Summary
يقدم هو وسيلة لتضخم الهواء مع الأوعية الدموية تثبيت الرئتين التي تحافظ على موقع الخلايا داخل الشعب الهوائية، الحويصلات الهوائية وبينستيتيوم لتحليل هيكل وظيفة. يتم الحفاظ على ضغط مجرى الهواء المستمر مع غرفة تضخم الهواء في حين يتم تثبيت perfused عبر البطين الأيمن. تتم معالجة الرئتين للدراسات النسيجية.
Abstract
غالبا ما يستخدم علم الأنسجة الرئوية للتحقيق في المساهمات التي تقدمها خلايا المجال الجوي أثناء التوازن الرئوي ومسببات الأمراض. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي طرق التثبيت الشائعة الاستخدام القائمة على الغرس إلى إزاحة خلايا المجال الجوي والمخاط إلى الشعب الهوائية الطرفية ويمكن أن تغير مورفولوجيا الأنسجة. وبالمقارنة، فإن تقنيات تثبيت التخثر الوعائي متفوقة في الحفاظ على موقع الخلايا ومورفولوجيا داخل المجال الجوي وبطانة المخاطية. ومع ذلك ، إذا لم يتم تطبيق ضغط مجرى الهواء الإيجابي في وقت واحد ، فقد تنهار مناطق الرئتين وقد تنتفخ الشعيرات الدموية في مساحات الحويصلات الهوائية ، مما يؤدي إلى تشويه تشريح الرئة. هنا، ونحن نصف طريقة رخيصة لتضخم الهواء أثناء تثبيت التشوش الأوعية الدموية للحفاظ على مورفولوجيا وموقع مجرى الهواء والخلايا السنخية وبينستيتيوم في الرئتين مورين للدراسات النسيجية المصب. يتم توصيل ضغط الهواء المستمر إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية من غرفة مغلقة مملوءة بالهواء تحافظ على الضغط عبر عمود سائل قابل للتعديل بينما يتم تثبيت المثبت من خلال البطين الأيمن.
Introduction
يمثل علم الأنسجة الرئوية المعيار الذهبي لتقييم بنية الرئة أثناء الصحة والمرض وهو واحد من الأدوات الأكثر استخداما من قبل الباحثين الرئويين1. واحدة من أهم جوانب هذه التقنية هو العزلة المناسبة والحفاظ على أنسجة الرئة ، لأن التباين في هذه الخطوة يمكن أن يؤدي إلى سوء نوعية الأنسجة والنتائج الخاطئة1،2،3. في الحيوانات الحية ، يتم تحديد حجم الرئة من خلال التوازن بين الارتداد المرن الداخلي للرئة والقوى الخارجية التي تنتقل من جدار الصدر والحجاب الحاجز عن طريق التوتر السطحي. وبناء على ذلك، عندما يتم إدخال الصدر، يتم فقدان القوى الخارجية وانهيار الرئة. أقسام النسيجية المعدة من الرئتين المنهارة لها مظهر مزدحم والحدود بين المقصورات التشريحية (أي المجال الجوي، الأوعية الدموية، وبينستيتيوم) يمكن أن يكون من الصعب التمييز. وللالتفاف على هذا التحدي، غالبا ما يضخم الباحثون الرئتين أثناء التثبيت الكيميائي بحيث يتم الحفاظ على حجم المجال الجوي والهندسة المعمارية.
يمكن نفخ الرئتين بالهواء أو السائل. يختلف الضغط اللازم لتضخيم الرئتين إلى نفس الحجم بين تضخم الهواء والسائل بسبب القوى بين الجزيئيات في واجهة الهواء السائل. مطلوب ضغط أعلى (على سبيل المثال، 25 سمH2O) أثناء تضخم الهواء من التضخم السائل (على سبيل المثال، 12 سمH2O) للتغلب على التوتر السطحي وفتح الحويصلات الهوائيةالمنهارة 4. مرة واحدة وقد جندت الحويصلات الهوائية, انخفاض الضغط يمكن أن تبقي الحويصلات الهوائية مفتوحة على نفس حجم الهضاب منحنى حجم الضغط, والضغوط تتساوى في جميع أنحاء الرئة وفقا لقانون باسكال4,5,6,7,8.
توجد طريقتان رئيسيتان لتضخم الرئة والتثبيت للحفاظ على رئتي مورين للأنسجة. الأكثر شيوعا ، يتم غرس المجال الجوي مع السائل -- غالبا ما تحتوي على مثبت. والميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه سهل نسبيا ولا يتطلب سوى القليل من التدريب. في حين أن غرس داخل الرحم من التثبيت قد يكون المفضل في الدراسات التي تركز على الأوعية الدموية، السائل الذي يتم غرسه عبر القصبة الهوائية يميل إلى دفع خلايا مجرى الهواء القريبة والموسينات في مناطق المجال الجوي أكثر البعيدة في حين أن تضخم الهواء لا1،3،4،9،10،11. وعلاوة على ذلك، مفرزة غير مقصودة من الكريات البيض من الظهارة خلال التضخم السائل يغير مورفولوجيا بهم، مما يعطيها artifactually بسيطة، مظهرمقربة 4،10،11،12. وأخيرا ، يمكن للتضخم في الرئتين مع السائل ضغط عن غير قصد بينستيتيوم4،10،11. معا، يمكن لهذه العوامل تشويه التشريح الطبيعي والتوزيعات الخلوية داخل الرئتين المحفوظة، وبالتالي الحد من هذه التقنية.
طريقة بديلة للحفاظ على الأنسجة هو تثبيت التشوه الوعائي. في هذه الطريقة، يتم تثبيت التثبيت في الأوعية الدموية الرئوية عن طريق فينا كافا أو البطين الأيمن. تحافظ هذه الطريقة على موقع الخلايا ومورفولوجيا في تجويف المجال الجوي. ومع ذلك ، ما لم يتم تضخيم الرئتين أثناء تثبيت التشوه ، فمن المرجح أن ينهار نسيج الرئة.
التضخم الجوي مع تثبيت التشوه الوعائي يسخر نقاط القوة من كل من تقنيات التثبيت المذكورة أعلاه. هنا نحن نقدم بروتوكول لهذه التقنية. المواد والمعدات المطلوبة غير مكلفة نسبيا ويمكن الحصول عليها بسهولة وتجميعها. الإعداد المكتمل، كما هو موضح في الشكل 1A،يوفر ضغط مجرى الهواء المستمر إلى الرئتين عن طريق عمود قابل للتعديل مملوء بالسوائل بينما توفر مضخة بيرستالدية مثبتة عبر البطين الأيمن. ويمكن بعد ذلك معالجة الرئتين مع مورفولوجيا المحفوظة لمزيد من التحليلات هيكل وظيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للصحة اليهودية الوطنية على جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول.
ملاحظة: يتم تنظيم البروتوكول إلى ثلاثة مكونات. العنصر الأول تفاصيل بناء تضخم الهواء مع معدات التشويش / التثبيت. يصف القسم الثاني كيفية إعداد المعدات لتجربة. يصف القسم الأخير كيفية إعداد الحيوان وإجراء التجربة.
1. بناء جهاز عمود الماء (الشكل 1B)
- إزالة المكبس من حقنة تلميح زلة 60 مل.
- إرفاق الشريط حول الحقنة في علامة 30 مل. تعيين ارتفاع المحاقن إلى هذه العلامة لضغط التضخم الأولي من 25 سمH2O. هذا هو أيضا حيث ينبغي أن يكون مستوى المياه في العمود طوال الإجراء بأكمله. تسمية الشريط إما "25 سم" (كما هو موضح في الشكل 1A)أو "التضخم".
ملاحظة: يستخدم ضغط تضخم يبلغ 25 سمH2O لضمان توظيف المجال الجوي المنهار. وبمجرد تجنيد الحويصلات الهوائية، ينخفض الضغط إلى 20 سمH2O لضمان عدم نزع المجال الجوي. - قياس 5 سم من الشريط نحو نهاية المكبس وإرفاق قطعة أخرى من الشريط إلى الحقنة. نقل المحاقن وصولا الى هذه العلامة لخفض ضغط التضخم إلى 20 سمH2O أثناء التثبيت. تسمية الشريط إما "20 سم" (كما هو موضح في الشكل 1A)أو "التثبيت".
- إرفاق 180 كلوريد البولي فينيل (PVC) أنابيب إلى طرف زلة نهاية الحقنة. يعتمد طول الأنبوب على المسافة بين المحقنة وغرفة تضخم الهواء (حوالي 25-30 سم).
- وضع ذكر Luer (2) موضوع نمط نقطة الإنطلاق (1.219 بوصة طول, 0.904 بوصة ارتفاع, 0.0904 بوصة القطر الداخلي) في الطرف الآخر من الأنابيب. هذا الرجل لوير سيتصل بتوقف غرفة التضخم الجوي (الخطوة 2.4).
2. بناء غرفة التضخم الجوي (الشكل 1C)
- حفر اثنين من الثقوب (ما يقرب من 4 ملم في القطر) في وعاء من البلاستيك 500 مل مع غطاء المسمار على. يجب أن تكون الثقوب بنفس حجم Luers الأنثوية (طول 1.224 بوصة ، ارتفاع 0.312 بوصة ، قطر داخلي 0.098 بوصة).
ملاحظة: يمكن استخدام الوسائط الفارغة أو الحاويات العازلة لغرفة تضخم الهواء. - خيوط معطف من Luers الإناث مع صانع طوقا السيليكون ووضع الجانب الأصغر في ثقوب حفرت مسبقا من الحاوية.
- إضافة صانع طوقا السيليكون حول Luers الإناث حيث يدخلون الحاوية لضمان ختم محكم الهواء.
- المسمار على stopcock في اتجاه واحد على لوير الإناث أقل على غرفة التضخم الجوي.
- قطع أنابيب إلى طول ما يقرب من 25 سم وإرفاق Luers الذكور إلى نهايات مجانية من الأنابيب. ربط لوير الذكور على نهاية واحدة من الأنابيب إلى لوير الإناث الحرة على غرفة التضخم الجوي. الذكر الآخر (لوير) سيتصل بحاوية معالجة الحيوانات
3. بناء حاوية تجهيز الحيوانات (الشكل 1D)
- حفر حفرة (قطرها حوالي 4 ملم) في جانب حاوية بلاستيكية كبيرة. يجب أن يكون قطر الثقب هو قطر الأنثى لوير. هناك حاجة إلى الحاوية البلاستيكية للقبض على محلول التثبيت الزائد.
ملاحظة: تم استخدام حاوية تخزين بلاستيكية بحجم 30 سم × 22 سم، 3.8 لتر. - خيوط معطف من Luer الإناث مع صانع طوقا السيليكون ووضع الجانب الأصغر في حفرة predrilled من الحاوية.
- إضافة صانع طوقا السيليكون حول Luer الإناث حيث يدخل ويخرج من الحاوية لضمان ختم محكم الهواء.
- المسمار stopcock في اتجاه واحد على لوير الإناث. الأنابيب من غرفة التضخم الجوي ستلتصق بهذا التوقف
4. إعداد الحلول
- حل الهيبارين
- ملء حاوية مع برنامج تلفزيوني خالية من الكالسيوم والهيبارين (20 U/mL). إعداد ما مجموعه 10 مل حل الهيبارين لكل فأر. الهيبارين هو مضاد للتخثر يمنع الجلطات الدموية من التشكل في الأوعية أثناء تثبيت التخثر. سيتم استخدام محلول الهيبارين لغسل الدم من الرئتين قبل تثبيت التشوه.
- الحل المثبت
تنبيه: يمكن أن تشكل المثبتات خطرا صحيا ويجب استخدامها في غطاء الدخان الكيميائي. يتم إعداد جميع الأجهزة في غطاء الدخان الكيميائي لمنع استنشاق المثبتات.- ملء حاوية مع برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم وبارافورمالديهايد (4٪ تركيز نهائي). إعداد ما مجموعه 50 مل حل التثبيت لكل ماوس.
ملاحظة: قد يختلف نوع المثبت المستخدم ويعتمد على الدراسات النسيجية في المصب.
- ملء حاوية مع برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم وبارافورمالديهايد (4٪ تركيز نهائي). إعداد ما مجموعه 50 مل حل التثبيت لكل ماوس.
5. إعداد جهاز التشويش
ملاحظة: يقترح مضخة التجبير لتسليم السوائل إلى الأوعية الدموية لضمان معدل التدفق المستمر. الاتجاهات التالية هي لإعداد مضخة التجبير، ويمكن أن تكون مختلفة لكل نموذج. بدلا من ذلك، إذا مضخة التجبير غير متوفر، يمكن إنشاء جهاز عمود الماء الثاني لتشويش السوائل من ارتفاع 35 سم H2O.
- أول مكان الأنابيب حول الجمعية الأسطوانة.
- تأمين الأنابيب في الوظائف الشق.
- قم بقفل العتلات في مكانها عن طريق وضع الرافعة اليسرى حول الأنبوب أولا وتأمينها في مكانها مع الجزء العلوي ثم الرافعة اليمنى.
- ضع الطرف القريب من الأنابيب في محلول الهيبارين والنهاية البعيدة في حاوية معالجة الحيوانات.
- preload حل الهيبارين في الأنابيب عن طريق تشغيل المضخة لطرد الهواء من الأنابيب.
- تأمين إبرة 25G × 5 /8 "على نهاية الجانب الأيسر من الأنابيب.
6. إعداد جهاز التضخم الجوي
- ضع المحقنة لعمود الماء في حامل حلقة.
- قياس ارتفاع عمودي من 25 سم من منصة الحيوان إلى علامة الشريط "25 سم" (الخطوة 1.2) على عمود الماء.
- إرفاق نهاية أنبوب عمود الماء إلى stopcock على غرفة الهواء.
- إرفاق أنبوب من Luer أنثى من غرفة الهواء إلى stopcock على حاوية معالجة الحيوانات.
ملاحظة: إذا تم إنشاء غرفة تضخم الهواء كما هو موضح في الشكل 1C، فإن ربط الأنابيب بترتيب عكسي قد يتسبب في تسرب المياه إلى الأنابيب التي تتصل بقنية القصبة الهوائية. - تأكد من إغلاق الغطاء إلى غرفة الهواء بإحكام.
- تأكد من أن stopcock على السطح الخارجي للحاوية معالجة الحيوان مغلقة و stopcock على الأنابيب المؤدية من عمود المياه إلى غرفة التضخم الهواء مفتوح.
- ملء المحقنة بالماء إلى علامة "25 سم". الماء سيترك الحقنة من خلال الأنابيب في غرفة الهواء. بمجرد أن يتم معادلة الضغط سوف تتوقف المياه المتدفقة.
- من الممكن أن تتسرب المياه ببطء إلى غرفة تضخم الهواء مع تقلب ضغط الهواء المحيط داخل غطاء محرك السيارة الكيميائي. إبقاء العين على مستوى المياه داخل الحقنة وإضافة المزيد إذا لزم الأمر. الحفاظ على مستوى المياه عند علامة "25 سم" طوال العملية.
ملاحظة: عادة ما تبقى مستويات المياه ثابتة في الجزء الأول من تضخم الهواء عند 25 سمH2O؛ ومع ذلك من المرجح أن تحتاج إلى إضافة المزيد من الماء إلى الحقنة أثناء التثبيت. وإذا لم تتوقف المياه عن التدفق، فمن المرجح أن يكون هناك تسرب للهواء داخل غرفة التضخم الجوي. قد تحتاج إلى تطبيق المزيد من صانع طوقا السيليكون حول Luers لمنع تسرب الهواء.
- من الممكن أن تتسرب المياه ببطء إلى غرفة تضخم الهواء مع تقلب ضغط الهواء المحيط داخل غطاء محرك السيارة الكيميائي. إبقاء العين على مستوى المياه داخل الحقنة وإضافة المزيد إذا لزم الأمر. الحفاظ على مستوى المياه عند علامة "25 سم" طوال العملية.
7. إعداد الحيوانات (الشكل 2)
ملاحظة: تم تعديل هذا الإجراء من Gage et al13. لقد أكملنا هذا الإجراء على الفئران البالغة من الذكور والإناث من مختلف الأعمار ونلاحظ أي تحيز في العمر أو الجنس.
- قتل الحيوان مع بنتوباربيتال الصوديوم (150 ملغم /كغ، intraperitoneally.). تأكد من أن الحيوان ميت قبل بدء التشريح.
ملاحظة: في حين يتم تنفيذ هذا الإجراء على الحيوانات القتل الرحيم، يمكن إجراء هذا الإجراء على الحيوانات الحية للاستفادة من القلب لضخ perfusates في جميع أنحاء الحيوان. - إجراء شقين الجانبية من خلال جدار البطن. جعل الشق الأول تحت القفص الصدري والثاني فوق الوركين. قطع على طول خط الوسط من شق أدنى نحو شق متفوقة.
- باستخدام مقص حاد، وجعل بعناية شق في الجانب الجانبي من الحجاب الحاجز. يجب أن تنهار الرئتين بمجرد ثقب الحجاب الحاجز.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب ثقب الرئتين. الرئة المثقوبة أقل عرضة للتضخم خلال الخطوات اللاحقة. - قطع عرضية على طول الحجاب الحاجز لفتح تجويف الصدر.
- قطع متفوقة على طول القص من عملية xiphoid إلى الشق الوداجي وجانبيا فوق القفص الصدري لفضح تماما القلب والرئتين. دبوس أسفل الجانبين من القفص الصدري.
- إجراء شق خط الوسط في الرقبة فوق القصبة الهوائية. إزالة الجلد والعضلات والغدة الدرقية والنسيج الضام المحيطة القصبة الهوائية.
- باستخدام ملقط منحني، الشريحة قطعتين من الخيط أو خياطة تحت القصبة الهوائية الخلفية. استخدام قطعة واحدة من خياطة لعقد التضخم Luer-كعب محول في مكان، واستخدام الآخر في نهاية المطاف لربط قبالة القصبة الهوائية في ختام تضخم الهواء والأوعية الدموية تثبيت التشوه.
- كزة حفرة صغيرة في القصبة الهوائية باستخدام إبرة 18G × 1 "أو مقص الربيع فاناس.
- ضع محول لوير كعب 20G في هذه الحفرة في القصبة الهوائية.
- ربط مؤشر ترابط واحد حول القصبة الهوائية على الفور إلى حيث يدخل محول لوير كعب روتين لعقد في مكانه.
- نقل الحيوان إلى حاوية معالجة الحيوانات.
- إرفاق محول لوب لوب إلى Luer أنثى في داخل حاوية معالجة الحيوانات.
8. تضخم الهواء ، والتشويش والتثبيت في الرئتين (الشكل 2)
- ضع إبرة 25G x 5/8 بوصة المرفقة بجهاز التشوه في البطين الأيمن للقلب.
- قطع الشريان الأورطي البطني للسماح للدم بالانزاف من القلب وتعزيز تدفق التشوه عبر الرئتين.
- فتح stopcock على السطح الخارجي للحيوان تجهيز حاوية لتضخيم الرئتين.
ملاحظة: قد يستغرق الأمر بعض الوقت حتى تتضخم الرئتين بشكل كامل. مشاهدة مستوى المياه في الحقنة، فإنه لا ينبغي أن ينخفض بسرعة ما لم يكن هناك تسرب في الرئتين. - تضخيم الرئتين في 25 سمH2O لمدة 5 دقائق. التضخم عند 25 سمH2O شروط مسبقة الرئة ويساعد في تجنيد مناطق الرئة atelectatic.
ملاحظة: قد تحتاج إلى إضافة كمية صغيرة من الماء إلى المحقنة للحفاظ على ارتفاع 25 سم. التهاب و / أو إصابة الرئة الناجمة تجريبيا قد تؤثر على تضخم الرئتين. وفي هذه الحالة، قد يكون من الضروري زيادة ضغط التضخم إلى حد أقصى قدره 35 سمH2O للمساعدة في توظيف المناطق النعوتة. - خلال اللحظة الأخيرة من تضخم الرئة، قم بتشغيل المضخة العجمية إلى معدل تدفق 10 مل/دقيقة. يجب أن يتدفق محلول الهيبارين من الزجاجة عبر الأنابيب إلى الحيوان.
- الهدف من ضخ الهيبارين هو منع تشكيل الثرومبي في الأوعية. وبناء على ذلك، غرس الهيبارين حتى تصبح الرئتين بيضاء وخالية من الدم. إذا لم تتحول الرئتين إلى اللون الأبيض، فقد يكون من الضروري تعديل الإبرة البطينية اليمنى.
- بعد تضخيم لمدة 5 دقائق، إيقاف المضخة التمعجية والتبديل أنابيب النفخ من محلول الهيبارين إلى المثبت.
- خفض حقنة عمود الماء إلى علامة "20 سم" (الخطوة 1.3). من الطبيعي أن تتحرك فقاعات الهواء داخل عمود الماء مع تغير الضغط من 25 إلى 20 سمH2O.
- تحقق من مستوى المياه في الحقنة. يجب أن يكون عند علامة "25 سم". قد يكون من الضروري إضافة المزيد في هذا الوقت.
- انتظر لمدة دقيقة واحدة للسماح للرئتين لتفريغ من 25 إلى 20 سمH2O.
- أعد تشغيل مضخة التشوه بمعدل تدفق يبلغ 6.5 مل/دقيقة.
- الأوعية الدموية perfusion الإصلاح لمدة 10 - 15 دقيقة.
9. استخراج الرئتين (الشكل 3)
- ربط بإحكام قطعة الثاني من الموضوع حول distal القصبة الهوائية إلى محول لوير كعب الروتين. قم بإزالة محول لوب من القصبة الهوائية.
- إزالة الإبرة من القلب.
- تحرير الرئتين والقلب من تجويف الصدر عن طريق قطع النسيج الضام الخلفي إلى mediastinum مع مقص حاد. الحرص على تجنب ثقب الرئتين.
- إزالة القلب بعناية من الرئتين.
- ضع الرئتين في التثبيت بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تختلف مدة التثبيت على الدراسات النسيجية في المصب.- ضع الرئتين في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 20-25 مل من التثبيت. ضع الخيط تأمين القصبة الهوائية من خلال فتح أنبوب مخروطي وآمنة من خيوط الغطاء. عكس الأنبوب المخروطي لضمان أن الرئتين المزدهرة ، والهواء المتضخم لا تزال مغمورة بالكامل في التثبيت وإلا فإنها سوف تطفو إلى أعلى السائل.
- معالجة الرئتين للدراسات النسيجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الصدر سليمة، وتعقد الرئتين مفتوحة من قبل القوى الخارجية التي يطبقها جدار الصدر عبر الفضاء الجنبي6،14. عندما يتم إدخال الحجاب الحاجز أثناء تشريح، يتم إلغاء سلامة الفضاء الجنبي والرئتين يجب أن تنهار(الشكل 2A،2B). لإعادة توسيع الرئتين، يتم إجراء تضخم الهواء. وكخطوة أولى، يتم تطبيق 25 سم من ضغط المياه لضمان توظيف المجال الجوي المنهار. وبناء على ذلك، عندما يتم فتح stopcock خارج الحاوية عقد الحيوان، والهواء يدخل الرئتين عن طريق القصبة الهوائية وينبغي ملاحظة التضخم بسهولة(الشكل 2C). بمجرد توسيع الرئتين بالكامل ، ينخفض ضغط التضخم إلى ضغط الماء 20 سم(الشكل 2D). يتم اختيار 20 سم من ضغط المياه لأنه يحافظ على التضخم الكامل للرئتين ولكن لا يبالغ في تثبيط المجال الجوي.
يجب أن تظل الرئتين متضخمة بعد ربط القصبة الهوائية (الشكل 3A) وبعد الإزالة من الصدر (الشكل 3B). يمكن أن يحدث انكماش الرئتين(الشكل 3C)إذا ثقبت الرئتين أثناء إعداد الحيوان أو استخراجه. إضافة مثبت إلى السطح الجنبي قد يساعد في ختم تسرب طفيفة أثناء الإجراء; ومع ذلك، يجب تطبيق التثبيت بحذر لأن الزائدة قد تلتزم الرئتين إلى تجويف الصدر. أي تسرب التي لم يتم إغلاقها أثناء التثبيت سيؤدي إلى انهيار الرئتين عند إزالتها من أجهزة التضخم الجوي. قد يحدث انكماش في الرئتين أيضا إذا لم تكن القصبة الهوائية مرتبطة تماما. عندما تغمرها في إصلاحية، والرئتين تضخم بشكل صحيح سيكون أكبر الطفو من الرئتين مفرغ.
ويمكن بعد ذلك معالجة تضخم الرئتين للتحليلات النسيجية وفقا للبروتوكولات المنشأة1،15. بالنسبة للشخصية 4، تمت معالجة الرئتين للأقسام المجمدة وملطخة بنظام تلطيخ يدوي تجاري. عدد قليل جدا من الخلايا المناعية موجودة في تجويف مجرى الهواء من الأنسجة الثابتة باستخدام التضخم التقليدي القائم على السائل(الشكل 4A). في المقابل ، يتم الحفاظ على الخلايا الالتهابية في جميع أنحاء المجال الجوي في الأنسجة الثابتة عن طريق ارتطام الأوعية الدموية مع تضخم الهواء(الشكل 4B).
الشكل 1: تجميع الأجهزة. أ. التجميع الكامل لجميع الأجهزة. باء - ال 20 في المائ يتكون عمود المياه من حقنة 60 مل متصلة بغرفة تضخم الهواء عبر أنابيب PVC 180 ولوير ذكر في اتجاهين. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن واستخدمت حاوية بلاستيكية مغلقة سعة 500 مل لبناء غرفة التضخم الجوي. يتصل لوير الذكر في عمود الماء بتوقف متصل بأنثى لوير داخل جدران الغرفة. وهناك أنثى إضافية لوير يربط أنابيب من غرفة التضخم الجوي إلى حاوية تجهيز الحيوانات. كل من Luers الإناث مغلفة في صانع طوقا السيليكون لضمان ختم محكم الهواء. ويرتبط اثنان من الذكور Luers إلى طرفي الأنابيب التي تربط غرفة التضخم الجوي إلى حاوية تجهيز الحيوانات. د- يتم إرفاق الحيوانات إلى غرفة التضخم الجوي من خلال محول كعب 20G Luer وضعت من خلال ثقب في القصبة الهوائية. يتم توصيل محول كعب روتين Luer إلى Luer أنثى داخل جدران حاوية معالجة الحيوانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد الحيوان ، والاتصال بغرفة تضخم الهواء ، وتضخم الرئتين. أ. بعد القتل الرحيم ، يتم الكشف عن تجاويف الحيوان البريتونية والصدرية. تتم إزالة القفص الصدري أو تثبيته للسماح بتوسيع الرئتين عند التضخم. يتم إدراج محول كعب روتين Luer في ثقب صغير مقطع إلى القصبة الهوائية ومؤمن بخيط أو خياطة. يتم توصيل محول كعب روتين Luer إلى Luer أنثى داخل جدار غرفة معالجة الحيوانات. يتم إرفاق الطرف الآخر من لوير الإناث إلى stopcock للسيطرة على تدفق الهواء من غرفة التضخم الجوي (غير مبين). باء - ال 20 في المائ انهارت الرئتين قبل تضخم الهواء. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن يتم تضخيم الرئتين إلى ضغط المياه 25 سم لتجنيد المناطق atelectasic. د- عندما يتم تغيير الضغط إلى ضغط التثبيت المقصود (20 سم من الماء)، تتفرغ الرئتين قليلا. يصور أيضا وضع إبرة 25G × 5/8 في البطين الأيمن لتثبيت التشوه الوعائي للرئة. جميع الصور هي صور بدقة 15.9 ميجابكسل وبنسبة عرض إلى ارتفاع 4:3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: استخراج الرئتين بعد الانتهاء من تضخم الهواء مع تثبيت التشوه الوعائي. أ. ويرتبط القصبة الهوائية قبالة القاصي إلى محول كعب لوير ويتم استخراج الرئتين عن طريق قطع النسيج الضام الخلفي إلى mediastinum. باء - ال 20 في المائ الرئتين المتضخمة بالهواء بعد الانتهاء الإجرائي الناجح. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن مثال على ضعف تضخم الرئتين التي نتجت عن تسرب الهواء الذي حدث داخل غرفة التضخم الجوي. لاحظ أن هذه الرئتين أصغر من الرئتين المتضخمتين بنجاح. جميع الصور هي صور بدقة 15.9 ميجابكسل وبنسبة عرض إلى ارتفاع 4:3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:مقارنة بين أنسجة الرئة التي تم الحصول عليها عن طريق التثبيت داخل الشرايين مقابل تضخم الهواء مع تثبيت التشوه الوعائي. أ. الرئتين المحفوظة عن طريق التثبيت داخل الرحم. باء - ال 20 في المائ الرئتين المحفوظة عن طريق تضخم الهواء مع تثبيت التشوه الوعائي. B (داخلي). تظهر الأسهم الكريات البيض في الشعب الهوائية للرئة التي تم إصلاحها عن طريق تثبيت التشوه الوعائي؛ النجوم تسليط الضوء على الكريات البيض في الحويصلات الهوائية. وبالمقارنة، فإن الكريات البيض غائبة بشكل ملحوظ في الشعب الهوائية للرئتين الثابتة عبر الطريق داخل التراتشي(A inset)ويتم إزاحة الكريات البيض داخل الحويصلات الهوائية، ويبدو أنها على اتصال ضيق مع الخلايا الظهارية. الاختصارات: A- مجرى الهواء، V- السفينة. تكبير الصور هي 40x مع 100x و 200x ل Insets A و B على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن استخدامها شائع، إلا أن طرق التثبيت داخل التراتشي تحل محل الكريات البيض من الشعب الهوائية ويمكن أن تغير بنية الرئة الطبيعية. طريقة تضخم الهواء مع تثبيت التشوه الوعائي التي يتم توفيرها في هذا البروتوكول يتغلب على هذه المزالق ويحافظ بشكل أكثر دقة على تشريح الرئة. مفاتيح الحصول على أنسجة عالية الجودة من طريقة تثبيت التشوه الوعائي تشمل الرصد الدقيق لضغوط تضخم الهواء، وتجنب تسرب الهواء، وضمان التغلغل الكافي من التثبيت في الأوعية الدموية.
أحد القيود المفروضة على هذا الإجراء هو أنه عندما يتم قطع سلامة الصدر ، تنهار الرئتين وإعادة تضخم الرئتين بعد الانهيار ضرورية لتقييم الهسهولوجي الدقيق. والبديل للبروتوكول الذي من شأنه الحفاظ على تضخم الرئة دون انهيار هو استخدام جهاز تنفس صناعي حيواني صغير. ومع ذلك ، فإن هذه المعدات غالبا ما تكون مكلفة ، ويقدم البروتوكول هنا حلا غير مكلف. في الرئتين السليمتين، يساعد الخافض للتوتر السطحي الذي تنتجه الخلايا الظهارية السنوية على تقليل التوتر السطحي، وفي معظم الحالات يمكن إعادة توسيع الرئتين بسهولة. ومع ذلك ، في الرئتين المريضة ، يمكن أن تكون الأنسجة أكثر صلابة ويمكن تغيير وظيفة تنشيط الرئة ، مما يعزز انهيار الرئة. وللتخفيف من هذا التأثير، يمكن "تجنيد" المناطق المنهارة باستخدام ضغوط تضخم الهواء الأعلى قليلا (أي 25 سمH2O)5. ويمكن بعد ذلك خفض الضغط للسماح انكماش طفيف في الرئتين إلى حجم الفسيولوجية. في أيدينا، ضغط التضخم من 20 سم المياه يعمل بشكل جيد. الضغوط أعلى من هذا يمكن الإفراط في نزع الحويصلات الهوائية وإضعاف التروية الوعائية. وعلى العكس من ذلك، تؤدي الضغوط المنخفضة إلى انهيار المجال الجوي. وعلى نفس المنوال، يجب أيضا أن تكون ضغوط التشوه الوعائي مرتجفة. ضغوط التشوه المفرط قد تنزع الشعيرات الدموية في الفضاء الحويصلات الدموية أو حتى تلف الشعيرات الدموية وتسبب وذمة الرئة4. من ناحية أخرى ، إذا كانت ضغوط التشوه الوعائي منخفضة للغاية ، فقد يكون التشوه غير كاف. لقد وجدنا أن معدلات تدفق 10 مل / دقيقة لحل الهيبارين و 6.5 مل / دقيقة للحل المثبت تحقيق نتيجة مثالية.
إن فحص غرفة تضخم الهواء بحثا عن التسريبات أمر حتمي لضمان ضغط التضخم المستمر أثناء تثبيت التشوه الوعائي. بمجرد إضافة الماء إلى الحقنة يجب أن يتدفق إلى قاع غرفة تضخم الهواء حتى تتساوى الضغوط. قد تحتاج إلى إضافة كمية صغيرة من المياه الإضافية إلى المحقنة للحفاظ على ارتفاع عمود يبلغ 25 سم للتضخم و 20 سم للتثبيت. قد تحتاج إلى استبدال تسرب السيليكون إذا تدفق إلى غرفة التضخم الهواء لا تتوقف.
سبب آخر لتسرب الهواء هو تلف الرئتين. يحدث هذا عادة أثناء فتح تجويف الصدر أو أثناء استخراج الرئتين من الصدر. وبالتالي ، يجب اتخاذ الممارسة والعناية الشديدة لتجنب إتلاف الرئة أثناء إعداد الماوس. السبب الأقل شيوعا هو أمراض الرئة التي تنتج عن أمراض الرئة الحادة. وتشمل القرائن على تسرب الهواء من الرئتين بطء إفراغ من عمود السوائل في الحقنة، وصوت الهسهسة أو فقاعات قادمة من سطح الرئة. تطبيق كمية صغيرة من مثبت على الرئتين في موقع تسرب يمكن أن تساعد في ختم تسرب صغير; ومع ذلك يمكن أن يسبب بعض المثبتة التزام الرئتين بتجويف الصدر وعندما يكون تلف الرئة واسعا ، قد تنهار الرئتين بمجرد إزالة ضغط الهواء.
بمجرد تقييم أي مصادر لتسرب الهواء وإدارتها ، يجب أن تتضخم الرئتين وتظل مضخمة أثناء التثبيت. يجب ربط القصبة الهوائية تحت القنية قبل إزالتها من جهاز التضخم لمنع الانهيار. ويمكن بعد ذلك معالجة الرئتين للدراسات النسيجية. يهدف تضخم الهواء مع تثبيت الرئتين إلى الحفاظ على الأرقام والمورفولوجيا وموقع خلايا مجرى الهواء مع الحفاظ بشكل كاف على بنية الرئة العالمية لدراسات وظيفة الهيكل النسيجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) يمنح HL140039 وHL130938. ويود المؤلفان أن يشكرا شانون هوت وجازالي ماكليندون على خبرتهما التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S.
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I.
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A.
