Summary
Presenteras är en metod för luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering av lungorna som bevarar placeringen av celler i luftvägarna, alveoli och interstitium för struktur-funktion analyser. Konstant luftvägstryck upprätthålls med en luft-uppblåsningskammare medan fixering genomsyras via rätt ventrikel. Lungor bearbetas för histologic studier.
Abstract
Lung histologi används ofta för att undersöka bidrag från luftrum celler under lung homeostas och sjukdom patogenes. Vanliga instillationsbaserade fixeringsmetoder kan dock tränga undan luftrumsceller och slem till terminala luftvägar och kan förändra vävnadsmorfologin. I jämförelse är vaskulär perfusion-fixering tekniker överlägsen på att bevara platsen och morfologin av celler inom luftrum och slemhinnan foder. Men om positivt luftvägstryck inte appliceras samtidigt kan lungornas regioner kollapsa och kapillärer kan svälla in i de alveolära utrymmena, vilket leder till förvrängning av lunganatomi. Häri beskriver vi en billig metod för luft-inflation under vaskulär perfusion-fixering för att bevara morfologi och plats för luftvägarna och alveolar celler och interstitium i murin lungor för nedströms histologic studier. Konstant lufttryck levereras till lungorna via luftstrupen från en förseglad, luftfylld kammare som upprätthåller trycket via en justerbar vätskekolonn medan fixeringen genomsyras genom rätt ventrikel.
Introduction
Lung histologi representerar guldstandarden för att bedöma lungarkitektur under hälsa och sjukdom och är ett av de vanligaste verktygen av lungforskare1. En av de mest kritiska aspekterna av denna teknik är korrekt isolering och bevarande av lungvävnad, eftersom variation i detta steg kan leda till dålig vävnadskvalitet och felaktiga resultat1,2,3. Hos levande djur bestäms lungvolymen av balansen mellan inåtgående elastisk rekyl i lungan och yttre krafter som överförs från bröstväggen och membranet genom ytspänning. Följaktligen, när bröstkorgen är in, går yttre krafter förlorade och lungan kollapsar. Histologic delar upp förberett från kollapsade lungor har ett trångt utseendemässigt och gränser mellan anatomic kupéer (dvs. luftrum, vasculature, och interstitium) kan vara svåra att skilja. För att kringgå denna utmaning blåser forskare ofta upp lungorna under kemisk fixering så att luftrumsstorlek och arkitektur upprätthålls.
Lungor kan blåsas upp med luft eller vätska. Det tryck som krävs för att blåsa upp lungorna till samma volym skiljer sig mellan luft- och vätskeinflation på grund av intermolecular krafter vid luft-flytande gränssnittet. Högre tryck (t.ex. 25 cmH2O) krävs vid luftinflation än flytande inflation (t.ex. 12 cmH2O) för att övervinna ytspänningen och öppna den kollapsade alveol4. När alveoli har rekryterats kan ett lägre tryck hålla alveolerna öppna för samma volym som tryckvolymkurvplatåerna, och trycket utjämnas i hela lungan enligt Pascals lag4,5,6,7,8.
Två huvudsakliga metoder för lunginflation och fixering finns för att bevara murin lungor för histologi. Oftast är luftrumen ingjutna med vätska - ofta innehållande ett fixativ. Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är att det är relativt enkelt och kräver lite träning. Medan intratrakeal instillation av fixativ kan föredras i studier som fokuserar på vaskulaturen, tenderar vätska som ingjuts via luftstrupen att trycka proximala luftvägsceller och muciner i mer distala luftrumsregioner medan luftinflationeninte 1,3,4,9,10,11. Dessutom förändrar oavsiktlig avskildhet av leukocyter från epitel under flytande inflation deras morfologi, artefaktuellt ger dem ett enkelt, rundat utseende4,10,11,12. Slutligen kan inflationen av lungorna med vätska oavsiktligt komprimera interstitium4,10,11. Tillsammans kan dessa faktorer förvränga den normala anatomin och cellfördelningen i de bevarade lungorna, vilket begränsar tekniken.
En alternativ metod för vävnad bevarande är vaskulär perfusion-fixering. I denna metod perfused fixativ i pulmonell vaskulatur via vena cava eller rätt ventrikel. Denna metod bevarar placeringen och morfologin hos celler i luftrummets lumen. Men om inte lungorna är uppblåsta under perfusion-fixering, lungvävnaden kommer sannolikt att kollapsa.
Luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering utnyttjar styrkor från var och en av ovanstående fixering tekniker. Häri tillhandahåller vi ett protokoll för denna teknik. De material och den utrustning som krävs är relativt billiga och kan enkelt erhållas och monteras. Den färdiga installationen, som visas i figur 1A, ger konstant luftvägstryck till lungorna genom en justerbar, vätskefylld kolonn medan en peristaltisk pump levererar fixativ via rätt ventrikel. Lungor med bevarad morfologi kan sedan bearbetas vidare för strukturfunktionsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) för nationaljudisk hälsa.
Protokollet är organiserat i tre komponenter. Den första komponenten beskriver konstruktionen av luftinflationen med perfusions-/fixeringsutrustning. I ett andra avsnitt beskrivs hur du ställer in utrustningen för ett experiment. Det sista avsnittet beskriver hur man förbereder djuret och utför experimentet.
1. Konstruktion av vattenkolonnapparaturen(figur 1B)
- Ta bort kolven från en 60 ml halkspetsspruta.
- Fäst tejpen runt sprutan vid 30 ml-märket. Ställ sprutans höjd på detta märke för det ursprungliga uppblåsningstrycket på 25 cmH2O. Det är också här vattennivån i kolonnen ska vara under hela proceduren. Märk tejpen antingen som "25 cm" (enligt figur 1A)eller "inflation".
OBS: Ett inflationstryck på 25 cmH2O används för att säkerställa rekrytering av kollapsade luftrum. När alveoli har rekryterats sänks trycket till 20 cmH2O för att säkerställa att luftrummet inte distended. - Mät 5 cm från tejpen mot kolvens ände och fäst en annan bit tejp på sprutan. Flytta sprutan ner till detta märke för att sänka inflationstrycket till 20 cmH2O under fixeringen. Märk tejpen antingen som "20 cm" (enligt figur 1A)eller "fixering".
- Fäst 180 polyvinylkloridrör (PVC) på sprutans halkspets. Slangens längd beror på avståndet mellan sprutan och luftinflationskammaren (ca 25-30 cm).
- Placera en manlig Luer (2) gängstil tee (1.219 inches längd, 0.904 inches höjd, 0.0904 inches innerdiameter) i andra änden av slangen. Denna hane Luer kommer att ansluta till kranen i luftinflationskammaren (steg 2.4).
2. Konstruktion av luftinflationskammaren(figur 1C)
- Borra två hål (ca 4 mm i diameter) i en 500 ml plastbehållare med skruvlock. Hålen ska vara lika stora som de kvinnliga luers (1.224 inches längd, 0.312 inches höjd, 0.098 inches innerdiameter).
OBS: Tomma media- eller buffertbehållare kan användas för luftinflationskammaren. - Täck trådar av kvinnliga luers med silikonpackningstillverkare och placera den mindre sidan i behållarens förborrade hål.
- Tillsätt silikonpackningstillverkaren runt de kvinnliga luers där de kommer in i behållaren för att säkerställa en lufttät tätning.
- Skruva på en enkelvägskran på den nedre kvinnliga Luer på luftinflationskammaren.
- Skär slangarna på ungefär 25 cm och fäst hanen Luers på de fria ändarna av slangen. Anslut den manliga Luer på ena änden av slangen till den fria kvinnliga Luer på luftinflationskammaren. Den andra hanen Luer kommer att ansluta till djurbearbetningsbehållaren.
3. Konstruktion av djurbearbetningsbehållaren(figur 1D)
- Borra ett hål (ca 4 mm diameter) i sidan på en stor plastbehållare. Hålet ska vara diametern på den kvinnliga Luer. Plastbehållaren behövs för att fånga överskottsfixeringslösning.
OBS: En 30 cm x 22 cm, 3,8 L plastbehållare användes. - Täck trådar av en kvinnlig Luer med en silikonpackningstillverkare och placera den mindre sidan i behållarens förborrade hål.
- Tillsätt silikonpackningstillverkaren runt honan Luer där den kommer in och lämnar behållaren för att säkerställa en lufttät tätning.
- Skruva en enkel vägs kran på den kvinnliga Luer. Slangar från luftinflationskammaren fästs på denna kran.
4. Utarbetande av lösningar
- Heparin lösning
- Fyll en behållare med kalciumfri PBS och heparin (20 U/ml). Förbered totalt 10 ml heparinlösning för varje mus. Heparin är ett antikoagulantia som förhindrar att blodproppar bildas i kärlen under perfusionsfixering. Heparinlösning kommer att användas för att spola blod från lungorna före perfusion-fixering.
- Fixativ lösning
VARNING: Fixeringar kan utgöra en hälsorisk och bör användas i en kemisk rökhuv. Alla apparater är uppstärvade i en kemisk rökhuv för att förhindra inandning av fixativ.- Fyll en behållare med kalciumfri PBS och paraformaldehyd (4% slutlig koncentration). Förbered totalt 50 ml fixativ lösning för varje mus.
OBS: Vilken typ av fixativ som används kan variera och beror på histologic studier nedströms.
- Fyll en behållare med kalciumfri PBS och paraformaldehyd (4% slutlig koncentration). Förbered totalt 50 ml fixativ lösning för varje mus.
5. Beredning av perfusionsapparat
OBS: En peristaltisk pump föreslås för leverans av vätskor till vaskulatur för att säkerställa konstant flödeshastighet. Följande anvisningar är till för att ställa in den peristaltiska pumpen och kan vara olika för varje modell. Alternativt, om en peristaltisk pump inte är tillgänglig, kan en andra vattenpelare konstrueras för att granska vätskor från en höjd av 35 cm H2O.
- Placera först slangen runt rullenheten.
- Fäst slangen i de hakade stolparna.
- Lås spakarna på plats genom att först placera vänster spak runt slangen och fästa den på plats med toppen och sedan höger spak.
- Placera den proximala änden av slangen i heparinlösningen och den distala änden i djurbearbetningsbehållaren.
- Förladda heparinlösningen i slangen genom att köra pumpen för att driva ut luft från slangen.
- Fäst en 25G x 5/8" nål på änden av vänster sida av slangen.
6. Förberedelse av luftinflationsapparater
- Placera sprutan för vattenpelaren i en ringhållare.
- Mät en vertikal höjd av 25 cm från djurplattformen till tejpmärket "25 cm" (steg 1.2) på vattenpelaren.
- Fäst änden av vattenpelarens rör på kranen på luftkammaren.
- Fäst ett rör från luftkammarens kvinnliga luer på kranen på djurbearbetningsbehållaren.
OBS: Om luftinflationskammaren är konstruerad enligt figur 1Ckan slangning i omvänd ordning orsaka att vatten läcker in i slangen som ansluts till trakealkanylen. - Se till att locket till luftkammaren är tätt stängt.
- Se till att kranen på utsidan av djurbearbetningsbehållaren är stängd och att kranen på slangen som leder från vattenkolonnen till luftinflationskammaren är öppen.
- Fyll sprutan med vatten till märket "25 cm". Vatten lämnar sprutan genom slangen i luftkammaren. När trycket är utjämnat kommer vattnet att sluta flöda.
- Det är möjligt att vatten långsamt läcker in i luftuppblåsningskammaren när omgivningslufttrycket i den kemiska huven fluktuerar. Håll ett öga på vattennivån i sprutan och tillsätt mer om det behövs. Håll vattennivån vid märket "25 cm" under hela proceduren.
OBS: Vanligtvis kommer vattennivåerna att vara konsekventa under den första delen av luftinflationen vid 25 cmH2O; emellertid mer bevattnar ska troligen att tillfogas till sprutan under fixering. Om vattnet inte slutar strömma är det troligt att det finns en luftläcka i luftinflationskammaren. Mer silikonpackningstillverkare kan behöva appliceras runt Luers för att förhindra luftläckage.
- Det är möjligt att vatten långsamt läcker in i luftuppblåsningskammaren när omgivningslufttrycket i den kemiska huven fluktuerar. Håll ett öga på vattennivån i sprutan och tillsätt mer om det behövs. Håll vattennivån vid märket "25 cm" under hela proceduren.
7. Beredning av djur(figur 2)
OBS: Denna procedur har ändrats från Gage et al13. Vi har slutfört denna procedur på vuxna manliga och kvinnliga möss i olika åldrar och notera ingen ålder eller könsförskjutning.
- Avliva djuret med natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneally.). Se till att djuret är dött innan dissekeringen påbörjas.
OBS: Medan detta förfarande utförs på avlivade djur, kan detta förfarande utföras på levande djur för att använda hjärtat för att pumpa perfusates i hela djuret. - Gör två laterala snitt genom bukväggen. Gör det första snittet under bröstkorgen och det andra ovanför höfterna. Skär längs mittlinjen från det underlägsna snittet mot det överlägsna snittet.
- Använd trubbig sax och gör försiktigt ett snitt i membransidans sidosida. Lungorna ska kollapsa så snart membranet punkteras.
OBS: Var försiktig så att lungorna inte punkteras. En punkterad lunga är mindre benägna att blåsa upp under senare steg. - Skär tvärgående längs membranet för att öppna brösthålan.
- Skär överlägset längs bröstbenet från xiphoidprocessen till halspulsådern och i andra lydnad ovanför revbenskorgen för att helt exponera hjärtat och lungorna. Fäst ribcagesidorna.
- Gör ett mittlinjesnitt i nacken ovanför luftstrupen. Ta bort hud, muskler, sköldkörtel och bindväv som omger luftstrupen.
- Använd böjda tångar och skjut två gängstycken eller suturer under den bakre luftstrupen. Använd en sutur för att hålla uppblåsningsadaptern Luer-stub på plats och använd den andra i slutändan för att binda av luftstrupen i slutet av luftinflation och vaskulär perfusion-fixering.
- Peta ett litet hål i luftstrupen med en 18G x 1" nål eller Vannas fjädersax.
- Placera en 20G Luer-stub adapter i detta hål i luftstrupen.
- Knyt en gänga runt luftstrupen omedelbart distala till den plats där Luer-stub-adaptern kommer in för att hålla den på plats.
- Överför djuret till djurbearbetningsbehållaren.
- Fäst Luer-stub-adaptern på den kvinnliga Luer på insidan av djurbearbetningsbehållaren.
8. Luftinflation, perfusion och fixering av lungorna (figur 2)
- Placera 25G x 5/8" nålen fäst vid perfusionsapparatens slangar i hjärtats högra kammare.
- Skär bukaortan så att blodet kan rinna av från hjärtat och för att främja flödet av perfusat genom lungorna.
- Öppna kranen på utsidan av djurbearbetningsbehållaren för att blåsa upp lungorna.
OBS: Det kan ta tid för lungorna att blåsa upp helt. Titta på vattennivån i sprutan, den bör inte minska snabbt om det inte finns en läcka i lungorna. - Blås upp lungorna vid 25 cmH2O i 5 minuter. Inflationen vid 25 cmH2O förkonditionerar lungan och hjälper till att rekrytera till eltaktiska lungregioner.
OBS: En liten mängd vatten kan behöva tillsättas sprutan för att bibehålla 25 cm höjd. Inflammation och/eller experimentellt inducerad lungskada kan påverka lungornas inflation. I detta fall kan det vara nödvändigt att öka inflationstrycket upp till högst 35 cmH2O för att hjälpa till att rekrytera till elregioner. - Under den sista minuten av lunginflationen, slå på peristaltic pumpen till ett flöde på 10 mL/min. Heparinlösning bör flöda från flaskan genom slangen in i djuret.
- Målet med heparininfusion är att förhindra bildandet av trombi i kärlen. Följaktligen ingjuter heparin tills lungorna blir vita och saknar blod. Om lungorna inte blir vita kan justering av rätt ventrikulär nål vara nödvändig.
- Efter uppblåsthet i 5 minuter, stäng av peristaltic pumpen och växla perfusion slangar från heparin lösningen till fixativet.
- Sänk vattenpelarsprutan till märket "20 cm" (steg 1.3). Det är normalt att luftbubblor rör sig inom vattenpelaren när trycket ändras från 25 till 20 cmH2O.
- Kontrollera vattennivån i sprutan. Den ska vara på "25 cm" -märket. Det kan vara nödvändigt att lägga till mer just nu.
- Vänta i 1 minut för att låta lungorna deflatera från 25 till 20 cmH2O.
- Starta om perfusionspumpen med en flödeshastighet på 6,5 ml/min.
- Vaskulär perfusion-fix i 10-15 minuter.
9. Extraktion av lungor(figur 3)
- Bind tätt den andra tråden runt luftstrupen distalt till Luer-stub-adaptern. Ta bort Luer-stub-adaptern från luftstrupen.
- Ta bort nålen från hjärtat.
- Befria lungorna och hjärtat från brösthålan genom att skära bindväven posterior till mediastinum med trubbig sax. Var noga med att undvika att punktera lungorna.
- Ta försiktigt bort hjärtat från lungorna.
- Placera lungorna i fixativ över natten.
OBS: Varaktigheten av fixativ varierar beror på nedströms histologic studier.- Placera lungorna i ett 50 ml koniskt rör som innehåller 20-25 ml fixativ. Placera gängan som säkrar luftstrupen genom öppningen av det koniska röret och säkras genom lockets gängor. Vänd det koniska röret för att säkerställa att de flytande, luftpumpade lungorna förblir helt nedsänkta i fixativ annars kommer de att flyta till toppen av vätskan.
- Bearbeta lungorna för histologic studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en intakt bröstkorg hålls lungorna öppna av yttre krafter som appliceras av bröstväggen via pleurautrymmet6,14. När membranet förs in under dissekeringen avskaffas pleurautrymmets integritet och lungorna kollapsar (figur 2A,2B). För att expandera lungorna igen utförs luftinflationen. Som ett första steg tillämpas 25 cm vattentryck för att säkerställa rekrytering av kollapsade luftrum. När kranen utanför djurhållningsbehållaren öppnas kommer luft därför in i lungorna via luftstrupen och inflationen bör lätt observeras (figur 2C). När lungorna är helt utbyggda sänks inflationstrycket till 20 cm vattentryck (Figur 2D). Det 20 cm långa vattentrycket väljs eftersom det upprätthåller fullständig inflation av lungorna men inte överdriver luftrummet.
Lungorna ska förbli uppblåsta efter trakeal ligatur (figur 3A) och efter avlägsnande från bröstkorgen (figur 3B). Deflation av lungor (figur 3C) kan uppstå om lungorna punkteras under djurberedning eller extraktion. Att lägga till fixering på pleuraytan kan hjälpa till att försegla mindre läckor under proceduren; Fixativ bör dock appliceras försiktigt eftersom överskott kan klibba lungorna på brösthålan. Eventuella läckor som inte förseglas under fixeringen kommer att resultera i kollapsade lungor vid avlägsnande från luftinflationsapparaterna. Deflation av lungorna kan också uppstå om luftstrupen inte är helt bunden. När de är nedsänkta i fixativa, korrekt uppblåsta lungor kommer att ha större flytkraft än deflaterade lungor.
Uppblåsta lungor kan sedan bearbetas för histologiska analyser enligt etablerade protokoll1,15. För figur 4bearbetades lungorna för fryst sektionering och färgades med ett kommersiellt manuellt färgningssystem. Mycket få immunceller finns i luftvägslummen av vävnad fixerad med traditionell vätskebaserad inflation (Figur 4A). Däremot bevaras inflammatoriska celler i hela luftrummet i vävnad som fixeras via vaskulär perfusion med luftinflation (Figur 4B).
Figur 1: Montering av apparater. A. Full montering av alla apparater. B. Jag är inte så bra på Vattenkolonnen består av en 60 ml spruta ansluten till luftinflationskammaren via 180 PVC-slangar och en tvåvägs hane Luer. C. En 500 ml förseglad plastbehållare användes för att konstruera luftinflationskammaren. Vattenkolonnens manliga Luer ansluter till en kran ansluten till en kvinnlig Luer innanför kammarens väggar. En extra hona Luer förbinder slangar från luftinflationskammaren till djurbearbetningsbehållaren. Båda honan Luers är belagda med silikonpackningstillverkare för att säkerställa en lufttät tätning. Två hanlurar är anslutna till båda ändarna av slangar som förbinder luftinflationskammaren med djurbearbetningsbehållaren. D. Jag är inte så bra på Djur är fästa vid luftinflationskammaren genom en 20G Luer stub adapter placerad genom ett hål i luftstrupen. Luer stub adapter är ansluten till en kvinnlig Luer innanför väggarna i djurbearbetningsbehållaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Djurberedning, anslutning till luftinflationskammaren och inflation av lungor. A. Efter dödshjälp exponeras djurets peritoneal och brösthålor. Revbenskorgen avlägsnas eller fästs ner för att möjliggöra expansion av lungorna vid uppblåsning. En Luer stub adapter sätts in i ett litet hål skärs i luftstrupen och säkras med tråd eller sutur. Luer stub adapter är ansluten till en kvinnlig Luer inuti väggen i djurbearbetningskammaren. Den andra änden av honan Luer är fäst vid en kran för att styra luftflödet från luftinflationskammaren (visas inte). B. Jag är inte så bra på Kollapsade lungor före luftinflation. C. Lungorna är uppblåsta till 25 cm vattentryck för att rekrytera atelekta regioner. D. Jag är inte så bra på När trycket ändras till det avsedda fixeringstrycket (20 cm vatten) deflaterar lungorna något. Också avbildad är placering av en 25G x 5/8 nål i rätt ventrikel för vaskulär perfusion-fixering av lungan. Alla bilder är fotografier med en upplösning på 15,9 megapixel och vid 4:3-bildförhållandet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Extraktion av lungor efter avslutad luftinflation med vaskulär perfusionsfixering. A. Luftstrupen är bunden av distala till Luer stub adapter och lungor extraheras genom att skära bindväven bakre till mediastinum. B. Jag är inte så bra på Luft-uppblåsta lungor efter framgångsrika förfarande slutförande. C. Exempel på dåligt uppblåsta lungor som berodde på en luftläcka som inträffade i luftinflationskammaren. Observera att dessa lungor är mindre än de framgångsrikt uppblåsta lungorna. Alla bilder är fotografier med en upplösning på 15,9 megapixel och vid 4:3-bildförhållandet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Jämförelse av lungvävnad som erhålls genom intratrakealbaserad fixering jämfört med luftinflation med vaskulär perfusion-fixering. A. Lungor bevaras genom intratrakeal-baserad fixering. B. Jag är inte så bra på Lungor bevaras av luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering. B (inset). Pilar visar leukocyter i luftvägarna i en lunga fixerad av vaskulär perfusion-fixering; stjärnor framhäva leukocyter i alveolerna. I jämförelse är leukocyter särskilt frånvarande i luftvägarna i lungorna som fixeras via intratrakealvägen (A infälld) och intraalveolära leukocyter förskjuts, som verkar vara i nära kontakt med epitelceller. Förkortningar: A- luftvägar, V- fartyg. Förstoring av bilder är 40x med 100x respektive 200x för A- respektive B-insets. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om ofta används, intratrakeal-baserade fixering metoder förskjuta leukocyter från luftvägarna och kan ändra normala lung arkitektur. Metoden för luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering som tillhandahålls i detta protokoll övervinner dessa fallgropar och mer exakt bevarar lunganatomi. Nycklarna till att få högkvalitativ vävnad från kärlperfusion-fixeringsmetoden inkluderar noggrann övervakning av luft-inflation tryck, undvika luftläckor och säkerställa adekvat perfusion av fixativ i vaskulaturen.
En begränsning till detta förfarande är att när bröstkorgens integritet avbryts, kollapsar lungorna och återinflationen av lungorna efter kollaps är nödvändigt för noggrann histologisk bedömning. Ett alternativ till protokollet som skulle upprätthålla lunginflation utan kollaps skulle vara användningen av en liten djurventilator. Sådan utrustning är dock ofta dyr, och protokollet här erbjuder en billig lösning. I friska lungor bidrar tensid som produceras av alveolära epitelceller till att minska ytspänningen, och i de flesta fall kan lungorna lätt utökas. Men i sjuka lungor kan vävnader vara styvare och lungsurfaktantfunktionen kan ändras, vilket främjar lungkollaps. För att mildra denna effekt kan kollapsade områden "rekryteras" med något högre luftinflationstryck (dvs. 25 cmH2O)5. Trycket kan sedan minskas för att möjliggöra liten deflation av lungorna till fysiologisk storlek. I våra händer fungerar ett inflationstryck på 20 cm vatten bra. Tryck högre än detta kan överdistera alveol och försämra vaskulär perfusion. Omvänt leder lågtryck till att luftrummet kollapsar. Längs liknande linjer måste vaskulär perfusionstryck också titreras. Överdrivet perfusionstryck kan distend kapillärer i det alveolära utrymmet eller till och med skada kapillärerna och orsaka lungödem4. Å andra sidan, om vaskulär perfusion tryck är för låg, perfusion kan vara otillräcklig. Vi har funnit att flödeshastigheter på 10 ml/min för heparinlösningen och 6,5 ml/min för fixeringslösningen ger ett optimalt resultat.
Kontroll av luftinflationskammaren efter läckor är absolut nödvändigt för att säkerställa konstant uppblåsningstryck under vaskulär perfusion-fixering. När vatten tillsätts sprutan ska det strömma in i botten av luftinflationskammaren tills trycket är utjämnat. En liten mängd extra vatten kan behöva tillsättas sprutan för att bibehålla en kolonnhöjd på 25 cm för uppblåsning och 20 cm för fixering. Silikontätningsmedel kan behöva bytas ut om flödet till luftinflationskammaren inte upphör.
En annan orsak till luftläckage är skador på lungorna. Detta inträffar oftast under öppnandet av brösthålan eller under extraktion av lungorna från bröstkorgen. Således måste övning och stor försiktighet vidtas för att undvika att skada lungan under musberedning. En mindre vanlig orsak är lungpatologi som är resultatet av svår lungsjukdom. Ledtrådar till luftläckor från lungorna inkluderar långsam tömning från vätskekolonnen i sprutan, ett väsande ljud eller bubblor som kommer från lungytan. Att applicera en liten mängd fixering vid lungorna på platsen för läckan kan hjälpa till att försegla små läckor; Vissa fixativ kan dock orsaka vidhäftning av lungorna till brösthålan och när lungskadorna är omfattande kan lungorna fortfarande kollapsa när lufttrycket har avlägsnats.
När några källor till luftläckage har bedömts och hanterats, bör lungorna blåsas upp och förbli uppblåsta under fixeringen. Luftstrupen ska ligateras under kanylen innan den avlägsnas från uppblåsningsapparaten för att förhindra kollaps. Lungor kan sedan bearbetas för histologic studier. Luft-inflation med vaskulär perfusion-fixering av lungor syftar till att bevara siffror, morfologi och placering av luftvägarna celler samtidigt bevarar på ett adekvat sätt globala lung arkitektur för histologic struktur-funktion studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) beviljar HL140039 och HL130938. Författarna vill tacka Shannon Hott och Jazalle McClendon för deras tekniska expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S.
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I.
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A.
