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Developmental Biology

सिंड्रोम से जुड़े न्यूरोलॉजिकल घाटे के डाउनस्ट्रीम मॉडलिंग के लिए टर्नर सिंड्रोम (45XO) भ्रूण कोशिकाओं से प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल न्यूक्लियोफेक्शन द्वारा एपिसोमल प्लाज्मिड्स के वितरण के माध्यम से भ्रूण ऊतक फाइब्रोब्लास्ट से एकीकरण मुक्त आईपीएससी की पीढ़ी का वर्णन करता है जिसके बाद आईपीएससी लक्षण वर्णन और न्यूरोनल भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का विवरण होता है।

Abstract

क्रोमोसोमल एन्यूप्लॉइडीज केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकृतियों और भ्रूण की मौत सहित गंभीर जन्मजात विकृतियों का कारण बनता है। प्रसव पूर्व आनुवंशिक स्क्रीनिंग विशुद्ध रूप से नैदानिक है और रोग तंत्र स्पष्ट नहीं करता है । यद्यपि एन्यूप्लाइड भ्रूण से कोशिकाएं क्रोमोसोमल एन्यूप्लाइडी वाले मूल्यवान जैविक सामग्री हैं, इन कोशिकाओं को कम रहता है, जो डाउनस्ट्रीम अनुसंधान प्रयोगों के लिए उनके उपयोग को सीमित करता है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) मॉडल की पीढ़ी एन्यूप्लाइड लक्षणों के सतत संरक्षण के लिए सेल तैयार करने का एक प्रभावी तरीका है। वे आत्म नवीनीकरण कर रहे है और भ्रूण के विकास की याद ताजा विशेष कोशिकाओं में अंतर । इस प्रकार, आईपीएससी प्रारंभिक विकासात्मक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम करते हैं। टर्नर सिंड्रोम (टीएस) एक दुर्लभ स्थिति है जो पूरी तरह से या आंशिक रूप से लापता एक्स गुणसूत्र से जुड़ी है। सिंड्रोम बांझपन, छोटे कद, अंतःस्रावी, मेटाबोलिक, ऑटोइम्यून और हृदय विकारों और न्यूरोकॉग्निटिव दोषों की विशेषता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल टीएस (45XO) भ्रूण ऊतक से फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और खेती का वर्णन करता है, लक्षण वर्णन के बाद नाभिक द्वारा एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग प्लाज्मिड्स के वितरण के माध्यम से एकीकरण मुक्त TSiPSCs का उत्पादन। रीप्रोग्रामिंग टीएसआईपीएससी की शुरुआत में लाइव सेल क्षारीय फॉस्फेटस स्टेनिंग द्वारा जांच की गई थी जिसके बाद प्लुरिपोटेंसी बायोमार्कर के लिए व्यापक जांच की गई थी। चयनित उपनिवेशों को यांत्रिक रूप से विच्छेदित किया गया था, कई बार पारित किया गया था और आगे के प्रयोगों के लिए स्थिर आत्म-नवीनीकरण कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं ने pluripotency प्रतिलेखन कारकों OCT4, NANOG, SOX2, सेल सतह मार्कर SSEA 4 और TRA1-81 pluripotent स्टेम सेल के विशिष्ट व्यक्त किए । मूल 45XO कारियोटाइप को रीप्रोग्रामिंग के बाद बरकरार रखा गया था। TSiPSCs भ्रूण निकायों के रूप में और endoderm, मेसोडर्म और ectoderm वंश विशिष्ट बायोमार्कर ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR भारी CHAINα/β), (यानीIIII TUBULIN)) व्यक्त की कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम थे । एक्सोजेनस एपिसोमल प्लाज्मिड अनायास खो गए थे और कोशिकाओं में 15 पारित होने के बाद पता नहीं चला। ये TSiPSCs दोषपूर्ण आणविक और सेलुलर न्यूरोडेवलपमेंट मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान सेलुलर संसाधन हैं जो टर्नर सिंड्रोम से जुड़े न्यूरोकॉग्निटिव घाटे के कारण होते हैं।

Introduction

एन्यूप्लाइडीज से मनुष्यों में जन्म दोष/जन्मजात विकृतियां और गर्भावस्था में कमी होती है । ~ 50%-गर्भावस्था के नुकसान से नमूनों का 70% साइटोजनेटिक असामान्यताओं को दर्शाता है। गर्भावस्था में जल्दी खो एन्यूप्लाइड भ्रूण आसानी से प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए प्राप्त नहीं किया जा सकता है अंय मॉडलों को विकसित करने की आवश्यकता को बढ़ाने के बारीकी से मानव भ्रूणजीने की क्षमता का प्रतिनिधित्व । आनुवंशिक विकारों से उत्पन्न कोशिकाओं से प्राप्त प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग प्रतिनिधि आनुवंशिक अनियमितताओं और भ्रूण के विकास पर उनके परिणाम को मॉडल करने के लिए किया गया है1,2,3,4. ये आईपीएससी विकासशील भ्रूण की एपिब्लास्ट कोशिकाओं के समान हैं और भ्रूण गठन की प्रारंभिक घटनाओं को फिर से ड्जेनेट कर सकते हैं। वे शुरुआती स्तनधारी भ्रूण में सेल वंश और पैटर्निंग के विकास कार्यक्रम की समझ और लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं। आईपीएससी पहले त्वचा फाइब्रोब्लास्ट और एम्निओसाइट्स से मोनोसोमी एक्स (टर्नर सिंड्रोम), ट्राइसोमी 8 (स्कैंसी सिंड्रोम 2), ट्राइसोमी 13 (पटाउ सिंड्रोम) और आंशिक ट्राइसोमी 11 जैसे एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम के जन्म के पूर्व नैदानिक परीक्षणों से प्राप्त हुआ; 22 (एमानुएल सिंड्रोम) ने विफल विकास के बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है4।

टर्नर सिंड्रोम (टीएस) एक दुर्लभ स्थिति है जो महिला बांझपन, छोटे कद, अंतःस्रावी और मेटाबोलिक विकारों, ऑटोइम्यून रोग का खतरा बढ़ जाती है, और हृदय रोग5के लिए एक गड़बड़ी की विशेषता है। यद्यपि यह एकमात्र जीवित मोनोसोमी सिंड्रोम है , लेकिन यह विकासशील भ्रूण के लिए भी घातक है जिससे सहज गर्भपात होता है6. टीएस के साथ जीवित व्यक्तियों को उनकी कोशिकाओं में एक्स-क्रोमोसोमल सामग्री के परिवर्तन की डिग्री के साथ मौजूद है । कायोटाइप एक एक्स क्रोमोसोम (45,XO) के पूर्ण नुकसान से लेकर 45,XO/46,XX जैसे मोज़ेक तक; 45,XO/47,XXX, रिंग क्रोमोसोम की उपस्थिति, वाई-क्रोमोसोमल सामग्री की उपस्थिति, आदि5।

सिंड्रोम का निदान आम तौर पर रोगसूचक व्यक्तियों और कोरियोनिक विली नमूना (सीवीएस) के रक्त को जल्दी एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम का पता लगाने के लिए किया जाता है। चूंकि एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम सहज गर्भपात के ~ 30% के लिए खाते हैं, इसलिए सहज गर्भपात पर गर्भाधान (पीओसी) के उत्पाद को कैरियोटाइप करना नियमित है। कोरियोनिक विली सहित ये भ्रूण कोशिकाएं साइटोजेनेटिक असामान्यता और उनसे प्राप्त आईपीएससी एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम4,6का अध्ययन करने के लिए जैविक सामग्री का एक मूल्यवान स्रोत प्रदान करती हैं । टीएस आईपीएससी को पहले रेट्रोवायरल रिप्रोग्रामिंग4के माध्यम से एम्निओसाइट्स से स्थापित किया गया है, कोरियोनिक विलाली के फाइब्रोब्लास्ट (जन्म के पूर्व निदान के माध्यम से प्राप्त) रेट्रोवायरल रिप्रोग्रामिंग6के माध्यम से, रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से7 सेंडेई वायरस रिप्रोग्रामिंग के माध्यम से और टीएस व्यक्तियों की त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से4 . चूंकि हमारी प्रयोगशाला का प्राथमिक ध्यान विकास की विफलता को समझना है, इसलिए हमने पीओसी से टीएस आईपीएससी उत्पन्न किया है, विशेष रूप से एक सहज गर्भपात8का कोरियोनिक विली घटक। इस भ्रूण ऊतक से अलग सभी कोशिकाओं में एक 45XO कारियोटाइप था और एक ही karyotype के साथ आईपीएससी मिले । ये आईपीएससी अद्वितीय हैं क्योंकि वे सबसे पहले गर्भपात किए गए भ्रूण से उत्पन्न होते हैं और एन्यूप्लाइडी संबंधित गर्भावस्था विफलताओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करते हैं। यह लेख एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग के माध्यम से इस अद्वितीय सेल स्रोत से आईपीएससी की पीढ़ी की विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है।

आईपीएससी पीढ़ी के शुरुआती तरीकों ने रीप्रोग्रामिंग कारकों को वितरित करने के लिए वायरल ट्रांसडक्शन और ट्रांसपोसंस का उपयोग किया। कोशिकाओं को बहुलता में उत्प्रेरण करने के तरीके रेट्रोवायरल वैक्टर9,उत्तेजनीय लेंटीवायरल वैक्टर10, 11 और ट्रांसपोसन आधारित तरीकों 12 को गैर-एकीकृत करने वाले एडेनोविराल वैक्टर13 और सेंडाइ वायरस आधारित वैक्टर14 का उपयोग करने से विकसित हुए हैं। रेट्रोवायरल और लेंटीवायरल आधारित रीप्रोग्रामिंग, हालांकि कुशल, मेजबान गुणसूत्रों में पुनर्प्रोग्रामिंग कारकों का एकीकरण शामिल है, जिससे सम्मिलन उत्परिवर्तन होते हैं जिनका आईपीएससी में अप्रत्याशित प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, वायरल आधारित पुनर्प्रोग्रामिंग आईपीएससी के अनुवादात्मक अनुप्रयोग को रोकता है। वायरस और डीएनए ट्रांसफेक्शन के इस्तेमाल से जुड़े संभावित जोखिमों को पूरी तरह से खत्म करने के लिए आरएनए बेस्ड सिस्टम15 और डायरेक्ट प्रोटीन डिलिवरी16 का पता लगाया गया है । हालांकि, इन तरीकों अक्षम साबित कर दिया है ।

2011 में, ओकिटा एट अल ने श्र्ना के माध्यम से टीपी 53 दमन के साथ संवर्धित एपिसोमल प्लाज्मिड्स द्वारा पुनर्प्रोग्रामिंग की बेहतर दक्षता की सूचना दी। उन्होंने एचएसएससी की सुरक्षा बढ़ाने के लिए सीएसवाईसी को गैर-ट्रांसफॉर्मिंग एलएमवाईसी (स्मॉल सेल लंग कार्सिनोमा एसोसिएटेड MYC) के साथ भी बदल दिया । ये एपिसोमल प्लाज्मिड्स 5 रीप्रोग्रामिंग कारक व्यक्त करते हैं: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC और TP5317,18के लिए shRNA । इन वैक्टरों को अतिरिक्त गुणसूत्रों को बनाए रखा जाता है और निरंतर संस्कृति पर पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं से खो दिया जाता है, इस प्रकार 10-15 मार्गों के भीतर लाइनों को ट्रांसजेन-मुक्त बना दिया जाता है। न्यूक्लियोफेक्शन इलेक्ट्रोपॉनेशन का एक विशेष रूप है जो सीधे मेजबान कोशिकाओं के नाभिक में न्यूक्लिक एसिड बचाता है। यह विभिन्न सेल प्रकारों में पुनर्प्रोग्रामिंग प्लाज्मिड के वितरण के लिए एक कुशल विधि है। एपिसोमल प्लाज्मिड लागत प्रभावी होते हैं और नाभिक की उच्च लागत की भरपाई करते हैं। यह विधि विभिन्न प्रकार की दैहिक कोशिकाओं से स्थिर आईपीएससी उपज अनुकूलित स्थितियों के तहत कुशल और प्रजनन योग्य है। इस प्रोटोकॉल में, हम एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग प्लाज्मिड के नाभिक द्वारा भ्रूण ऊतक से अलग फाइब्रोब्लास्ट से आईपीएससी के उत्पादन के लिए विधि का वर्णन करते हैं। यहां भ्रूण कोरियोनिक विली, प्लाज्मिड शुद्धिकरण, न्यूक्लियोफेक्शन, पुनर्प्रोग्रामिंग प्लेट से उपनिवेशों को चुनने और स्थिर आईपीएससी की स्थापना से फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल दिए गए हैं।

नए उत्पन्न आईपीएससी में pluripotency लक्षणों की उपस्थिति की पुष्टि करना आवश्यक है। इसमें पूर्णाधिकारी से संबंधित कारकों का प्रदर्शन शामिल है (उदाहरण के लिए, क्षारीय फॉस्फेट अभिव्यक्ति, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, ई-cadherin; आमतौर पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस या जीन अभिव्यक्ति परख के साथ दिखाया गया है), विट्रो भेदभाव में द्वारा तीन रोगाणु परतों की पहचान उनके भेदभाव क्षमता को मान्य करने के लिए, क्रोमोसोमल सामग्री निर्धारित करने के लिए karyotyping, माता-पिता की कोशिकाओं के साथ पहचान स्थापित करने के लिए स्ट्रक्य टाइपिंग, और वीवो में अधिक कठोर जैसे टेराटोमा गठन और टेट्राप्लॉयड पूरक। यहां हम कायोटाइपिंग के लक्षण वर्णन प्रोटोकॉल, जीवित कोशिकाओं क्षारीय फॉस्फेट धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्लूपपोती से संबंधित बायोमार्कर का पता लगाने, इन विट्रो भेदभाव परख और एक्सोजेनस जीन19के नुकसान को प्रदर्शित करने की विधि का वर्णन करते हैं।

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Protocol

एफसीवी मणिपाल अस्पताल की अनुमोदन समिति के तहत मणिपाल अस्पताल, बेंगलुरु से प्राप्त किया गया था।

नोट: सभी बफ़र्स और समाधानों की संरचना के लिए तालिका 1 देखें।

1. भ्रूण कोरियोनिक विली (एफसीवी) से फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

  1. कोलेजनेस में नमूना संग्रह और ऊतक विघटन
    1. सेल संस्कृति सुविधा के लिए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) और परिवहन (कमरे के तापमान पर) में बाँझ परिस्थितियों में एफसीवी लीजिए।
    2. विली को 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और 1x एंटीबायोटिक एंटीमायकोटिक समाधान (पीबीएस-एए) वाले पीबीएस में कई बार (न्यूनतम 4 गुना) धोएं। पीबीएस-एए को पूरी तरह से पाइपिंग करके हटा दें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1 एमएल कोलेजनास ब्लेंड (5 मिलीग्राम/एमएल) के साथ कोरियोनिक विली का इलाज करें।
    4. सेल संस्कृति माध्यम के साथ बेअसर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), एक 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए 225 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए विघटित विली और एक गोली के रूप में जारी कोशिकाओं को पचाने।
  2. उपसंस्कृति और स्टॉक विस्तार
    1. प्लेट विघटित विली एक टी-25 संस्कृति फ्लास्क में जारी कोशिकाओं के साथ पूर्ण मीडिया (जैसे, AmnioMAX) के 5 एमएल युक्त है और एक शांत फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति प्राप्त होने तक बढ़ती है।
    2. बाद के ट्रांसफैक्शन और लक्षण वर्णन प्रयोगों में उपयोग के लिए स्टॉक तैयार करने के लिए संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट का विस्तार करें:
      1. कोशिकाओं को अलग करने के लिए 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एफसीवी फाइब्रोब्लास्ट और इनक्यूबेट युक्त टी-25 फ्लास्क में 0.05% ट्राइप्सिन का 2 मिलियन प्लासिन जोड़ें।
      2. इनक्यूबेशन के बाद, एफबीएस (ट्राइप्सिन के समान मात्रा में) जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें।
        नोट: एफबीएस युक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए भी किया जा सकता है, जब 1:3 ट्राइप्सिन में जोड़ा जाता है: मीडिया अनुपात।
      3. सेल पेलेट प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में 225 x ग्राम पर अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
      4. पूर्ण मीडिया के 1 एमसीएल में डेजेंट सुपरनेट और रिसिपेंड सेल पेलेट।
      5. 60 मिमी ऊतक संस्कृति-उपचारित व्यंजनों में प्रत्येक 500 माइक्रोन स्थानांतरित करें और वॉल्यूम को 5 एमएल तक बनाएं। 1:2 के इस बंटवारे के अनुपात, भी बाद के मार्ग के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
  3. क्रायोप्रिजर्वेशन
    1. चरण 1.2.2.1 - 1.2.2.3 में वर्णित 0.05% ट्राइप्सिन का उपयोग करके एंजाइमेटिक वियोजन करें और सेल पेलेट प्राप्त करें।
    2. सुपरनैंट को त्यागें और सेल पेलेट को फ्रीजिंग मिक्स के 1 मिलीलन में फिर से खर्च करें, जिसमें 1:9 डाइमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ): एफबीएस शामिल हैं।
    3. एक बाँझ क्रायोवियल के लिए सामग्री हस्तांतरण और एक ठंड कंटेनर में शीशी जगह है।
    4. -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीज करें और फिर अगले दिन तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में शीशियों को स्थानांतरित करें।

2. प्लाज्मिड डीएनए अलगाव और सत्यापन

  1. बैक्टीरियल सेल तैयारी
    1. ई. कोलाई के स्ट्रीक ग्लिसरोल स्टॉक्स जिसमें तीन व्यक्तिगत प्लाज्मिड्स पीसीएक्सल-एचओसीटी3/4-shp53-F, pCXLE-hSK और pCXLE-hUL (Addgene से) अलग लुरिया Bertani-ampicillin आगर प्लेटों पर ।
    2. लुरिया बर्टानी-एम्पिसिलिन माध्यम के 5 एमएल की स्टार्टर संस्कृतियों में एकल उपनिवेशों को टीका लगाएं। मिलाते हुए (10 x ग्राम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    3. लुरिया बर्टानी-एम्पिसिलिन माध्यम के 100 मिलीएल में इस स्टार्टर संस्कृति के 200 माइक्रोन टीका। मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 6000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा रात भर बैक्टीरियल संस्कृति फसल।
  2. मिडी प्लाज्मिड शुद्धिकरण किट के साथ प्लाज्मिड अलगाव
    1. 4 एमएल रिसुस्पेन बफर में बैक्टीरियल पेलेट को रीसुस्पेंड करें।
    2. लाइसिस बफर के 4 एमएल जोड़ें और 4-6 बार सख्ती से उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. अच्छी तरह से मिलाने के लिए प्री-ठंडा बेअसर बफर और इनवर्ट ट्यूब के 4 एमएल 4-6 बार जोड़ें। 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ≥20,000 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज। एक ताजा ट्यूब में सुपरनैंट लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ≥20,000 x g पर फिर से अपकेंद्रित्र।
    5. संतुलन बफर के 4 एमएल लगाने से कॉलम को समतुल्य करें।
    6. कॉलम में सुपरनिटेंट लगाएं।
    7. कॉलम को 10 एमएल वॉश बफर से दो बार धोएं।
    8. गर्म (65 डिग्री सेल्सियस) एल्यूशन बफर के 5 एमएल के साथ एल्यूट डीएनए।
    9. एल्यूटेड डीएनए में आइसोप्रोपेनॉल के 3.5 एमएल जोड़कर डीएनए को उपजी करें। अच्छी तरह मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ≥15,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। डिकंट सुपरनेट सावधानी से।
    10. डीएनए गोली को 70% इथेनॉल और अपकेंद्रित्र के 2 मिलील के साथ 10 मिनट के लिए ≥15,000 x ग्राम पर धोएं। डिकंट सुपरनेट सावधानी से।
    11. 5-10 मिनट के लिए एयर-ड्राई पैलेट और 1 μg/mL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पीसीआर ग्रेड पानी की एक उपयुक्त मात्रा में डीएनए भंग ।
      नोट: बफ़र्स में डीएनए को भंग न करें क्योंकि यह इलेक्ट्रोपाउरेशन के लिए उपयुक्त नहीं है। पुराने प्लाज्मिड डीएनए तैयार करने से पुनर्प्रोग्राम्ड कॉलोनियां नहीं निकलती हैं।
  3. EcoRI प्रतिबंध पाचन द्वारा प्लाज्मिड सत्यापन
    1. नाभिक मुक्त पानी के 15 माइक्रोन, 10x बफर के 2 माइक्रोन, प्लाज्मिड डीएनए के 1 माइक्रोन और इकोरी एंजाइम के 1 माइक्रोन मिलाएं। धीरे-धीरे मिलाएं।
    2. एक हीट ब्लॉक में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    3. 1x TAE बफर में 1% एगर उठे जेल पर 6x डीएनए जेल लोडिंग डाई और इलेक्ट्रोफोरेस के साथ पचाने वाले प्लाज्मिड नमूनों को 0.5 माइक्रोग्राम/एमएल एटिडियम ब्रोमाइड के साथ मिलाएं। मानक डीएनए सीढ़ी शामिल करें। डीएनए उचित रूप से हल हो गया है के बाद जेल छवि। पीसीएक्सLE-hOCT3/4-shp53-F के अपेक्षित इकोरी बैंड आकार 6,834 बीपी, 3,758 बीपी और 1,108 बीपी हैं; पीसीएक्सल-एचयूल 10,200 बीपी और 1,900 बीपी हैं; पीसीएक्सलई-एचएसके 10,200 बीपी और 2,500 बीपी हैं।

3. न्यूक्लियोफेक्शन

  1. सेल पेलेटिंग
    1. संस्कृति टी-25 फ्लास्क में अलग भ्रूण कोरियोनिक विल्ली फाइब्रोब्लास्ट पूर्ण मीडिया के 5 एमएल में 80-90% तक।
    2. पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं और चरण 1.2.2.1 - 1.2.2.3 में वर्णित के रूप में ट्रिपसिनाइज करें।
    3. कम सीरम मीडिया (जैसे, ऑप्टी-एमईएम) के 5 एमएल में सुपरनैंट, रिसिस्पेंड पैलेट, रिसिपेंड गोली को हटा दें। हीमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें और नाभिक के लिए10 6 कोशिकाओं को लें। 5 मिनट के लिए 225 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को पूरी तरह से हटा दें।
  2. रीएजेंट तैयारी और नाभिक
    1. 0.5 एमएल सप्लीमेंट और 2.25 एमएल न्यूक्लियोफेक्टर सॉल्यूशन (दोनों किट में प्रदान) को मिलाकर न्यूक्लियोफेक्टर रिएजेंट तैयार करें।
    2. 1.5 एमएल ट्यूब में न्यूक्लियोफेक्टर समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें। 1μg PCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK और pCXLE-hUL के प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें । धीरे-धीरे इस मिश्रण में 106 कोशिकाओं (चरण 3.1.2 से) को फिर से रीसस्ट करें।
    3. सेल-डीएनए निलंबन को क्यूवेट में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नमूना किसी भी हवा के बुलबुले के बिना क्यूवेट (किट में प्रदान) के नीचे को कवर करता है। कुवेट को कैप करें और धारक में डालें। न्यूक्लियोफेक्टर प्रोग्राम यू-23 (उच्च दक्षता के लिए) का चयन करें और लागू करें।
    4. धारक से बाहर cuvette निकालें और पूरा मीडिया के 1 mL जोड़ें । सामग्री को धीरे-धीरे 60 मिमी ऊतक संस्कृति में स्थानांतरित करें, पूर्ण मीडिया के 4 एमएल (मीडिया के कुल 5 एमएल में) से भरे पेट्री डिश का इलाज किया जाता है। कोशिकाओं को आर्द्रीकृत सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 24 घंटे के बाद, जांच करें कि कोशिकाओं ने संलग्न किया है या नहीं। माध्यम को पूरी तरह से बदलें।
      नोट: कोशिका मृत्यु की दर नाभिक में उच्च है जो कुछ व्यवहार्य कोशिकाओं को देते हैं।
    6. कोशिकाओं को 10 दिनों तक पूर्ण मीडिया में बनाए रखें और अगले 20 दिनों के लिए pluripotency मीडिया में स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रयोग काम कर रहा है, पुष्टि करने के लिए पुष्टि करने के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग कोशिकाओं (जैसे एपिथेलियल आकृति विज्ञान और कॉम्पैक्ट कॉलोनी गठन) में होने वाले रूपात्मक परिवर्तनों का पालन करने के लिए नियमित रूप से कोशिकाओं की कल्पना करें। 20 दिनों की संस्कृति के बाद लगभग 25 आईपीएससी कॉलोनियों को pluripotency मीडिया में देखा जा सकता है ।

4. आईपीएससी कॉलोनियों का उठा और प्रचार-प्रसार

  1. रीप्रोग्रामिंग प्लेट से उठा कॉलोनी
    1. मैन्युअल रूप से खींचे गए ग्लास पिपेट या 1 मिलीएल सिरिंज सुइयों का उपयोग करके पुनर्प्रोग्रामिंग डिश में गठित भ्रूणस्टेम सेल जैसी कालोनियों को मैन्युअल रूप से विच्छेदन करें और प्लूपिपेंसी माध्यम के साथ निष्क्रिय माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट फीडर के साथ पहले से तैयार प्लेट में स्थानांतरित करें या मैटेसआर माध्यम के साथ मैट्रिगेल लेपित प्लेटों पर फीडर मुक्त संस्कृतियों की स्थापना करें।
      नोट: माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) माउस भ्रूण (13-14 दिनों की गर्भवती महिला चूहों से विच्छेदित) से एंजाइमेटिक अलगाव का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे और माइटोकिसिन सी उपचार द्वारा माइटोटोली रूप से निष्क्रिय किए गए थे। एक ही डिश के लिए रीप्रोग्रामिंग प्लेट से कई कालोनियों को स्थानांतरित करके अलग-अलग व्यंजनों या मिश्रित क्लोन आबादी में पुनर्प्रोग्रामिंग प्लेट से एकल उपनिवेशों को उगाकर एकल क्लोन आबादी स्थापित करें।
  2. उभरती कॉलोनियों का यांत्रिक हस्तांतरण नए फीडरों में और स्थिर आईपीएससी स्थापित करने के लिए पासिंग
    1. हर दूसरे दिन खिलाकर पूर्णाधिकारी माध्यम में आईपीएससी का प्रचार करें और हर 5-7 दिनों में 1:3 विभाजित करें। 9:1 अनुपात में नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट और डीएमएसओ के फ्रीजिंग मिश्रण में क्रायोप्रेरिजिंग द्वारा स्टॉक तैयार करें।
      नोट: नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट का उपयोग एफबीएस के बजाय आईपीएससी के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए फ्रीजिंग मिश्रण में किया जाता है क्योंकि एफबीएस में घटक दीर्घकालिक संरक्षण के दौरान pluripotent कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित कर सकते हैं।

5. आईपीएससी का चरित्र चित्रण

नोट: पांचवें पैसेज नंबर के बाद पीसीआर और प्लूपिपोती बायोमार्कर के लिए इम्यूनोस्टेटिंग सहित लक्षण वर्णन अध्ययन किए गए । बाद में एक मार्ग संख्या पर Karyotyping प्रदर्शन किया गया ।

  1. करयोटाइपिंग
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत सीओ2 इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए कोल्सेमिड के साथ आईपीएससी की एक कॉन्फ्लोटेंट 60 एमएम पेट्री डिश का इलाज करें।
    2. 0.05% ट्राइप्सिन उपचार और अपकेंद्रित्र द्वारा फसल। अलौकिक निकालें और सेल गोली ढीला करने के लिए माध्यम के बचे हुए निशान पिपेट।
    3. हाइपोटोनिक समाधान के 5 एमएल जोड़ें। ट्यूब को उलटा करके मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 225 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
      नोट: प्राप्त गोली शराबी दिखाई देना चाहिए।
    4. पैलेट को ढीला करने के लिए टैप करते हुए धीरे-धीरे कार्नॉय के फिक्सेटिव समाधान के 2.5 एमएल जोड़ें।
    5. साफ ग्लास स्लाइड पर सेल सस्पेंशन गिराकर कायोटाइपिंग के लिए स्प्रेड तैयार करें।
    6. 1 मिनट के लिए 0.15% ट्राइपसिन के साथ स्लाइड्स का इलाज करें, और पीबीएस के साथ एक बार धोएं। फिर 4 मिनट के लिए गिम्सा समाधान के साथ दाग और एक आसुत पानी धोने के साथ समाप्त होता है। उचित सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहण और प्रक्रिया।
  2. ट्रांसजीन मुक्त स्थिति का प्रदर्शन
    1. जीनोमिक डीएनए अलगाव
      1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के नीचे में पिपेट 20 माइक्रोल प्रोटीज़।
      2. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पीबीएस में 200 माइक्रोएल TSiPSCs को फिर से निलंबित करें।
      3. नमूना करने के लिए बफर अल के 200 μL जोड़ें और पल्स-भंवर द्वारा 15 एस के लिए मिश्रण।
      4. 56 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      5. ढक्कन के अंदर से बूंदों को हटाने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें।
      6. नमूने में इथेनॉल (96-100%) के 200 माइक्रोन जोड़ें, और पल्स-भंवर द्वारा 15 एस के लिए फिर से मिलाएं। मिश्रण के बाद, ढक्कन के अंदर से बूंदों को हटाने के लिए ट्यूब को संक्षेप में अपकाइज करें।
      7. रिम को गीला किए बिना पिछले चरण से मिश्रण को मिनी स्पिन कॉलम (2 एमएल संग्रह ट्यूब में) पर ध्यान से लागू करें। टोपी बंद करें, और 1 मिनट के लिए 6000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। फिलट्रेट युक्त ट्यूब को त्यागें और मिनी स्पिन कॉलम को एक साफ 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें।
      8. ध्यान से मिनी स्पिन कॉलम खोलें और रिम को गीला किए बिना, बफर AW1 के 500 माइक्रोन जोड़ें। 1 मिनट के लिए 6000 x g पर टोपी और अपकेंद्रित्र बंद करें। मिनी स्पिन कॉलम को साफ 2 एमएल कलेक्शन ट्यूब में रखें और फिलट्रेट युक्त कलेक्शन ट्यूब को डिस्कार्ड करें।
      9. ध्यान से मिनी स्पिन कॉलम खोलें और रिम को गीला किए बिना बफर AW2 के 500 माइक्रोन जोड़ें। 3 मिनट के लिए पूरी गति (20,000 x g) पर टोपी और अपकेंद्रित्र बंद करें।
      10. मिनी स्पिन कॉलम को एक नए 2 एमएल कलेक्शन ट्यूब में रखें और पुराने कलेक्शन ट्यूब को फिलट्रेट से डिस्कनेक्ट करें। संभव बफर AW2 कैरीओवर की संभावना को खत्म करने के लिए 1 मिनट के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र।
      11. मिनी स्पिन कॉलम को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें, और फिलट्रेट युक्त संग्रह ट्यूब को त्याग दें। ध्यान से मिनी स्पिन कॉलम खोलें और 200 μL बफर एई या आसुत पानी जोड़ें। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट (15-25 डिग्री सेल्सियस) 5 मिनट के लिए, और फिर 1 मिनट के लिए 6000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    2. ट्रांसजीन-फ्री स्टेटस पीसीआर (कापा हाईफाई पीसीआर किट KR0368 का उपयोग करना)
      1. सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्ण ठीक से गल और मिश्रित हैं।
      2. टेबल 2 (बर्फ पर प्रतिक्रियाओं को सेट करें) के आधार पर सभी प्रतिक्रिया घटकों की उचित मात्रा वाले पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें।
      3. पीसीआर मास्टर मिक्स, टेम्पलेट और प्राइमर की उचित मात्रा को व्यक्तिगत पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      4. व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं, मिश्रण और अपकेंद्रित्र संक्षेप में कैप करें।
      5. टेबल 3के बाद पीसीआर करें ।
  3. प्लुरिपोटेंसी बायोमार्कर पहचान
    1. क्षारीय फॉस्फेट (एपी) धुंधला
      1. संस्कृति क्षेत्र के हर 10 सेमी2 के लिए 1.5 एमएल DMEM/F-12 में 500x स्टॉक समाधान के 3 माइक्रोन को कमजोर करके 1x एपी लाइव दाग काम समाधान तैयार करें।
      2. आईपीएससी कल्चर डिश से मीडियम निकालें। एक बार डीएमईएम/एफ-12 के साथ संस्कृति को धोएं। आईपीएससी पर 1x एपी लाइव दाग समाधान जोड़ें। 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      3. एपी दाग निकालें और DMEM/F-12 के साथ दो बार धोते हैं । 30-90 मिनट के धुंधला के भीतर एक मानक फिटसी फिल्टर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत ताजा DMEM/F-12 और छवि जोड़ें ।
    2. प्लुरिपोटेंसी बायोमार्कर के लिए इम्यूनोस्टेटिंग
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ कंप्लेंट आईपीएससी संस्कृतियों को ठीक करें। पीबीएस ट्वीन 20 (पीबीएसटी) के साथ तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट।
      2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएसटी में 0.3% ट्राइटन एक्स-100 के साथ कोशिकाओं को पार करें। पीबीएएसटी के साथ तीन बार धोएं।
        नोट: पर्मेबिलाइजेशन केवल इंट्रासेलुलर एंटीजन के लिए किया जाना चाहिए।
      3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएसटी में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें। रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी (1% बीएसए में 1:1000 पतला) के साथ कोशिकाओं को दाग दें। प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएएसटी के साथ तीन बार धोएं।
      4. कमरे के तापमान पर 5 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (1% बीएसए में 1:1000 पतला) के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं। पीबीएएसटी के साथ तीन बार धोएं।
      5. 1 मिनट के लिए 0.5 μg/mL 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडलोले (DAPI) के साथ नाभिक लेबल । कोशिकाओं को पीबीएसटी के साथ एक बार धोएं।
      6. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत छवियों को कैप्चर करें।

6.इन विट्रो भेदभाव परख

  1. भ्रूण शरीर (ईबी) भेदभाव
    1. भ्रूण शरीर माध्यम में कम लगाव पेट्री व्यंजन में आईपीएससी कालोनियों को छोटे टुकड़ों में काटें, इकट्ठा करें और प्लेट करें। हर 3 दिन में माध्यम की जगह 15 दिनों के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं।
      नोट: दिन 15 ईबी तीन रोगाणु परत बायोमार्कर का पता लगाने के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट सेल वंश को विकास कारकों के साथ प्रेरित किया जा सकता है, इसके बाद बायोमार्कर का पता लगाया जा सकता है।
  2. एंडोडर्म (हेपेटोसिट) भेदभाव
    1. बहुलता माध्यम में मोनोलेयर संस्कृतियों में आईपीएससी बढ़ाएं।
    2. एक बार एकम्फ्लूंट, 1x इंसुलिन ट्रांसफरिन सेलेनाइट और 100 एनजी/एमएल एक्टिविन ए के साथ 2 दिनों के लिए आरपीएमआई 1640 मीडिया में शिफ्ट करें, इसके बाद 30 एनजी/एमएल बीएफजीएफ और 9 दिनों के लिए 20 एनजी/एमएल बीएमपी 4 के साथ आरपीएमआई 1640 मीडिया में वृद्धि हुई। हर 2 दिन में मीडियम बदलें।
    3. 10 दिन के बाद से, 0.1 माइक्रोन डेक्सामेथासोन के साथ मीडिया को पूरक करें। 20 दिन पर प्रयोग समाप्त करें ।
  3. मेसोडर्म (कार्डियोमायोसाइट) भेदभाव
    1. प्लेट दिवस भ्रूण शरीर माध्यम में 0.5% मातृगेल-लेपित प्लेटों पर 8 ईबी। ईबी को संलग्न करने और पतन की अनुमति दें।
    2. 20 एनजी/एमएल बीएमपी 4 के साथ मीडिया को पूरक करें और 20 दिनों के लिए बढ़ाएं। हर 2-3 दिन में मीडियम बदलें। 20 दिन पर प्रयोग समाप्त करें ।
  4. एक्टोडेर्म (न्यूरोनल) भेदभाव
    1. प्लेट डे 4 ईबीएस पर 2 μg/cm2 कोलेजन टाइप IV-coated प्लेटें भ्रूण शरीर माध्यम में । ईबी को संलग्न करने और पतन की अनुमति दें।
    2. अगले दिन, 2mg/mL ग्लूकोज, 1x इंसुलिन ट्रांसफरिन सेलेनिट, और 2.5μg/mL फाइब्रोनेक्टिन के साथ DMEM एफ-12 के लिए मध्यम बदलाव । 15 दिन पर प्रयोग समाप्त करें ।
  5. सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड का गठन
    1. 70-80% तक एमईएफ पर 35 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में टीएसआईपीएससी बढ़ाएं। कॉलोनियों को काटकर 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। 5 मिनट के लिए 225 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
    2. सुपरनैंट को हटाने के लिए पीबीएस और सेंट्रलाइज के 2 एमएल में रीसस्टिंग करके कॉलोनियों के टुकड़ों को धोएं।
    3. 0.05% ट्राइप्सिन के 1 एमसीएल जोड़ें और कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए ट्यूब पर टैप करें। कॉलोनी के टुकड़ों को एकल सेल निलंबन में अलग करने के लिए 3-4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    4. 10 μg/ml rho-संबद्ध प्रोटीन kinase (रॉक) अवरोधक Y-27632 dihydrochloride (ROCKi) युक्त pluripotency मीडिया के 4 ml के साथ कमजोर पड़ने से ट्राइप्सिन बेअसर करने के लिए वियोजन प्रेरित सेल मौत को रोकने के लिए ।
    5. एक गोली प्राप्त करने के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनैंट को त्यागें और कोशिकाओं को 2mL भ्रूणीय शरीर माध्यम में फिर से खर्च करें जिसमें 10 μg/mL ROCKi होता है ।
    6. सेल काउंटिंग के लिए सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन निकालें। मृत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन जोड़ें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    7. 150 माइक्रोन प्रति 9,000 जीवित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कोशिका निलंबन के लिए आरओसीकी के साथ भ्रूण शरीर माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें।
    8. प्लेट 150 माइक्रोल प्रत्येक कुएं में कम-अटैचमेंट 96-वेल प्लेट और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत CO2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट। 24 घंटे के बाद एकत्रीकरण के लिए प्लेटों की जांच करें। दिन 2 धीरे माध्यम को दूर करने और ROCKi बिना ताजा भ्रूण माध्यम के साथ बदलें ।
    9. 6 दिन, एक कम लगाव के कुओं के लिए ईबी स्थानांतरित 24 अच्छी तरह से 1% N2 पूरक, 2 m ग्लूटामैक्स पूरक और 1 mm गैर आवश्यक अमीनो एसिड और 1 μg/mL heparin के साथ DMEM-F12 से बना तंत्रिका प्रेरण माध्यम के ५०० माइक्रोन युक्त थाली । हर 2 दिन में माध्यम बदलें।
    10. न्यूरल इंडक्शन मीडियम में 5 दिनों के बाद 200 माइक्रोल टिप्स की खाली टिप ट्रे पर पैराफिल के 2 सेमी x 2 सेमी वर्ग को लेयर करके मैट्रिगेल में न्यूरोपिथेल एग्रीगेट करते हैं। छोटे डेंट बनाने के लिए टिप ट्रे में प्रत्येक छेद पर दस्ताने उंगलियों के साथ पैराफिल्म दबाएं। स्टरलाइज करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ साफ पैराफिल्म।
    11. पैराफिल्म स्क्वायर को 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें। पैराफिल्म में डेंट्स पर न्यूरोएपिथेलिक समुच्चय को स्थानांतरित करने के लिए कट 200 माइक्रोल युक्तियों का उपयोग करें। पिपटिंग करके अतिरिक्त माध्यम निकालें।
    12. न्यूरोएपिथलियल एग्रीगेट्स पर गल मैट्रिगेल का 30 माइक्रोन जोड़ें और एक पिपेट टिप का उपयोग करके मैट्रिगेल के केंद्र में कुल की स्थिति करें। पॉलीमराइज करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 20-30 मिनट के लिए 60 एमएम डिश रखें।
    13. 1:1 DMEM-F12 से बना सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड विभेदन माध्यम के 5 एमएल जोड़ें: न्यूरोबेसल माध्यम, 0.5% N2 पूरक, इंसुलिन के 2.5 μg/ml, 2 m ग्लूटामैक्स पूरक, 0.5 m M NEAA, 1% B27 पूरक और 2.5 mL पेनिकलिन-स्ट्रेप्टोमाइसी।
    14. एक बाँझ संदंश का उपयोग करना पैराफिल्म शीट को चालू कर देता है और पकवान को उत्तेजित करता है जब तक कि मैट्रिगेल एम्बेडेड एग्रीगेट्स शीट को माध्यम में बंद नहीं कर देते। वैकल्पिक दिनों में मीडिया परिवर्तन देने केलिए 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत सीओ 2 इनक्यूबेटर में एम्बेडेड समुच्चय बढ़ाएं।
    15. स्थिर संस्कृति के 4 दिनों के बाद 50 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर के अंदर स्थापित एक कक्षीय शेखर पर 60 मिमी व्यंजन रखें। संस्कृति 3 महीने के लिए ऑर्गेनॉइड हर 3 दिनों में सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड भेदभाव माध्यम के साथ पूरा मीडिया परिवर्तन दे रही है ।

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Representative Results

45XO karyotype के साथ एक अनायास गर्भपात भ्रूण से एकीकरण मुक्त आईपीएससी की पीढ़ी
हमने एफसीवी से फाइब्रोब्लास्ट को टर्नर सिंड्रोम (टीएस) विशिष्ट 45XO कारियोटाइप के साथ अलग किया और उन्हें टीएसआईपीएससी उत्पन्न करने के लिए एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग प्लाज्मिड्स के साथ संक्रमित किया जिसका उपयोग सिंड्रोम के डाउनस्ट्रीम मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है, विशेष रूप से संबंधित न्यूरोलॉजिकल घाटे(चित्रा 1aऔर बी)। हमने ट्रांसफेक्शन प्रयोगों(चित्रा 1 सीएंडडी)के लिए गैर-प्रतीक एपिसोमल वैक्टर और न्यूक्लियोफ्क्शन का उपयोग किया। हमने पुनर्प्रोग्रामिंग की सफलता की निगरानी के लिए कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों का पालन किया। फाइब्रोब्लास्ट से एपिथेलियल आकृति विज्ञान में बदलाव, इसके बाद एक चित्रित कॉम्पैक्ट कॉलोनीगठन (चित्र 2 ए)देखा गया। TSiPSCs ने मानव भ्रूणीय स्टेम सेल जैसे अलग किनारों के साथ आकृति विज्ञान और 20 पोस्ट ट्रांसफैक्शन(चित्रा 2b)के आसपास एक उच्च नाभिक-से-साइटोप्लाज्म अनुपात का अधिग्रहण किया। इसके विपरीत, अपूर्ण रूप से पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाएं एपिथेलियल मॉर्फोलोजी प्राप्त करती हैं लेकिन कॉम्पैक्ट उपनिवेश बनाने में विफल होती हैं। (चित्रा 2c)।

टीएसआईपीएससी का लक्षण वर्णन
TSiPSCs के Karyotyping टर्नर सिंड्रोम(चित्रा 3a)के साथ जुड़े 45XO karyotype से पता चला । टीएसआईपीएससी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने प्लुरिपेंसी ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर्स OCT4, NANOG, SOX2, और सेल सरफेस मार्कर SSEA4, ई-कैडेरिन और टीआरए-1-81 की अभिव्यक्ति दिखाई । मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाएं प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के स्वर्ण मानक हैं। हमने साथ ही ह्यूज 1 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस किया जिसे टीएसआईपीएससी(चित्रा 3 बी)द्वारा प्लुरिपोती बायोमार्कर अभिव्यक्ति की तुलना के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। टीएसआईपीएससी की ट्रांसजीन मुक्त स्थिति एपिसोमल प्लाज्मिड मार्कर ओरीप और ईबीएनए के लिए जीनोमिक डीएनए पीसीआर द्वारा प्रदर्शित की गई थी। 15 मार्ग से, Orip और EBNA जीन TSiPSCs में खो गए थे । एपिसोमल जीन ओरीप और ईबीएनए को परिलक्षित किया गया और इस स्तर पर एपिसोमल प्लाज्मिड्स की उपस्थिति का संकेत देते हुए 9 TSiPSCs पारित करने में बैंड दिखाया गया । हालांकि, इन जीनों को पारित करने में परिलक्षित नहीं किया गया था 15 TSiPSCs एपिसोमल प्लाज्मिड के नुकसान का संकेत है और इसलिए एक ट्रांसजीन मुक्त राज्य(चित्रा 3c)।

इन विट्रो विभेदन परख
टीएसआईपीएससी लाइनों की विभेदन क्षमता को विट्रो मेंप्रदर्शित किया गया था । कम लगाव प्लेटों में एकत्रीकरण पर TSiPSCs भ्रूण निकायों कागठन (चित्रा 4a)। टीएसआईपीएससी के विकास कारक प्रेरित भेदभाव का उपयोग तीन रोगाणु परतों के सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए किया गया था। वंश विशिष्ट बायोमार्कर का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण ने पुष्टि की कि टीएसआईपीएससी ने एंडोडर्म (SOX17), मेसोडर्म (MYOSIN VENTRICULAR भारी CHAINα/β) और ectoderm (οIII TUBULIN)(चित्रा 4b)के प्रतिनिधि डेरिवेटिव में विभेदित किया।

सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड भेदभाव।
टीएसआईपीएससी को चरणवार तरीके से सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड के रूप में विभेदित किया गया था। टीएसआईपीएससी के एकल कोशिका निलंबन को प्रारंभिक 6 दिनों के लिए रोगाणु परतों के विकास को प्रोत्साहित करने के लिए भ्रूणीय निकायों में एकत्र किया गया था और इसके बाद 5 दिनों के लिए न्यूरोएपिथेलियल विकास को शामिल किया गया था। न्यूरोएपिथेलियल एग्रीगेट उन्हें मैट्रिक्स में एम्बेडेड थे जो एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स और बेसमेंट झिल्ली घटक प्रदान करते थे जो उचित अपिकाबेसल अभिविन्यास का समर्थन करते हैं, न्यूरोएपिथेलियल कलियों की वृद्धि जो विस्तार करते हैं और ल्यूमेंस बनाते हैं। ऑर्गेनॉइड(चित्रा 5b)के समग्र आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए न्यूरोपिथेलियल मार्कर नेस्टिन के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस का प्रदर्शन किया गया था। न्यूरोपिथेलियम गुहा(चित्रा 5c - सफेद रेखा) की तरह एक वेंट्रिकल को घेरे हुए है। ऑर्गेनॉइड रूपात्मक रूप से वेंट्रिकुलर जोन (वीजेड), सब वेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) और कॉर्टेक्स जैसे क्षेत्रों(चित्रा 5c - लाल, नारंगी और पीली रेखाएं क्रमशः) प्रदर्शित करते हैं

Figure 1
चित्रा 1:फाइब्रोब्लास्ट अलगाव और नाभिक के माध्यम से पुनर्प्रोग्रामिंग।  (क) कोलेजन उपचार से पहले भ्रूण कोरियोनिक विली की सूक्ष्म छवि। (ख)फाइब्रोब्लास्ट्स को रीप्रोग्रामिंग प्रयोगों के लिए भ्रूण कोरियोनिक विली से अलग किया जाता है । (ग)इकोरी प्रतिबंध पाचन द्वारा पुनर्प्रोग्रामिंग प्लाज्मिड का सत्यापन। (घ)इम्योलोफेक्शन के माध्यम से एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग प्लाज्मिड का उपयोग करके भ्रूण कोरियोनिक विलाली फाइब्रोब्लास्ट से आईपीएससी पीढ़ी के लिए नियोजित ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:टर्नर सिंड्रोम की स्थापना प्रेरित pluripotent स्टेम सेल । (क)रीप्रोग्रामिंग के समयावधि के दौरान सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन देखा गया । (ख)पूरी तरह से रीप्रोग्राम्ड टीएसआईपीएससी कॉलोनी। (ग)अनुचित तरीके से पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं वाली कॉलोनी की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:टीएसआईपीएससी का लक्षण वर्णन।  {टीएसआईपीएससी का कारियोटाइप। (ख)भ्रूणीय स्टेम सेल HUES1 की तुलना में टीएसआईपीएससी में प्लुरिपोती बायोमार्कर OCT4, NANOG, SOX2, SSEA-4 और टीआरए-1-81 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण । नाभिक 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल के साथ दाग रहे हैं । 3सी. टीएसआईपीएससी के ट्रांसजीन मुक्त स्थिति का प्रदर्शन। लेन 1-डीएनए सीढ़ी, लेन 2- पीसीएक्सल-एचएसके के साथ ओरीप पॉजिटिव कंट्रोल, लेन 3- एब् ना पॉजिटिव कंट्रोल के साथ पीसीएक्सल-एचएसके, टीएसआईपीएससी के साथ लेन 4-ओरिप, टीएसआईपीएससी के साथ लेन 5-ईबीएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:TSiPSCs की विट्रो भेदभाव क्षमता में।  (क)टीएसआईपीएससी भ्रूणीय निकायों में विभेदित । (ख)एंडोडर्मल मार्कर SOX17 के लिए टीएसआईपीएससी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस एनालिसिस, मेसोडर्मल मार्कर मायोसिन वेंट्रिकुलर हैवी चेन α/β और एक्टोडर्मल मार्कर आईआई ट्यूबलिन और SOX2 । नाभिक 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल के साथ दाग रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:टीएसआईपीएससी का न्यूरोनल और सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड भेदभाव।  {विभेदित न्यूरॉन्स के साइटोआर्किटेचर को समझने के लिए ऐक्टिन का फ्लोओडिन स्टेनिंग किया गया। टीएसआईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स ने डेंड्राइट्स और एक्सॉन (तीर) के साथ पिरामिड के आकार के न्यूरोनल सोमा (एरोहेड) को प्रदर्शित किया। नाभिक 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल के साथ दाग रहे हैं । इम्यूनोस्टेपिंग। (क)ऑर्गेनॉइड की घोर आकृति विज्ञान का पालन करने के लिए नेस्टिन और ऐक्टिन के लिए इम्यूनोदाता । (ग)नेस्टिन के लिए धुंधला करने के लिए apically और basally संगठित न्यूरोनल परतों की कल्पना । नाभिक 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल के साथ दाग रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: मीडिया, बफ़र्स और समाधानों की संरचना कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: पीसीआर रिएक्शन मिक्स कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: पीसीआर साइकिलिंग कार्यक्रम कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

दोषपूर्ण फेनोटाइप को बनाए रखने के लिए साइटोननिक असामान्य भ्रूण ऊतक के स्थिर सेलुलर मॉडल का उत्पादन आवश्यक है। आईपीएससी मार्ग दोषपूर्ण गुणों के सतत संरक्षण के लिए सेल तैयार करने का सबसे प्रभावीतरीकाहै ।

Pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) आत्म नवीकरण और विशेष कोशिकाओं में भेदभाव के गुणों को प्रदर्शित करने के प्रारंभिक दरार भ्रूण21की याद ताजा करती है । इसलिए, पीएससी समय से पहले गर्भपात भ्रूण में प्रारंभिक आणविक, सेलुलर और विकासात्मक दोषों का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं।

इस लेख में हमने बेहतर एपिसोमल वैक्टर के साथ संयुक्त न्यूक्लियोफेक्शन का उपयोग करके मानव आईपीएससी पीढ़ी का वर्णन किया है। परिणाम बताते हैं कि इस संयोजन में एकीकरण मुक्त मानव आईपीएससी लाइनों को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत तरीका शामिल है जैसा कि इस तथ्य से सबूत है कि सफल पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए एकल ट्रांसफैक्शन पर्याप्त थे। हमने एफसीवी फाइब्रोब्लास्ट के प्रगतिशील रूपांतरण को सूक्ष्म रूप से बहुलिपोपेंट कोशिकाओं में ट्रैक किया। 20 दिनों के बाद ट्रांसफैक्शन हमने नॉन-रीप्रोग्राम्ड एफसीवी फाइब्रोब्लास्ट से घिरे रीप्रोग्राम्ड टीएसआईपीएससी की कॉलोनियों को देखा । रूपात्मक रूप से, व्युत्पन्न मानव आईपीएससी प्रयोगशाला में साथ उगाए जाने वाले भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं जैसा दिखता है। आमतौर पर, कोशिकाओं को चमकदार सीमाओं के साथ कॉम्पैक्ट उपनिवेशों के रूप में एकत्रित किया जाता है। उपनिवेशों की कोशिकाओं में बड़े नाभिक और कसकर पैक किया गया था जिसमें कोशिकाओं के बीच बंद झिल्ली संपर्क का सुझाव दिया गया था। गैर-रीप्रोग्राम्ड फाइब्रोब्लास्ट ने इन कॉलोनियों को घेर लिया और घेर लिया। iMEFs में स्थानांतरण पर वे जारी आत्म नवीकरण की संपत्ति का प्रदर्शन 30 से अधिक स्थानान्तरण के लिए संस्कृति में पैदा जारी है ।

जैसा कि TSiPSCs 45XO फाइब्रोब्लास्ट से उत्पन्न हुए थे, हमने कोशिकाओं को यह जांचने के लिए तैयार किया कि क्या उन्होंने क्रोमोसोमल संरचना को बनाए रखा है। TSiPSCs ने कोशिका सतत संस्कृति में 45XO कारियोटाइप को बनाए रखा, जिसमें एक स्थिर 45XO गुणसूत्र आनुवंशिक श्रृंगार का सुझाव दिया गया था। 45XO एन्यूप्लाइडी का प्रतिनिधित्व करने वाले सेलुलर संसाधन के रूप में उपयोगी होने के लिए टीएसआईपीएससी को पुनर्प्रोग्रामिंग प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले बहिर्जात डीएनए से मुक्त होना चाहिए। हमने एपिसोमल विशिष्ट मार्कर-ओरीप और ईबीएनए के लिए जीनोमिक डीएनए पीसीआर का प्रदर्शन करके अवशिष्ट एपिसोमल प्लाज्मिड्स की उपस्थिति की जांच की। हमें 15 अंशों के बाद TSiPS कोशिकाओं में इन मार्कर का कोई निशान नहीं मिला, जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि टीएसआईपीएससी ने लंबे समय तक संस्कृति में एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग वैक्टर खो दिया है।

एक pluripotent कोशिकाओं की पहचान इन विट्रो और वीवो दोनों में तीन रोगाणु वंश की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता है। व्युत्पन्न TSiPSCs में इस क्षमता का परीक्षण करने के लिए हमने उन्हें भ्रूण शरीर के गठन के लिए विट्रो में अधीन किया और वंश निर्दिष्ट साइटोकिन्स और विकास कारकों द्वारा निर्देशित भेदभाव परख। TSiPSCs भ्रूण निकायों का गठन किया और एक्टोडरमल कोशिकाओं में विभेदित न्यूरोनल मार्कर व्यक्त, मेसोडर्मल कोशिकाओं हृदय मार्कर और एंडोडर्मल कोशिकाओं को व्यक्त SOX17 endoderm भाग्य का एक बायोमार्कर व्यक्त । हमने पहले से स्थापित प्रोटोकॉल22का उपयोग करके उच्च क्रम 3डी सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड में अंतर करने के लिए टीएसआईपीएससी की क्षमता का भी परीक्षण किया । टीएसआईपीएससी उत्तरोत्तर अपने आंतरिक विकास कार्यक्रमों के कारण अपने आंतरिक विकास कार्यक्रमों को ऑर्गेनॉइड नामक मिनी ऊतकों में व्यवस्थित करता है। टीएसआईपीएससी में सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड मिले, जिसमें मस्तिष्क के ऊतकों के समान साइटोआर्किटेचर दिखाई देता है, जिसमें गुहा जैसे वेंट्रिकल के आसपास न्यूरोपिथेलियम होता है। हालांकि इन ऑर्गेनॉइड को सटीक सेल प्रकारों को प्रकट करने के लिए और सामान्य आईपीएससी की तुलना में टीएसआईपीएससी के आंतरिक तंत्रिका ऊतक पैटर्निंग गुणों को अलग करने के लिए बड़े पैमाने पर चित्रित करना होगा। टीएसआईपीएससी से उत्पन्न इन सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड और अन्य प्रकार के मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का उपयोग विकासात्मक और कार्यात्मक विसंगतियों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है जो टीएस व्यक्तियों के न्यूरोलॉजिकल कमियों के लक्षणों में योगदान दे सकते हैं। टीएसआईपीएससी ने प्लुरिपेंसी की बायोमार्कर विशेषताओं के साथ-साथ भेदभाव की पहचान विशेषता का प्रदर्शन किया जिससे प्रेरित बहुलता के लिए रीप्रोग्रामिंग की सफलता पर प्रकाश डाला गया।

उपर्युक्त विधि ने हमारी प्रयोगशाला में विभिन्न स्रोतों (अन्य लाइनों के डेटा नहीं दिखाए गए) से प्राप्त डर्मल फाइब्रोब्लास्ट और मेसेंकिमल कोशिकाओं को फिर से प्रोग्राम करने में कुशलतापूर्वक काम किया है। हमारे अनुभव में, पुनर्प्रोग्रामिंग प्रयोग की सफलता के लिए निम्नलिखित कदम महत्वपूर्ण हैं:

क) प्लाज्मिड तैयारी की गुणवत्ता: पुरानी तैयारी से आईपीएससी नहीं निकलता है।
ख) ट्रांसफेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की गुणवत्ता: आईपीएससी उत्पादन के लिए कोशिकाओं का प्रसार आवश्यक है। प्रति ट्रांसफेक्शन 0.5 से 1 मिलियन कोशिकाओं में प्रजनन योग्य पुनर्प्रोग्रामिंग दक्षता उत्पन्न हुई।
ग) हौसले से पुनर्गठित नाभिक अभिकर्णों: एक महीने से अधिक समय से संग्रहित न्यूक्लियोफेक्टर रिएजेंटों का पुनर्गठन आईपीएससी नहीं निकलता था ।
घ) आईपीएससी के यांत्रिक उपसंस्कृति द्वारा मास्टर सेल बैंक के रखरखाव से स्थिर रेखाएं उत्पीड हुईं । प्रयोग आवश्यकता के अनुसार एंजाइमेटिक वियोजन का प्रयोग किया गया।

प्रयोगशाला का भविष्य का उद्देश्य इस कुशल विधि का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विकास, कार्यात्मक और रोग मॉडलिंग के लिए गुणसूत्र असामान्य रूप से असामान्य आईपीएससी का एक पैनल स्थापित करना है। भ्रूण एन्यूप्लाइड्स के कारण गर्भावस्था में कमी होती है और जीवित जन्मों में अंग विकृतियां होती हैं। सहज गर्भपात के ऊतकों से प्राप्त एन्यूप्लाइड आईपीएससी मॉडल और अध्ययन विफल भ्रूण विकास की घटनाओं के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं। भ्रूण निकायों और ऊतक विशिष्ट ऑर्गेनॉइड 22 सहित इन विट्रो 2डी और 3डी संस्कृति प्रणालियों में शोधकर्ताओं को आणविक और सेलुलर अनियमितताओं जैसे कि एबर्टेंट सेल प्रसार और वंश विशिष्ट कोशिकाओं में सेल मृत्यु को समझने में मदद मिलेगी जो विकासात्मक विसंगतियों और एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम से जुड़ी गर्भावस्था विफलताओं के रूप में प्रकट हो सकती है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

उपर्युक्त शोध के लिए वित्तीय सहायता मणिपाल उच्च शिक्षा अकादमी द्वारा प्रदान की गई थी। एनसीबीएस में एम.M एंक्टर की प्रयोगशाला में आंशिक रूप से लाइन का लक्षण वर्णन किया गया था। हम करयोटाइपिंग के साथ सहायता के लिए आनंद डायग्नोस्टिक लेबोरेटरी को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

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References

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सिंड्रोम से जुड़े न्यूरोलॉजिकल घाटे के डाउनस्ट्रीम मॉडलिंग के लिए टर्नर सिंड्रोम (45XO) भ्रूण कोशिकाओं से प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी
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Veerasubramanian, N., Karthikeyan,… More

Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

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