Summary
Kvantificering af knæ extensor maksimal styrke er bydende nødvendigt at forstå funktionelle tilpasninger til aldring, sygdom, skade, og rehabilitering. Vi præsenterer en ny metode til gentagne gange at måle in vivo knæ forlængelse isometrisk peak stivkrampe drejningsmoment.
Abstract
Skeletmuskulatur plasticitet som reaktion på utallige forhold og stimuli medierer samtidig funktionel tilpasning, både negativ og positiv. I klinikken og forskningslaboratoriet måles maksimal muskelstyrke bredt langsgående hos mennesker, med knæudtrykte muskulatur det mest rapporterede funktionelle resultat. Patologi af knæet extensor muskel kompleks er veldokumenteret i aldring, ortopædiske skader, sygdom, og disuse; knæ extensor styrke er tæt forbundet med funktionel kapacitet og skade risiko, understreger betydningen af pålidelig måling af knæ extensor styrke. Repeterbar, in vivo vurdering af knæ extensor styrke i prækliniske gnaver undersøgelser tilbyder værdifulde funktionelle endepunkter for undersøgelser udforske slidgigt eller knæskade. Vi rapporterer en in vivo og ikke-invasiv protokol til gentagne gange at måle isometrisk peak stivkrampe drejningsmoment af knæ extensors i mus over tid. Vi demonstrerer konsistens ved hjælp af denne nye metode til at måle knæudvdestyrke med gentagen vurdering hos flere mus, der producerer lignende resultater.
Introduction
Skeletmuskulatur er et meget tilpasningsligt væv med kompenserende ændringer til masse og struktur som reaktion på et utal af stimuli, såsom motion, ernæring, skade, sygdom, aldring og disuse. Mange undersøgelser, der undersøger skeletmuskulaturtilpasning hos mennesker, anvender metoder til at måle både skeletmuskulaturstørrelse og indvirkning på funktionen, da guldstandardstyrkevurderinger let kan gentages hos mennesker.
Specifikt, knæ extensor og flexor styrke er mest vurderet i klinisk forskning. Ændringer i knæ extensor styrke er blevet bredt rapporteret i humane undersøgelser af aldring, motion, ortopædisk skade, knæ slidgigt, kronisk sygdom, og disuse1,2,3,4,5,6,7. Men metoder til gentagne gange og ikke-invasivt analysere knæ extensor muskel (quadriceps) styrke i mekanistiske gnaver undersøgelser har været relativt begrænset. En metode til bestemmelse af in vivo quadriceps muskelkontraktilitet hos rotter blev tidligere udviklet8; Der kræves dog omfattende konstruktion af ikke-kommercielt tilgængeligt udstyr. I betragtning af bredden af gnavermodeller udviklet til at studere muskuloskeletale resultater efter knæskade / slidgigt9,10,11,12,13 eksisterer der behov for ikke-invasiv vurdering af quadriceps styrke.
Desuden anvender gnaverundersøgelser, der undersøger molekylære mekanismer, der understøtter skeletmuskulaturtilpasning, ofte musemodeller på grund af enkelheden af genetisk modifikation, ligesom mange farmakologiske interventionsundersøgelser på grund af de reducerede økonomiske omkostninger forbundet med lavere vægtbaseret dosering af et lægemiddel hos mus sammenlignet med rotter. Vi rapporterer en ikke-invasiv metode til gentagne gange at måle in vivo knæ extensor funktion i samme mus over tid ved hjælp af kommercielt tilgængelige udstyr med mindre modifikation, lette reproducerbarhed blandt forskellige laboratorier, og giver mere direkte sammenligning med menneskelige styrke resultater.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Opsætning af udstyr
- Bekræft, at maskinerne er tilsluttet i henhold til producentens specifikationer.
- Hvis ikke allerede er på plads, skal du fastgøre 300D-305C-FP-motoren med knæforlængelsesapparat til 809C-dyreplatformen.
- Tænd for vandpumpen til 37 °C for at begynde at opvarme platformen.
- Hvis computeren ikke allerede er tændt, skal du tænde for computeren efterfulgt af High-Power Bi-Phase Stimulator og 2 Channel Dual-Mode Lever System.
- Hæld isoflurane i fordamperen for at maksimalt fylde linjen.
2. Opsætning af software
- Åbn softwaren (detaljer i materialetabellen).
- Hvis du vil bruge funktionen Øjeblikkelig stimulering sammen med Live Data Monitor til at optimere sondeplaceringen (trin 4), skal du vælge Forbered eksperiment efterfulgt af Konfigurer øjeblikkelig stimuld (Figur 1). Indstil pulsfrekvensen (Hz) til 125, pulsbredde (ms) som 0,2, Antal pulser som 1, Togfrekvens (Hz) som 0,5 og køretid (r) som 120.
- Vælg Filer, og åbn Live Data Monitor.
- For at udføre twitch (trin 5) og momentfrekvens (trin 6) eksperimenter skal du vælge en tidligere programmeret undersøgelse, der omfatter passende trækninger og knæforlængelsesmomentfrekvenseksperimenteksperiment (beskrevet nedenfor i trin 5 og trin 6).
- Vælg den relevante forsøgsmus eller Tilføj nyt dyr, og indtast tilsvarende museoplysninger, der skal gemmes med momentdata.
- Vælg Næste eksperiment eller Forrige eksperiment for at skifte fra twitch-protokol til momentfrekvenssekvens.
3. Opsætning af mus
- Placer den enkelte mus i bedøvelseskammeret.
- Slip ilttankventilen, og indstil iltstrømshastigheden til 1 L/min med 2,5 % isoflurane.
- Sørg for, at musen forbliver i kammeret med låget sikkert lukket, indtil det er helt bevidstløst. Bekræft fuldstændigt tab af bevidsthed ved fraværende fodrefleks med tå knivspids.
- Anæstesiiseret mus i en liggende position med hovedet i næsesnæven på den opvarmede platform med iltstrømningshastighed ved 1 L/min med 2,5% isoflurane.
- Barber håret fra højre bagben ved hjælp af elektriske klippere. Fjern hår fra det barberede område med en alkohol tørre og et lille vakuum. Rens fjernet hår væk fra bagbenet og platformen.
- Fastgør den øverste bagben, bageste til knæet (Figur 2).
BEMÆRK: Sørg for, at knæets bevægelsesområde ikke hindres. - Anbring underekstremiteten i knæforlængelsesapparatet med det forreste skinneben, der let rører ved det justerbare plaststykke (Kraften i kanalaflæsningen skal læse mellem 0 og -1,0 mN*m). Afhængigt af størrelsen af underekstremiteten af musen, kirurgisk tape kan vikles omkring den nederste del af den justerbare plast stykke til at tillade benet til at hvile sikkert.
BEMÆRK: Detaljerede billeder og dimensioner af det specialfremstillede plaststykke er vist i supplerende figur 1. - Juster knopper på platformen for at sikre, at knæet er bøjet ved 60°.
- Placer let et stykke tape over musen torso på platformen for at forhindre kompenserende bevægelse med maksimal knæforlængelse.
4. Elektrodeplacering
- Anbring elektroderne subkutant 2-4 mm proksimale i knæet direkte over quadriceps/knæ extensor muskler (Figur 2). Elektroderne skal være ca. 1-2 mm fra hinanden.
- For at bestemme optimal placering af elektroder skal du bruge funktionen Øjeblikkelig stimulering med Live Data Monitor. Indstil strømforstærkning /strøm ved 50 mA for gentagne trækninger for at bekræfte knæforlængelse (knæudtrykslederne vil producere en negativ spjætkurve). Juster sonderne under øjeblikkelig stimulering for at opnå maksimalt knæforlængelsesmoment som målt i Vinduet Live Data Monitor.
BEMÆRK: Figur 3 viser en repræsentativ øjeblikkelig stimuleringseffekt, der bekræfter knæforlængelsen. Supplerende Video 1 og supplerende Video 2 viser real-time og slow-motion knæ extensor trækninger uden motorarmen på plads, giver mulighed for visuel bekræftelse af knæforlængelse. - Under gentagne trækninger med Instant Stimulation, palpate knæ flexor muskler med pegefingeren for at bekræfte ingen aktivering af antagonistiske muskler. For maksimalt at stimulere knæ extensorer, sonde repositionering kan være nødvendigt afhængigt af kroppens sammensætning af musen og små anatomiske forskelle i den nøjagtige placering af motorpunktet af lårbensnerven og knæ extensor muskler.
BEMÆRK: Et muskelmotorpunkt er det sted, hvor motorgrenen af en nerve kommer ind i muskelmaven og er det punkt, der har mindst modstand mod elektrisk ledningsevne og efterfølgende den højeste reaktionsevne over for elektrisk stimulation14,15. I kliniske anvendelser ved hjælp af elektrisk stimulation identificeres dette punkt ved scanning med en penelektrode for at finde placeringen over den muskel, hvor en muskelstæt opstår med den laveste injicerede strøm14,15. Identifikation af muskelmotorpunktet er afgørende for at lette optimal neuromuskulær elektrisk stimulation15. I humane kliniske forsøg, muskelmotor point for quadriceps muskler er blevet identificeret i den distale halvdel af musklen14. For at opnå optimal knæ extensor stimulation i mus, denne teknik blev recapitulated ved hjælp af elektrode placering med Instant Stimulation til tættest omtrentlige muskelmotor punkt steder typisk findes i den distale halvdel af knæ extensorer. Der findes en vis variation i elektrode placering (fra relativt overfladisk til dyb), der resulterer i maksimalt drejningsmoment, og Instant Stimulation funktion letter optimal elektrode placering.
5. Bestemmelse af optimal strøm
- Når optimal sonde placering er bestemt, udføre en række progressive trækninger til at bestemme optimal strømforstærkning / strøm, der skal anvendes til drejningsmoment-frekvens eksperiment, med det formål at bestemme den laveste strøm for at opnå den maksimale trækninger drejningsmoment output. Begynd med det aktuelle sæt til 50 mA, og vælg Kør eksperiment for at producere et enkelt spjæt. Vælg Analyser resultater for at få vist momentoutput. Registrer det trækkraftmoment, der vises under Max Force, med fratrukket baseline.
BEMÆRK: Vælg muligheden for at invertere Force-kanalen for at konvertere målinger fra negativt moment til positivt. - Forøg strømmen til 60-70 mA og gentag twitch eksperiment. Registrer det trækkraftmoment, der vises under Max Force, med fratrukket baseline.
- Fortsæt med en række twitch eksperimenter på denne måde (stigende ca. 10-20 mA med hver progression), indtil twitch drejningsmoment ikke længere stiger (enten plateauer eller begynder at falde). Eksempel på twitch-serien vises i tabel 1.
- Registrer den laveste strøm, hvor det højeste rykmoment blev opnået. Denne strøm vil blive brugt og forblive konstant under det kommende kraftfrekvenseksperiment. Figur 4 viser en repræsentativ spidsbelastning.
6. Momentfrekvenseksperiment til bestemmelse af top isometrisk stivkrampe
- I softwaren (se Materialetabel) skal du vælge det forprogrammerede momentfrekvenseksperiment for knæforlængelse, der sikrer følgende indstilling. Stimulus varighed: 0,35 s, Frekvens sekvens: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, hvileperiode mellem pulser / sammentrækninger: 120 s
BEMÆRK: Prøveudtagningshastigheden er 10.000 Hz (standardindstilling). - Kør Eksperiment, Analyser resultater, og manuelt registrere det drejningsmoment, der vises under Max Force med baseline fratrukket (sørg for kraftkanalen er omvendt, som knæ extensor sammentrækning vil producere negativt drejningsmoment) ved hver frekvens. Bemærk den højeste Max Force-værdi som det top isometriske stivkrampemoment. Eksempel på momentfrekvensdata er vist i tabel 2, og figur 5 viser en repræsentativ stivkrampekurve for den topisometriske stivkrampeudgang, der opnås ved 120 Hz.
7. Afslutning af eksperiment
- Når momentfrekvenseksperimentet er afsluttet, skal du udføre en opfølgningstæt og sammenligne med den indledende spidsbelastning ved samme strøm for at vurdere skader / træthed.
BEMÆRK: I nogle modeller af skade og sygdom forventes øget fedtbarhed af skeletmuskulatur og udgør ikke et problem med den eksperimentelle opsætning eller musen. - Når alle momentmålinger er afsluttet, skal du forsigtigt fjerne elektrodesonder og fjerne knæet.
- Sluk for isoflurane og fjern musen fra næsekeglen.
- Placer musen tilbage i et passende bur placeret oven på en opvarmning pad. Overvåg, når musen kommer sig og genvinder bevidstheden.
BEMÆRK: Musen skal være ved bevidsthed og bevæge sig inden for 2-3 min.
8. Dataanalyse
- Uddrag data efter eksperimentet fra analysesoftware (se Materialetabel).
- Åben analysesoftware.
- Vælg Hent data fra softwaren.
- Vælg Den dato, hvor eksperimentet blev udført, og den relevante musekode.
- Vælg interessefrekvensen (alle twitch-eksperimenter, og hver frekvens af momentfrekvenseksperimentet vil blive angivet).
- Vælg Muskelanalyse.
- Bekræft, at Brug oprindelig rettelse er markeret.
BEMÆRK: Baseline moment beregnes af softwaren som gennemsnittet af de første 100 point udtaget og trækkes fra den absolutte maksimale momentværdi. - Registrer den momentværdi, der er angivet under Maksimum.
BEMÆRK: Data, der præsenteres her, er ufiltrerede; Der kan dog vælges et filter i softwaren, hvis det ønskes.
- Alternativt, som beskrevet ovenfor i trin 6.2, manuelt registrere drejningsmoment output vises under Max Force i realtid ved hvert drejningsmoment-frekvens punkt / sammentrækning gennem Analyze Resultater vinduet.
- Bekræft, at grundlinjen trækkes fra, og tvingkanalen er omvendt.
- Indtast data i et regneark til beregning af kropsvægt normalisering (drejningsmoment / kropsvægt i gram) og graftegning og statistiske analyser af interesse. Statistisk software blev brugt til graftegning drejningsmoment-frekvens kurver og beregning område under kurven.
BEMÆRK: Momentdata måles i mN.m (milliNewton.meter).
- Hvis du vil generere stivkrampekurver, skal du eksportere komplette data fra hver frekvens fra analysesoftwaren.
- Gentag trin 8.1.1-8.1.4 ovenfor.
- Vælg Eksporter data.
- Vælg Rå filtrerede data, og gem på den foretrukne placering. MATLAB kan anvendes til at generere stivkrampekurver fra den eksporterede tekstfil og/eller til yderligere analyse.
BEMÆRK: MATLAB-kode til generering af stivkrampekurve fra tekstfil er tilgængelig efter anmodning.
9. Kalibrering af dobbeltfunktionshåndtagssystem
- Kalibrer systemet før første brug for at sikre nøjagtige og pålidelige data, og gentag kalibreringen med jævne mellemrum ved hjælp af dataindsamlingssoftwaren og de kendte vægte.
- Åbn dataindsamlingssoftware.
- Klik på fanen Installation , og vælg Kanalopsætning.
- Vælg 305C-FP, der er angivet under Mine instrumenter.
- Klik på Kalibrer markeret for at åbne vinduet Kalibreringseditor.
- Hvis du vil kalibrere længden, skal du indtaste en række testspændinger, herunder både negative og positive spændinger (f.eks. -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
- Klik på Angiv for den første linje.
- Klik på Læs.
- Mål den nøjagtige længde af løftestangarmen i millimeter og input i den tilsvarende boks.
- Gentag for den næste spænding.
- Når du har registreret alle spændinger, skal du klikke på Beregn calfaktorer (optaget i mm/volt).
- For at kalibrere kraft i, udnytte et sæt af kendte vægte stigende i en lineær progression.
- Juster motoren, så den hviler på kanten af bænken eller bordet med løftearmen parallelt med bordpladen og hænger over kanten, så vægten kan hænge.
- Hæng den første vægt fra håndtaget arm ved hjælp af en elastik. Under Anvendt kraftskal du indtaste den kendte vægt i gram, der tegner sig for gummibåndets masse.
- Vælg Læs.
- Gentag i mindst 3 kendte vægte.
- Vælg Beregn beregningsfaktor.
- Hvis du vil kontrollere beregningen, skal du afbilde kalibreringsdata og kurve, der passer, ved at vælge Plot Cal.
- Hvis du vil kalibrere kraften ud, skal du indtaste kalibreringsspændinger (op til 10 volt)
- Klik på Indstil direkte ved siden af kalibreringsspændingen.
- Gentag for hver spændingsledning.
- Tryk forsigtigt på håndtagsarmen med en finger, indtil Force Out ophører med at skifte, og motorarmen begynder at bevæge sig.
- Bevar denne position. Vælg Læs.
- Gentag for hver spændingsledning.
- Vælg Beregn beregningsfaktor.
Representative Results
Momentfrekvenskurven bruger lavere frekvenser til at producere flere isolerede isometriske trækninger med relativt lavt drejningsmoment og skrider frem gennem stadig højere frekvenser, hvilket resulterer i fusion af trækninger til en isometrisk stivkrampetrækning, hvor der opnås spidskrampe. Den præsenterede protokol for knæforlængelse peak stivkrampe drejningsmoment kraft-frekvens kurve indleder ved 10 Hz, som fremkalder 3 isolerede trækninger. Delvis fusion af trækninger forekommer ved 40 Hz, og det maksimale stivkrampemoment nås mellem 120-180 Hz (Figur 5).
Figur 6 illustrerer repræsentative knæforlængelsesmomentfrekvenskurver fra kvindelige C57BL/6-mus. Tre separate mus blev testet ved baseline, og eksperimentet blev gentaget i hver mus 2 uger senere til sammenligning for at vurdere reproducerbarhed. Momentfrekvenskurver vises med rå momentværdier (Figur 6A) samt rå momentværdier normaliseret til muse kropsvægt (Figur 6B). Gentagne observationer viser sammenlignelige resultater hos alle 3 mus med en 2-ugers hvileperiode mellem forsøg. Kropsvægt normaliserede drejningsmoment data bør overvejes ud over rå drejningsmoment, som mindre udsving i vægt kan påvirke funktionelle output og er ikke betragtes med rå drejningsmoment alene. Desuden letter kropsvægt normaliserede momentdata sammenligning af mus af varierende størrelser. Moment kan også normaliseres til muskel våd vægt eller myofiber tværsnit område, som vi tidligere har vist16.
Figur 7A viser området under kurven ved hjælp af kropsvægt normaliserede isometriske momentdata fra komplette momentfrekvenseksperimentforsøg (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) for 4 separate C57BL/6 mus, hvilket fremhæver lignende samlede momentoutput og variationskoefficienter mellem 5,6% og 8,8% med gentagne eksperimenter inden for de samme mus. Data er mest simpelthen rapporteret som peak stivkrampe drejningsmoment (Figur 7B), som er den maksimale momentværdi fra de gentagne stivkrampe isometriske sammentrækninger fra 120-200 Hz. Den maksimale stivkrampeudgang er sammenlignelig hos 6-8 måneder gamle C57BL/6 mus (Figur 7B) med variationskoefficienter på mellem 4,8 % og 8,7 % med langsgående vurdering hos de samme mus. Peak stivkrampe er mest sammenlignelig med guld-standard styrke vurdering i humane undersøgelser: maksimal isometrisk toque.
Desuden er knæ extensor peak stivkrampe drejningsmoment protokol er et nyttigt værktøj til at opdage styrke forskelle i flere musemodeller. Figur 8 viser den skarpe kontrast mellem knæ extensor styrke i en ikke-skadet, sund 6-måneder gammel C57BL/6 kvindelige mus (sort linje) og en transgen mus model af suprafysiologi hypertrofi, hvor myostatin / GDF8 er slået ud (blå linje). Vi viser også en peak stivkrampe kurve fra en C57BL/6 mus 7 dage efter kirurgisk transection af den forreste korsbånd (ACL-T) (rød linje), der viser en næsten 50% nedgang i peak drejningsmoment efter skade, som er et godt stykke uden for koefficienter variation observeret med gentagne test af uskadte mus. Sideløbende med menneskelige data17,18, styrke er markant formindsket med ACL-T. Alle mus er kvinder og af samme alder (6-8 måneder).
| Twitch-eksperiment | Strømafbrydelse/Aktuel (mA) | Moment (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
Tabel 1: Eksempel på twitch-serier. * betegner optimal strømforstærkning/ strøm.
| Frekvens (Hz) | Moment(mN•m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
Tabel 2: Eksempel på data om drejningsmomentfrekvenskurve. * betegner peak stivkrampe drejningsmoment.
Figur 1: Opsætning af dataindsamlingssoftware. Illustration af opsætning af dataindsamlingssoftware med Live Data Monitor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Museopsætning og elektrodeplacering. (A-B) Liggende position af musen, der modtager anæstesi via en næsekegle på den opvarmede platform. Overekstremitet er sikkert fastspændt, bageste til knæet for at give mulighed for ubegrænset bevægelse på knæleddet. Motorarmen justeres, så knæet bøjes ca. 60°. Lårnerververens motorpunkt stimuleres af nåleelektroder for at aktivere sammentrækning af knæudsdrivende. Museopsætning vises fra en sidevisning (A) og overheadvisning (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bestemmelse af optimal elektrodeplacering for at opnå isometrisk knæforlængelse. Repræsentation af gentagne negative trækninger stimuleret med 50 mA ved hjælp af Instant Stimulation funktion og ses i Live Data Monitor. Røde pile indikerer de første tre knæforlængelsestrækninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativ spjæt for at bestemme optimal amperage. Den laveste amperage til at fremkalde det højeste ryk isometriske drejningsmoment skal bestemmes for kraftfrekvenseksperimentet ved gentagne twitch-eksperimenter med gradvist øget forstærker. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative stivkrampekurver i hele et momentfrekvenseksperiment for samme mus. (A) Submaximalt isometrisk stivkrampemoment produceret ved 10 Hz. (B) Submaximal isometrisk stivkrampe ved 40 Hz. (C) Top isometrisk stivkrampeudgang ved 120 Hz. (D) Isometrisk stivkrampemoment ved 150 Hz. (E) Isometrisk stivkrampe ved 180 Hz. (F) Isometrisk stivkrampemoment ved 200 Hz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Data for repræsentative drejningsmomentkurve. Momentfrekvenskurve ved 2 forskellige tidspunkter (uge 1 og 3) i 3 separate mus, præsenteret som råt topmoment (A) og råt topmoment normaliseret til kropsvægt (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentativt område under kurven (AUC) og top-stivkrampedata. (A) AUC for 4 separate mus, præsenteret som råmoment normaliseret til kropsvægt. (B) Top-stivkrampe til de samme 4 mus, præsenteret som rå peak stivkrampe drejningsmoment normaliseret til kropsvægt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Peak stivkrampe drejningsmoment af knæ extensors i flere musemodeller. Repræsentative stivkrampe-stivkrampekurver for en åbenlys hypertrofitransgen musemodel (GDF8 KO), en uskadt sund C57BL/6-mus (mus 2) og en C57BL/6-mus 7 dage efter forreste korsbåndstranssektion (ACL-T). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Dimensioner af specialfremstillet plast. Indsat i rødt viser dimension af dybde. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 1: Real-time knæ extensor spjæt uden motor arm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende Video 2: Slowmotion knæ extensor spjæt uden motor arm. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Måling og analyse af muskelfunktion i gnavermodeller er afgørende for at gøre translationelle og meningsfulde slutninger vedrørende histologiske og molekylære skeletmuskulaturtilpasninger observeret med motion, skade, sygdom og terapeutisk behandling. Vi demonstrerer en metode til at vurdere knæ extensor maksimal styrke pålideligt og gentagne gange i mus ved hjælp af kommercielt tilgængeligt udstyr, med den justerbare plast stykke til at holde underekstremmen på den forreste skinneben er den eneste brugerdefinerede fabrikerede del, der kan replikeres.
Fælles funktionelle vurderingsværktøjer er blevet meget brugt til gentagne gange at evaluere fysisk ydeevne inden for den samme mus, såsom løbebånd, der løber til viljetræthed, rotarod performance test, omvendt klæbende test og grebsstyrketest. Men mens informative, disse vurderinger involverer kardiopulmonal og adfærdsmæssige komponent (r), som kan sløre forhør af neuromuskulær funktion forbundet med disse fysiske præstationsforanstaltninger. Desuden er elementer af udholdenhed, koordinering og balance til stede i mange af disse funktionelle vurderinger til forskellige niveauer, hvilket begrænser klar fortolkning i forhold til muskelstyrke. Den kraftproducerende evne til gnavermuskler kan måles in vitro, in situ eller in vivo. Hver tilgang har relative fordele og begrænsninger. Specifikt, med in vitro vurdering, musklen er helt isoleret og fjernet fra dyrets krop, så der ikke er nogen indflydelse fra perfusion eller innervation19. Dette giver et velkontrolleret miljø for at fastslå kontraktile evne, men begrænser størrelsen af musklen, der undersøges gennem afhængighed af passiv diffusion af ilt og næringsstoffer under test. In situ test opretholder innervation og blodforsyning af musklen, men er begrænset til en enestående terminal vurdering, som med in vitro test20. Endelig er in vivo test den mindst invasive med musklen tilbage i sit oprindelige miljø med perkutane elektroder indsat i nærheden af motornerven for elektrisk at stimulere musklen. En styrke ved in vivo-tilgangen er potentialet for langsgående test på tværs af tid21,22,23.
In vivo evaluering af peak muskel kontraktilitet optimalt måler maksimal styrke som den normale anatomi og fysiologi af musen forbliver intakt, og metoden kan gentages på samme mus før og efter en intervention eller i hele levetiden. Specifikt er in vivomåling af knæudseendestyrke hos mus murinstyrkevurderingen med den største translationelle relevans for humane undersøgelser, da maksimal knæforlængelsesmoment almindeligvis måles og betragtes som guldstandardstyrketest hos mennesker med korrelation til forskellige funktionelle og sundhedsmæssige resultater24,25,26,27 . Desuden observeres knæ extensorpatologi med aldring samt et utal af skader og sygdomme1,2,4,5,6, men det har ikke været let at opnå en vurdering af virkningen af disse tilstande på knæudtryk eller styrke i længderetningen hos mus.
Selv om denne metode giver mulighed for at bestemme knæ extensor peak drejningsmoment i en langsgående måde, visse begrænsninger af protokollen bør overvejes. Lavere frekvenser mellem 40 Hz og 120 Hz blev udeladt fra momentfrekvensprotokollen, hvilket kan begrænse muligheden for at detektere venstre eller højre skift i momentfrekvenskurven med skade eller sygdom. Men ved hjælp af denne momentfrekvensprotokol har vi været i stand til at opdage ændringer for at toppe stivkrampemoment i en ACL-skadesmodel og mellem C56BL/6 vilde mus og en transgen musemodel af suprafysiologisk muskelmasse (Figur 8). Vi bemærker, at det kan være gavnligt at sikre elektroderne med hjælpende hænder eller lignende apparater, da muskelsammentrækninger kan bevæge elektroder lidt. Vi noterede os ikke nogen åbenlys forskydning af elektroder med progressive sammentrækninger; muligheden for let bevægelse af elektroderne kan dog ikke udelukkes, hvilket kan påvirke muskelstimulering. Derudover blev intramuskulær elektromyografi (EMG) ikke udført i forbindelse med stimulusprotokollen; det kan dog være muligt at medtage EMG-foranstaltninger, hvis det ønskes og hensigtsmæssigt for forsøgsmodellen af interesse.
Vurdering af knæ extensor styrke i murin modeller af ortopædiske skader og sygdom vil lette præklinisk forskning med meningsfuld translationel relevans for kliniske styrke foranstaltninger. Vores protokol muliggør præcis og gentagen vurdering af maksimal knæudvrætstyrke hos mus med kommercielt tilgængeligt udstyr, der er tilgængeligt for ethvert laboratorium.
Disclosures
Matthew Borkowski er ansat af Aurora Scientific Inc., en virksomhed, der potentielt kan drage fordel af forskningsresultaterne og er også en leder af virksomheden.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Rosario Maroto for teknisk bistand. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01 AR072061 (CSF). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus | |
| 6100 Dynamic Muscle Control LabBook software | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dynamic Muscle Analysis | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| BravMini hair clippers | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Eye Lube | Optixcare | Item Number: 142422 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | Item Number: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | Version 8.3.0 (328) |
References
- Brightwell, C. R., et al. Moderate-intensity aerobic exercise improves skeletal muscle quality in older adults. Translational Sports Medicine. 2 (3), 109-119 (2019).
- Moro, T., et al. Muscle protein anabolic resistance to essential amino acids does not occur in healthy older adults before or after resistance exercise training. Journal of Nutrition. 148 (6), 900-909 (2018).
- Angelozzi, M., et al. Rate of force development as an adjunctive outcome measure for return-to-sport decisions after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Orthopedic Sports Physical Therapy. 42 (9), 772-780 (2012).
- Kalyani, R. R., et al. Quadriceps strength, quadriceps power, and gait speed in older U.S. adults with diabetes mellitus: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2002. Journal of American Geriatric Society. 61 (5), 769-775 (2013).
- Culvenor, A. G., Ruhdorfer, A., Juhl, C., Eckstein, F., Øiestad, B. E. Knee extensor strength and risk of structural, symptomatic, and functional decline in knee osteoarthritis: A systematic review and meta-analysis. Arthritis Care Res (Hoboken). 69 (5), 649-658 (2017).
- Abramowitz, M. K., et al. Skeletal muscle fibrosis is associated with decreased muscle inflammation and weakness in patients with chronic kidney disease. American Journal of Physiology and Renal Physiology. 315 (6), 1658-1669 (2018).
- Arentson-Lantz, E. J., English, K. L., Paddon-Jones, D., Fry, C. S. Fourteen days of bed rest induces a decline in satellite cell content and robust atrophy of skeletal muscle fibers in middle-aged adults. Journal of Applied Physiology. 120 (1985), 965-975 (2016).
- Pratt, S. J. P., Lovering, R. M. A stepwise procedure to test contractility and susceptibility to injury for the rodent quadriceps muscle. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Kwok, J., et al. Histopathological analyses of murine menisci: implications for joint aging and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 24 (4), 709-718 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Wurtzel, C. N., et al. Pharmacological inhibition of myostatin protects against skeletal muscle atrophy and weakness after anterior cruciate ligament tear. Journal of Orthopedic Research. 35 (11), 2499-2505 (2017).
- Botter, A., et al. Atlas of the muscle motor points for the lower limb: implications for electrical stimulation procedures and electrode positioning. European Journal of Applied Physiology. 111 (10), 2461-2471 (2011).
- Gobbo, M., Maffiuletti, N. A., Orizio, C., Minetto, M. A. Muscle moter point identification is essential for optimizing neuromuscular electrical stimulation use. Journal of Neuroengineering and Rehabililitation. 11, 17 (2014).
- Neelakantan, H., et al. Small molecule nicotinamide N-methyltransferase inhibitor activates senescent muscle stem cells and improves regenerative capacity of aged skeletal muscle. Biochemical Pharmacology. 163, 481-492 (2019).
- Kline, P. W., Morgan, K. D., Johnson, D. L., Ireland, M. L., Noehren, B. Impaired quadriceps rate of torque development and knee mechanics after anterior cruciate ligament reconstruction with patellar tendon autograft. American Journal of Sports Medicine. 43 (10), 2553-2558 (2015).
- Hiemstra, L. A., Webber, S., MacDonald, P. B., Kriellaars, D. J. Knee strength deficits after hamstring tendon and patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction. Medicine and Science in Sports and Exercise. 32 (8), 1472-1479 (2000).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. Journal of Visualized Experiments. (56), e3167 (2011).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskeletal Disorder. 12, 246 (2011).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Davis, C. C., Ellis, T. J., Amesur, A. K., Hewett, T. E., Di Stasi, S. Improvements in knee extension strength are associated with improvements in self-reported hip function following arthroscopy for femoroacetabular impingement syndrome. International Journal of Sports Physical Therapy. 11 (7), 1065-1075 (2016).
- Omori, G., et al. Quadriceps muscle strength and its relationship to radiographic knee osteoarthritis in Japanese elderly. Journal of Orthopedic Science. 18 (4), 536-542 (2013).
- Wilk, K. E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee. Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).
- Bobowik, P., Wiszomirska, I. Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly. Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).
