Summary
प्रस्तुत हवा के लिए एक विधि है फेफड़ों के संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ हवा मुद्रास्फीति के लिए है कि वायुमार्ग के भीतर कोशिकाओं के स्थान को बरकरार रखता है, alveoli और संरचना समारोह विश्लेषण के लिए interstitium । लगातार वायुमार्ग दबाव को वायु-मुद्रास्फीति कक्ष के साथ बनाए रखा जाता है जबकि फिक्सेटिव को सही वेंट्रिकल के माध्यम से प्रेरित किया जाता है। फेफड़ों को हिस्टोलॉजिक अध्ययन के लिए संसाधित किया जाता है।
Abstract
फेफड़ों के हिस्टोलॉजी का उपयोग अक्सर फेफड़ों के होमोस्टेसिस और रोग रोगजनकता के दौरान हवाई क्षेत्र की कोशिकाओं द्वारा प्रदान किए गए योगदान की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले इन्स्टिलेशन-आधारित निर्धारण विधियां हवाई क्षेत्र की कोशिकाओं और बलगम को टर्मिनल एयरवेज में विस्थापित कर सकती हैं और ऊतक आकृति विज्ञान को बदल सकती हैं। इसकी तुलना में, संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण तकनीक हवाई क्षेत्रों और म्यूकोसल अस्तर के भीतर कोशिकाओं के स्थान और आकृति विज्ञान को संरक्षित करने में बेहतर हैं। हालांकि, यदि सकारात्मक वायुमार्ग दबाव एक साथ लागू नहीं किया जाता है, तो फेफड़ों के क्षेत्र गिर सकते हैं और केशिकाएं अल्वेलर रिक्त स्थान में उभार सकती हैं, जिससे फेफड़ों की शरीर रचना में विकृति आ सकती है। इसके साथ ही, हम वायु-मुद्रास्फीति के लिए एक सस्ती विधि का वर्णन करते हैं, जो वायुमार्ग और अल्वोलार कोशिकाओं के आकृति विज्ञान और स्थान को संरक्षित करने के लिए संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के दौरान हवा-मुद्रास्फीति के लिए एक सस्ती विधि का वर्णन करता है और डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिक अध्ययनों के लिए मुरीन फेफड़ों में इंटरस्टिटियम। लगातार हवा का दबाव एक सीलबंद, हवा से भरे कक्ष से श्वासनली के माध्यम से फेफड़ों को दिया जाता है जो समायोज्य तरल स्तंभ के माध्यम से दबाव बनाए रखता है जबकि फिक्सेटिव सही वेंट्रिकल के माध्यम से किया जाता है।
Introduction
फेफड़ों की हिस्मोलॉजी स्वास्थ्य और रोग के दौरान फेफड़ों की वास्तुकला का आकलन करने के लिए सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करती है और फेफड़े के शोधकर्ताओं द्वारा सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरणों में से एक है1। इस तकनीक के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक फेफड़ों के ऊतकों का उचित अलगाव और संरक्षण है, क्योंकि इस चरण में परिवर्तनशीलता से ऊतक की गुणवत्ता खराब हो सकती है और गलत परिणाम1,2,3हो सकते हैं। जीवित जानवरों में, फेफड़ों की मात्रा फेफड़ों और बाहरी बलों के आवक लोचदार हटना के बीच संतुलन द्वारा निर्धारित किया जाता है छाती की दीवार और सतह तनाव से डायाफ्राम से प्रेषित । तदनुसार, जब छाती में प्रवेश किया जाता है, तो बाहरी ताकतें खो जाती हैं और फेफड़े गिर जाते हैं। ढह फेफड़ों से तैयार हिस्टोलॉजिक सेक्शन में भीड़-भाड़ वाली उपस्थिति होती है और शारीरिक डिब्बों (यानी, हवाई क्षेत्र, वास्कुलेचर और इंटरस्टिटियम) के बीच सीमाएं अलग करना मुश्किल हो सकता है। इस चुनौती को दरकिनार करने के लिए शोधकर्ता अक्सर रासायनिक निर्धारण के दौरान फेफड़ों को फुलाते हैं ताकि हवाई क्षेत्र का आकार और वास्तुकला बनाए रखा जा सके ।
फेफड़ों को हवा या तरल के साथ फुलाया जा सकता है। एक ही मात्रा के लिए फेफड़ों को फुलाने के लिए आवश्यक दबाव वायु-तरल इंटरफेस पर अंतरमॉलिकुलर बलों के कारण हवा और तरल मुद्रास्फीति के बीच अलग होता है। सतह के तनाव को दूर करने और ढह गई अल्वियोली4को खोलने के लिए तरल मुद्रास्फीति (उदाहरण के लिए, 12 सीएमएच 2 ओ) की तुलना में वायु-मुद्रास्फीति के दौरान उच्च दबाव (उदाहरण केलिए,25सीएमएच 2 ओ) की आवश्यकता होती है। एक बार अल्वियोली की भर्ती हो जाने के बाद, एक कम दबाव अल्वियोली को दबाव-मात्रा वक्र पठारों के समान मात्रा में खुला रख सकता है, और पास्कलके कानून4,5,6,7, 8के अनुसार पूरे फेफड़ों में दबाव बराबर होजाताहै।
फेफड़ों की मुद्रास्फीति और निर्धारण के दो मुख्य तरीके हिस्टिन फेफड़ों को हिस्त विज्ञान के लिए संरक्षित करने के लिए मौजूद हैं। सबसे अधिक, हवाई क्षेत्र तरल के साथ डाले जाते हैं - अक्सर एक स्थिर होते हैं। इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह अपेक्षाकृत आसान है और थोड़ा प्रशिक्षण की आवश्यकता है । जबकि सुधारात्मक के इंट्राचेल इन्स्टिलेशन को उन अध्ययनों में प्राथमिकता दी जा सकती है जो वैक्यूलेचर पर ध्यान केंद्रित करते हैं, श्वासनली के माध्यम से डाले जाने वाले तरल समीपस्थ वायुमार्ग कोशिकाओं और म्यूसिन को अधिक डिस्टल हवाई क्षेत्र क्षेत्रों में धकेल देते हैं जबकि वायु मुद्रास्फीति1, 3,4,9,10,11नहीं होती है । इसके अलावा, तरल मुद्रास्फीति के दौरान एपिथेलियम से ल्यूकोसाइट्स की अनजाने टुकड़ी उनकी आकृति विज्ञान को बदल देती है, जो उन्हें एक सरल, गोलाकार उपस्थिति4,10,11,12देती है। अंत में, तरल के साथ फेफड़ोंकी मुद्रास्फीति अनजाने में इंटरस्टिटियम4,10,11संपीड़न कर सकती है। साथ में, ये कारक संरक्षित फेफड़ों के भीतर सामान्य शरीर रचना विज्ञान और सेलुलर वितरण को विकृत कर सकते हैं, इस प्रकार तकनीक को सीमित कर सकते हैं।
ऊतक संरक्षण की एक वैकल्पिक विधि संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण है। इस विधि में, सुधारक वेना कावा या सही वेंट्रिकल के माध्यम से फेफड़े के वास्कुलेचर में व्याप्त है। यह विधि हवाई क्षेत्र ल्यूमेन में कोशिकाओं के स्थान और आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है। हालांकि, जब तक फेफड़ों को परफ्यूजन-निर्धारण के दौरान फुलाया जाता है, तब तक फेफड़ों के ऊतकों के पतन की संभावना होती है।
संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ वायु-मुद्रास्फीति उपरोक्त निर्धारण तकनीकों में से प्रत्येक से ताकत का दोहन करती है। इसके साथ ही हम इस तकनीक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। आवश्यक सामग्री और उपकरण अपेक्षाकृत सस्ती हैं और आसानी से प्राप्त और इकट्ठे किए जा सकते हैं। पूरा सेटअप, चित्रा 1Aमें दिखाया गया है, एक समायोज्य, तरल पदार्थ से भरे कॉलम के माध्यम से फेफड़ों के लिए लगातार वायुमार्ग दबाव प्रदान करता है, जबकि एक परिस्टाल्टिक पंप सही वेंट्रिकल के माध्यम से फिक्सेटिव बचाता है । संरक्षित आकृति विज्ञान वाले फेफड़ों को तब संरचना-कार्य विश्लेषणों के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों को राष्ट्रीय यहूदी स्वास्थ्य की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
नोट: प्रोटोकॉल तीन घटकों में आयोजित किया जाता है। पहला घटक परफ्यूजन/निर्धारण उपकरण के साथ वायु-मुद्रास्फीति के निर्माण का विवरण देता है । एक दूसरा खंड एक प्रयोग के लिए उपकरण स्थापित करने का तरीका बताता है। अंतिम खंड जानवर को तैयार करने और प्रयोग करने के तरीके का वर्णन करता है।
1. जल स्तंभ तंत्र का निर्माण(चित्रा 1B)
- एक 60 मिलील स्लिप टिप सिरिंज से प्लंजर निकालें।
- 30 एमएल के निशान पर सिरिंज के चारों ओर टेप संलग्न करें। 25 सीएमएच2ओ के शुरुआती मुद्रास्फीति दबाव के लिए सिरिंज की ऊंचाई को इस निशान पर सेट करें। यह भी है जहां कॉलम में जल स्तर पूरी प्रक्रिया के दौरान होना चाहिए। टेप को या तो "25 सेमी" (जैसा कि चित्र 1 एमें दर्शाया गया है) या "मुद्रास्फीति" के रूप में लेबल करें।
नोट: 25 cmH 2 O के एक मुद्रास्फीति दबाव ढह हवाई क्षेत्र की भर्ती सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग कियाजाताहै । एक बार अल्वियोली की भर्ती हो जाने के बाद, दबाव को 20 सीएमएच 2 ओ तक कम कर दियाजाताहै ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि हवाई क्षेत्रों को डिटेन नहीं किया गया है । - टेप से प्लंजर अंत की ओर 5 सेमी मापें और सिरिंज के लिए टेप का एक और टुकड़ा संलग्न करें। निर्धारण के दौरान मुद्रास्फीति के दबाव को 20 सेमीएच 2 ओ तक कम करने के लिए सिरिंज को इस निशान सेनीचेले जाएं। टेप को या तो "20 सेमी" (जैसा कि चित्र 1 एमें दर्शाया गया है) या "निर्धारण" के रूप में लेबल करें।
- सिरिंज के स्लिप टिप एंड पर 180 पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) ट्यूबिंग संलग्न करें। ट्यूबिंग की लंबाई सिरिंज और वायु मुद्रास्फीति कक्ष (लगभग 25-30 सेमी) के बीच की दूरी पर निर्भर है।
- टयूबिंग के दूसरे छोर में एक पुरुष लूयर (2) थ्रेड स्टाइल टी (1.219 इंच लंबाई, 0.904 इंच ऊंचाई, 0.0904 इंच आंतरिक व्यास) रखें। यह पुरुष Luer हवा मुद्रास्फीति कक्ष (चरण 2.4) के स्टॉपकॉक से कनेक्ट होगा।
2. वायु-मुद्रास्फीति कक्ष का निर्माण(चित्रा 1C)
- एक पेंच पर टोपी के साथ एक 500 एमएल प्लास्टिक कंटेनर में दो छेद (व्यास में लगभग 4 मिमी) ड्रिल करें। छेद मादा लुयर्स (1.224 इंच लंबाई, 0.312 इंच ऊंचाई, 0.098 इंच आंतरिक व्यास) के समान आकार होना चाहिए।
नोट: खाली मीडिया या बफर कंटेनर वायु मुद्रास्फीति कक्ष के लिए उपयोग किया जा सकता है । - सिलिकॉन गैसकेट निर्माता के साथ मादा लुयर्स के कोट धागे और कंटेनर के पूर्व-ड्रिल छेद में छोटे पक्ष को रखें।
- मादा लुयर्स के चारों ओर सिलिकॉन गैसकेट निर्माता जोड़ें जहां वे एक एयर-टाइट सील सुनिश्चित करने के लिए कंटेनर में प्रवेश करते हैं।
- हवा मुद्रास्फीति कक्ष पर कम महिला Luer पर एक तरह से स्टॉपकॉक पर पेंच ।
- लगभग 25 सेमी की लंबाई के लिए टयूबिंग काटें और टयूबिंग के मुक्त सिरों के लिए पुरुष Luers देते हैं। हवा मुद्रास्फीति कक्ष पर मुक्त महिला Luer करने के लिए टयूबिंग के एक छोर पर पुरुष Luer कनेक्ट करें । अन्य पुरुष लूयर पशु प्रसंस्करण कंटेनर से जुड़ेंगे।
3. पशु प्रसंस्करण कंटेनर का निर्माण(चित्रा 1D)
- एक बड़े प्लास्टिक कंटेनर के किनारे में एक छेद (लगभग 4 मिमी व्यास) ड्रिल करें। छेद मादा लूयर का व्यास होना चाहिए। अतिरिक्त निर्धारण समाधान को पकड़ने के लिए प्लास्टिक कंटेनर की आवश्यकता होती है।
नोट: एक 30 सेमी x 22 सेमी, 3.8 एल प्लास्टिक भंडारण कंटेनर का उपयोग किया गया था। - सिलिकॉन गैसकेट निर्माता के साथ एक मादा लूयर के कोट धागे और कंटेनर के प्रीड्रिल छेद में छोटे पक्ष को रखें।
- मादा लूर के चारों ओर सिलिकॉन गैसकेट निर्माता जोड़ें जहां यह एक एयर-टाइट सील सुनिश्चित करने के लिए कंटेनर में प्रवेश करता है और बाहर निकलता है।
- महिला Luer पर एक तरह से स्टॉपकॉक पेंच । वायु-मुद्रास्फीति कक्ष से ट्यूबिंग इस स्टॉपकॉक से जुड़ी होगी।
4. समाधान की तैयारी
- हेपरिन समाधान
- कैल्शियम मुक्त पीबीएस और हेपरिन (20 यू/एमएल) के साथ एक कंटेनर भरें । प्रत्येक माउस के लिए कुल 10 एमएल हेपरिन समाधान तैयार करें। हेपरिन एक एंटी-कोगुलेंट है जो परफ्यूजन-फिक्सेशन के दौरान जहाजों में रक्त के थक्के बनाने से रोकता है। हेपरिन समाधान का उपयोग परफ्यूजन-निर्धारण से पहले फेफड़ों से रक्त को फ्लश करने के लिए किया जाएगा।
- फिक्सेटिव समाधान
सावधानी: फिक्सेटिव एक स्वास्थ्य खतरा पेश कर सकते हैं और एक रासायनिक धुएं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। फिक्सेटिव्स की साँस लेने से रोकने के लिए सभी उपकरण रासायनिक धुएं हुड में स्थापित किए जाते हैं।- कैल्शियम मुक्त पीबीएस और पैराफॉर्मलडिहाइड (4% अंतिम एकाग्रता) के साथ एक कंटेनर भरें। प्रत्येक माउस के लिए कुल 50 एमएल फिक्सेटिव समाधान तैयार करें।
नोट: इस्तेमाल किया फिक्सेटिक के प्रकार भिन्न हो सकते हैं और डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिक अध्ययनों पर निर्भर करेगा।
- कैल्शियम मुक्त पीबीएस और पैराफॉर्मलडिहाइड (4% अंतिम एकाग्रता) के साथ एक कंटेनर भरें। प्रत्येक माउस के लिए कुल 50 एमएल फिक्सेटिव समाधान तैयार करें।
5. परफ्यूजन उपकरण की तैयारी
नोट: लगातार प्रवाह दर सुनिश्चित करने के लिए वैक्यूलेचर में तरल पदार्थों के वितरण के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप का सुझाव दिया जाता है। निम्नलिखित निर्देश पेरिस्टाल्टिक पंप स्थापित करने के लिए हैं और प्रत्येक मॉडल के लिए अलग हो सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, यदि एक पेरिस्टाल्टिक पंप अनुपलब्ध है, तो 35 सेमी एच2ओ की ऊंचाई से तरल पदार्थ को छिद्रित करने के लिए एक दूसरे पानी स्तंभ उपकरण का निर्माण किया जा सकता है।
- सबसे पहले रोलर असेंबली के चारों ओर ट्यूबिंग रखें।
- नॉच्ड पोस्ट में टयूबिंग को सुरक्षित करें।
- पहले ट्यूबिंग के चारों ओर बाएं लीवर को रखकर और ऊपर और फिर सही लीवर के साथ जगह में सुरक्षित करके लीवर को जगह में कुंडी करें।
- टयूरिन के समीपस्थ अंत को हेपरिन समाधान में रखें और डिस्टल एंड को पशु प्रसंस्करण कंटेनर में रखें।
- ट्यूबिंग से हवा को निष्कासित करने के लिए पंप चलाकर ट्यूबिंग में प्रीलोड हेपरिन समाधान।
- टयूबिंग के बाईं ओर के अंत पर एक 25G x 5/8 "सुई सुरक्षित ।
6. वायु-मुद्रास्फीति तंत्र की तैयारी
- पानी के कॉलम के लिए सिरिंज को रिंग होल्डर में रखें।
- पानी के कॉलम पर "25 सेमी" टेप मार्क (चरण 1.2) तक पशु मंच से 25 सेमी की ऊर्ध्वाधर ऊंचाई को मापें।
- पानी के कॉलम की ट्यूब के अंत को एयर चैंबर पर स्टॉपकॉक से अटैच करें।
- जानवर प्रसंस्करण कंटेनर पर स्टॉपकॉक के लिए एयर चैंबर की मादा लूयर से एक ट्यूब संलग्न करें।
नोट: यदि वायु-मुद्रास्फीति कक्ष का निर्माण चित्रा 1Cमें दर्शाया गया है, तो रिवर्स क्रम में ट्यूबिंग संलग्न करने से पानी को टयूबिंग में रिसाव हो सकता है जो श्वासनली कैनुला से जोड़ता है। - सुनिश्चित करें कि एयर चैंबर की टोपी कसकर बंद हो।
- सुनिश्चित करें कि पशु प्रसंस्करण कंटेनर के बाहर स्टॉपकॉक बंद हो गया है और पानी के कॉलम से हवा-मुद्रास्फीति कक्ष तक जाने वाले ट्यूबिंग पर स्टॉपकॉक खुला है।
- सिरिंज को "25 सेमी" निशान पर पानी से भरें। पानी हवा कक्ष में ट्यूबिंग के माध्यम से सिरिंज छोड़ देंगे । एक बार दबाव बराबर होने के बाद पानी बहना बंद हो जाएगा।
- यह संभव है कि पानी धीरे-धीरे रासायनिक हुड के भीतर परिवेश हवा के दबाव के रूप में हवा मुद्रास्फीति कक्ष में रिसाव होगा उतार चढ़ाव। सिरिंज के भीतर जल स्तर पर नजर रखें और जरूरत पड़ने पर और अधिक जोड़ें। प्रक्रिया के दौरान "25 सेमी" निशान पर जल स्तर बनाए रखें।
नोट: आमतौर पर पानी का स्तर 25 cmH2O पर हवाई मुद्रास्फीति के पहले भाग के लिए लगातार रहेगा; हालांकि अधिक पानी की संभावना को निर्धारण के दौरान सिरिंज में जोड़ा जाना चाहिए । यदि पानी बहना बंद नहीं करता है, तो यह संभावना है कि वायु-मुद्रास्फीति कक्ष के भीतर हवा का रिसाव मौजूद है। अधिक सिलिकॉन गैसकेट निर्माता को हवा लीक को रोकने के लिए Luers के आसपास लागू करने की आवश्यकता हो सकती है ।
- यह संभव है कि पानी धीरे-धीरे रासायनिक हुड के भीतर परिवेश हवा के दबाव के रूप में हवा मुद्रास्फीति कक्ष में रिसाव होगा उतार चढ़ाव। सिरिंज के भीतर जल स्तर पर नजर रखें और जरूरत पड़ने पर और अधिक जोड़ें। प्रक्रिया के दौरान "25 सेमी" निशान पर जल स्तर बनाए रखें।
7. जानवरों की तैयारी(चित्रा 2)
नोट: इस प्रक्रिया को पण एट अल13से संशोधित किया गया है । हम अलग उम्र के वयस्क पुरुष और महिला चूहों पर इस प्रक्रिया को पूरा कर लिया है और कोई उंर या सेक्स पूर्वाग्रह ध्यान दें ।
- सोडियम पेंटोबार्बिटल (150 मिलीग्राम/किलो, इंट्रापेरिटोनली)) के साथ जानवर को इच्छामृत्यु दें। सुनिश्चित करें कि विच्छेदन शुरू करने से पहले जानवर मर चुका है।
नोट: जबकि यह प्रक्रिया इच्छामृत्यु वाले जानवरों पर की जाती है, इस प्रक्रिया को जीवित जानवरों पर किया जा सकता है ताकि पूरे जानवर में परफ्यूसेट्स पंप करने के लिए दिल का उपयोग किया जा सके। - पेट की दीवार के माध्यम से दो पार्श्व चीरे बनाएं। रिब पिंजरे के नीचे पहला चीरा और कूल्हों के ऊपर दूसरा चीरा बनाएं। बेहतर चीरा की ओर अवर चीरा से मिडलाइन के साथ कटें।
- कुंद कैंची का उपयोग करना, ध्यान से डायाफ्राम के पार्श्व पक्ष में एक चीरा बनाते हैं। डायाफ्राम पंचर होते ही फेफड़े गिर जाने चाहिए।
नोट: फेफड़ों को पंचर करने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। बाद के चरणों के दौरान पंचर फेफड़े बढ़ने की संभावना कम होती है। - वक्ष गुहा को खोलने के लिए डायाफ्राम के साथ ट्रांसवर्सली काटें।
- xiphoid प्रक्रिया से जुगुलर पायदान और बाद में रिब पिंजरे के ऊपर पूरी तरह से दिल और फेफड़ों का पर्दाफाश करने के लिए उरोस्थि के साथ बेहतर ढंग से कटौती । रिबकेज के किनारों को पिन करें।
- श्वासनली के ऊपर गर्दन में मिडलाइन चीरा बनाएं। श्वासनली के आसपास की त्वचा, मांसपेशी, थायराइड ग्रंथि और संयोजी ऊतक को हटा दें।
- घुमावदार संदंश का उपयोग करना, पीछे श्वासनली के नीचे धागे या सीवन के दो टुकड़ों को स्लाइड करें। सीवन के एक टुकड़े का उपयोग करने के लिए जगह में मुद्रास्फीति Luer-स्टब एडाप्टर पकड़, और दूसरे अंततः का उपयोग करने के लिए हवा मुद्रास्फीति और संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के समापन पर श्वासनली टाई ।
- एक 18G x 1 "सुई या Vannas वसंत कैंची का उपयोग कर श्वासनली में एक छोटा सा छेद प्रहार।
- श्वासनली में इस छेद में एक 20G Luer-स्टब एडाप्टर रखें।
- श्वासनली के चारों ओर एक धागा बांधें तुरंत डिस्टल करें जहां लुएर-स्टब एडाप्टर इसे जगह में रखने के लिए प्रवेश करता है।
- जानवर को पशु प्रसंस्करण कंटेनर में स्थानांतरित करें।
- पशु प्रसंस्करण कंटेनर के अंदर पर मादा लूयर के लिए लुएर-स्टब एडाप्टर संलग्न करें।
8. वायु मुद्रास्फीति, परफ्यूजन और फेफड़ों का निर्धारण(चित्र 2)
- 25G x 5/8 "सुई दिल के सही वेंट्रिकल में परफ्यूजन उपकरण टयूबिंग से जुड़ी रखें।
- दिल से रक्त को निकालने और फेफड़ों के माध्यम से परफ्यूसेट के प्रवाह को बढ़ावा देने के लिए पेट के महाधमनी को काटें।
- फेफड़ों को फुलाने के लिए पशु प्रसंस्करण कंटेनर के बाहर स्टॉपकॉक खोलें।
नोट: फेफड़ों को पूरी तरह से फुलाने में समय लग सकता है। सिरिंज में जल स्तर देखें, जब तक फेफड़ों में रिसाव न हो तब तक इसमें तेजी से कमी नहीं आनी चाहिए। - 5 मिनट के लिए 25 cmH2O पर फेफड़ों को फुलाएं। 25 cmH2O पर मुद्रास्फीति फेफड़ों पूर्व शर्तों और atelectatic फेफड़ों के क्षेत्रों की भर्ती में सहायता करता है ।
नोट: 25 सेमी ऊंचाई बनाए रखने के लिए सिरिंज में थोड़ी मात्रा में पानी जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है। सूजन और/या प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित फेफड़ों की चोट फेफड़ों की मुद्रास्फीति को प्रभावित कर सकती है । इस मामले में, एटइलेक्टिक क्षेत्रों की भर्ती में सहायता करने के लिए अधिकतम 35 सीएमएच2ओ तक मुद्रास्फीति के दबाव को बढ़ाना आवश्यक हो सकता है। - फेफड़ों की मुद्रास्फीति के अंतिम क्षणों के दौरान, पेरिस्टाल्टिक पंप को 10 एमएल/मिनट के प्रवाह दर पर चालू करें । हेपरिन समाधान जानवर में ट्यूबिंग के माध्यम से बोतल से प्रवाहित होना चाहिए।
- हेपरिन जलसेक का लक्ष्य जहाजों में थ्रोम्बी के गठन को रोकना है। तदनुसार, जब तक फेफड़े सफेद नहीं हो जाते और रक्त रहित नहीं हो जाते तब तक हेपरिन का संचार करें। यदि फेफड़े सफेद नहीं होते हैं, तो सही वेंट्रिकुलर सुई का समायोजन आवश्यक हो सकता है।
- 5 मिनट के लिए फुलाने के बाद, पेरिस्टाल्टिक पंप को बंद कर दें और हेपरिन समाधान से फिक्सेटिव में परफ्यूजन टयूबिंग स्विच करें।
- पानी के कॉलम सिरिंज को "20 सेमी" मार्क (चरण 1.3) में कम करें। हवा के बुलबुले के लिए पानी के कॉलम के भीतर स्थानांतरित करना सामान्य है क्योंकि दबाव 25 से 20 सीएमएच 2 ओ तकबदलताहै।
- सिरिंज में जलस्तर की जांच करें। यह "25 सेमी" निशान पर होना चाहिए। इस समय और अधिक जोड़ना आवश्यक हो सकता है।
- फेफड़ों को 25 से 20 सेमीएच 2 ओ तक डिफ्लेट करने की अनुमति देने के लिए1मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- 6.5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर परफ्यूजन पंप को पुनः आरंभ करें।
- 10 - 15 मिनट के लिए संवहनी पर्फ्यूजन-फिक्स करें।
9. फेफड़ों की निकासी(चित्र 3)
- लुएर-स्टब एडाप्टर के लिए श्वासनली डिस्टल के चारों ओर धागे का दूसरा टुकड़ा कसकर बांधें। श्वासनली से लूयर-स्टब एडाप्टर निकालें।
- दिल से सुई निकालें।
- कुंद कैंची के साथ मध्यस्थता करने के लिए संयोजी ऊतक पीछे काटने के द्वारा वक्ष गुहा से फेफड़ों और दिल मुक्त। फेफड़ों को पंचर करने से बचने का ध्यान रखें।
- ध्यान से फेफड़ों से दिल निकालें।
- फेफड़ों को रात भर फिक्सेटिव में रखें।
नोट: फिक्सेटिव की अवधि डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिक अध्ययनों पर निर्भर करती है।- फेफड़ों को 50 एमएल शंकुदाता में रखें जिसमें 20-25 एमएल फिक्सेटिव हो। शंकुदाता के उद्घाटन के माध्यम से श्वासनली को सुरक्षित करने वाला धागा रखें और टोपी के धागे द्वारा सुरक्षित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए शंकु नली को उलटें कि उछाल, हवा में फुलाए फेफड़े फिक्सेटिव में पूरी तरह से डूबे रहते हैं अन्यथा वे तरल के शीर्ष पर तैरेंगे।
- हिस्टोलॉजिक अध्ययन के लिए फेफड़ों को संसाधित करें।
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Representative Results
एक अक्षुण्ण छाती में, फेफड़ों को बाहरी बलों द्वारा खुला रखा जाता है जो सीने की दीवार द्वारा पीएल्यूरल स्पेस6,14के माध्यम से लागू होते हैं। विच्छेदन के दौरान डायाफ्राम में प्रवेश होने पर, प्ल्युरल स्पेस की अखंडता समाप्त हो जाती है और फेफड़ों को गिर जाना चाहिए(चित्र 2 ए,2B)। फेफड़ों का फिर से विस्तार करने के लिए, वायु मुद्रास्फीति की जाती है। पहले कदम के रूप में, ढह हवाई क्षेत्रों की भर्ती सुनिश्चित करने के लिए 25 सेमी पानी का दबाव लागू किया जाता है। तदनुसार, जब पशु होल्डिंग कंटेनर के बाहर स्टॉपकॉक खोला जाता है, तो हवा श्वासनली के माध्यम से फेफड़ों में प्रवेश करेगी और मुद्रास्फीति को आसानी से मनाया जाना चाहिए(चित्रा 2C)। एक बार फेफड़ों का पूरी तरह से विस्तार हो जाने के बाद मुद्रास्फीति का दबाव घटकर 20 सेमी पानी का दबाव(चित्रा 2डी)हो जाता है । पानी के दबाव के 20 सेमी चुना जाता है क्योंकि यह फेफड़ों की पूरी मुद्रास्फीति को बनाए रखता है, लेकिन हवाई क्षेत्र से अधिक नहीं है ।
फेफड़ों को श्वासनली लिगेशन(चित्रा 3 ए)और छाती(चित्रा 3B)से हटाने के बाद फुलाया जाना चाहिए। फेफड़ों का अपस्फीति(चित्रा 3 सी) हो सकता है यदिफेफड़े जानवरों की तैयारी या निष्कर्षण के दौरान पंचर होते हैं। प्ल्युरल सतह में फिक्सेटिव जोड़ने से प्रक्रिया के दौरान मामूली लीक को सील करने में मदद मिल सकती है; हालांकि, फिक्सेटिव को सावधानी से लागू किया जाना चाहिए क्योंकि अतिरिक्त छाती गुहा के फेफड़ों का पालन कर सकता है। किसी भी लीक है कि निर्धारण के दौरान सील नहीं कर रहे है हवा मुद्रास्फीति उपकरणों से हटाने पर फेफड़ों ढह में परिणाम होगा । यदि श्वासनली पूरी तरह से नहीं बंधा है तो फेफड़ों का अपस्फीति भी हो सकती है। जब सुधारात्मक में डूबे, ठीक से फुलाया फेफड़ों हवा निकाल फेफड़ों की तुलना में अधिक उछाल होगा ।
इसके बाद स्थापित प्रोटोकॉल 1,15के अनुसार बढ़े हुए फेफड़ों को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए संसाधित किया जासकताहै । चित्रा 4 केलिए, फेफड़ों को जमे हुए खंड के लिए संसाधित किया गया था और वाणिज्यिक मैनुअल धुंधला प्रणाली के साथ दाग दिया गया था। पारंपरिक तरल-आधारित मुद्रास्फीति(चित्रा 4 ए)का उपयोग करके तय किए गए ऊतकों के वायुमार्ग ल्यूमेंस में बहुत कम प्रतिरक्षा कोशिकाएं मौजूद होती हैं। इसके विपरीत, भड़काऊ कोशिकाओं को वायु-मुद्रास्फीति(चित्रा 4B)के साथ संवहनी परफ्यूजन के माध्यम से तय ऊतक में पूरे हवाई क्षेत्र में संरक्षित किया जाता है।
चित्रा 1:उपकरणों की विधानसभा। A. सभी उपकरणों की पूर्ण विधानसभा। B. पानी के कॉलम में 180 पीवीसी ट्यूबिंग और दो तरह के पुरुष लूयर के माध्यम से वायु-मुद्रास्फीति कक्ष से जुड़े 60 एमएल सिरिंज होते हैं। सी. एयर-इन्फ्लेशन चैंबर के निर्माण के लिए 500 एमएल सील किए गए प्लास्टिक कंटेनर का इस्तेमाल किया गया। पानी के कॉलम का पुरुष लूयर कक्ष की दीवारों के भीतर एक महिला लूयर से जुड़े स्टॉपकॉक से जोड़ता है। एक अतिरिक्त मादा लूर वायु-मुद्रास्फीति कक्ष से पशु प्रसंस्करण कंटेनर से टयूबिंग को जोड़ती है। दोनों महिला Luers सिलिकॉन गैसकेट निर्माता में लेपित करने के लिए एक हवा तंग सील सुनिश्चित कर रहे हैं । दो पुरुष लुयर्स ट्यूबिंग के दोनों सिरों से जुड़े होते हैं जो वायु-मुद्रास्फीति कक्ष को पशु-प्रसंस्करण कंटेनर से जोड़ता है। डी. जानवरों को श्वासनली में एक छेद के माध्यम से रखा एक 20G Luer स्टब एडाप्टर के माध्यम से हवा मुद्रास्फीति कक्ष से जुड़े रहे हैं । लुएर स्टब एडाप्टर पशु प्रसंस्करण कंटेनर की दीवारों के भीतर एक मादा लुयर से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:पशु तैयारी, वायु-मुद्रास्फीति कक्ष से कनेक्शन, और फेफड़ों की मुद्रास्फीति। A. इच्छामृत्यु के बाद जानवर के पेरिटोनियल और छाती-गुलाल सामने आते हैं। रिब पिंजरे को हटा दिया जाता है या मुद्रास्फीति पर फेफड़ों के विस्तार की अनुमति देने के लिए नीचे टिकी होती है। एक Luer स्टब एडाप्टर एक छोटे से छेद श्वासनली में कटौती में डाला जाता है और धागे या सीवन के साथ सुरक्षित । लुएर स्टब एडाप्टर पशु प्रसंस्करण कक्ष की दीवार के भीतर एक मादा लुयर से जुड़ा हुआ है। मादा लूयर का दूसरा छोर वायु-मुद्रास्फीति कक्ष (नहीं दिखाया गया) से वायु प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक स्टॉपकॉक से जुड़ा हुआ है। B. हवाई मुद्रास्फीति से पहले ढह फेफड़े । सी. फेफड़ों को 25 सेमी पानी के दबाव में बढ़ाया जाता है ताकि एटइलेक्टेसिक क्षेत्रों को भर्ती किया जा सके। डी. जब दबाव को इच्छित निर्धारण दबाव (20 सेमी पानी) में बदल दिया जाता है, तो फेफड़े थोड़ा डिफ्लेट होते हैं। इसके अलावा चित्रित फेफड़ों के संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के लिए सही वेंट्रिकल में एक 25G x 5/8 सुई की नियुक्ति है । सभी छवियां 15.9 मेगापिक्सल रेजोल्यूशन और 4:3 आस्पेक्ट रेशियो पर फोटोग्राफ्स हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:संवहनी पर्फ्यूजन निर्धारण के साथ वायु-मुद्रास्फीति के पूरा होने के बाद फेफड़ों का निष्कर्षण। A. श्वासनली को ल्यूर स्टब एडाप्टर से डिस्टल बांधा जाता है और फेफड़ों को कनेक्टिव टिश्यू को काटने के बाद मीडियास्टिनम से निकाला जाता है। B. सफल प्रक्रियात्मक पूर्णता के बाद हवा में फुलाया फेफड़े। सी. खराब फुलाया फेफड़ों का उदाहरण है कि एक हवा रिसाव है कि हवा मुद्रास्फीति कक्ष के भीतर हुई से हुई । ध्यान दें ये फेफड़े सफलतापूर्वक फुलाए गए फेफड़ों की तुलना में छोटे होते हैं। सभी छवियां 15.9 मेगापिक्सल रेजोल्यूशन और 4:3 आस्पेक्ट रेशियो पर फोटोग्राफ्स हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:इंट्राचेल-आधारित निर्धारण बनाम वायु-मुद्रास्फीति द्वारा प्राप्त फेफड़ों के ऊतकों की तुलना संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ। A. इंट्राचेल आधारित निर्धारण द्वारा संरक्षित फेफड़े। B. संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ वायु-मुद्रास्फीति द्वारा संरक्षित फेफड़े। बी (इनसेट) । तीर संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण द्वारा तय फेफड़ों के वायुमार्ग में ल्यूकोसाइट्स दिखाते हैं; सितारे अल्वियोली में ल्यूकोसाइट्स को हाइलाइट करते हैं। इसकी तुलना में, ल्यूकोसाइट्स इंट्राएचियल मार्ग(एक इनसेट)के माध्यम से तय फेफड़ों के वायुमार्ग में विशेष रूप से अनुपस्थित हैं और इंट्रा-अल्वेलर ल्यूकोसाइट्स विस्थापित होते हैं, जो एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ तंग संपर्क में दिखाई देते हैं। संक्षिप्त रूप: एक-वायुमार्ग, वी- पोत। छवियों का आवर्धन क्रमशः ए और बी इनसेट के लिए 100x और 200x के साथ 40x हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हालांकि आमतौर पर उपयोग किया जाता है, इंट्राचेल-आधारित निर्धारण विधियां वायुमार्ग से ल्यूकोसाइट्स को विस्थापित करती हैं और सामान्य फेफड़ों की वास्तुकला को बदल सकती हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रदान की जाने वाली संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ वायु-मुद्रास्फीति की विधि इन नुकसानों पर काबू पा देती है और फेफड़ों के शरीर रचना को अधिक सटीक रूप से बरकरार रखता है। संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण विधि से उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक प्राप्त करने की चाबियां में वायु-मुद्रास्फीति दबावों की सावधानीपूर्वक निगरानी, वायु लीक से बचने और वैक्यूलेचर में फिक्सेटिव के पर्याप्त परफ्यूजन सुनिश्चित करना शामिल है।
इस प्रक्रिया के लिए एक सीमा यह है कि जब छाती की अखंडता बाधित है, फेफड़ों पतन और पतन के बाद फेफड़ों की फिर से मुद्रास्फीति सटीक हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए आवश्यक है । प्रोटोकॉल है कि पतन के बिना फेफड़ों की मुद्रास्फीति को बनाए रखने के लिए एक विकल्प एक छोटे जानवर वेंटिलेटर का उपयोग किया जाएगा । हालांकि, इस तरह के उपकरण अक्सर महंगे होते हैं, और यहां प्रोटोकॉल एक सस्ता समाधान प्रदान करता है। स्वस्थ फेफड़ों में, अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा उत्पादित सर्फेक्टेंट सतह के तनाव को कम करने में मदद करता है, और ज्यादातर मामलों में फेफड़ों को आसानी से फिर से विस्तारित किया जा सकता है। हालांकि, रोगग्रस्त फेफड़ों में, ऊतकों को कठोर किया जा सकता है और फेफड़ों के सर्फेक्टेंट फ़ंक्शन को बदला जा सकता है, फेफड़ों के पतन को बढ़ावा देना। इस प्रभाव को कम करने के लिए, ढह क्षेत्रों को थोड़ा अधिक वायु मुद्रास्फीति दबाव (यानी, 25 सीएमएच 2 ओ)5का उपयोग करके "भर्ती" किया जा सकता है। इसके बाद फेफड़ों के मामूली अपस्फीति को फिजियोलॉजिकल आकार में जाने की अनुमति देने के लिए दबाव को कम किया जा सकता है। हमारे हाथ में 20 सेमी पानी का महंगाई का दबाव अच्छी तरह से काम करता है। इससे अधिक दबाव अल्वेओली को अधिक डिस्टर्ब कर सकते हैं और संवहनी परफ्यूजन को ख़राब कर सकते हैं। इसके विपरीत, कम दबाव के परिणामस्वरूप हवाई क्षेत्र ढह जाता है। इसी तरह की लाइनों के साथ, संवहनी पर्फ्यूजन दबाव भी टाइटेटेड होना चाहिए। अत्यधिक परफ्यूजन दबाव केशिकाओं को अल्वियोलर अंतरिक्ष में बदल सकता है या यहां तक कि केशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और फेफड़ों के एडीमा 4 का कारणबन सकताहै । दूसरी ओर, यदि संवहनी पर्फ्यूजन दबाव बहुत कम हैं, तो पर्फ्यूजन अपर्याप्त हो सकता है। हमने पाया है कि हेपरिन समाधान के लिए 10 एमएल/मिनट की प्रवाह दर और फिक्सेटिव समाधान के लिए ६.५ एमएल/मिनट एक इष्टतम परिणाम प्राप्त करते हैं ।
लीक के लिए वायु मुद्रास्फीति कक्ष की जांच करना अनिवार्य है ताकि संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के दौरान लगातार मुद्रास्फीति का दबाव सुनिश्चित किया जा सके । एक बार पानी सिरिंज में जोड़ दिया जाता है यह हवा मुद्रास्फीति कक्ष के नीचे में प्रवाह जब तक दबाव बराबर होना चाहिए । मुद्रास्फीति के लिए 25 सेमी और निर्धारण के लिए 20 सेमी की कॉलम ऊंचाई बनाए रखने के लिए सिरिंज में थोड़ी मात्रा में अतिरिक्त पानी जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है। यदि वायु मुद्रास्फीति कक्ष में प्रवाह बंद नहीं होता है तो सिलिकॉन सीलेंट को प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता हो सकती है।
हवा के रिसाव का एक और कारण फेफड़ों को नुकसान होना है। यह सबसे अधिक छाती गुहा के उद्घाटन के दौरान या छाती से फेफड़ों की निकासी के दौरान होता है। इस प्रकार, माउस तैयार करने के दौरान फेफड़ों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अभ्यास और बड़ी सावधानी बरती जानी चाहिए। एक कम आम कारण फेफड़ों की विकृति है जो गंभीर फेफड़ों की बीमारी से होती है। फेफड़ों से हवा लीक करने के लिए सुराग सिरिंज में तरल पदार्थ स्तंभ से धीमी गति से खाली, एक hissing ध्वनि या फेफड़ों की सतह से आ रही बुलबुले शामिल हैं । रिसाव की साइट पर फेफड़ों के लिए फिक्सेटिव की एक छोटी राशि लागू करने से छोटे लीक सील करने में मदद कर सकते हैं; हालांकि कुछ सुधारात्मक वक्ष गुहा के लिए फेफड़ों के पालन का कारण बन सकता है और जब फेफड़ों की क्षति व्यापक है, फेफड़ों अभी भी एक बार हवा के दबाव को हटा दिया है पतन हो सकता है ।
एक बार जब वायु रिसाव के किसी भी स्रोत का आकलन और प्रबंधन किया गया है, तो फेफड़ों को संकुचन करना चाहिए और निर्धारण के दौरान फुलाया जाना चाहिए । पतन को रोकने के लिए मुद्रास्फीति तंत्र से हटाने से पहले श्वासनली को कैनुला के नीचे लिटाया जाना चाहिए। इसके बाद फेफड़ों को हिस्टोलॉजिक अध्ययन के लिए संसाधित किया जा सकता है। फेफड़ों के संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ वायु-मुद्रास्फीति का उद्देश्य हिस्टोलोजिक संरचना-कार्य अध्ययनों के लिए वैश्विक फेफड़ों की वास्तुकला को पर्याप्त रूप से संरक्षित करते हुए वायुमार्ग कोशिकाओं की संख्या, आकृति विज्ञान और स्थान को संरक्षित करना है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल हार्ट, लंग, और ब्लड इंस्टीट्यूट (एनएचएलबीआई) अनुदान HL140039 और HL130938 द्वारा वित्त पोषित किया गया था । लेखक शैनन हॉट और जाज़ले मैकक्लेंडन को उनकी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
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