Summary
Vi beskriver bruken av en porcin hornhinne for å teste den antivirale effekten av eksperimentelle legemidler.
Abstract
Virus og bakterier kan forårsake en rekke okulære overflatefeil og degenerasjon som sår og sår gjennom hornhinneinfeksjon. Med en seroprevalens som spenner fra 60-90% over hele verden, Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) ofte forårsaker mucocutaneous lesjoner i den orofaciale regionen som også manifesterer seg som lesjoner og infeksjon-assosiert blindhet. Mens nåværende antivirale legemidler er effektive, krever fremveksten av motstand og utholdenhet av giftige bivirkninger utvikling av nye antivirale midler mot dette allestedsnærværende patogenet. Selv om in vitro-vurdering gir noen funksjonelle data om et fremvoksende antiviralt, viser de ikke kompleksiteten til okulært vev in vivo. In vivo-studier er imidlertid dyre og krever opplært personell, spesielt når du arbeider med virale midler. Derfor er ex vivo-modeller effektive, men rimelige trinn for antiviral testing. Her diskuterer vi en protokoll for å studere infeksjon ved HSV-1 ved hjelp av porcine corneas ex vivo og en metode for å behandle dem topisk ved hjelp av eksisterende og nye antivirale legemidler. Vi demonstrerer også metoden for å utføre en plakkanalyse ved hjelp av HSV-1. Metodene som er beskrevet kan brukes til å utføre lignende eksperimenter for å studere infeksjoner som ligner HSV-1-patogenet.
Introduction
Personer som lider av okulære infeksjoner pådrar seg ofte synstap1. Med høy seroprevalens over hele verden lider HSV-infiserte individer av tilbakevendende øyeinfeksjoner som fører til hornhinnen arrdannelse, stromal keratitt og neovascularization2,3,4,5. HSV-infeksjoner har også vist seg å forårsake sjeldnere, en rekke alvorlige tilstander blant immunkompromitterte, ubehandlede pasienter som encefalitt og systemisk sykelighet6,7,8. Legemidler som Acyclovir (ACV) og dens nukleosidanaloger har vist konsistent suksess med å dempe HSV-1-infeksjon og til og med kontrollere reaktivering, men langvarig bruk av disse stoffene er forbundet med nyresvikt, fosteravvik og manglende begrensning av fremveksten av legemiddelresistens mot utviklende virusstammer9,10,11,12,13. Kompleksiteter forbundet med HSV-1 okulære infeksjoner, har tidligere blitt studert in vitro ved hjelp av monolayers og 3D-kulturer av menneskelige hornhinneceller og in vivo ved hjelp av murine eller kanin okulære infeksjoner. Mens disse in vitro-modellene gir betydelige data om de cellulære biologiske komponentene i HSV-1-infeksjoner, klarer de imidlertid ikke å etterligne den intrikate kompleksiteten i hornhinnen vev og gjør lite for å belyse den dendrittiske spredningen av viruset14. Derimot, selv om in vivo-systemer er mer innsiktsfulle i å vise infeksjon spredt i hornhinner og immunaktiveringsresponser under HSV-1-infeksjon, kommer de med advarselen om at de krever trente etterforskere og store fasiliteter for dyrepleie for å overse forsøkene.
Her bruker vi porcin hornhinner som en ex vivo modell for å undersøke HSV-1 infeksjon indusert sår system. Både den potensielle farmakologien til visse legemidler samt sårets celle- og molekylærbiologi forårsaket av infeksjonen kan studeres gjennom vevsekstlantkulturer. Denne modellen kan også endres for bruk til andre virus- og bakterieinfeksjoner også. I denne studien ble porcin hornhinnen brukt til å teste den antivirale effekten av et preklinisk lite molekyl, BX795. Bruken av svine corneas ble foretrukket på grunn av enkel tilgang og kostnadseffektivitet. I tillegg er porcin hornhinnemodeller gode modeller av menneskelige øyne med hornhinnen lett å isolere, tilstrekkelig størrelse for infeksjon og visualisering og robust for å håndtere15. Porcin hornhinnen er også sammenlignbar med kompleksiteten av menneskelige hornhinnen modeller i både trans hornhinnen permeabilitet og systemiskabsorpsjon 15. Ved å bruke denne modellen til studien var vi i stand til å belyse hvordan BX795 er verdig videre undersøkelse som en kompetent hemmer av HSV-1 virusinfeksjon og legger til litteraturen for å klassifisere den som en potensiell antiviral forbindelse med små molekyler16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt svinevevet som ble brukt i denne studien ble levert av en tredjeparts privat organisasjon, og ingen av dyrehåndteringene ble utført av University of Illinois hos Chicago-personell.
1. Materialer
-
Reagenser
- Bruk følgende reagenser for plakkanalyse: pulvermetylcellulose, Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM), føtal bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin (P/S) for plakkanalyse.
- Bruk krystallfiolette tabletter og etanol (molekylærbiologisk karakter) for å forberede krystallfiolett løsning for plakkanalyse.
-
Vero celle vekstmedier - DMEM hele medier
- Åpne DMEM-medieflasken inne i vevskulturhetten. Fjern 55 ml medier fra flasken ved hjelp av en serologisk pipette og kast den. Legg 50 ml FBS av P/S til DMEM. Kjøl ved 4 °C.
-
Plaque analysemedier - Lager av 5% metylcellulose media
- Mål 2,5 g metylcellulosepulver med en røremagnet inne i en 500 ml glassflaske og autoklaver den. Etter at flasken er avkjølt til romtemperatur, ta 500 ml DMEM hele medier som inneholder 50 ml FBS og 5 ml P / S og legg den til glassflaske som inneholder metylcellulose.
- Rør dette ved 4 °C i 2 dager ved hjelp av en magnetisk omrører. Kjøl ved 4 °C.
-
Medieforberedelse for utskilt porcin hornhinne
- Åpne en minimum viktig medieflaske (MEM) inne i vevskulturhetten. Kast 10 ml MEM fra flasken ved hjelp av en serologisk pipette.
- Tilsett 5 ml insulin-transferrin-selen (ITS) og 5 ml antimykotisk-antibiotika (AA) til media og kjøl ved 4 °C.
-
Master og arbeider lager av krystallfiolett:
- For å lage den krystallfiolette lagerløsningen, tilsett 1 g krystallfiolett pulver til 100 ml 20% etanol i vann. Denne bestanden (1% m / v krystallfiolett) kan lagres og brukes i opptil år når den lagres på et sted som er mørkt.
- For å lage et arbeidslager fra dette, legg til 50 ml original lagerløsning til 350 ml vann. Tilsett 100 ml etanol til denne løsningen for å lage en 500 ml fungerende krystallfiolett løsning (0,1% m / v krystallfiolett).
MERK: Begge disse løsningene må lagres i mørket.
2. Prosedyre
- Isolering av porcin hornhinnen fra hele øynene17
- Når du mottar svineøyne fra en egnet leverandør, lagre på is hvis det er forsinkelse med vevsbehandling som avbildet i figur 1.
- Sørg for at personlig verneutstyr brukes og brukes under denne prosedyren for å unngå forurensning samt ulykker fra søl av glasslegemet humor.
- Spray arbeidsområdet med 70% etanol for å rengjøre og desinfisere. For å sikre at arbeidsområdet er stabilt, sprer du et benkdeksel og teiper sidene sikkert som avbildet i figur 2.
- Plasser svineøyne på gasbind (Figur 3). Bruk 50 mm gasbind til å holde i bakre del (Figur 4A) med svineøyne som vist i figur 4B med én hånd.
- Med en nål på 30 G lager du forsiktig en enkelt stikk i omtrent midten av øyets epiteloverflate og sørger for at det ikke er noen skade på stroma (figur 5). Poke bør begrenses til epitelet (~ 100-200 μm) for å unngå stromal involvering.
- Bruk et skarpt sterilisert blad, lag et lite snitt på scleraen i 1 mm avstand fra hornhinnen. Klipp kanten av hornhinnen og sørg for at glasslegemet ikke lekker ved hjelp av en rask og jevn roterende handling av hånden (Figur 6A). Ved å holde hornhinnen på hornhinnen-sclera kanten med en flat pinsett, kutte av de resterende tethering membraner av øyet ved hjelp av bladet (Figur 6B).
- Ta hornhinnen og legg den i en 12-brønns plate lagt med 2 ml hornhinne medium. Hornhinnen bør plasseres vendt opp, demonstrert i en rekke trinn i figur 7A-D, figur 8).
- Tilsett 5 μL av virusløsningen som inneholder 5 x 105 plakkdannende enheter (PFU) på 17 GFP til debrided stedet på hornhinnen overflaten. Plasser 12-brønnsplaten som inneholder infiserte svine corneas i en inkubator med 5% CO2 i 72 timer.
- Spray eventuelle ekstra øyne som ikke brukes i eksperiment med 10% blekemiddel og forsvarlig avhendet i biofareposer.
- Visualisering
MERK: Viruset bør visualiseres hver dag før tilsetning av legemidler.- Slå på stereomikroskopet og LED-lyskilden og la maskinens lampe varme opp før du forestiller hornhinnene. Bær forsiktig platen av hornhinnen til instrumentet uten å forstyrre løsningen. Bytt filter slik at GFP (380-460 nm) brukes til å se på prøver. Sett eksponeringstiden til 500 ms for å ta bilder.
- Først plasserer du hornhinneplaten under stereoskopet og tar bildene med den laveste forstørrelsen på 7,5x. Følg opp dette med en rekke økende forstørrelsesbilder (f.eks. 15x, 25x, 35x) slik at all viral spredning og dendritdannelse visualiseres tydelig
- Sørg for å returnere de infiserte hornhinnene tilbake i vevskulturinkubatoren og lagre alle bildene som ble tatt.
- Kvantifisering av virusinfeksjon
MERK: Virustitrer fra svinekorn bør evalueres hver dag for å analysere effekten av narkotikabehandling.- For å kvantifisere virus, frø Vero celler med en tetthet på 5 x 105 av celler per brønn hvis du bruker en 6-brønns plate som gjort i dette eksperimentet. Gjør dette en dag før infeksjonen. Inkuber de belagte cellene over natten for å sikre at de er sammenfallende for virus kvantifisering.
- Aliquot 500 μL serumfrie medier i flere mikrocentrifugerør. Sett inn steril bomullsspisset vattpinne dyppet i de serumfrie mediefylte rørene. Bomullspinnene må dyppes og fuktes i minst 5 minutter før bruk.
- Uten å forstyrre de underliggende mediene, transportere den infiserte porcine hornhinneplaten inn i et biosikkerhetsskap. Bruk de våte bomullspinnene til å gjøre 3 omdreininger med klokken og 3 omdreininger mot klokken med en diameter på 5 mm fra midten av den infiserte svinepoeaen uten å påføre for høyt trykk.
- Sett bomullspinnen tilbake i det serumfrie mediefylte mikrosenterrøret og roter det med klokken og mot klokken 5 ganger. Metallspissen på bomullspinnen skal kuttes kort slik at den passer helt inn i mikrosenterrøret og lokket kan lukkes.
- Plasser mikrocentrifugerøret som inneholder den vattsteinede bomullsspissen på en virvelmaskin og virvel i høy hastighet i 1 min.
- Utfør virus kvantifisering via en plakkanalyse på disse prøvene.
MERK: Dette kvantifiseringstrinnet må utføres på dag 2, 4 og eventuelt på 6 dager etter infeksjon.
- Virus kvantifisering ved plakk analyse
MERK: For å utføre en plakkanalyse, vokse og plate Vero celler i en 6 brønnplate og sikre 90% sammenløp av celler før starten av analysen. Bruk en konfluent 75 cm2 kolbe av disse cellene. Alle trinnene nedenfor må utføres inne i et biosikkerhetsskap.- Vask den sammenfallende monolayeren av Vero-celler i kolben med 10 ml fersk fosfatbuffer saltvann (PBS) etter å ha aspirert kulturmediet. Gjenta vasketrinnet igjen med PBS etter å ha aspirert det første settet med vaskeoppløsning.
- Tilsett 1 ml 0,05 % Trypsin i cellemonolayet. Inkuber kolben ved 37 °C i 5 minutter. Med det blotte øye, sørg for at cellene løsnes fra innsiden av kolben. Hvis ikke, vent i ytterligere 5 minutter før du undersøker kolben igjen. Når celler ser ut til å være løsrevet, legg til 9 ml hele medier til monolayeren for å sikre at cellene løsner helt fra kolbeoverflaten.
- Samle alle cellene fra kolben sammen med hele mediet og legg dem i et 15 ml sentrifugerør.
- For hver brønn av de 6 brønnplatene som brukes til plakkanalyse, bruk 300 μL fra sentrifugerøret. Fyll opp hver brønn på 6 brønnplaten med 2 ml hele medier. La platene ligge i inkubatoren over natten for å la dem vokse og danne en konfluent monolayer i hver brønn.
- For å utføre en plakkanalyse, må det utføres en seriell fortynning av prøver før kvantifisering av virus.
- Utfør en logg101 fold fortynning av viruset i mikro-sentrifuge rør ved hjelp av serumfrie medier til en fortynning på10-8 er nådd. Når du ved en10-3 fortynning overfører 1 ml av fortynning til monolayer av belagte celler etter å ha aspirert vekstmediet på cellene fra 6 brønnplaten, vil dette være infeksjonstrinnet. Inkuber den infiserte platen ved 37 °C inkubator i 2 timer.
- Aspirer eksisterende infeksjonsmedier, vask med PBS to ganger forsiktig for å belegge celler og tilsett 2 ml metylcellulose ladede medier per brønn til alle 6 brønner. Inkuber i 72 timer eller til dannelse av plakk kan ses. Plakk kan identifiseres ved dannelse av små hull mellom celler i cellemonolayeren.
- Tilsett 1 ml metanol sakte til hjørnet av hver brønn, ved hjelp av veggen som ledespiss. Inkuber 6 brønnplaten ved romtemperatur i 15 min. Aspirer sakte innholdet i hver brønn fra platen uten å forstyrre eller agitere cellemonolayeren.
- Tilsett 1 ml krystallfiolett arbeidsløsning til hver brønn på 6 brønnplater, slik at alle cellene er dekket. Inkuber 6 brønnplaten i mørket i 30 min. Kast den krystallfiolette løsningen ved å aspirere den og tørk brønnene på et ark med absorberende papir.
- Tell antall plakk ved den høyeste fortynningsbrønnen for å kvantifisere det totale virusinnholdet i startløsningen. Gjenta prosessen to ganger for å bekrefte den virale titeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å forstå effekten av de eksperimentelle antiviralene, må de testes grundig før de sendes til in vivo humane kliniske studier. I denne forbindelse må positiv kontroll, negativ kontroll og testgrupper identifiseres. Trifluorothymidine (TFT) har lenge vært brukt som foretrukket behandling for å behandle herpes keratitt topisk16. Brukt som en positiv kontroll, viser TFT-behandlede hornhinnegrupper lavere infeksjonsspredning. Som en negativ kontroll brukte vi DMSO eller kjøretøykontroll oppløst i PBS. BX795, det eksperimentelle prekliniske stoffet var testgruppen. Totalt 4 hornhinnen ble tildelt hver gruppe og stoffene ble tilsatt 3 ganger hver dag til svine corneas. Våre resultater ved hjelp av stereoskopisk fluorescensavbildning viser at den antivirale effekten av BX795 ligner TFT i å kontrollere virusspredning. Viral spredning i studiene våre kan visualiseres ved å avbilde den grønne fluorescenskanalen i stereoskopet. Vi observerte at kjøretøy bare behandlet negativ kontrollgruppe hornhinner viste spredning av viruset fra den sentrale infeksjonssonen til periferien med 6 dager etter innledende viral inokulasjon, mens begge stoffene (BX795 og TFT) fjerner infeksjonen i dag 4 - 6 bilder (Figur 9A). På samme måte viser okulære vattpinner tatt på dag 2 og 4 etter infeksjon en fullstendig hemming av virus i den positive kontrollen og BX795-behandlede prøver mens en kraftig økning i smittsomvirustiter observeres i den negative kontrollgruppen (Figur 9B).
Figur 1: Svineøyne holdt på is til vevet er behandlet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av arbeidsbenk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Svineøyne plassert på gasbind. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Porcin øye med 30G nål avbildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: 30 G nål brukt; hull laget i midten av epiteloverflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Roterende virkning som brukes til å skjære rundt hornhinnens kant med skarpt sterilisert blad (A, B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Cornea-bilder. (A,B) Hornhinnen endelig kuttet ved hjelp av skarp saks (C) Isolert hornhinnen holdes av pinsett (D) Helt isolert hornhinne, klar til bruk Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Corneas plassert i 12-brønnsplate og inkubert i 72 timer Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Progresjon av virusspredning tatt under infeksjonsforløpet. Nyeksist porcin hornhinner ble smittet med HSV-1 17-GFP og (A) avbildet ved hjelp av mikroskop på dag 2, 4 og 6 post infeksjon. Aktuell behandling med DMSO, TFT eller BX795 ble startet på dag 2 etter infeksjon. (B) Plakkanalyser ble utført ved hjelp av vattpinner tatt fra svinekornene på Vero Cells. Toveis ANOVA-test ble utført for å forstå signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene. n=4, ****p=0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere forskning har vist at BX795 har en lovende rolle som antiviralt middel mot HSV-1-infeksjon; ved å hemme TANK-bindende kinase 1 (TBK1)16. Både TBK1 og autofagi har spilt en rolle i å hemme HSV-1 infeksjon som demonstrert på humane hornhinnen epitelceller. BX795 ble vist å være maksimalt effektiv med antiviral aktivitet i en konsentrasjon på 10μM og ved hjelp av både vestlig blotanalyse og viral plakkanalyse av viktige virusproteiner, BX795 ble vist å hemme HSV-1 infeksjon som kan sammenlignes med aktiviteten til TFT16. Studien på svine hornhinnen fulgte samme analyse og oppnådde lignende resultater som vist ovenfor; BX795 er vist å være like effektiv som TFT i hemmende infeksjon - bilder tatt av porcin hornhinner på dag 4 og 6 av infeksjon viser sammenlignbare resultater i både TFT og BX795. Plakettanalyser utført for å kvantifisere utskilte virioner forsterker også disse funnene16. BX795 har også vist seg å ha antivirale effekter in vitro og bruken topisk i musemodeller in vivo har også vist undertrykkelse av hornhinnen HSV-1 infeksjon16.
Studien bidrar til å etablere BX795 som en effektiv og ledende forbindelse for bredspektret antiviral anvendelse mot HSV-1-infeksjon. Ved å vise sin effekt i porcine modeller som sammenlignbare med TFT, BX795 står for å lykkes i flere infeksjonsmodeller16. I tillegg er BX795 viktig, da det har vist seg å være effektivt i flere virusstammer, til og med HSV-1 (KOS) tk12 som er resistent mot et annet mye brukt stoff Acyclovir (ACV)16. BX975-behandlede celler viser svært lite uttrykk for HSV-1 viralt protein gB som sertifiserer hemmingseffekten av HSV-1-virus. BX795 viser også bedre anti-viral effekt ved lavere doser sammenlignet med andre behandlinger og anti-herpesvirusbehandlinger. Videre viser terapeutiske konsentrasjoner av BX795 (selv foreslått konsentrasjon på 10 μM) ingen negativ cytotoksisitet mot celler - ingen apoptoseinduksjon og celledød, som igjen er sammenlignbar med TFT-kontrollen16.
Kritiske trinn i protokollseksjonen inkluderer isolering av svinekornea fra hele øyet. Dette innebærer debridement av hornhinnen i midten av øyet ved hjelp av en nål og krever svært liten kraft for å sikre ingen stromal involvering etterfulgt av å utskille hornhinnen fra okulær overflate forsiktig uten å forstyrre iris. Et annet sett med kritiske trinn inkluderer deler som involverer pre-fukting bomull tips og swabbing hornhinnen overflaten. Bevegelsen bør være forsiktig for å sikre at hornhinnen epitel ikke løsnes fra okulær overflate.
Modifikasjon kan gjøres til epitel debridement trinnet. I stedet for å bruke en 30 G nål for å lage en enkelt poke i midten av hornhinnen, kan eksperimentet bruke et sterilt blad eller 30 G nål for å forsiktig lage rutenettformede riper til hornhinnen epitel. Dette sikrer robust infeksjon til epitelet.
Porcine hornhinnen bør brukes på samme dag av anskaffelser og bør ikke holdes i mer enn 24 timer. Porcine hornhinnen holdt i is i mer enn 4 timer vil resultere i at iris stikker til hornhinnen. Dette gjør det vanskeligere å skille hornhinnen fra resten av øyet under eksisjon. Ikke alle svine corneas vil bli smittet likt. Eksperimentet skal infisere minst 5 øyne per gruppe og deretter velge like infiserte hornhinn på dag 2 postinfeksjon for å fortsette med eksperimentet.
Betydningen av den nåværende teknikken innebærer kostnadseffektiviteten ved å bruke svin over menneskelige hornhinnen. Teknikken er også signifikant på grunn av den relative friskheten til hornhinnene som brukes sammenlignet med menneskelige hornhinnen.
Fremtidige anvendelser av den nåværende teknikken inkluderer, men ikke begrenset til, bruken i testing av legemiddelgjennomtrengelighetsstudier, ex vivo farmakokinetiske og farmakodynamiske studier. Porcin hornhinnen kan også brukes til å teste antibakterielle og antifungale legemidler i tillegg til antivirale legemidler. Hornhinnene kan også brukes til ex vivo sårhelingsanalyser for å studere diabetikersår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt og ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH-tilskudd (R01 EY024710, RO1 AI139768 og RO1 EY029426) til D.S. A.A. ble støttet av et F30EY025981-stipend fra National Eye Institute, NIH. Studien ble utført ved hjelp av svine corneas hentet fra Park Packing company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
