Summary
Vorgestellt wird eine Methode zur Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung der Lunge, die die Position von Zellen in Atemwegen, Alveolen und Interstitium für Struktur-Funktions-Analysen bewahrt. Der konstante Atemwegsdruck wird mit einer Luftfüllkammer aufrechterhalten, während das Fixiermittel über den rechten Ventrikel perfundiert wird. Lungen werden für histologische Studien verarbeitet.
Abstract
Die Lungenhistologie wird häufig verwendet, um die Beiträge von Luftraumzellen während der Lungenöostase und krankheitspathogenese zu untersuchen. Häufig verwendete Instillations-basierte Fixierungsmethoden können jedoch Luftraumzellen und Schleim in die terminalen Atemwege verdrängen und die Gewebemorphologie verändern. Im Vergleich dazu sind vaskuläre Perfusionsfixierungstechniken überlegen, um die Position und Morphologie von Zellen innerhalb der Lufträume und der Schleimhaut zu erhalten. Wenn jedoch nicht gleichzeitig ein positiver Atemwegsdruck ausgeübt wird, können Regionen der Lunge kollabieren und Kapillaren können sich in die Alveolarräume wölben, was zu einer Verzerrung der Lungenanatomie führt. Hierin beschreiben wir eine kostengünstige Methode zum Aufblasen der Luft während der vaskulären Perfusionsfixierung, um die Morphologie und Lage von Atemwegs- und Alveolarzellen und Interstitium in murinen Lungen für nachgeschaltete histologische Studien zu erhalten. Konstanter Luftdruck wird über die Luftröhre aus einer versiegelten, luftgefüllten Kammer, die den Druck über eine einstellbare Flüssigkeitssäule aufrechterhält, an die Lunge abgegeben, während das Fixiermittel durch den rechten Ventrikel durchblutet wird.
Introduction
Die Lungenhistologie stellt den Goldstandard für die Beurteilung der Lungenarchitektur während gesundheitlich und krank dar und ist eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge von Lungenforschern1. Einer der kritischsten Aspekte dieser Technik ist die richtige Isolierung und Erhaltung von Lungengewebe, da variabilität in diesem Schritt zu schlechter Gewebequalität und fehlerhaften Ergebnissen führen kann1,2,3. Bei lebenden Tieren wird das Lungenvolumen durch das Gleichgewicht zwischen dem nach innen elastischen Rückstoß der Lunge und den nach außen übertragenen Kräften bestimmt, die von der Brustwand und dem Zwerchfell durch Oberflächenspannung übertragen werden. Dementsprechend gehen beim Eintritt in den Thorax äußere Kräfte verloren und die Lunge kollabiert. Histologische Abschnitte, die aus kollabierten Lungen hergestellt werden, haben ein überfülltes Aussehen und Grenzen zwischen anatomischen Kompartimenten (dh Lufträumen, Gefäßen und Interstitium) können schwer zu unterscheiden sein. Um diese Herausforderung zu umgehen, blasen Forscher die Lunge während der chemischen Fixierung oft auf, so dass die Größe und Architektur des Luftraums erhalten bleibt.
Lungen können mit Luft oder Flüssigkeit aufgeblasen werden. Der Druck, der notwendig ist, um die Lunge auf das gleiche Volumen aufzublasen, unterscheidet sich zwischen Luft- und Flüssigkeitsaufblasen aufgrund von intermolekularen Kräften an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Beim Luftaufblasen ist ein höherer Druck (z. B.25cmH 2 O) erforderlich als beim Flüssigkeitsaufblasen (z. B. 12 cmH2O), um die Oberflächenspannung zu überwinden und die kollabierten Alveolen zu öffnen4. Sobald die Alveolen rekrutiert wurden, kann ein niedrigerer Druck die Alveolen auf das gleiche Volumen wie die Druck-Volumen-Kurve Plateaus offen halten, und die Drücke gleichen sich in der gesamten Lunge nach Pascals Gesetz4,5,6,7,8aus.
Es gibt zwei Hauptmethoden der Lungeninflation und -fixierung, um die mausige Lunge für die Histologie zu erhalten. Am häufigsten werden die Lufträume mit Flüssigkeit eingeträufert - oft mit einem Fixiermittel. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass er relativ einfach ist und wenig Training erfordert. Während die intratracheale Instillation von Fixativmitteln in Studien, die sich auf das Gefäßsystem konzentrieren, bevorzugt werden kann, neigt Flüssigkeit, die über die Luftröhre eingeträufelt wird, dazu, proximale Atemwegszellen und Mucine in distalere Luftraumregionen zudrücken,während die Luftinflation nicht1,3,4,9,10,11. Darüber hinaus verändert die versehentliche Ablösung von Leukozyten vom Epithel während des flüssigen Aufblasens ihre Morphologie und verleiht ihnen künstlich ein einfaches, abgerundetes Aussehen4,10,11,12. Schließlich kann das Aufblasen der Lunge mit Flüssigkeit unbeabsichtigt das Interstitiumkomprimieren 4,10,11. Zusammen können diese Faktoren die normale Anatomie und die Zellulären Verteilungen innerhalb der konservierten Lunge verzerren und so die Technik einschränken.
Eine alternative Methode der Gewebeerhaltung ist die vaskuläre Perfusionsfixierung. Bei dieser Methode wird das Fixiermittel über die Hohlvene oder den rechten Ventrikel in das Lungengefäß perfundiert. Diese Methode bewahrt die Position und Morphologie von Zellen im Luftraumlumen. Wenn die Lunge jedoch während der Perfusionsfixierung nicht aufgeblasen wird, wird das Lungengewebe wahrscheinlich kollabieren.
Luftblasen mit vaskulärer Perfusionsfixierung nutzen die Stärken aus jeder der oben genannten Fixierungstechniken. Hierin stellen wir ein Protokoll für diese Technik zur Verfügung. Die benötigten Materialien und Geräte sind relativ kostengünstig und können leicht beschafft und montiert werden. Der fertige Aufbau, der in Abbildung 1Adargestellt ist, sorgt über eine einstellbare, flüssigkeitsgefüllte Säule für einen konstanten Atemwegsdruck in der Lunge, während eine Peristaltikpumpe das Fixiermittel über den rechten Ventrikel liefert. Lungen mit erhaltener Morphologie können dann für Struktur-Funktions-Analysen weiterverarbeitet werden.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Jewish Health genehmigt.
HINWEIS: Das Protokoll ist in drei Komponenten unterteilt. Die erste Komponente beschreibt den Aufbau der Luftbeblasung mit Perfusions- / Fixationsausrüstung. In einem zweiten Abschnitt wird beschrieben, wie die Ausrüstung für ein Experiment eingerichtet wird. Der letzte Abschnitt beschreibt, wie man das Tier vorbereitet und das Experiment durchführt.
1. Aufbau der Wassersäulenvorrichtung (Abbildung 1B)
- Entfernen Sie den Kolben aus einer 60-ml-Spritze mit Schlupfspitze.
- Befestigen Sie Klebeband um die Spritze bei der 30-ml-Marke. Stellen Sie die Höhe der Spritze auf diese Markierung für den anfänglichen Aufblasdruck von 25 cmH2O ein. Hier sollte auch der Wasserstand in der Säule während des gesamten Verfahrens sein. Beschriften Sie das Band entweder als "25 cm" (wie in Abbildung 1Adargestellt) oder als "Inflation".
HINWEIS: Ein Luftdruck von 25 cmH2O wird verwendet, um die Rekrutierung von eingestürzten Lufträumen zu gewährleisten. Sobald Die Alveolen rekrutiert wurden, wird der Druck auf 20 cmH2O gesenkt, um sicherzustellen, dass die Lufträume nicht aufgebläht werden. - Messen Sie 5 cm vom Band in Richtung des Kolbenendes und befestigen Sie ein weiteres Stück Klebeband an der Spritze. Bewegen Sie die Spritze bis zu dieser Markierung, um den Aufblasdruck während der Fixierung auf20cmH 2 O zu senken. Beschriften Sie das Band entweder als "20 cm" (wie in Abbildung 1Adargestellt) oder als "Fixierung".
- Befestigen Sie 180 Polyvinylchlorid (PVC)-Schläuche am Ende der Slip-Spitze der Spritze. Die Länge des Schlauches ist abhängig vom Abstand zwischen Spritze und Luftaufblaskammer (ca. 25-30 cm).
- Legen Sie ein männliches Luer (2) Faden-T-Shirt (1,219 Zoll Länge, 0,904 Zoll Höhe, 0,0904 Zoll Innendurchmesser) in das andere Ende des Schlauchs. Dieser männliche Luer wird mit dem Absperrhahn der Luftfüllkammer verbunden (Schritt 2.4).
2. Aufbau der Luftfüllkammer (Abbildung 1C)
- Bohren Sie zwei Löcher (ca. 4 mm Durchmesser) in einen 500 mL Kunststoffbehälter mit Schraubkappe. Die Löcher sollten die gleiche Größe wie die weiblichen Luers haben (1,224 Zoll Länge, 0,312 Zoll Höhe, 0,098 Zoll Innendurchmesser).
HINWEIS: Leere Medien oder Pufferbehälter können für die Luftaufblaskammer verwendet werden. - Beschichten Sie die Fäden der Luers mit Silikondichtungsmaschine und legen Sie die kleinere Seite in die vorgebohrten Löcher des Behälters.
- Fügen Sie silikonen Dichtungsmacher um die weiblichen Luers hinzu, wo sie in den Behälter gelangen, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten.
- Schrauben Sie einen Einweg-Absperrhahn an der unteren Luer-Buchse an der Luftfüllkammer an.
- Schneiden Sie Schläuche auf eine Länge von ca. 25 cm und befestigen Sie männliche Luers an den freien Enden des Schlauches. Verbinden Sie den männlichen Luer an einem Ende des Schlauchs mit dem freien weiblichen Luer an der Luftaufblaskammer. Der andere männliche Luer verbindet sich mit dem Tierverarbeitungsbehälter.
3. Aufbau des Tierverarbeitungsbehälters (Abbildung 1D)
- Bohren Sie ein Loch (ca. 4 mm Durchmesser) in die Seite eines großen Kunststoffbehälters. Das Loch sollte den Durchmesser des weiblichen Luer haben. Der Kunststoffbehälter wird benötigt, um überschüssige Fixierungslösung aufzufangen.
HINWEIS: Es wurde ein 30 cm x 22 cm großer, 3,8 l Kunststoff-Aufbewahrungsbehälter verwendet. - Beschichten Sie die Fäden eines Luer-Weibchens mit einem Silikondichtungsmacher und legen Sie die kleinere Seite in das vorgebohrte Loch des Behälters.
- Fügen Sie silikonen Dichtungsmacher um die weibliche Luer hinzu, wo sie in den Behälter ein- und austritt, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten.
- Schrauben Sie einen Einweg-Absperrhahn auf die luer-Hündin. An diesem Absperrhahn werden Schläuche aus der Luftaufblaskammer befestigt.
4. Herstellung von Lösungen
- Heparin-Lösung
- Füllen Sie einen Behälter mit kalziumfreiem PBS und Heparin (20 U/ml). Bereiten Sie insgesamt 10 ml Heparinlösung für jede Maus vor. Heparin ist ein Gerinnungshemmstoff, das verhindert, dass sich während der Perfusionsfixierung Blutgerinnsel in den Gefäßen bilden. Heparinlösung wird verwendet, um Blut aus der Lunge vor der Perfusionsfixierung zu spülen.
- Fixative Lösung
ACHTUNG: Fixiermittel können eine Gesundheitsgefahr darstellen und sollten in einem chemischen Abzug verwendet werden. Alle Geräte sind in einem chemischen Abzug aufgebaut, um das Einatmen von Fixiermitteln zu verhindern.- Füllen Sie einen Behälter mit kalziumfreiem PBS und Paraformaldehyd (4% Endkonzentration). Bereiten Sie insgesamt 50 ml Fixierlösung für jede Maus vor.
HINWEIS: Die Art des verwendeten Fixiermittels kann variieren und hängt von nachgelagerten histologischen Studien ab.
- Füllen Sie einen Behälter mit kalziumfreiem PBS und Paraformaldehyd (4% Endkonzentration). Bereiten Sie insgesamt 50 ml Fixierlösung für jede Maus vor.
5. Herstellung von Perfusionsapparaten
HINWEIS: Für die Abgabe von Flüssigkeiten in die Gefäße wird eine Peristaltikpumpe empfohlen, um eine konstante Durchflussrate zu gewährleisten. Die folgenden Anweisungen gelten für die Einrichtung der Peristaltikpumpe und können für jedes Modell unterschiedlich sein. Alternativ kann, wenn eine Peristaltikpumpe nicht verfügbar ist, eine zweite Wassersäulenvorrichtung konstruiert werden, um Flüssigkeiten aus einer Höhe von 35 cmH2Ozu perfundieren.
- Legen Sie zuerst den Schlauch um die Rollenbaugruppe.
- Befestigen Sie den Schlauch in den eingekerdeten Pfosten.
- Verriegeln Sie die Hebel, indem Sie zuerst den linken Hebel um den Schlauch legen und ihn mit dem oberen und dann dem rechten Hebel an Ort und Stelle besichern.
- Legen Sie das proximale Ende des Schlauches in die Heparinlösung und das distale Ende in den Tierverarbeitungsbehälter.
- Laden Sie die Heparinlösung in den Schlauch vor, indem Sie die Pumpe laufen lassen, um Luft aus dem Schlauch auszustoßen.
- Befestigen Sie eine 25G x 5/8" Nadel am Ende der linken Seite des Schlauches.
6. Herstellung von Luftfüllgeräten
- Legen Sie die Spritze für die Wassersäule in einen Ringhalter.
- Messen Sie eine vertikale Höhe von 25 cm von der Tierplattform bis zur "25 cm" Bandmarkierung (Schritt 1.2) auf der Wassersäule.
- Befestigen Sie das Ende des Rohres der Wassersäule am Absperrhahn der Luftkammer.
- Befestigen Sie ein Rohr vom weiblichen Luer der Luftkammer am Absperrhahn am Tierverarbeitungsbehälter.
HINWEIS: Wenn die Luftaufblaskammer wie in Abbildung 1Cdargestellt aufgebaut ist, kann das Anbringen von Schläuchen in umgekehrter Reihenfolge dazu führen, dass Wasser in den Schlauch austritt, der mit der Trachealkanüle verbunden ist. - Stellen Sie sicher, dass die Kappe zur Luftkammer fest verschlossen ist.
- Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn an der Außenseite des Tierverarbeitungsbehälters geschlossen ist und der Absperrhahn am Schlauch, der von der Wassersäule zur Luftaufblaskammer führt, offen ist.
- Füllen Sie die Spritze mit Wasser bis zur Markierung "25 cm". Wasser verlässt die Spritze durch den Schlauch in die Luftkammer. Sobald der Druck ausgeglichen ist, hört das Wasser auf zu fließen.
- Es ist möglich, dass Wasser langsam in die Luftfüllkammer austritt, da der Umgebungsluftdruck innerhalb der chemischen Haube schwankt. Behalten Sie den Wasserstand in der Spritze im Auge und fügen Sie bei Bedarf weitere hinzu. Halten Sie den Wasserstand während des gesamten Verfahrens auf der Marke "25 cm".
HINWEIS: Normalerweise bleibt der Wasserstand für den ersten Teil der Luftluftluft bei 25 cmH2O konstant; Während der Fixierung muss jedoch wahrscheinlich mehr Wasser in die Spritze einfärbst. Wenn das Wasser nicht aufhört zu fließen, ist es wahrscheinlich, dass ein Luftleck in der Luftfüllkammer besteht. Möglicherweise müssen mehr Silikondichtungshersteller um die Luers herum angebracht werden, um Luftlecks zu vermeiden.
- Es ist möglich, dass Wasser langsam in die Luftfüllkammer austritt, da der Umgebungsluftdruck innerhalb der chemischen Haube schwankt. Behalten Sie den Wasserstand in der Spritze im Auge und fügen Sie bei Bedarf weitere hinzu. Halten Sie den Wasserstand während des gesamten Verfahrens auf der Marke "25 cm".
7. Vorbereitung der Tiere (Abbildung 2)
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde von Gage et al13modifiziert. Wir haben dieses Verfahren an erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen unterschiedlichen Alters abgeschlossen und stellen keine Alters- oder Geschlechtsverzerrung fest.
- Euthanisieren Sie das Tier mit Natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneal). Stellen Sie sicher, dass das Tier tot ist, bevor Sie mit der Dissektion beginnen.
HINWEIS: Während dieses Verfahren an eingeschläferten Tieren durchgeführt wird, kann dieses Verfahren an lebenden Tieren durchgeführt werden, um das Herz zu nutzen, um Perfusate durch das Tier zu pumpen. - Machen Sie zwei seitliche Einschnitte durch die Bauchdecke. Machen Sie den ersten Schnitt unterhalb des Brustkorbs und den zweiten über den Hüften. Schneiden Sie entlang der Mittellinie vom unteren Schnitt zum oberen Schnitt.
- Machen Sie mit einer stumpfen Schere vorsichtig einen Schnitt in die seitliche Seite des Zwerchfells. Die Lunge sollte kollabieren, sobald das Zwerchfell punktiert ist.
HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Lunge nicht punktiert wird. Eine punktierte Lunge ist weniger wahrscheinlich, sich bei späteren Schritten aufzublasen. - Schneiden Sie quer entlang der Membran, um die Brusthöhle zu öffnen.
- Schneiden Sie überlegen entlang des Brustbeins vom Xiphoid-Prozess bis zur jugulären Notch und seitlich über dem Brustkorb, um Herz und Lunge vollständig freizulegen. Stecken Sie die Seiten des Brustkorbs fest.
- Machen Sie einen Mittellinienschnitt im Hals oberhalb der Luftröhre. Entfernen Sie Haut, Muskeln, Schilddrüse und Bindegewebe, das die Luftröhre umgibt.
- Schieben Sie mit einer gekrümmten Zette zwei Gewinde- oder Nahtstücke unter die hintere Luftröhre. Verwenden Sie ein Stück Naht, um den Aufblas-Luer-Stub-Adapter an Ort und Stelle zu halten, und verwenden Sie das andere schließlich, um die Luftröhre am Ende der Luftblase und der vaskulären Perfusionsfixierung abzubinden.
- Stechen Sie ein kleines Loch in die Luftröhre mit einer 18G x 1" Nadel oder Vannas Federschere.
- Stecken Sie einen 20G Luer-Stub-Adapter in dieses Loch in der Luftröhre.
- Binden Sie ein Gewinde um die Luftröhre sofort distal an die Stelle, an die der Luer-Stub-Adapter eintritt, um sie an Ort und Stelle zu halten.
- Das Tier in den Tierverarbeitungsbehälter geben.
- Befestigen Sie den Luer-Stub-Adapter an der weiblichen Luer auf der Innenseite des Tierverarbeitungsbehälters.
8. Luftblasen, Perfusion und Fixierung der Lunge (Abbildung 2)
- Legen Sie die 25G x 5/8 "Nadel, die am Perfusionsapparat befestigt ist, in den rechten Ventrikel des Herzens.
- Schneiden Sie die Bauchaorta ab, damit Blut aus dem Herzen abfließen kann und um den Perfusatfluss durch die Lunge zu fördern.
- Öffnen Sie den Absperrhahn an der Außenseite des Tierverarbeitungsbehälters, um die Lunge aufzublasen.
HINWEIS: Es kann einige Zeit dauern, bis sich die Lunge vollständig aufgeblasen hat. Beobachten Sie den Wasserstand in der Spritze, er sollte nicht schnell abnehmen, es sei denn, es gibt ein Leck in der Lunge. - Blasen Sie die Lunge bei 25 cmH2O für 5 Minuten auf. Eine Inflation bei 25 cmH2O präditioniert die Lunge und hilft bei der Rekrutierung von atelektischen Lungenregionen.
HINWEIS: Möglicherweise muss der Spritze eine kleine Menge Wasser hinzugefügt werden, um die Höhe von 25 cm zu erhalten. Entzündungen und/oder experimentell induzierte Lungenverletzungen können das Aufblasen der Lunge beeinflussen. In diesem Fall kann es erforderlich sein, den Inflationsdruck auf maximal 35 cmH2O zu erhöhen, um die Rekrutierung von atelektischen Regionen zu unterstützen. - Schalten Sie in der letzten Minute der Lungeninflation die Peristaltikpumpe auf eine Durchflussrate von 10 ml/min ein. Heparinlösung sollte aus der Flasche durch den Schlauch in das Tier fließen.
- Das Ziel der Heparinfusion ist es, die Bildung von Thromben in den Gefäßen zu verhindern. Dementsprechend Heparin infundieren, bis die Lunge weiß wird und frei von Blut ist. Wenn die Lunge nicht weiß wird, kann eine Anpassung der rechtsventrikulären Nadel erforderlich sein.
- Nach dem Aufblasen für 5 Minuten die Peristaltikpumpe ausschalten und den Perfusionsschlauch von der Heparinlösung auf das Fixiermittel umstellen.
- Senken Sie die Wassersäulenspritze auf die Markierung "20 cm" (Schritt 1.3). Es ist normal, dass sich Luftblasen innerhalb der Wassersäule bewegen, wenn sich der Druck von 25 auf 20 cmH2O ändert.
- Überprüfen Sie den Wasserstand in der Spritze. Es sollte bei der Marke "25 cm" sein. Es kann erforderlich sein, zu diesem Zeitpunkt weitere hinzuzufügen.
- Warten Sie 1 Minute, damit sich die Lunge von 25 auf 20 cmH2O entleeren kann.
- Starten Sie die Perfusionspumpe mit einer Durchflussrate von 6,5 ml/min neu.
- Vaskuläre Perfusion-Fix für 10 - 15 Minuten.
9. Extraktion der Lunge (Abbildung 3)
- Binden Sie das zweite Stück Gewinde um die Luftröhre distal fest mit dem Luer-Stub-Adapter. Entfernen Sie den Luer-Stub-Adapter aus der Luftröhre.
- Entfernen Sie die Nadel vom Herzen.
- Befreien Sie Lunge und Herz von der Brusthöhle, indem Sie das Bindegewebe posterior zum Mediastinum mit einer stumpfen Schere schneiden. Achten Sie darauf, eine Punktion der Lunge zu vermeiden.
- Entfernen Sie vorsichtig das Herz aus der Lunge.
- Legen Sie die Lunge über Nacht in fixierend.
HINWEIS: Die Dauer des Fixativums hängt von nachgelagerten histologischen Studien ab.- Legen Sie die Lunge in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 20-25 ml Fixiermittel. Legen Sie das Gewinde, das die Luftröhre durch die Öffnung des konischen Rohrs sichert, und befestigen Sie es an den Gewinden der Kappe. Kehren Sie den konischen Schlauch um, um sicherzustellen, dass die schwimmfähigen, luftgeblasenen Lungen vollständig in Fixiermittel getaunken bleiben, da sie sonst an die Spitze der Flüssigkeit schweben.
- Verarbeiten Sie die Lunge für histologische Studien.
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Representative Results
In einem intakten Thorax wird die Lunge durch äußere Kräfte, die von der Brustwand über den Pleuraraum6,14ausgeübtwerden,offen gehalten. Wenn das Zwerchfell während der Dissektion betreten wird, wird die Integrität des Pleuraraums aufgehoben und die Lunge sollte kollabieren (Abbildung 2A, 2B). Um die Lunge wieder zu erweitern, wird ein Luftaufblasen durchgeführt. In einem ersten Schritt werden 25 cm Wasserdruck angewendet, um die Rekrutierung eingestürzter Lufträume zu gewährleisten. Dementsprechend gelangt beim Öffnen des Absperrhahns außerhalb des Tierhaltungsbehälters Luft über die Luftröhre in die Lunge und ein Aufblasen sollte leicht beobachtet werden (Abbildung 2C). Sobald die Lunge vollständig expandiert ist, wird der Aufblasdruck auf 20 cm Wasserdruck gesenkt (Abbildung 2D). Der Wasserdruck von 20 cm wird gewählt, weil er das vollständige Aufblasen der Lunge aufrechterhält, aber die Lufträume nicht überdehnt.
Die Lunge sollte nach der Trachealligatur (Abbildung 3A) und nach der Entfernung aus dem Thorax (Abbildung 3B) aufgeblasen bleiben. Eine Deflation der Lunge (Abbildung 3C) kann auftreten, wenn die Lunge während der tierischen Vorbereitung oder Extraktion punktiert wird. Das Hinzufügen von Fixiermitteln zur Pleuraoberfläche kann helfen, kleinere Lecks während des Verfahrens zu versiegeln. Das Fixiermittel sollte jedoch vorsichtig angewendet werden, da überschüssige Lungen an der Brusthöhle haften können. Alle Lecks, die während der Fixierung nicht versiegelt werden, führen zu kollabierten Lungen, wenn sie aus den Luftfüllgeräten entfernt werden. Eine Deflation der Lunge kann auch auftreten, wenn die Luftröhre nicht vollständig abgebunden ist. Wenn sie in fixative, richtig aufgeblasene Lungen getaunken werden, haben sie einen größeren Auftrieb als entleerte Lungen.
Aufgeblasene Lungen können dann für histologische Analysen nach etablierten Protokollen1,15verarbeitet werden. Für Abbildung 4wurden Lungen für gefrorene Schnitte verarbeitet und mit einem handelsüblichen manuellen Färbesystem gefärbt. Nur sehr wenige Immunzellen sind in den Atemwegslumen von Gewebe vorhanden, das mit herkömmlicher flüssigkeitsbasierter Inflation fixiert wird (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu werden Entzündungszellen in allen Lufträumen im Gewebe konserviert, das durch vaskuläre Perfusion mit Luftblase fixiert wird (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Montage von Apparaten. A. (A). Vollständige Montage aller Apparate. B. Die Wassersäule besteht aus einer 60-ml-Spritze, die über 180 PVC-Schläuche mit der Luftaufblaskammer verbunden ist, und einem Zwei-Wege-Luer. C. (EN) Für den Bau der Luftfüllkammer wurde ein 500 ml versiegelter Kunststoffbehälter verwendet. Der männliche Luer der Wassersäule verbindet sich mit einem Absperrhahn, der mit einem weiblichen Luer innerhalb der Wände der Kammer verbunden ist. Ein zusätzliches Luer-Weibchen verbindet Schläuche von der Luftaufblaskammer mit dem Tierverarbeitungsbehälter. Beide weiblichen Luers sind mit Silikondichtungsmacher beschichtet, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten. Zwei männliche Luer sind an beiden Enden des Schlauches verbunden, der die Luftaufblaskammer mit dem Tierverarbeitungsbehälter verbindet. D. Die Tiere werden durch einen 20G Luer-Stub-Adapter, der durch ein Loch in die Luftröhre gesteckt wird, an der Luftaufblaskammer befestigt. Der Luer-Stub-Adapter wird mit einem weiblichen Luer innerhalb der Wände des Tierverarbeitungsbehälters verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Tierpräparation, Verbindung zur Luftfüllkammer und Aufblasen der Lunge. A. (A). Nach der Euthanasie werden die Peritoneal- und Brusthöhlen des Tieres freigelegt. Der Brustkorb wird entfernt oder festgekleinert, um eine Ausdehnung der Lunge beim Aufblasen zu ermöglichen. Ein Luer-Stummeladapter wird in ein kleines Loch eingeführt, das in die Luftröhre geschnitten und mit Gewinde oder Naht gesichert wird. Der Luer-Stub-Adapter wird mit einem weiblichen Luer innerhalb der Wand der Tierverarbeitungskammer verbunden. Das andere Ende des weiblichen Luer ist an einem Absperrhahn befestigt, um den Luftstrom aus der Luftfüllkammer zu steuern (nicht abgebildet). B. Kollabierte Lunge vor dem Aufblasen der Luft. C. (EN) Die Lungen werden auf 25 cm Wasserdruck aufgeblasen, um atelektronische Regionen zu rekrutieren. D. Wenn der Druck auf den vorgesehenen Fixationsdruck (20 cm Wasser) geändert wird, entleeren sich die Lungen leicht. Ebenfalls abgebildet ist das Einsetzen einer 25G x 5/8 Nadel in den rechten Ventrikel zur vaskulären Perfusionsfixierung der Lunge. Alle Bilder sind Fotos mit einer Auflösung von 15,9 Megapixeln und einem Seitenverhältnis von 4:3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Extraktion der Lunge nach Abschluss der Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung. A. (A). Die Luftröhre wird distal an den Luer-Stub-Adapter gebunden und die Lunge wird extrahiert, indem das Bindegewebe posterior zum Mediastinum geschnitten wird. B. Luftaufgeblasene Lungen nach erfolgreichem Abschluss des Verfahrens. C. (EN) Beispiel für schlecht aufgeblasene Lungen, die aus einem Luftleck resultierten, das in der Luftaufblaskammer auftrat. Beachten Sie, dass diese Lungen kleiner sind als die erfolgreich aufgeblasenen Lungen. Alle Bilder sind Fotos mit einer Auflösung von 15,9 Megapixeln und einem Seitenverhältnis von 4:3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleich von Lungengewebe, das durch intratracheale Fixierung mit Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung erhalten wurde. A. (A). Lungen, die durch intratracheale Fixierung erhalten bleiben. B. Lungen, die durch Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung erhalten bleiben. B (Einschub). Pfeile zeigen Leukozyten in den Atemwegen einer Lunge, die durch vaskuläre Perfusionsfixierung fixiert sind; Sterne heben Leukozyten in den Alveolen hervor. Im Vergleich dazu fehlen Leukozyten insbesondere in den Atemwegen der Lunge, die über den intratrachealen Weg (A-Inset) fixiert sind, und intraalveoläre Leukozyten werden verdrängt, die in engem Kontakt mit Epithelzellen zu stehen scheinen. Abkürzungen: A- Atemweg, V- Schiff. Die Vergrößerung der Bilder ist 40x mit 100x bzw. 200x für A- und B-Einsätze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Obwohl häufig verwendet, verdrängen intratracheale Fixierungsmethoden Leukozyten aus den Atemwegen und können die normale Lungenarchitektur verändern. Die in diesem Protokoll vorgesehene Methode der Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung überwindet diese Fallstricke und bewahrt die Lungenanatomie genauer. Zu den Schlüsseln zur Gewinnung von hochwertigem Gewebe aus der vaskulären Perfusionsfixierungsmethode gehören die sorgfältige Überwachung des Luftfülldrucks, die Vermeidung von Luftlecks und die Sicherstellung einer ausreichenden Durchblutung des Fixativums in das Gefäß.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass, wenn die Integrität des Thorax unterbrochen wird, die Lunge kollabiert und ein erneutes Aufblasen der Lunge nach dem Kollaps für eine genaue histologische Beurteilung erforderlich ist. Eine Alternative zum Protokoll, das die Lungeninflation ohne Kollaps aufrechterhält, wäre die Verwendung eines Kleintierbeatmungsgeräts. Solche Geräte sind jedoch oft teuer, und das Protokoll bietet hier eine kostengünstige Lösung. In gesunden Lungen hilft das von alveolären Epithelzellen produzierte Tensid, die Oberflächenspannung zu reduzieren, und in den meisten Fällen kann die Lunge leicht wieder erweitert werden. In erkrankten Lungen kann das Gewebe jedoch steifer sein und die Funktion des Lungentensids kann verändert werden, was den Lungenkollaps fördert. Um diesen Effekt abzumildern, können kollabierte Bereiche mit etwas höheren Luftaufblasdrücken (d.h. 25 cmH2O)5"rekrutiert" werden. Der Druck kann dann reduziert werden, um eine leichte Deflation der Lunge auf physiologische Größe zu ermöglichen. In unseren Händen funktioniert ein Aufblasdruck von 20 cm Wasser gut. Höhere Drücke können die Alveolen überdehnten und die Gefäßperfusion beeinträchtigen. Umgekehrt führen niedrige Drücke zum Zusammenbruch des Luftraums. In ähnlicher Weise müssen auch vaskuläre Perfusionsdrücke titriert werden. Übermäßiger Perfusionsdruck kann Kapillaren in den Alveolarraum ausblästigen oder sogar die Kapillaren schädigen und Lungenödeme verursachen4. Auf der anderen Seite, wenn der vaskuläre Perfusionsdruck zu niedrig ist, kann die Perfusion unzureichend sein. Wir haben festgestellt, dass Durchflussraten von 10 ml/min für die Heparinlösung und 6,5 ml/min für die fixierende Lösung ein optimales Ergebnis erzielen.
Die Überprüfung der Luftfüllkammer auf Leckagen ist unerlässlich, um einen konstanten Aufblasdruck während der vaskulären Perfusionsfixierung sicherzustellen. Sobald Wasser in die Spritze gegeben wurde, sollte es in den Boden der Luftfüllkammer fließen, bis sich der Druck ausgleicht. Möglicherweise muss der Spritze eine kleine Menge zusätzliches Wasser zugesetzt werden, um eine Säulenhöhe von 25 cm für das Aufblasen und 20 cm für die Fixierung aufrechtzuerhalten. Silikondichtmittel muss möglicherweise ausgetauscht werden, wenn der Durchfluss in die Luftaufblaskammer nicht aufhört.
Eine weitere Ursache für Luftleckagen ist eine Schädigung der Lunge. Dies tritt am häufigsten beim Öffnen der Brusthöhle oder bei der Extraktion der Lunge aus dem Thorax auf. Daher muss Übung und große Sorgfalt darauf geachtet werden, die Lunge während der Mausvorbereitung nicht zu beschädigen. Eine weniger häufige Ursache ist die Lungenpathologie, die aus einer schweren Lungenerkrankung resultiert. Hinweise auf Luftlecks aus der Lunge sind eine langsame Entleerung aus der Flüssigkeitssäule in der Spritze, ein zischendes Geräusch oder Blasen, die von der Lungenoberfläche kommen. Das Auftragen einer kleinen Menge Fixiermittel auf die Lunge an der Stelle des Lecks kann helfen, kleine Lecks zu versiegeln; Bestimmte Fixiermittel können jedoch zu einer Anhaftung der Lunge an der Brusthöhle führen, und wenn die Lungenschädigung groß ist, kann die Lunge immer noch kollabieren, sobald der Luftdruck entfernt wird.
Sobald alle Quellen von Luftleckagen bewertet und verwaltet wurden, sollten sich die Lungen aufblasen und während der Fixierung aufgeblasen bleiben. Die Luftröhre sollte vor dem Entfernen aus dem Aufblasapparat unterhalb der Kanüle ligiert werden, um einen Kollaps zu verhindern. Lungen können dann für histologische Studien verarbeitet werden. Die Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung der Lunge zielt darauf ab, Anzahl, Morphologie und Lage der Atemwegszellen zu erhalten und gleichzeitig die globale Lungenarchitektur für histologische Struktur-Funktionsstudien angemessen zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) mit den Zuschüssen HL140039 und HL130938 finanziert. Die Autoren danken Shannon Hott und Jazalle McClendon für ihre technische Expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
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