Summary
这项研究的目的是确定纳米粒子跟踪分析(NTA)能否检测和量化含有健康成年人纳米晶体的尿钙。目前的研究结果表明,NTA可能是估计肾结石疾病期间泌尿纳米晶体的潜在工具。
Abstract
肾结石在全世界成人和儿童中越来越普遍。最常见的肾结石类型由草酸钙(CaOx)晶体组成。当尿液中富含矿物质(如钙、草酸盐、磷酸盐)并形成肾结石之前时,就会发生结晶。评估石器晶体的标准方法包括显微镜、过滤和离心。然而,这些方法主要检测微晶体,而不是纳米晶体。纳米晶体被建议对肾脏上皮细胞的危害大于体外微晶体。在这里,我们描述了纳米粒子跟踪分析(NTA)检测人类泌尿纳米晶体的能力。健康成年人在饮用草酸盐负荷以刺激泌尿纳米晶体之前,先吃受控的草酸盐饮食。尿在草酸盐负荷前后收集了24小时。用乙醇加工和清洗样品以净化样品。泌尿纳米晶体沾染了钙结合氟磷,氟-4 AM。染色后,使用 NTA 确定纳米晶体的大小和计数。这项研究的结果表明,NTA可以有效地检测健康成年人的纳米晶体。这些发现表明,NTA可能是肾结石患者纳米晶体的有价值的早期检测方法。
Introduction
当尿液中富含矿物质时,尿晶体就会形成。这可能发生在健康的人,但更常见的个人肾结石1。泌尿晶体的存在和积累会增加患肾结石的风险。具体来说,当晶体与兰德尔的斑块结合,核化,积累,并随着时间的推移生长2,3,4时,就会发生这种情况。晶体在肾结石形成之前和晶体的评估可能具有预测价值的肾结石前3,5。具体来说,结晶体已被建议有用,以预测在含有结石6,7的草酸钙病史患者的结石复发的风险。
据报道,晶体对肾上皮和循环免疫细胞功能8、9、10、11、12、13产生负面影响。此前有报道称,与健康个体相比,从草酸钙(CaOx)肾结石前体中循环的单核细胞抑制了细胞生物能学。此外,CaOx晶体可减少细胞生物能学,并破坏单核细胞8中的红氧平衡。食用富含草酸盐的膳食可能导致结晶体,导致肾管损伤,并改变保护肾结石形成的尿大分子的生产和功能。多项研究已证明,尿晶体的形状和大小可能因尿液17、18、19的pH值和温度而异。此外,尿蛋白已被证明可以调节晶体行为20。道登等人19日提出,结晶体分析可能有助于肾结石病患者的管理,并评估他们对治疗的反应。目前可用于评估晶体存在的一些常规方法包括极化显微镜21、22、电子显微镜23、粒子计数器3、尿液过滤24、蒸发3、5或离心21。这些研究为肾结石领域提供了宝贵的见解。然而,这些方法的局限性是无法可视化和量化大小小于 1μm 的晶体。这种大小的晶体可能通过附着在兰德尔的斑块上来影响CaOx石的生长。
与较大的微晶体25相比,纳米晶体已证明对肾脏细胞造成广泛损伤。纳米晶体的存在已经报告在尿液中使用纳米粒子分析仪26,27。最近的研究已经使用荧光标记的双磷酸盐探针(亚龙-氟辛/阿伦德龙酸盐-Cy5)来检查纳米晶体使用纳米级流细胞测量28。这种染料的限制是,它不是具体的,将结合几乎所有类型的石头,除了半胱氨酸。因此,准确评估个体中纳米晶体的存在可能是诊断结晶体和/或预测结石风险的有效工具。本研究的目的是利用纳米粒子跟踪分析(NTA)检测和量化含有纳米晶体的钙(大小为 <1微米)。为此,NTA 技术与含钙氟磷、氟-4 AM 相结合,用于检测和量化健康成年人尿液中含有纳米晶体的钙。
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Protocol
这项工作中概述的所有实验都得到了阿拉巴马大学伯明翰分校(UAB)机构审查委员会的批准。健康成人(33.6±3.3岁;n=10)如果有正常的血液综合代谢板,非烟草使用者,非怀孕,体重指数在20-30公斤/米2之间,并且没有慢性疾病或急性疾病,则报名参加研究。健康参与者在研究开始前签署了书面知情同意书。
1. 临床协议和尿液收集
- 让参与者在收集尿液(24 小时样本)之前,先食用由 UAB 临床和转化科学中心准备的低草酸盐饮食 3 天,并快速过夜。
- 第二天,让参与者在食用草酸盐(含有水果和蔬菜的冰沙,约8毫米草酸盐)之前返回其24小时尿样(草本前)。参与者随后收集尿液24小时(牛酸后样本),第二天返回尿液。
- 在处理前在室温下保持所有尿液样本(RT),如下图 1所示。
2. 尿液处理
注:所有使用的材料和设备都列在 材料表中。
注意:在处理临床样品和试剂时,时刻佩戴个人防护装备。具体来说,手套、脸部和眼罩、呼吸保护和防护服。
- 测量和记录尿液pH度和体积。在将 50 mL 尿液添加到标记的无菌 50 mL 圆锥管中之前,彻底混合。
- 使用台式离心机在 RT 中以 1200 x g 的离心机样品 10 分钟。
注意:将样品保存在RT,以防止进一步的晶体形成,因为较冷的温度可以促进结晶。 - 丢弃超自然物,用5mL的100%乙醇再次清洗和补充颗粒。使用台式离心机在 RT 将样品以 1200 x g 分分钟,使用离心机进行 10 分钟。
- 丢弃超自然物,在1mL的100%乙醇中补充颗粒。将样品储存在 -20 °C,以供以后处理或弄脏样品,如下所述。
注意:存储或新鲜染色样品的数据点(即颗粒大小/浓度)没有显著差异。
3. 纳米粒子跟踪分析
- 样品准备
- 金纳米粒子:使用金纳米粒子优化仪器上的设置。在超纯水中稀释 100 nm 大小的金纳米粒子 1:1000。
- 人类尿液:在水中稀释尿液样本20次,然后用5mM Fluo-4 AM(一种钙荧光染料)在黑暗中染色30分钟。使用 NTA 分析样本。
- 准备氧化钙(CaOx)晶体,如前所述29。在分析之前,将 10 mM 库存溶液(10 mL 水中的 14.6 毫克)稀释到 50 μM,并在黑暗中使用 5 mM Fluo-4 AM 对稀释样品进行污渍 30 分钟。
- 磷酸钙 (CaP) 晶体:在 NTA 分析之前,在水中稀释 10 mM 库存溶液(10mL 水中 50.4 毫克)至 50 μM,并在黑暗中使用 5 mM Fluo-4 AM 对稀释样品进行污渍 30 分钟。
- 仪器设置、摄像机设置和数据收集
注:用于此方法的计算机和仪器设置显示在 图 2 中。- 打开电脑,然后打开仪器。打开软件并打开相机。
- 打开软件窗口后,单击窗口左上角的捕获图标以启动捕获模式。相机初始化需要几秒钟。
- 首先使用 1 mL 注射器将空气泵入平台,直到平台看起来清洁。使用另一个 1 mL 注射器将水轻轻加入仪器 2-3 次,以消除任何气泡。
注意:在平台和管道中查找任何气泡。在运行样品之前和运行样品时,在整个仪器中不要有气泡是很重要的。如果存在气泡,用空气和水再次清洁平台。 - 平台清洁后,通过查看摄像机添加水以检查表面是否有污染。接下来,在样品装载泵喷油器中加入金纳米粒子作为控制,以设置仪器。
- 将屏幕上或旋钮上的摄像头级别调整到仪器的右侧,直到图像开始显示彩色像素,然后降低相机水平。
- 然后调整屏幕以优化图像。左键单击视频图像上的鼠标按钮。按住左鼠标按钮,上下拖动图像以获取整个视图。
注:普通相机镜头和滤镜用于评估金纳米粒子和未染色样品。 - 设置输液速度并对焦相机,使金纳米粒子在相机屏幕上可见。将输液速度设置为高(即 500 μL/min),以便初始设置,以确保检测到金纳米粒子。检测到后,将速度降低到 50μL/min。
- 调整相机水平以可视化粒子。对于未染色的样品,调整 5 级的屏幕增益以实现相机对焦,并将相机级别设置为 8。设定对焦后,记录示例(即仅 1 次测量,仅 60 秒)。
注:对焦和连续流速对于获取清晰清晰的粒子图像以进行计数非常重要。 - 优化后,在评估样品之前,再次用水清洁设备。查看摄像机,确保管子清洁且颗粒不存在。
注意:在每个样品之间清洗腔室,直到摄像机检测到颗粒。 - 要分析染色样品,将相机调整到包含合适荧光滤光片的滤镜位置。将稀释和染色的样品加载到样品装载泵喷油器上,并将速度降低到 20 μL/min,以便分析样品。
- 接下来调整屏幕增益和相机级别,因为这些是重要的参数。对于染色(荧光)样品,将屏幕增益设置为 5,相机级别设置为 13 级。
注意:这些参数将根据样本类型而变化,每个示例都需要优化以获得焦点。 - 使用标准测量来测量每个样本的 5 次捕获,其中一个捕获持续时间为 60 秒。
- 每次测量后保存和存储数据。该软件将为每个测量保存图像和视频文件。该软件提供输出数据(例如,晶体大小:10 nM - 1000 nM 和浓度)在卓越和 pdf 格式。
- 计算每个样本所有 5 个读数的平均纳米粒子数。使用平均值的标准偏差或标准误差分析数据,并使用 t 测试进行配对分析。
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Representative Results
这项研究的结果表明,NTA可以有效地检测人类尿液中含有尿纳米晶体的钙的平均大小和浓度。这是通过使用氟磷、氟-4 AM 和纳米粒子跟踪分析实现的。Fluo-4 AM 能够与 CaOx 和 CaP 晶体结合。如图3A所示,CaOx晶体的大小确定在50-270纳米之间,平均浓度为1.26 x 109颗粒/mL。CaP晶体的大小在30-225纳米之间,平均浓度为2.22×109粒子/mL(图3B)。为了确定NTA能否评估人类尿液中的纳米晶体,健康成年人被要求食用受控的草酸盐饮食,然后摄入高草酸盐。收集负荷前后的24小时尿液样本,以评估尿纳米晶体大小和浓度。草前尿液样本中含有一些尿纳米晶体(1.65 x 108 ± 3.29 x 107颗粒/mL)在 110-300 nm 之间(图 4)。相比之下,氧化后样品(7.05 x 108< ±1.08 x 10 8 粒子/mL;100-320 nm) 尿纳米晶体显著增加(p.010001)。为了确认该方法的可重复性,对样品进行了三次测量,技术复制品(图5)没有显著变化。
图1:隔离和染色人类泌尿纳米晶体的协议。请点击这里查看此图的更大版本。
图2:纳米粒子跟踪分析(NTA)的描述。 (B) 样品在填充光学表面之前,使用注射器泵以连续速度注入进水管。然后,通过目标镜头观察样品,当样品流过平台时,相机会捕获样品,然后通过出口管退出以丢弃样品。请单击此处查看此图的较大版本。
图3: NTA 检测 Fluo-4 AM 标记的草酸钙 (CaOx) 和磷酸钙 (CaP) 晶体。(A) CaOx 和 (B)CaP 晶体的代表图显示大小分布和浓度。请单击此处查看此图的较大版本。
图4:NTA检测Flo-4 AM标记为24小时人类泌尿纳米晶体。 Fluo-4 AM 代表图在 24 小时牛皮前和牛后样本中标记了尿纳米晶体,这些样本来自健康成年人,使用受控的草酸盐饮食。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5:使用NTA在24小时尿液收集中复制人类纳米晶体的技术。 在24小时(A)牛酸前和(B)牛酸盐后从健康成年人的受控草酸盐饮食中,对Fluo-4 AM标记的泌尿纳米晶体进行技术复制。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
NTA在本研究中使用钙结合探针Flo-4 AM来评估人类尿液中的纳米晶体。没有标准方法可以检测尿液中的纳米晶体。一些研究小组已经检测出尿液中的纳米晶体,并依靠使用广泛的协议或方法,这些协议或方法限制了他们量化样本的能力。这项研究展示了一种特定而敏感的方法,用于检测参与饮食喂养研究的人类尿液中含有纳米晶体的钙,该研究包括摄入高草酸盐负荷。草酸盐的消耗量相当于实际世界中草酸盐的消耗量(例如,1/2菠菜沙拉)。
NTA是一种具有良好特征的高分辨率工具,它使用布朗运动测量解决方案30中的粒子。它已用于评估生物纳米粒子的各种生物样本31,32,33。此外,NTA 可以准确预测任何类型的生物样本中颗粒的大小和浓度。此方法不需要任何标签:但是,标签可用于检测特定颗粒。在这项研究中,利用Flo-4 AM高效和专门地检测尿液样本中含有纳米晶体的钙。钙荧光探针最初用于测量自由细胞酸钙34。Fluo-4是荧光-3的类似物,其荧光在与35自由钙结合后增加>100倍。此外,Fluo-4已被证明使用流细胞学36来评估关节炎患者的同体液中的钙颗粒。因此,我们使用 Fluo-4 AM 进行这些研究。
所有样品均不断注入平台进行精确检测。确定浓度和颗粒大小取决于流速,因为高流速率(即 50 μL/min)会影响对浓度的准确评估,以及粒子大小与静态设置和较低流速(即 20 μL/min)37 相比。因此,稳定的慢速流速可准确测量样品中存在的颗粒数量。其他可能影响粒子计数和大小的重要参数包括相机水平、检测阈值和对焦 38、39、40。样品中一致的粒子测量(CV 约 20%)在目前的研究中观察到,这与另一项研究39的发现是一致的。最后,使用电子显微镜29证实人类尿液中存在纳米晶体。这项研究证明NTA可以成功地测量来自人类的尿纳米晶体。
此协议的一个优点是使用 Fluo-4 AM 来评估溶液中含有颗粒的钙。另一个优点是在检测样品中的纳米晶体时观察到的最小变异性。NTA在此设置中的一个限制是无法区分纳米晶体的形态。然而,这种方法可能有利于检测结晶体,以预测有含肾结石钙病史的个人的结石风险。此协议无法取代当前的方法,但可能会提供有关泌尿纳米晶体的新见解。使用NTA来评估含晶体的尿钙是一种新方法,它应该强调纳米晶体的重要性,超越标准显微镜和上述方法。有必要进行更多的调查,以探索这种方法在肾结石人群中的可靠性。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢所有研究参与者和 UAB CCTS 生物营养核心和 UAB 高分辨率成像服务中心的贡献。这项工作得到了国家卫生研究院DK106284和DK123542(TM)和UL1TR003096(国家推进转化科学中心)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
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