Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En 3D kartografisk beskrivelse av cellen av Cryo Soft X-ray Tomography

Published: March 15, 2021 doi: 10.3791/62190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1MISTRAL beamline, Alba Light Source, Cerdanyola del Valles, Spain, 2Beamline B24, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, UK

Summary

Her presenteres en protokoll som beskriver prøveforberedelsen og datainnsamlingstrinnene som kreves i cryo soft X-ray tomografi (SXT) for å avbilde ultrastrukturen til hele kryobevarte celler med en oppløsning på 25 nm halv tonehøyde.

Abstract

Avbildningsteknikker er grunnleggende for å forstå celleorganisasjon og maskineri i biologisk forskning og relaterte felt. Blant disse teknikkene tillater kryo myk røntgentomografi (SXT) avbildning av hele kryokonserverte celler i vannvinduets røntgenenergiområde (284-543 eV), der karbonstrukturer har iboende høyere absorpsjon enn vann, slik at 3D-rekonstruksjonen av absorpsjons lineær koeffisient av materialet som finnes i hver voksel. Kvantitativ strukturell informasjon på nivået av hele celler opp til 10 μm tykk er da oppnåelig på denne måten, med høy gjennomstrømning og romlig oppløsning ned til 25-30 nm halv pitch. Cryo-SXT har vist seg relevant for dagens biomedisinske forskning, og gir 3D-informasjon om cellulære infeksjonsprosesser (virus, bakterier eller parasitter), morfologiske endringer på grunn av sykdommer (som recessive genetiske sykdommer) og hjelper oss med å forstå narkotikavirkning på cellenivå, eller lokalisere spesifikke strukturer i 3D-cellemiljøet. I tillegg, ved å dra nytte av den justerbare bølgelengden på synkrotronanlegg, spektroskopi eller dens 3D-motstykke, kan spektrotomografi også brukes til å avbilde og kvantifisere spesifikke elementer i cellen, for eksempel kalsium i biomineraliseringsprosesser. Cryo-SXT gir komplementær informasjon til andre biologiske avbildningsteknikker som elektronmikroskopi, røntgenfluorescens eller synlig lysfluorescens, og brukes vanligvis som partnermetode for 2D- eller 3D-korrelativ avbildning ved kryogeniske forhold for å koble funksjon, plassering og morfologi.

Introduction

Cryo-SXT kan spille en sentral rolle i biologisk bildeforskning, da det gir 3D-middels oppløsning (25-30 nm halv tonehøyde) volumer av hydrerte hele celler 1,2,3,4,5,6. I vannvinduets energiområde, mellom karbon og oksygenabsorpsjon K kanter (4,4-2,3 nm), absorberer karbonrike cellulære strukturer 10 ganger mer enn det oksygenrike mediet som gjennomsyrer og omgir dem. I dette energiområdet kan vitrifiserte celler opp til 10 μm tykkelse avbildes uten behov for seksjonering eller farging, noe som fører til kvantitative høyabsorpsjonskontrastprojeksjoner, som, kombinert med prøverotasjonsevner, tillater tomografisk rekonstruksjon av cellulær struktur. Cryo-SXT fyller en nisje når det gjelder prøvedimensjoner og romlig oppløsning som ikke er lett tilgjengelig av noen annen bildeteknikk.

Kort sagt, absorpsjonskontrasten til cryo-SXT er kvantitativ, da dempingen av fotonene gjennom prøven av tykkelse t adlyder Beer-Lambert-loven som følger: Equation 1, hvor jeg0 representerer hendelsesintensiteten og μl den lineære absorpsjonskoeffisienten, som avhenger av bølgelengden λ og den imaginære delen β av den brytningsindeksen til prøven (Equation 2 ). Dempingen er en funksjon av den biokjemiske sammensetningen og tykkelsen på strukturene som blir avbildet, med hver biokjemiske komponent som har en bestemt røntgen lineær absorpsjonskoeffisient μl (LAC). Dette betyr at hver tomografi voxel verdi avhenger av de kjemiske elementene og deres konsentrasjon i den voxel7. Dette muliggjør naturlig diskriminering av forskjellige organeller som nuklei, nukleoli, lipidlegemer eller mitokondrier, eller forskjellige komprimeringstilstander av kromatin utelukkende basert på deres iboende LAC-verdier rekonstruert 2,8,9.

I tillegg er cryo-SXT en høy gjennomstrømningsteknikk med tomogrammer som samles inn på få minutter. Dette muliggjør spesielt mesoskala avbildning av cellepopulasjoner som kan fanges på viktige tidspunkter som divisjon, differensiering og apoptose, men også ved forskjellige responstilstander som de som er indusert av kjemisk eksponering for spesifikke medikamentterapier eller til patogene infeksjoner. Data samlet inn på disse viktige punktene vil levere 3D-beskrivelse av systemet med en trofast oversikt over den romlige organiseringen av de forskjellige cellulære organellene på de spesifikke øyeblikkene.

Vanligvis brukes cryo-SXT i kombinasjon med andre teknikker som følger korrelative tilnærminger som gjør det mulig å finne spesifikke egenskaper, hendelser eller makromolekyler i 3D-cellemiljøet 4,10,11,12,13,14,15,16, eller harde røntgenfluorescensdata 17,18 . Korrelative tilnærminger ved kryogeniske forhold er av avgjørende betydning for å oppnå det mest komplette og verdifulle bildet av interessesystemet. Et kortfattet sammendrag av den typiske arbeidsflyten ved strålelinjene Mistral (Alba) og B24 (Diamond) cryo-SXT er skissert i figur 1.

Videre, ved å dra nytte av bølgelengdejusteringsevnen på synkrotronanlegg, kan spektroskopisk informasjon fås i tillegg til den strukturelle ved hjelp av den spesifikke differensialabsorpsjonen av bestemte elementer som finnes i prøven. Et eksempel på dette ville være plasseringen av kalsium i studiet av biomineraliseringsprosesser i cellene 19,20,21. Ved å ta 2D-bilder på forskjellige fotonenergier (spektra) eller tomogrammer under og ved røntgenabsorpsjonskanten av interesse, kan pikslene eller voxlene som inneholder det valgte elementet identifiseres. Spectra tillater også differensiering av kjemiske tilstander (dvs. utviklingen av amorf kalsium til hydroksyapatitt som i forrige biomineraliseringseksempel20). Kvantifisering av ulike elementer er mulig i 2D og 3D. Spektroskopisk avbildning av vitrifiserte celler gjøres vanligvis i vannvinduet, men er også mulig ved andre energiområder hvis vanninnholdet er lavt nok, eller hvis andre prøveprepareringsprotokoller, inkludert dehydrering, brukes22. En detaljert spektroskopi trinnvis protokoll er utenfor fokuset til protokollen heri.

I det følgende fokuserer protokollen på å kort oppsummere de viktigste prøveforberedelsestrinnene, selv om hvert system kanskje trenger individuell raffinement, etterfulgt av en detaljert trinnvis datainnsamlingsprosedyre for cryo myk røntgentomografi.

Protocol

1. Prøvepreparering

  1. Klargjøre rutenettstøtten
    1. Bestråle gitteret med UV i 3 timer med karbonfilmen vendt oppover for sterilisering.
    2. Valgfritt: I tilfelle problemer med celler som ikke er festet til rutenettet, bruker du ett av følgende trinn.
      1. Hydrofiliser karbonstøttefolien ved plasmabehandling av gitteret for å øke prøvespredningen og bedre celleadhesjon.
        1. Plasser gitterets karbonside opp i glødeutladningskammeret og utsett nettet for plasma i 30 s til 15 min (ved hjelp av Ar eller/og O2) avhengig av utstyret.
      2. Funksjonaliser gitteret med Poly-L-lysin (PLL)
        1. Tilsett individuelle dråper 60 μL PLL i en Petri-tallerken og legg gitteret på toppen av PLL-dråpen med karbonfilmen vendt ned. Inkuber i 30 min ved 37 °C og flekk PLL med et filterpapir.
      3. Funksjonaliser gitteret med foster bovint serum (FBS).
        1. Senk nettene i FBS over natten. Dypp gitteret i en bufferløsning for å vaske og la gitteret ligge på et filterpapir for å fjerne overflødig væske.
  2. Voksende tilhengerceller på rutenett
    1. Vokse celler i en cellekulturrett på 100 mm for å nå 80% -90% samløp (figur 2A).
    2. Frø 1-5 x 105 celler/ml (juster verdi til system) på toppen av Au-gitteret i en P60 Petri-tallerken (totalt 3 ml).
      NOTAT: Tilsetningen av cellefjæringen må gjøres veldig nøye med karbonfilmen til rutenettet vendt oppover i en cellekulturrett på 60 mm. Klargjør flere gitter per tilstand, én betingelse per P60 Petri-tallerken (figur 2B).
    3. La cellene slå seg ned til sammenløpet på rutenettet når flere celler (1 til 10 avhengig av cellestørrelsen) i hver maske firkant (avhengig av cellelinjen kan dette ta opptil 24 timer).
      NOTAT: Før frysing bør gitteret kontrolleres med et synlig lysmikroskop (VLM), evaluere karbonfilmintegriteten samt cellesammenløpet i hvert rutenett (figur 2C). Vent til riktig celletetthet på rutenettet er nådd. Hvis gitteret er for flytende eller karbonfolien er ødelagt, start på nytt.
  3. Avsetning av celler i suspensjon på rutenett
    1. Velg et forberedt Au- eller Cu-rutenett ved hjelp av pinsett fra dykkfryseren (se pkt. 1.6).
    2. Forbered en 1-5 x 105 celle suspensjon (optisk tetthet absorbans på 0,3 i tilfelle bakterier) og tilsett 4 μL av den forberedte suspensjonen til rutenettet.
    3. Inkuber rutenettet med dråpen i noen minutter horisontalt for å tillate avsetning av cellene, og plasser deretter pinsetten som holder rutenettet inne i det klimakontrollerte vitrifiseringskammeret satt til passende temperatur- og fuktighetsforhold (trinn 1.6.1).
  4. Valgfritt: fluorescerende merking av prøvene
    NOTAT: Det kan være gunstig å fluorescerende merke noen organeller av prøven. Avhengig av interessen kan spesifikke fluoroforer eller celler som stabilt uttrykker et fluorescerende protein eller transfektert for forbigående uttrykk for et protein av interesse, brukes. Dette gjør det enkelt å oppdage celler ved hjelp av kryo-epifluorescensmikroskopi og hjelper til med å finne celler av interesse for etterfølgende røntgenbilder. I det følgende beskriver protokollen bare bruken av fluoroforer.
    1. Forbered en arbeidsløsning for fluorofor (se produsentens anbefaling) og følg den spesifikke protokollen.
    2. Tilsett fluoroforene i Petri-parabolen som inneholder gitteret og bland forsiktig.
    3. La det inkubere i et mørkt miljø og gå direkte til trinn 1.6 etter at inkubasjonen er ferdig.
      MERK: Det er viktig å være klar til å vitrify når inkubasjonen er ferdig for å unngå uspesifisert merking og følgelig uskarpt fluorescerende signal.
  5. Klargjøring av au nanopartikler (NPs) for tomogramprojeksjonsjustering
    1. Ta en aliquot på 1 ml av Au fiducial lagerløsning (100 nm ved Mistral eller 250 nm ved B24) og sentrifuger ved lav hastighet (for å unngå aggregering) i 1 min for å la NPs pellet.
      NOTAT: Hvis det er mulig, er det å foretrekke å forlate fiducials å bosette seg naturlig over natten eller mer, for å unngå aggregering.
    2. Fjern supernatanten. Umiddelbart før frysing må du suspendere NPs på nytt i 20 μL serumfritt medium eller bufferløsning for å oppnå en homogen løsning.
      NOTAT: Sonikering og virveling anbefales for å homogenisere løsningen.
  6. Dypfrysende gitter
    FORSIKTIG: Flytende nitrogen kan forårsake kaldforbrenning og riktig verneutstyr bør brukes (lang labfrakk, vernebriller, hansker, lange bukser og lukkede sko). Etan er svært eksplosivt og bør holdes borte fra gnister eller åpen ild.
    1. Følg produsentens anvisninger for å klargjøre og bruke stempelfryserinstrumentet.
      NOTAT: Fuktighet er vanligvis satt til 80%-90%; temperaturen vil avhenge av celletype (gjær maksimalt 30 °C, pattedyrceller 37 °C, insektceller 28 °C osv.).
    2. Ta et rutenett med monterings pinsettene fra Petri-parabolen ved kanten, pass på at du ikke bøyer rutenettet og monterer det på stempelfryserenheten. Pass på at cellene vender bort fra blottingspapiret.
    3. Valgfritt: Vask rutenettet tre ganger i buffer når det gjelder tilhengerceller.
    4. Tilsett 1,5 μL au NP fiducials på toppen av cellene (gjennom hullet på høyre side av kammeret) og la det stå i 30 s før oppblåsthet og dypping av rutenettet.
      NOTAT: Når det gjelder celler i suspensjon, legg Au NP fiducials til rutenettet mens det fortsatt er i horisontal posisjon før du monterer pinsett og la dem bosette seg i 30 s. Blotting er avgjørende for rutenett av høy kvalitet. Blotting avstand må kalibreres før du starter; flathet av blotting papir er viktig for reproduserbar blotting (følg instruksjonene fra produsenten). Blotting tid må vurderes for hver celle type.
    5. Klargjør flere rutenett per betingelse. Overfør rutenettet og lagre ved kryogeniske temperaturer for å bevare vitrifisering.
  7. Screening av gitter med kryo synlig lysmikroskopi
    1. Overfør gitteret under flytende nitrogen fra kryo-boksene til en standard kryokassett (tre posisjoner for 3 mm TEM-gitter) inne i et ferdigkjølt kryotrinn (se instruksjoner fra produsenten).
    2. Cryo-kassetten er plassert på kryo-scenebroen og kryo-scenen er montert på et bredt felt epifluorescence lysmikroskop.
    3. Bilde rutenettene ved -196,5 °C ved hjelp av et langt mål for avstand (10x, 50x, 100x) for å finne egnede celler for kryo-SXT-avbildning og vurdere rutenettkvaliteten (tilstedeværelse av tykk is, integriteten til karbonstøttefilmen, tilstedeværelse av fluorescerende signal, etc.).
    4. Lokaliser cellene av interesse ved hjelp av lyse felt eller / og fluorescensavbildning.
      MERK: På dette stadiet tar du bildene hvis et koblet kamera er til stede på mikroskopet. Bruk den til bildekorrelasjon.
    5. Etter screening, returner gitteret til kryo-boksene i en flytende nitrogenlagringsdewar.
      NOTAT: Hvis det ikke blir funnet noen gode prøver, gjentar du prøveforberedelsestrinnene for å endre noen av parameterne. Vanligvis er parametrene som krever modifikasjon oppblåsthetstid, i tilfelle isen er for tykk eller konfluensen, hvis det er for mange celler per maske firkant.

2. Lasting i røntgenmikroskopet for overføring (TXM)

  1. Avkjøl overføringskammeret med flytende nitrogen til det når <100 K, avkjøl arbeidsstasjonen (figur 3A) og slå på varmeren på arbeidsstasjonskanten. Vent til det slutter å koke.
  2. Plasser de nødvendige kryoboksene som inneholder rutenett, på de tilsvarende stedene i arbeidsstasjonen (figur 3A). Vær oppmerksom på å overføre dem trygt under kryoforhold.
  3. Legg de valgte rutenettene inn i prøveholderne som tidligere er avkjølt (figur 3B); last holderne på romfergen og beskytt dem med dekslene (figur 3C).
  4. Last skyttelbussen inn i overføringskammeret ved <100 K og pump den ned til lavt vakuum (figur 3D).
  5. Fest overføringskammeret til TXM (figur 4A) og last skyttelbussen fra overføringskammeret inn i TXM etter vakuumprosedyren på skjermen (figur 4B).
  6. Når romfergen er inne med prøvene, kan TXM-robotarmen bringe en prøveholder om gangen til prøvetrinnet (figur 4C).

3. Avbildning ved hjelp av TXM-programvaren

MERK: Gitter på prøvestadiet avbildes først med et on-line synlig lysmikroskop (VLM) for å kartlegge rutenettet enten i brightfield- og/eller fluorescensmodus før de avbildes med røntgenstråler. Bruk styrespakikonet som tilsvarer bevegelseskontrollfanen øverst til venstre for å åpne bevegelseskontrollen.

  1. Bilde av rutenettet med online VLM.
    1. Bright felt mosaikk oppkjøp
      1. Velg VLM-kameraet (forstørrelseslinse > VLM) og slå på VLM-ledekilden for lysfeltavbildning (mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Kildeinnstillinger og velg Overføring).
      2. Roter prøven til -60 grader for å møte VLM-målet (Motion Control > Sample > Sample θ) og flytt prøven til forventede midtstilte posisjoner (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y).
      3. Mens du anskaffer bilder i trinn på 20 til 50 μm først for å bringe rutenettet omtrent i fokus (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Continuous > Start; Bevegelseskontroll > Ta prøver av og endre prøve Z).
      4. Finpuss fokuset med mindre trinn ned til 5 μm til cellene og/eller hullene i karbonstøttefilmen er i fokus (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Continuous > Start; Motion Control > Sample and change Sample Z) og starte oppkjøpet av et fullstendig mosaikkkart over rutenettet i lysfeltmodus. Bruk standardverdiene for mosaikken. (Mikroskop > oppkjøp > anskaffelsesinnstillinger > anskaffelsesmoduser > Mosaic > Start).
        NOTAT: Et mosaikkkart er laget av enkeltbilder. Antall bilder (antall kolonner, rader og trinnstørrelsen i X og Y) bør angis til å visualisere hele rutenettet. Trinnstørrelsen avhenger av størrelsen på synsfeltet (FoV). Standardverdiene brukes her. Hvis rutenettet ikke er godt sentrert i X-Y-planet med hensyn til full mosaikk FoV, stopp oppkjøpet, korriger prøve X- og Y-koordinatene og gjenta oppkjøpet.
    2. Fluorescensmodus mosaikk oppkjøp
      1. Slå av den VLM-ledede kilden for lysfeltavbildning (mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Source Settings og avvalg Transmission) og velg LED-lyskilden som tilsvarer ønsket eksitasjonsbølgelengde (rød, grønn eller blå) og det tilsvarende optiske filteret manuelt på oppsettet.
      2. Finpuss fokuset på fluorescensbildet (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Continuous > Start; Motion Control > Sample and change Sample Z), og skaff deg deretter et mosaikkkart som beholder posisjonsparametrene (X og Y) fra bright field mosaic (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Mosaic > Start).
      3. Slå av LED-lyskilden
      4. Valgfritt: Basert på lysfeltet og fluorescensmosaikkkartene, kommenter områdene av interesse (ROI) identifisert tidligere (trinn 1.7.4) eller nye AVKASTNING (X-Y-posisjoner i bildet).
  2. Røntgen mosaikk acquistion
    1. Velg CCD-røntgendetektoren (forstørrelseslinse > velg Pixis), ta prøven til 0 graders rotasjon (Bevegelseskontroll > Prøv og endre prøve θ) og flytt røntgenoptikken (kondensator- og soneplate) til justerte posisjoner (Bevegelseskontroll > Kondensator > bytt kondensator z; Bevegelseskontroll > soneplate og bytt soneplate Z).
      NOTAT: Avkjøl CCD-brikken til -65 °C før avbildning (Mikroskop > Kameratemperatur > Pixis og endre innstilt temperatur til -65 °C og klikk på Påfør).
    2. Flytt prøven til midten av nett firkanten i en av de valgte avkastningene (Bevegelseskontroll > Eksempel og endre Prøve X, Prøve Y).
    3. Bruk binning 2 og utgangsspalte på 5 μm for å minimere bestråling og 1 s eksponering ved Mistral, og binning 1 og 60 μm ved B24, juster fokuset ved hjelp av prøve Z-oversettelse (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Kamerainnstillinger og endre binning; Motion Control > XS og endre XS; Mikroskop > anskaffelse > anskaffelsesinnstillinger> anskaffelsesmoduser > kontinuerlig > start; Bevegelseskontroll > Ta prøver av og endre prøve Z). Start i trinn på 5 μm og foredle det ned til trinn på 0,5 μm, til cellen eller karbonfoliehullene er godt i fokus.
    4. Skaff deg et mosaikkkart over mesh-torget (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Mode > Mosaic > Start).
      NOTAT: Mosaikkanskaffelsesparametere kan bestemmes på samme måte som for VLM-mosaikkene (avsnitt 3.1.1.4). Trinnstørrelsen avhenger av forstørrelsen som er forhåndsvalgt av strålelinjepersonalet.
    5. Flytt prøven til en flat feltposisjon (FF) (et tomt område i rutenettet, helst et hull i karbonstøtten) (Bevegelseskontroll > Prøve og endre prøve X, prøve Y).
    6. Sett eksponeringstiden til 1 s på Mistral og 0,5 s på B24 (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Camera Settings og endre eksponeringstid) og skaff deg et enkelt bilde (Microscope > Acquisition > Acquisition Modes > Single > Start).
    7. Normaliser (del) den oppkjøpte mosaikken av FF-bildet for å få overføringen (med verdier mellom 0 og 1) og lagre den normaliserte mosaikken (klikk på det første høyre øvre hjørneikonet på høyre side av bildet for å åpne menyen>velus referansefanen> klikk Enkeltreferanse og bla gjennom den spesifikke FF).
  3. Forbereder innsamling av røntgen tilt-serien
    NOTAT: Finn rotasjonsaksen for hvert interesseområde som avbildes.
    1. Lag et utvalg av områder i mosaikkene for å utføre tomografi, det vil si ved å plassere en firkantet form (klikk på Verktøy på venstre side av bildevinduet) med størrelsen på FoV i røntgenmosaikkkartet.
      NOTAT: Når du velger områder, bør du vurdere avstanden fra kantlinjen (≥10 μm) og andre celler for å unngå overlapping av celler under rotasjon. I tillegg må du sjekke tilstanden til cellen (forventet celleform, istykkelse, suksess av vitrifisering, fiducial spredning, etc.).
    2. Eksempeljustering på rotasjonsaksen
      NOTAT: Den rapporterte prosedyren er iterativ. Gjentakelsen konvergerer raskere ved hjelp av ± 60° vinkler som maksimale rotasjonsvinkler (θM). Hvis de ikke er tilgjengelige, bruk vinkler så nært som mulig for å ± 60°.
      1. Sett kameraet til binning 2, eksponeringstid 1 s (Mikroskop > Anskaffelse > Anskaffelsesinnstillinger > Kamerainnstillinger og endre eksponeringstid; endre binning; Mikroskop > oppkjøp > anskaffelsesmoduser > kontinuerlig > Start), sett utgangsspalten til 5 μm.
        NOTAT: Minimer dosen så mye som mulig ved å arbeide med minimal blenderåpning av utgangsspalte.
      2. Når rotasjonen er 0°, flytter du til det tidligere merkede området ved hjelp av prøve X- og prøve Y-oversettelsen og fokuserer på funksjonen til cellen som skal plasseres i rotasjonsaksen ved hjelp av prøve Z-oversettelsen (Motion Control > Sample og endre Sample x; Eksempel y; Prøve z).
      3. Roter prøven til + θM (Motion Control > Sample and change Sample θ) og tegn en linje (L+) (klikk på linjeverktøyknappen på høyre side av bildevinduet) på funksjonen til cellen for å sette på rotasjonsaksen.
      4. Roter til -θM (Bevegelseskontroll > Eksempel og endre Prøve θ) og tegn en linje (L-) (klikk på linjeverktøyknappen på høyre side av bildevinduet) på funksjonen til cellen du vil plassere på rotasjonsaksen.
      5. Når du er på +θM eller -θM, bruker du eksempel Z-oversettelsen til å flytte den valgte funksjonen til midtposisjonen mellom begge linjene (Bevegelseskontroll > Eksempel og endre eksempel Z).
      6. Gjenta prosedyren fra trinn 3.3.2.3 iterativt til en minimumsavstand L+ til L- er nådd.
        NOTAT: Avstanden mellom de to linjene L+ og L- skal være mindre med hensyn til den forrige gjentakelsen.
      7. Ved eksempel θ = 0 (Bevegelseskontroll > Eksempel og endre utvalg θ) flytter du prøve X dobbelt så stor avstand for å plassere den valgte funksjonen midt på begge linjene (Bevegelseskontroll > Eksempel og endre prøve X). Flytt soneplaten (ZP) X for å bringe funksjonen tilbake til midten av FoV (Motion Control > ZP og endre ZP X). Gjør dette trinnet bare én gang per rutenett.
      8. Optimaliser ZP Z-posisjonen på nytt med hensyn til den nye rotasjonsaksen ved å registrere en ZP Z-brennviddeserie (samlinger av bilder i forskjellige ZP Z-posisjoner, vanligvis i trinn på 0,3 μm) (Mikroskop > Oppkjøp > Oppkjøpsinnstillinger > Anskaffelsesmoduser > Focal Series > Start) og flytt ZP Z til posisjonen der prøven er i fokus (Motion Control > Zone Plate og endre Zone Plate og endre Zone Plate og endre Zone
      9. Angi parameterne for oppkjøpet av tilt-serien.
        NOTAT: Det maksimale vinkelområdet er til slutt begrenset av brennvidden på ZP (henholdsvis ±70 eller ±65 grader for en 40 nm eller 25 nm ZP for en flat prøve). Optimaliser signal-til-støy-forholdet (S/N) og strålingsskader for å definere eksponeringstiden. For tomografi, bruk forskjellige eksponeringstider på forskjellige vinkelområder.
      10. Bestem det høyeste rotasjons vinkelområdet, i tilfelle skyggelegging oppstår før den maksimale rotasjonsvinkelen nås.
      11. Sett kamerabindingen til 1 (Mikroskop > Anskaffelse > Anskaffelsesinnstillinger > kamerainnstillinger og endre binning), åpne utgangsspalten til 15 μm ved Mistral (Bevegelseskontroll > XS og endre XS) og sett rotasjonen til 0° (Bevegelseskontroll > Prøve og endre prøve θ).
      12. Skaff deg et enkelt bilde med eksponeringstiden 1 s (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Single > Start) og beregn eksponeringstiden som kreves for hver vippevinkel av tomografien.
  4. Tomografi oppkjøp
    1. Flytt til den negative maksimumsvinkelen +0,1 (for eksempel for ZP 25 nm går du til -65,1°) (Bevegelseskontroll > Prøve og endre prøve θ).
    2. Angi antall bilder som totalt antall vinkler (med tanke på bildet i vinkel 0) og vinkelområdet (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Tomography og endre antall bilder, og endre deretter Angle Start og Angle End).
    3. Angi den definerte eksponeringstiden og start anskaffelsen (Mikroskop > Anskaffelse > Anskaffelsesinnstillinger > Kamerainnstillinger og endre eksponeringstid og klikk deretter på Start).
    4. Flytt til FF-posisjonen (Motion Control > Sample and change Sample X; endre deretter Sample Y) og skaff deg 10 FF-bilder (Microscope > Acquisition > Acquisition Modes > Average og endre antall bilder, og klikk deretter på Start).
      NOTAT: Ved Mistral er spektroskopi eller energiavhengig mikroskopi mulig når man kjøper projeksjoner mens du skanner energien over en absorpsjonskant av interesse. Den endelige utgangen er en stabel med 2D-projeksjoner, som vil inneholde et røntgenabsorpsjonsspekter (XAS) i hver piksel, det vil si bilder med kjemisk informasjon. Utvidelse til 3D kombinere spektroskopi med tomografi er i prinsippet mulig. Den totale dosen som kreves kan være en begrensning, og deretter kan det være nødvendig med spesifikke strategier som differensialabsorpsjonsavbildning.

4. Dataanalyse

MERK: All dataanalyse gjøres med tilgjengelig åpen programvare og skript utviklet med automatiserte rørledninger.

  1. På Mistral
    1. Pipeline konverterer tomografi stabler fra txrm forlengelse (TXM programvareutvidelse) til hdf5 (åpen kildekode hierarkiske dataformat) med alle nødvendige metadata, deretter normaliserer stabelen av FF gjennomsnitt og maskinstrøm, og til slutt dekonvolverer stablene ved målepunkt spredning funksjonen av det optiske systemet for en bestemt Fresnel sone plate (ZP) linse og energi23, 24. For dekonvolusjon finner du riktig k = 1/SNR-verdi (avhenger av prøvetykkelsen). For skriptet som er utviklet ved Mistral, skriver du inn kommandoen: txrm2deconv "input tomo" "input FF" -zp="ZP used" - e= " energy " - dx= " pixel size " - k= " 1/SNR " - t=-1.
    2. For skriptet utviklet på Mistral for automatisk justering, skriv inn kommandoen: ctalignxcorr "normalisert deconvolved stack.mrc" "normalisert stack.hdf5".
      MERK: En rekke programmer kan brukes til justering av projeksjonene til en felles rotasjonsakse ved hjelp av Au NP fiducials25,26. Justering av projeksjonene krever subpikselnøyaktighet. Automatisk justering kan bare være tilfredsstillende når Au NP-fiducials er nok (>7) og godt spredt på synsfeltet. Manuell justering er ofte nødvendig en posteriori for å korrigere automatisk justering for å oppnå høyest mulig nøyaktighet.
    3. Hvis du vil rekonstruere den justerte normaliserte stakken, bruker du en av de flere tilgjengelige algoritmene.
      MERK: Den justerte stabelen kan rekonstrueres ved hjelp av vektet ryggprojeksjon (WBP) eller samtidig iterativ rekonstruksjonsteknikker (SIRT) på få minutter. For å bevare de lineære absorpsjonskoeffisientene (LAC) foretrekkes imidlertid algebraiske rekonstruksjonsteknikker (ART)27. ART krever mer databehandlingstid, så SIRT28 gjøres først for en rask automatisk justert rekonstruksjon av vippeserien (30 gjentakelser på få minutter). Når justeringen er tilfredsstillende, vil ART bli brukt.
  2. Ved B24
    1. Et spesialbygd datasamlebånd konverterer txrm-datafiler til standard Tiffs med alle metadataene som trengs, og sender dem deretter til en satsvis runtomo-arbeidsflyt som behandler datasettene på tre måter: WBP, SIRT og patch.

Representative Results

Det kan være utfordrende å forberede prøver for cryo-SXT. Selv innenfor samme prøverutenett er det mulig å ha områder som er ideelle, og områder som ikke er ideelle, som det fremgår av figur 5, som viser to firkanter fra samme Au finder-rutenett. Den ideelle prøven bør ha enkeltceller i midten av et firkantet nett, innebygd i et tynt lag med is og omgitt av godt spredte Au-fiducial markører som brukes til justering av vippeprojeksjoner før tomografirekonstruksjon. Figur 5A viser en fibroblastlignende celle (NIH 3T3) som oppfyller mange av disse vilkårene. Et enkelt stykke fra en 3D-rekonstruksjon ved hjelp av ART27 i området merket med den røde boksen som angir synsfeltet (FoV), vises i figur 5B. Mange forskjellige organeller som mitokondrier (M), endoplasmic retikulum (ER), vesikler (V) og kjernen (N) kan skille seg ut takket være den kvantitative rekonstruksjonen av LACene. I tillegg er signal-til-støy-forholdet til rekonstruksjonen svært høyt, noe som gjør det mulig å oppnå høy kontrast til de cellulære funksjonene. På den annen side viser Figur 5C en firkant med høyere celletetthet. På grunn av dette er blotting vanligvis mindre effektiv, noe som fører til et tykkere islag, eller til og med vitrifiseringsproblemer. I noen tilfeller kan dette allerede observeres ved screening av nettet ved hjelp av epifluorescenskartlegging før røntgenavbildningen, og disse rutenettene bør unngås for enhver pris. I figur 5C kan det observeres en sprekk i gitteret og den vitrifiserte isen som går gjennom hele maskeplassen (merket med de røde pilene). Enhver avbildning i nærheten av sprekker bør unngås på grunn av sannsynlig ustabilitet i rutenettet når de utsettes for strålen. I tillegg kan sprekker være et tegn på tykk is, som det var tilfelle i dette området. En vippeserie ble spilt inn i området merket med den røde boksen. I figur 5D vises en enkelt skive fra den tilsvarende 3D-rekonstruksjonen. Selv om noen større strukturer kan gjenkjennes, går fine detaljer tapt i støyen og kornete tekstur på grunn av den dårlige vitrifiseringskvaliteten til den tykke isen, som det kan ses spesielt, for eksempel på de øvre mitokondriene som pilen peker på.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt. Skjematisk arbeidsflyt fulgte før cryo-SXT-datainnsamling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Voksende celler på rutenett. (A) Celler vokser i en P100 Petri-tallerken med en sammenløp rundt 80% -90%. (B) P60 Petri-tallerken med flere gitter etter sådd av cellene. (C) Celler som vokser oppå et rutenett etter 24 timer. Skalastenger: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Lastegitter på prøveholderne og inn i overføringskammeret. (A) Arbeidsstasjon fylt med flytende nitrogen med romfergen og kryoboksene klare til lasting av gitteret. (B) Prøveholder satt inn i lasteren med gitteret lastet. (C) Skyttelbuss med prøveholderen i posisjon 3 uten dekselet. (D) Arbeidsstasjon med overføringskammeret tilkoblet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Laste prøver inn i TXM (A) Feste overføringskammeret til TXM. (B) Shuttle inne i TXM. (C) TXM robotarm som setter prøveholderen inn i prøvetrinnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på cryo myke røntgentomogrammer. Øvre rad: Ideell prøve, (A) 2D mosaikkvisning av en rutenett firkant som viser en isolert celle i midten. (B) Ett stykke fra det rekonstruerte 3D-volumet som viser det merkede området med den røde boksen (A). Sammenlignet med (D) er bildet mye jevnere og flere detaljer er synlige. Nedre rad: ikke-ideelle prøver, (C) 2D mosaikkvisning av en rutenett firkant som viser for høy cellesamstrømning og sprekker i is- og rutenettfolie (røde piler). (D) Ett stykke fra det rekonstruerte 3D-volumet som viser området merket med den røde boksen i (C). Den fattige eller suboptimale vitrifiseringen kan identifiseres av bildets kornete tekstur. N: Kjernen; M: Mitokondrier; ER: Endoplasmic Reticulum; MV: Multivesicular kropper; V: Vacuole; Skalastenger: A &0 μm; B &D 2 μm.VKlikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Prøvepreparering er et kritisk skritt for å oppnå myke røntgentomogrammer av høy kvalitet, da kvaliteten deres direkte avhenger av kvaliteten på prøvevistrifiseringen og islagtykkelsen der cellen er innebygd. Projeksjoner med høyt signal-til-støy-forhold vil bli samlet inn i regioner med tynt islag, noe som gjør det mulig å minimere strålingsdosen som kreves for å oppnå høyest mulig oppløsning. I tillegg vil cellesamstrømningen også påvirke den endelige tomogramkvaliteten, siden man bør unngå å ha nærliggende celler som kommer inn i FoV ved rotasjon. Til slutt vil riktig spredning av Au-fiducial markører bestemme nøyaktigheten av projeksjonsjusteringen og deretter til slutt bestemme kvaliteten på det endelige 3D-rekonstruerte volumet. Merk at en riktig spredning av Au-fiducials på rutenettet muliggjør automatisering av projeksjonsjusteringstrinnet, uten hvilken en høy kompetanse er nødvendig for et så kritisk trinn.

Protokollen heri skildrer bare en mulig prøveforberedelsesstrategi, som har likheter med de som brukes i kryoelektrontomografi (cryo-ET). I begge tilfeller vil protokoller som forbedrer den krevende prøveforberedelsen for bedre reproduserbarhet være grunnleggende for suksessen til disse teknikkene, og det arbeides mot dette målet29. Det er verdt å nevne at i tillegg til å avbilde isolerte celler, kan deler av vev også visualiseres forutsatt at overføringssignalet gjennom seksjonen vil være nok i høye vippevinkler. Vanligvis vil dette innebære deler av få mikron (under 10 μm).

Hvis du vil vise en bestemt struktur eller hendelse i en celle, må man kontrollere at denne funksjonen er inne i FoV-en i vippeserien. Siden FoV i cryo-SXT er begrenset til 10 x 10 μm2 til 15 x 15 μm2, avhengig av linsen og står for en pikseloversampling av oppløsningen til minst en faktor på 2, er den ofte mindre enn hele celleutvidelsen (se de røde firkantene angitt i figur 5). Derfor må avkastningen bli funnet og riktig merket. Dette gjøres vanligvis ved hjelp av fluorescerende koder og synlige lyskorrelative tilnærminger. 2D-strategier som kombinerer epifluorescens er enkle ettersom det myke røntgenoverføringsmikroskopet har et integrert on-line synlig lysfluorescensmikroskop, men andre tilnærminger for høyoppløselig 2D- eller 3D-fluorescenssignal er også tilgjengelige 4,12,13,15,16 . I slike tilfeller må nettet først avbildes i spesifikke instrumenter som mikroskoper med superoppløsning. Vær oppmerksom på at de mest effektive korrelative tilnærmingene er de som involverer datainnsamling ved kryogene forhold. Dette er fordi tidsforløpet mellom romtemperatur (RT), synlig lysfluorescensavbildning og prøvevistrifisering, for eksempel, vil hindre å fange riktig cellulær hendelse i tide; I tillegg kan vitrifiseringsprosedyren løsne den interessecellen som er avbildet ved RT fra rutenettet. Selv om de fleste korrelative avbildningsmetoder kan innebære at prøvenettene må manipuleres og transporteres fra det ene instrumentet til det andre, og til tross for den økte risikoen for nettkontaminering eller skade dette utgjør, er belønningen klar: å kunne finne spesifikke hendelser eller molekyler i det cellulære landskapet.

Når hele celleavbildning er nødvendig, er det mulig å sy forskjellige tomogrammer forutsatt at den totale dosen som påføres ikke overstiger strålingsskadegrensen. Vanligvis er den avsatte dosen for å samle få tomogrammer på samme celle godt under grensen ved oppnåelig oppløsning (109 Gy), og derfor er det ikke nødvendig med noen spesifikk strategi for å senke dosen, selv om dette er prøve- og eksperimentavhengig. Ved intensiv datainnsamling som spektrotomografi, vil det faktisk være nødvendig å minimere dosen, og praktisk datainnsamling og spesifikke behandlingsstrategier må brukes.

Cryo-SXT har flere begrensninger, som bør nevnes her. Den første er den velkjente manglende kilen, som er iboende til å bruke flate prøvestøtter. Kapillærprøvestøtter som tillater 180-graders rotasjon har blitt brukt tidligere og brukes fortsatt på noen anlegg, men de presenterer også ulemper som en fattig kontrast på grunn av glassabsorpsjon og begrensningen av å bruke celler i suspensjon. En måte å redusere effekten av den manglende kilen er ved å utføre dobbel tilt tomografi. Dette er faktisk mulig på Mistral-strålelinjen i dag. Den andre begrensningen er satt av Fresnel soneplatelinse som brukes i slike mikroskoper. Denne linsen setter den ultimate oppløsningen oppnåelig og dybdeskarpheten (DoF), som begge er tett beslektet. Dette innebærer at å øke oppløsningen vil redusere DoF mens tykkelsen på cellen ofte vil være større. For eksempel vil en 40 nm linse i teorien ha en DoF på 3 μm og en oppløsning på 24,4 nm halv pitch. Kompromisset mellom oppløsning og DoF er derfor strategisk, og valget av linsen vil avhenge av typen celle30,31. Til slutt er operasjonelle TXMer over hele verden langt fra ideelle mikroskoper, og det arbeides for å forbedre de optiske systemene for å nå de teoretiske forventningene. Til slutt kan visualiseringen og segmenteringen av de rekonstruerte volumene utføres med spesifikke programvareverktøy 25,32,33,34.

Oppsummert tillater cryo-SXT bildeceller kvantitativt ved middels oppløsning (25-30 nm halv tonehøyde) og i statistiske tall (få titalls tomogrammer per dag). Dette gjør det mulig å oppnå organisering, distribusjon og dimensjon av organeller ved bestemte forhold, for eksempel under patogeninfeksjon eller sykdommer, på nøyaktige tidspunkter eller etter bestemte behandlinger. Det er derfor en nyttig komplementær biologisk bildeteknikk til de mer vanlige elektron- og synlige lysmikroskopiene, hver av dem takler et bestemt utvalg av prøvedimensjoner og oppløsning. Cryo-SXT brukes ofte i korrelative tilnærminger som involverer synlig lysfluorescens, men andre kryokorrelative strategier er også mulige.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette prosjektet har fått støtte fra EU-kommisjonens Horisont 2020 iNEXT-Discovery-prosjekt og EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen No 75439.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira Thermo Fisher Software for segmentation
Au Holey Carbon Films  finder grids (Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2 Au G200F1 Au Holey Carbon Films finder grids
Au nanoparticles  BBI Group, Cardiff, UK Au nanoparticles 100nm 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba)
Au nanoparticles  BBI Group, Cardiff, UK Au nanoparticles 250nm 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond)
Axio Scope A1 Zeiss 430035 9060 Fluorescence microscope
Blotting No.1 filter paper Whatman WHA10010155 Blotting filter
Bsoft Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008)
Chimera Software for segmentation (Pettersen et al. 2004)
Cryo-EM Glow Discharge Set PELCO easiGlow 91000S Glow Discharge Cleaning System
Cu Holey Carbon Films  finder grids (Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2Cu G200F1 Cu Holey Carbon Films finder grids
Fetal calf serum Sigma F9665 Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture
ImageJ Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)
IMOD Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996)
Leica EM GP Grid Plunger Leica 16706401 Automatic Plunge Freezer EM
LINKAM cryo-stage Linkam Scientific Instruments CMS 196 Cryo-Correlative Microscopy Stage
MIB Software for segmentation (Belevich et al. 2016)
P100 Petri dish Sigma P6106 Treated for cell culture and sterile
P60 Petri dish Sigma D8054 Treated for cell culture and sterile
Polylysin Sigma P4707 Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered
Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV Xradia NCT-SB Transmission soft X-Ray microscope
SURVOS Software for segmentation  (Luengo et al. 2017)
Tomo3d Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)
TomoJ Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007)
XM Data Explorer Zeiss TXM software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
  2. Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
  3. Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
  4. Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
  5. Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
  6. Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
  7. Natterer, F. The mathematics of computerized tomography. , Wiley. New York. (1986).
  8. Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
  9. Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
  10. Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
  11. Cinquin, B., et al. Putting molecules in their place. Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).
  12. Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
  13. Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
  14. Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
  15. Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
  16. Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
  17. Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
  18. Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
  19. Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
  20. Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
  21. Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
  22. Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
  23. Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
  24. Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
  25. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  26. Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
  27. Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
  28. Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
  29. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
  30. Attwood, D. Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , Cambridge University Press. Cambridge. (2000).
  31. Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , Springer. New York. (2007).
  32. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
  33. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  34. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).

Tags

Biologi Utgave 169 Røntgenbilder myk røntgentomografi kryogeniske temperaturer hele celler spektroskopi
En 3D kartografisk beskrivelse av cellen av Cryo Soft X-ray Tomography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Groen, J., Sorrentino, A., Aballe,… More

Groen, J., Sorrentino, A., Aballe, L., Oliete, R., Valcárcel, R., Okolo, C., Kounatidis, I., Harkiolaki, M., Pérez-Berná, A. J., Pereiro, E. A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography. J. Vis. Exp. (169), e62190, doi:10.3791/62190 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter