssteget, utan vilket en hög expertis behövs för ett sådant kritiskt steg.
Protokollet här visar bara en möjlig provberedningsstrategi, som har likheter med de som används i kryoelektrontomografi (kryo-ET). I båda fallen kommer protokoll som förbättrar den krävande provberedningen för bättre reproducerbarhet att vara grundläggande för framgången för dessa tekniker, och ansträngningar görs mot detta mål29. Det är värt att nämna att förutom att avbilda isolerade celler kan delar av vävnad också visualiseras förutsatt att överföringssignalen genom sektionen räcker vid höga lutningsvinklar. Vanligtvis kommer detta att innebära sektioner av få mikron (under 10 μm).
För att avbilda en specifik struktur eller händelse inuti en cell måste man se till att den här funktionen är inne i FoV i tilt-serien. Eftersom FoV i kryo-SXT är begränsad till 10 x 10 μm2 till 15 x 15 μm2 beroende på linsen och står för en pixelöversampling av upplösningen till minst en faktor 2, är den ofta mindre än hela cellförlängningen (se de röda rutorna som anges i figur 5). Därför måste avkastningen hittas och märkas korrekt. Detta görs vanligtvis med hjälp av fluorescerande taggar och korrelativa tillvägagångssätt för synligt ljus. 2D-strategier som kombinerar epifluorescens är enkla eftersom det mjuka röntgenöverföringsmikroskopet har ett integrerat on-line synligt ljusfluorescensmikroskop, men andra metoder för högupplöst 2D- eller 3D-fluorescenssignal finns ocksåtillgängliga 4,12,13,15,16 . I dessa fall måste rutnätet avbildas först i specifika instrument som superupplösningsmikroskop. Observera att de mest effektiva korrelativa metoderna är de som involverar datainsamling vid kryogena förhållanden. Detta beror på att tidsfördröjningen mellan rumstemperatur (RT), synligt ljusfluorescensavbildning och provförglasning, till exempel, kommer att hindra att fånga rätt cellulär händelse i tid; Dessutom kan förglasningsförfarandet lossa den intressanta cellen som har avbildats vid RT från rutnätet. Även om de flesta korrelativa avbildningsmetoder kan innebära att provnäten måste manipuleras och transporteras från ett instrument till ett annat, och trots den ökade risken för nätförorening eller skada som detta medför, är belöningen tydlig: att kunna identifiera specifika händelser eller molekyler inom det cellulära landskapet.
När helcellsavbildning krävs är det möjligt att sy olika tomogram förutsatt att den totala dosen som appliceras inte överskrider gränsen för strålskador. Vanligtvis är den deponerade dosen för att samla in få tomogram på samma cell långt under gränsen vid den uppnåeliga upplösningen (109 Gy) och därför krävs ingen specifik strategi för att sänka dosen, även om detta är prov- och experimentberoende. Vid intensiv datainsamling, t.ex. spektrotomografi, skulle det verkligen krävas en minimering av dosen och en bekväm datainsamling och specifika behandlingsstrategier.
Cryo-SXT har flera begränsningar, vilket bör nämnas här. Den första är den välkända saknade kilen, som är inneboende för att använda platta provstöd. Kapillärprovstöd som tillåter 180-graders rotation har använts tidigare och används fortfarande vid vissa anläggningar, men de uppvisar också nackdelar som en fattig kontrast på grund av glasabsorptionen och begränsningen av att använda celler i suspension. Ett sätt att minska effekten av den saknade kilen är att utföra dubbel lutningstomografi. Detta är verkligen möjligt vid Mistral strålrör nuförtiden. Den andra begränsningen fastställs av Fresnel-zonplattlinsen som används i sådana mikroskop. Detta objektiv ställer in den ultimata upplösningen som kan uppnås och skärpedjupet (DoF), båda är tätt relaterade. Detta innebär att ökad upplösning kommer att minska DoF medan cellens tjocklek ofta blir större. Till exempel kommer en 40 nm-lins i teorin att ha en DoF på 3 μm och en upplösning på 24,4 nm halv tonhöjd. Kompromissen mellan upplösning och DoF är därför strategisk och valet av lins beror på typen av cell30,31. Slutligen är operativa TXM över hela världen långt ifrån idealiska mikroskop och ansträngningar görs för att förbättra de optiska systemen för att nå de teoretiska förväntningarna. Slutligen kan visualiseringen och segmenteringen av de rekonstruerade volymerna utföras med specifika programvaruverktyg 25,32,33,34.
Sammanfattningsvis tillåter kryo-SXT avbildning av celler kvantitativt vid medelhög upplösning (25-30 nm halv tonhöjd) och i statistiska tal (få tiotals tomogram per dag). Detta gör det möjligt att erhålla organellernas organisation, distribution och dimension vid specifika förhållanden, till exempel under patogeninfektion eller sjukdomar, vid exakta tidpunkter eller efter särskilda behandlingar. Det är därför en användbar kompletterande biologisk avbildningsteknik till de vanligare elektron- och synliga ljusmikroskopierna, var och en av dem hanterar ett specifikt spektrum av provdimensioner och upplösning. Cryo-SXT används ofta i korrelativa tillvägagångssätt som involverar synlig ljusfluorescens, men andra kryokorrelativa strategier är också möjliga.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Projektet har fått finansiering från Europeiska kommissionens Horizon 2020 iNEXT-Discovery-projekt och Eus forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 75439.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
| Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
| Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
| Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
| Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
| Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
| Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
| Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
| Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
| IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
| Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
| LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
| MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
| P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
| P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
| Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
| Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
| SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
| Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
| TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
| XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |
References
- Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
- Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
- Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
- Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
- Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
- Natterer, F. The mathematics of computerized tomography. , Wiley. New York. (1986).
- Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
- Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
- Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
- Cinquin, B., et al.
- Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
- Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
- Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
- Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
- Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
- Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
- Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
- Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
- Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
- Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
- Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
- Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
- Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
- Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
- Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
- Attwood, D. Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , Cambridge University Press. Cambridge. (2000).
- Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , Springer. New York. (2007).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).
