Summary
Viene presentato un metodo per il gonfiaggio dell'aria con perfusione-fissazione vascolare dei polmoni che preserva la posizione delle cellule all'interno delle vie aeree, degli alveoli e dell'interstizio per le analisi struttura-funzione. La pressione costante delle vie aeree viene mantenuta con una camera di gonfiaggio dell'aria mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro. I polmoni vengono elaborati per studi istologici.
Abstract
L'istologia polmonare viene spesso utilizzata per studiare i contributi forniti dalle cellule dello spazio aereo durante l'omeostasi polmonare e la patogenesi della malattia. Tuttavia, i metodi di fissazione basati sull'instillazione comunemente usati possono spostare le cellule dello spazio aereo e il muco nelle vie aeree terminali e possono alterare la morfologia dei tessuti. In confronto, le tecniche di perfusione-fissazione vascolare sono superiori nel preservare la posizione e la morfologia delle cellule all'interno degli spazi aerei e del rivestimento della mucosa. Tuttavia, se la pressione positiva delle vie aeree non viene applicata contemporaneamente, le regioni dei polmoni possono collassare e i capillari possono gonfiarsi negli spazi alveolari, portando alla distorsione dell'anatomia polmonare. Qui, descriviamo un metodo economico per l'inflazione dell'aria durante la perfusione-fissazione vascolare per preservare la morfologia e la posizione delle vie aeree e delle cellule alveolari e dell'interstizio nei polmoni murini per gli studi istologici a valle. La pressione costante dell'aria viene erogata ai polmoni attraverso la trachea da una camera sigillata e riempita d'aria che mantiene la pressione attraverso una colonna liquida regolabile mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro.
Introduction
L'istologia polmonare rappresenta il gold standard per la valutazione dell'architettura polmonare durante la salute e la malattia ed è uno degli strumenti più comunemente usati dai ricercatori polmonari1. Uno degli aspetti più critici di questa tecnica è il corretto isolamento e conservazione del tessuto polmonare, poiché la variabilità in questa fase può portare a una scarsa qualità dei tessuti e risultatierrati 1,2,3. Negli animali viventi, il volume polmonare è determinato dall'equilibrio tra il rinculo elastico verso l'interno del polmone e le forze esterne trasmesse dalla parete toracica e dal diaframma dalla tensione superficiale. Di conseguenza, quando si entra nel torace, le forze esterne vengono perse e il polmone collassa. Le sezioni istologiche preparate da polmoni collassati hanno un aspetto affollato e i confini tra i compartimenti anatomici (cioè spazi aerei, vascolarizzazione e interstizio) possono essere difficili da distinguere. Per aggirare questa sfida, i ricercatori spesso gonfiano i polmoni durante la fissazione chimica in modo da mantenere le dimensioni e l'architettura dello spazio aereo.
I polmoni possono essere gonfiati con aria o liquido. La pressione necessaria per gonfiare i polmoni allo stesso volume differisce tra gonfiaggio dell'aria e del liquido a causa delle forze intermolecolari all'interfaccia aria-liquido. Durante il gonfiaggio dell'aria è necessaria una pressione più elevata (ad esempio,25cmH 2 O) rispetto al gonfiaggio del liquido (ad esempio, 12 cmH2O) per superare la tensione superficiale e aprire gli alveoli collassati4. Una volta che gli alveoli sono stati reclutati, una pressione inferiore può mantenere gli alveoli aperti allo stesso volume dei plateau della curva pressione-volume, e le pressioni si equalizzano in tutto il polmone secondo la legge di Pascal4,5,6,7,8.
Esistono due metodi principali di inflazione e fissazione polmonare per preservare i polmoni murini per l'istologia. Più comunemente, gli spazi aerei sono instillati con liquido - spesso contenente un fissativo. Il vantaggio principale di questo approccio è che è relativamente facile e richiede poca formazione. Mentre l'instillazione intratracheale di fissativo può essere preferita negli studi che si concentrano sulla vascolarizzazione, il liquido che viene instillato attraverso la trachea tende a spingere le cellule prossimali delle vie aeree e le mucina in regioni più distali dello spazio aereo mentre l'inflazione dell'aria non1,3,4,9,10,11. Inoltre, il distacco involontario dei leucociti dall'epitelio durante il gonfiaggio liquido altera la loro morfologia, conferendo loro un aspetto semplice e arrotondato4,10,11,12. Infine, il gonfiaggio dei polmoni con liquido può involontariamente comprimere l'interstizio4,10,11. Insieme, questi fattori possono distorcere la normale anatomia e le distribuzioni cellulari all'interno dei polmoni conservati, limitando così la tecnica.
Un metodo alternativo di conservazione dei tessuti è la perfusione-fissazione vascolare. In questo metodo, il fissativo viene perfuso nella vascolarizzazione polmonare attraverso la vena cava o il ventricolo destro. Questo metodo preserva la posizione e la morfologia delle cellule nel lume dello spazio aereo. Tuttavia, a meno che i polmoni non siano gonfiati durante la fissazione della perfusione, è probabile che il tessuto polmonare collassi.
Il gonfiaggio dell'aria con perfusione-fissazione vascolare sfrutta i punti di forza di ciascuna delle tecniche di fissazione di cui sopra. Qui forniamo un protocollo per questa tecnica. I materiali e le attrezzature necessari sono relativamente economici e possono essere facilmente ottenuti e assemblati. La configurazione completata, mostrata nella Figura 1A,fornisce una pressione costante delle vie aeree ai polmoni attraverso una colonna regolabile e piena di liquido, mentre una pompa peristaltica fornisce fissativo attraverso il ventricolo destro. I polmoni con morfologia preservata possono quindi essere ulteriormente elaborati per analisi struttura-funzione.
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Protocol
Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della National Jewish Health.
NOTA: il protocollo è organizzato in tre componenti. Il primo componente descrive in dettaglio la costruzione del gonfiaggio dell'aria con apparecchiature di perfusione / fissazione. Una seconda sezione descrive come impostare l'attrezzatura per un esperimento. La sezione finale descrive come preparare l'animale ed eseguire l'esperimento.
1. Costruzione dell'apparato a colonna d'acqua (Figura 1B)
- Rimuovere lo stantuffo da una siringa a punta antiscivolo da 60 mL.
- Attaccare del nastro attorno alla siringa al segno di 30 ml. Impostare l'altezza della siringa su questo segno per la pressione di gonfiaggio iniziale di 25 cmH2O. Questo è anche il punto in cui il livello dell'acqua nella colonna dovrebbe essere durante l'intera procedura. Etichettare il nastro come "25 cm" (come illustrato nella Figura 1A)o "inflazione".
NOTA: una pressione di gonfiaggio di 25 cmH2O viene utilizzata per garantire il reclutamento di spazi aerei collassati. Una volta reclutati gli alveoli, la pressione viene abbassata a 20 cmH2O per garantire che gli spazi aerei non siano distesi. - Misurare 5 cm dal nastro verso l'estremità dello stantuffo e attaccare un altro pezzo di nastro adesivo alla siringa. Spostare la siringa verso il basso fino a questo segno per abbassare la pressione di gonfiaggio a 20 cmH2O durante la fissazione. Etichettare il nastro come "20 cm" (come illustrato nella Figura 1A)o "fissazione".
- Fissare il tubo 180 in polivinilcloruro (PVC) all'estremità della punta antiscivolo della siringa. La lunghezza del tubo dipende dalla distanza tra la siringa e la camera di gonfiaggio dell'aria (circa 25-30 cm).
- Posizionare un t-shirt maschio in stile Luer (2) (1,219 pollici di lunghezza, 0,904 pollici di altezza, 0,0904 pollici di diametro interno) nell'altra estremità del tubo. Questo Luer maschio si collegherà al rubinetto della camera di gonfiaggio dell'aria (Step 2.4).
2. Costruzione della camera di gonfiaggio dell'aria (Figura 1C)
- Praticare due fori (circa 4 mm di diametro) in un contenitore di plastica da 500 ml con tappo a vite. I fori dovrebbero avere le stesse dimensioni dei Luers femminili (1.224 pollici di lunghezza, 0.312 pollici di altezza, 0.098 pollici di diametro interno).
NOTA: i contenitori di supporto o tampone vuoti possono essere utilizzati per la camera di gonfiaggio dell'aria. - Rivestire i fili di Luers femmina con produttore di guarnizioni in silicone e posizionare il lato più piccolo nei fori preforati del contenitore.
- Aggiungere il produttore di guarnizioni in silicone attorno ai Luers femmina dove entrano nel contenitore per garantire una tenuta ermetica.
- Avvitare un rubinetto uninodo sul Luer femmina inferiore sulla camera di gonfiaggio dell'aria.
- Tagliare tubi della lunghezza di circa 25 cm e attaccare i Luers maschi alle estremità libere del tubo. Collegare il Luer maschio su un'estremità del tubo al Luer femmina libero sulla camera di gonfiaggio dell'aria. L'altro Luer maschio si collegherà al contenitore per la lavorazione degli animali.
3. Costruzione del contenitore per la lavorazione degli animali (Figura 1D)
- Praticare un foro (circa 4 mm di diametro) sul lato di un grande contenitore di plastica. Il foro dovrebbe essere il diametro del Luer femmina. Il contenitore di plastica è necessario per catturare la soluzione di fissazione in eccesso.
NOTA: è stato utilizzato un contenitore di plastica da 30 cm x 22 cm, 3,8 L. - Rivestire i fili di un Luer femmina con un produttore di guarnizioni in silicone e posizionare il lato più piccolo nel foro preforato del contenitore.
- Aggiungere il produttore di guarnizioni in silicone attorno al Luer femmina dove entra ed esce dal contenitore per garantire una tenuta ermetica.
- Avvitare un rubinetto unino sulla femmina Luer. I tubi della camera di gonfiaggio dell'aria si attaccheranno a questo rubinetto.
4. Preparazione delle soluzioni
- Soluzione di eparina
- Riempire un contenitore con PBS privo di calcio ed eparina (20 U/mL). Preparare un totale di 10 ml di soluzione di eparina per ogni topo. L'eparina è un anticoagulante che impedisce la formazione di coaguli di sangue nei vasi durante la fissazione della perfusione. La soluzione di eparina sarà utilizzata per lavare il sangue dai polmoni prima della fissazione della perfusione.
- Soluzione fissativa
ATTENZIONE: i fissativi possono rappresentare un pericolo per la salute e devono essere utilizzati in una cappa aspirante chimica. Tutti gli apparecchi sono allestiti in una cappa chimica per impedire l'inalazione di fissativi.- Riempire un contenitore con PBS privo di calcio e paraformaldeide (concentrazione finale del 4%). Preparare un totale di 50 ml di soluzione fissativa per ogni mouse.
NOTA: Il tipo di fissativo utilizzato può variare e dipenderà da studi istologici a valle.
- Riempire un contenitore con PBS privo di calcio e paraformaldeide (concentrazione finale del 4%). Preparare un totale di 50 ml di soluzione fissativa per ogni mouse.
5. Preparazione dell'apparecchio di perfusione
NOTA: Una pompa peristaltica è suggerita per l'erogazione di fluidi in vascolarizzazione per garantire una portata costante. Le seguenti indicazioni sono per l'impostazione della pompa peristaltica e possono essere diverse per ogni modello. In alternativa, se una pompa peristaltica non è disponibile, può essere costruito un secondo apparato a colonna d'acqua per perfondere i fluidi da un'altezza di 35 cm H2O.
- Per prima cosa posizionare il tubo attorno al gruppo rullo.
- Fissare il tubo nei montanti dentellati.
- Fissare le leve in posizione posizionando prima la leva sinistra attorno al tubo e fissandola in posizione con la parte superiore e poi con la leva destra.
- Posizionare l'estremità prossimale del tubo nella soluzione di eparina e l'estremità distale nel contenitore di lavorazione degli animali.
- Precaricare la soluzione di eparina nel tubo facendo funzionare la pompa per espellere l'aria dal tubo.
- Fissare un ago da 25G x 5/8" all'estremità del lato sinistro del tubo.
6. Preparazione dell'apparato di gonfiaggio dell'aria
- Posizionare la siringa per la colonna d'acqua in un supporto ad anello.
- Misurare un'altezza verticale di 25 cm dalla piattaforma animale al segno del nastro "25 cm" (passo 1.2) sulla colonna d'acqua.
- Fissare l'estremità del tubo della colonna d'acqua al rubinetto della camera d'aria.
- Attaccare un tubo dal Luer femmina della camera d'aria al rubinetto sul contenitore di lavorazione degli animali.
NOTA: se la camera di gonfiaggio dell'aria è costruita come illustrato nella Figura 1C,il fissaggio del tubo in ordine inverso può causare perdite d'acqua nel tubo che si collega alla cannula tracheale. - Assicurarsi che il tappo della camera d'aria sia ben chiuso.
- Assicurarsi che il rubinetto all'esterno del contenitore per la lavorazione degli animali sia chiuso e che il rubinetto sul tubo che porta dalla colonna d'acqua alla camera di gonfiaggio dell'aria sia aperto.
- Riempire la siringa con acqua fino al segno "25 cm". L'acqua lascerà la siringa attraverso il tubo nella camera d'aria. Una volta equalizzata la pressione, l'acqua smetterà di scorrere.
- È possibile che l'acqua fuoriesca lentamente nella camera di gonfiaggio dell'aria mentre la pressione dell'aria ambiente all'interno del cappuccio chimico fluttua. Tenere d'occhio il livello dell'acqua all'interno della siringa e aggiungerne altri se necessario. Mantenere il livello dell'acqua al segno "25 cm" durante tutta la procedura.
NOTA: Di solito i livelli dell'acqua rimangono costanti per la prima parte del gonfiaggio dell'aria a 25 cmH2O; tuttavia sarà probabile che più acqua debba essere aggiunta alla siringa durante la fissazione. Se l'acqua non smette di scorrere, è probabile che esista una perdita d'aria all'interno della camera di gonfiaggio dell'aria. Potrebbe essere necessario applicare più produttore di guarnizioni in silicone attorno ai Luers per evitare perdite d'aria.
- È possibile che l'acqua fuoriesca lentamente nella camera di gonfiaggio dell'aria mentre la pressione dell'aria ambiente all'interno del cappuccio chimico fluttua. Tenere d'occhio il livello dell'acqua all'interno della siringa e aggiungerne altri se necessario. Mantenere il livello dell'acqua al segno "25 cm" durante tutta la procedura.
7. Preparazione degli animali (Figura 2)
NOTA: questa procedura è stata modificata da Gage et al13. Abbiamo completato questa procedura su topi maschi e femmine adulti di varie età e non notiamo alcun pregiudizio di età o sesso.
- Eutanasia dell'animale con pentobarbital di sodio (150 mg/kg, per via intraperitoneale). Assicurarsi che l'animale sia morto prima di iniziare la dissezione.
NOTA: Mentre questa procedura viene eseguita su animali eutanasizzati, questa procedura può essere eseguita su animali vivi per utilizzare il cuore per pompare perfusi in tutto l'animale. - Fare due incisioni laterali attraverso la parete addominale. Fai la prima incisione sotto la gabbia toracica e la seconda sopra i fianchi. Tagliare lungo la linea mediana dall'incisione inferiore verso l'incisione superiore.
- Usando forbici smussate, fai con attenzione un'incisione nel lato laterale del diaframma. I polmoni dovrebbero collassare non appena il diaframma viene perforato.
NOTA: Bisogna fare attenzione per evitare di perforare i polmoni. Un polmone perforato ha meno probabilità di gonfiarsi durante le fasi successive. - Tagliare trasversalmente lungo il diaframma per aprire la cavità toracica.
- Tagliare superiormente lungo lo sterno dal processo xifoideo alla tacca giugulare e lateralmente sopra la gabbia toracica per esporre completamente il cuore e i polmoni. Fissare i lati della gabbia toracica.
- Fai un'incisione della linea mediana nel collo sopra la trachea. Rimuovere la pelle, i muscoli, la ghiandola tiroidea e il tessuto connettivo che circonda la trachea.
- Usando una pinca curva, fai scorrere due pezzi di filo o sutura sotto la trachea posteriore. Usa un pezzo di sutura per tenere in posizione l'adattatore Luer-stub di gonfiaggio e usa l'altro in definitiva per legare la trachea al termine del gonfiaggio dell'aria e della fissazione della perfusione vascolare.
- Fai un piccolo buco nella trachea usando un ago da 18G x 1 "o forbici a molla Vannas.
- Posizionare un adattatore Luer-stub da 20 G in questo foro nella trachea.
- Legare un filo attorno alla trachea immediatamente distale al punto in cui entra l'adattatore Luer-stub per tenerlo in posizione.
- Trasferire l'animale nel contenitore di lavorazione degli animali.
- Collegare l'adattatore Luer-stub alla femmina Luer all'interno del contenitore per la lavorazione degli animali.
8. Gonfiaggio dell'aria, perfusione e fissazione dei polmoni (Figura 2)
- Posizionare l'ago 25G x 5/8" attaccato al tubo dell'apparato di perfusione nel ventricolo destro del cuore.
- Tagliare l'aorta addominale per consentire al sangue di defluire dal cuore e per promuovere il flusso di perfusate attraverso i polmoni.
- Aprire il rubinetto all'esterno del contenitore di lavorazione degli animali per gonfiare i polmoni.
NOTA: potrebbe essere necessario del tempo prima che i polmoni si gonfino completamente. Guarda il livello dell'acqua nella siringa, non dovrebbe diminuire rapidamente a meno che non ci sia una perdita nei polmoni. - Gonfiare i polmoni a 25 cmH2O per 5 minuti. L'inflazione a 25 cmH2O precondiziona il polmone e aiuta a reclutare regioni polmonari atelette.
NOTA: potrebbe essere necessario aggiungere una piccola quantità di acqua alla siringa per mantenere l'altezza di 25 cm. L'infiammazione e / o la lesione polmonare indotta sperimentalmente possono influenzare l'inflazione dei polmoni. In questo caso, potrebbe essere necessario aumentare la pressione di gonfiaggio fino a un massimo di 35 cmH2O per aiutare a reclutare regioni atelette. - Durante l'ultimo minuto di gonfiaggio polmonare, accendere la pompa peristaltica a una portata di 10 ml / min. La soluzione di eparina dovrebbe fluire dalla bottiglia attraverso il tubo nell'animale.
- L'obiettivo dell'infusione di eparina è prevenire la formazione di trombi nei vasi. Di conseguenza, infondere eparina fino a quando i polmoni diventano bianchi e sono privi di sangue. Se i polmoni non diventano bianchi, può essere necessaria la regolazione dell'ago ventricolare destro.
- Dopo aver gonfiato per 5 minuti, spegnere la pompa peristaltica e commutare il tubo di perfusione dalla soluzione di eparina al fissativo.
- Abbassare la siringa della colonna d'acqua fino al segno "20 cm" (punto 1.3). È normale che le bolle d'aria si muova all'interno della colonna d'acqua quando la pressione varia da 25 a 20 cmH2O.
- Controllare il livello dell'acqua nella siringa. Dovrebbe essere al segno "25 cm". Potrebbe essere necessario aggiungerne altri in questo momento.
- Attendere 1 minuto per consentire ai polmoni di sgonfiarsi da 25 a 20 cmH2O.
- Riavviare la pompa di perfusione a una portata di 6,5 ml/min.
- Correzione della perfusione vascolare per 10 - 15 minuti.
9. Estrazione dei polmoni (Figura 3)
- Legare strettamente il secondo pezzo di filo attorno alla trachea distale all'adattatore Luer-stub. Rimuovere l'adattatore Luer-stub dalla trachea.
- Rimuovere l'ago dal cuore.
- Liberare i polmoni e il cuore dalla cavità toracica tagliando il tessuto connettivo posteriore al mediastino con forbici smussate. Fare attenzione ad evitare di perforare i polmoni.
- Rimuovere con attenzione il cuore dai polmoni.
- Posizionare i polmoni in fissativo durante la notte.
NOTA: La durata delle variazioni fissative dipende dagli studi istologici a valle.- Posizionare i polmoni in un tubo conico da 50 ml contenente 20-25 ml di fissativo. Posizionare il filo che fissa la trachea attraverso l'apertura del tubo conico e fissare per i fili del cappuccio. Invertire il tubo conico per garantire che i polmoni galleggianti e gonfiati ad aria rimangano completamente immersi in fissativo altrimenti galleggieranno verso la parte superiore del liquido.
- Elaborare i polmoni per studi istologici.
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Representative Results
In un torace intatto, i polmoni sono tenuti aperti da forze esterne applicate dalla parete toracica attraverso lo spaziopleurico6,14. Quando il diaframma viene inserito durante la dissezione, l'integrità dello spazio pleurico viene abolita e i polmoni dovrebbero collassare (Figura 2A, 2B). Per ri-espandere i polmoni, viene eseguito il gonfiaggio dell'aria. Come primo passo, vengono applicati 25 cm di pressione dell'acqua per garantire il reclutamento degli spazi aerei collassati. Di conseguenza, quando il rubinetto all'esterno del contenitore per animali viene aperto, l'aria entrerà nei polmoni attraverso la trachea e l'inflazione dovrebbe essere facilmente osservata (Figura 2C). Una volta che i polmoni sono completamente espansi, la pressione di gonfiaggio viene ridotta a 20 cm di pressione dell'acqua (Figura 2D). I 20 cm di pressione dell'acqua sono scelti perché mantengono il gonfiaggio completo dei polmoni ma non distendono eccessivamente gli spazi aerei.
I polmoni devono rimanere gonfiati dopo la legatura tracheale (Figura 3A) e dopo la rimozione dal torace (Figura 3B). La deflazione dei polmoni (Figura 3C) può verificarsi se i polmoni vengono perforati durante la preparazione o l'estrazione degli animali. L'aggiunta di fissativo alla superficie pleurica può aiutare a sigillare perdite minori durante la procedura; tuttavia, il fissativo deve essere applicato con cautela in quanto l'eccesso può far aderire i polmoni alla cavità toracica. Eventuali perdite che non sono sigillate durante la fissazione comporteranno il collasso dei polmoni al momento della rimozione dagli apparati di gonfiaggio dell'aria. La deflazione dei polmoni può verificarsi anche se la trachea non è completamente legata. Quando sono immersi in polmoni fissativi, correttamente gonfiati avranno una maggiore galleggiabilità rispetto ai polmoni sgonfiati.
I polmoni gonfiati possono quindi essere elaborati per analisi istologiche secondo i protocolli stabiliti1,15. Per la Figura 4,i polmoni sono stati elaborati per il sezionamento congelato e colorati con un sistema di colorazione manuale commerciale. Pochissime cellule immunitarie sono presenti nei lumi delle vie aeree del tessuto fissato utilizzando l'inflazione tradizionale a base liquida (Figura 4A). Al contrario, le cellule infiammatorie sono conservate in tutti gli spazi aerei nel tessuto fissato tramite perfusione vascolare con gonfiaggio dell'aria (Figura 4B).
Figura 1: Assemblaggio di apparecchi. A. Assemblaggio completo di tutti gli apparecchi. B. La colonna d'acqua è costituita da una siringa da 60 mL collegata alla camera di gonfiaggio dell'aria tramite 180 tubi in PVC e da un Luer maschio bidirezionale. C. Un contenitore di plastica sigillato da 500 ml è stato utilizzato per costruire la camera di gonfiaggio dell'aria. Il Luer maschio della colonna d'acqua si collega a un rubinetto collegato a un Luer femmina all'interno delle pareti della camera. Un Luer femmina aggiuntivo collega i tubi dalla camera di gonfiaggio dell'aria al contenitore per la lavorazione degli animali. Entrambe le Luers femminili sono rivestite in guarnizioni in silicone per garantire una tenuta ermetica. Due Luers maschi sono collegati a entrambe le estremità del tubo che collega la camera di gonfiaggio dell'aria al contenitore di lavorazione degli animali. D. Gli animali sono attaccati alla camera di gonfiaggio dell'aria attraverso un adattatore per stub Luer da 20 G posizionato attraverso un foro nella trachea. L'adattatore per stub Luer è collegato a un Luer femmina all'interno delle pareti del contenitore per la lavorazione degli animali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione degli animali, collegamento alla camera di gonfiaggio dell'aria e gonfiaggio dei polmoni. A. Dopo l'eutanasia, le cavità peritoneali e toraciche dell'animale sono esposte. La gabbia toracica viene rimossa o bloccata per consentire l'espansione dei polmoni in caso di gonfiaggio. Un adattatore per stub Luer viene inserito in un piccolo foro tagliato nella trachea e fissato con filo o sutura. L'adattatore per stub Luer è collegato a un Luer femmina all'interno della parete della camera di lavorazione degli animali. L'altra estremità del Luer femmina è attaccata a un rubinetto per controllare il flusso d'aria dalla camera di gonfiaggio dell'aria (non mostrato). B. Polmoni collassati prima del gonfiaggio dell'aria. C. I polmoni sono gonfiati a 25 cm di pressione dell'acqua per reclutare regioni atelettasiche. D. Quando la pressione viene modificata alla pressione di fissazione prevista (20 cm di acqua), i polmoni si sgonfiano leggermente. Viene anche raffigurato il posizionamento di un ago 25G x 5/8 nel ventricolo destro per la perfusione-fissazione vascolare del polmone. Tutte le immagini sono fotografie con una risoluzione di 15,9 megapixel e proporzioni 4:3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Estrazione dei polmoni dopo il completamento del gonfiaggio dell'aria con fissazione della perfusione vascolare. A. La trachea viene legata distale all'adattatore Luer stub e i polmoni vengono estratti tagliando il tessuto connettivo posteriore al mediastino. B. Polmoni gonfiati ad aria dopo il completamento procedurale con successo. C. Esempio di polmoni scarsamente gonfiati che sono il risultato di una perdita d'aria che si è verificata all'interno della camera di gonfiaggio dell'aria. Si noti che questi polmoni sono più piccoli dei polmoni gonfiati con successo. Tutte le immagini sono fotografie con una risoluzione di 15,9 megapixel e proporzioni 4:3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto del tessuto polmonare ottenuto per fissazione intratracheale rispetto all'inflazione dell'aria con la fissazione della perfusione vascolare. A. Polmoni preservati dalla fissazione intratracheale. B. Polmoni preservati dal gonfiaggio dell'aria con perfusione-fissazione vascolare. B (inserto). Le frecce mostrano leucociti nelle vie aeree di un polmone fissato dalla perfusione-fissazione vascolare; le stelle evidenziano i leucociti negli alveoli. In confronto, i leucociti sono notevolmente assenti nelle vie aeree dei polmoni fissati per via intratracheale (inserto A) e i leucociti intra-alveolari sono spostati, sembrando essere in stretto contatto con le cellule epiteliali. Abbreviazioni: A- airway, V- vessel. L'ingrandimento delle immagini è 40x con 100x e 200x rispettivamente per gli inserti A e B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene comunemente usati, i metodi di fissazione intratracheali spostano i leucociti dalle vie aeree e possono alterare la normale architettura polmonare. Il metodo di gonfiaggio dell'aria con fissazione della perfusione vascolare fornito in questo protocollo supera queste insidie e preserva più accuratamente l'anatomia polmonare. Le chiavi per ottenere tessuto di alta qualità dal metodo di perfusione-fissazione vascolare includono un attento monitoraggio delle pressioni di gonfiaggio dell'aria, evitando perdite d'aria e garantendo un'adeguata perfusione di fissativo nella vascolarizzazione.
Una limitazione a questa procedura è che quando l'integrità del torace viene interrotta, i polmoni collassano e il reimgonfiaggio dei polmoni dopo il collasso è necessario per un'accurata valutazione istologica. Un'alternativa al protocollo che manterrebbe l'inflazione polmonare senza collasso sarebbe l'uso di un piccolo ventilatore per animali. Tuttavia, tali apparecchiature sono spesso costose e il protocollo qui offre una soluzione economica. Nei polmoni sani, il tensioattivo prodotto dalle cellule epiteliali alveolari aiuta a ridurre la tensione superficiale e nella maggior parte dei casi i polmoni possono essere facilmente ri-espansi. Tuttavia, nei polmoni malati, i tessuti possono essere più rigidi e la funzione dei tensioattivi polmonari può essere alterata, promuovendo il collasso polmonare. Per mitigare questo effetto, le aree collassate possono essere "reclutate" utilizzando pressioni di gonfiaggio dell'aria leggermente più elevate (ad es. 25 cmH2O)5. La pressione può quindi essere ridotta per consentire una leggera sgonfiamento dei polmoni a dimensioni fisiologiche. Nelle nostre mani, una pressione di gonfiaggio di 20 cm di acqua funziona bene. Pressioni superiori a questa possono sovra-distendare gli alveoli e compromettere la perfusione vascolare. Al contrario, le basse pressioni provocano il collasso dello spazio aereo. In modo simile, anche le pressioni di perfusione vascolare devono essere titolate. Pressioni di perfusione eccessive possono distendare i capillari nello spazio alveolare o addirittura danneggiare i capillari e causare edema polmonare4. D'altra parte, se le pressioni di perfusione vascolare sono troppo basse, la perfusione può essere inadeguata. Abbiamo scoperto che portate di 10 ml/min per la soluzione di eparina e di 6,5 ml/min per la soluzione fissativa raggiungono un risultato ottimale.
Il controllo della camera di gonfiaggio dell'aria per le perdite è indispensabile per garantire una pressione di gonfiaggio costante durante la perfusione-fissazione vascolare. Una volta aggiunta acqua alla siringa, dovrebbe fluire sul fondo della camera di gonfiaggio dell'aria fino a quando le pressioni non si equalizzano. Potrebbe essere necessario aggiungere una piccola quantità di acqua aggiuntiva alla siringa per mantenere un'altezza della colonna di 25 cm per il gonfiaggio e 20 cm per la fissazione. Potrebbe essere necessario sostituire il sigillante siliconico se il flusso nella camera di gonfiaggio dell'aria non cessa.
Un'altra causa di perdite d'aria è il danno ai polmoni. Questo si verifica più comunemente durante l'apertura della cavità toracica o durante l'estrazione dei polmoni dal torace. Pertanto, la pratica e la grande cura devono essere prese per evitare di danneggiare il polmone durante la preparazione del topo. Una causa meno comune è la patologia polmonare che deriva da una grave malattia polmonare. Gli indizi sulle perdite d'aria dai polmoni includono lo svuotamento lento dalla colonna di fluido nella siringa, un suono sibile o bolle provenienti dalla superficie polmonare. L'applicazione di una piccola quantità di fissativo ai polmoni nel sito della perdita può aiutare a sigillare piccole perdite; tuttavia alcuni fissativi possono causare aderenza dei polmoni alla cavità toracica e quando il danno polmonare è esteso, i polmoni possono ancora collassare una volta rimossa la pressione dell'aria.
Una volta che le fonti di perdita d'aria sono state valutate e gestite, i polmoni dovrebbero gonfiarsi e rimanere gonfiati durante la fissazione. La trachea deve essere legata sotto la cannula prima della rimozione dall'apparato di gonfiaggio per evitare il collasso. I polmoni possono quindi essere elaborati per studi istologici. L'inflazione dell'aria con perfusione-fissazione vascolare dei polmoni mira a preservare il numero, la morfologia e la posizione delle cellule delle vie aeree, preservando adeguatamente l'architettura polmonare globale per gli studi istologici struttura-funzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) sovvenzioni HL140039 e HL130938. Gli autori desiderano ringraziare Shannon Hott e Jazalle McClendon per la loro competenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
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