Summary
这里介绍的是一种温和的3D打印技术，由交替的粘性惯性力驱动，以实现水凝胶微载体的构建。自制喷嘴具有灵活性，可轻松更换不同的材料和直径。可以获得直径为50-500μm的细胞结合微载体并收集以进行进一步培养。
Abstract
微载体是直径为60-250μm且比表面积较大的微球，通常用作大规模细胞培养的载体。微载体培养技术已成为细胞学研究的主要技术之一，在大规模细胞扩增领域得到普遍应用。微载体也被证明 在体外 组织工程构建和临床药物筛选中发挥着越来越重要的作用。目前制备微载体的方法包括微流控芯片和喷墨打印，它们通常依赖于复杂的流道设计，不兼容的两相界面和固定的喷嘴形状。这些方法面临着复杂的喷嘴加工，不方便的喷嘴更换以及应用于多个生物墨水时挤出力过大的挑战。在这项研究中，应用了一种称为交替粘性 - 惯性力喷射的3D打印技术，以构建直径为100-300μm的水凝胶微载体。随后将细胞接种在微载体上以形成组织工程模块。与现有方法相比，该方法为各种生物活性材料提供了自由的喷嘴尖端直径，灵活的喷嘴切换，自由控制打印参数和温和的打印条件。
Introduction
微载体是直径为60-250μm，比表面积较大的微球，通常用于细胞的大规模培养1，2。它们的外表面为细胞提供了丰富的生长位点，内部为空间增殖提供了支撑结构。球形结构还为监测和控制参数提供了便利，包括pH，O2以及营养物质和代谢物的浓度。当与搅拌罐生物反应器结合使用时，与传统培养物相比，微载体可以在相对较小的体积内实现更高的细胞密度，从而为实现大规模培养提供了一种经济有效的方法3。微载体培养技术已成为细胞学研究的主要技术之一，在干细胞、肝细胞、软骨细胞、成纤维细胞和其他结构的大规模扩增领域取得了很大进展4。它们也被发现是理想的药物输送载体和自下而上的单位，因此在临床药物筛选和 体外 组织工程修复中发挥着越来越重要的作用5。
为了满足不同场景下的力学性能要求，开发了多种类型的水凝胶材料，用于微载体的建造6，7，8，9，10，11。海藻酸盐和透明质酸（HA）水凝胶是两种最常用的微载体材料，因为它们具有良好的生物相容性和交联性12，13。海藻酸盐可以很容易地被氯化钙交联，其机械性能可以通过改变交联时间来调节。酪胺共轭HA通过过氧化氢和辣根过氧化物酶14催化的酪胺部分的氧化偶联而交联。胶原蛋白由于其独特的螺旋结构和交联纤维网络，经常被用作佐剂混合到微载体中，以进一步促进细胞附着15，16。
目前制备微载体的方法包括微流控芯片，喷墨打印和电喷雾17，18，19，20，21，22，23。微流控芯片已被证明在生产大小均匀的微载体方面具有快速高效的特性24。然而，该技术依赖于复杂的流道设计和制造工艺25。喷墨打印过程中的高温或过大的挤出力，以及电喷雾方法中的强电场，可能会对材料的性能产生不利影响，尤其是其生物活性19。此外，当应用于各种生物材料和直径时，这些方法中使用的定制喷嘴导致加工复杂性有限，成本高，灵活性低。
为了提供一种方便的微载体制备方法，应用了一种称为交替粘性惯性力喷射（AVIFJ）的3D打印技术来构建水凝胶微载体。该技术利用垂直振动过程中产生的向下驱动力和静压来克服喷嘴尖端的表面张力，从而形成液滴。在打印过程中，小的快速位移不是强烈的力和热条件，而是直接作用于喷嘴，对生物墨水的物理化学性质产生轻微影响，并对生物活性材料表现出极大的吸引力。利用AVIFJ方法，成功形成了直径为100-300 μm的多种生物材料的微载体。此外，微载体进一步证明可以很好地结合细胞，并为粘附的细胞提供合适的生长环境。
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Protocol
1. 细胞培养
- 用10%胎牛血清（FBS），1%非必需氨基酸溶液（NEAA），1%青霉素G和链霉素以及1%谷氨酰胺补充剂作为A549细胞的培养基补充高葡萄糖Dulbecco的改良最低必需培养基。
- 在37°C和5%CO 2的CO2培养箱中培养A549细胞
- 解离细胞，使用胰蛋白酶以约80%汇合度进行传代培养。
- 使用3mL胰蛋白酶在37°C下处理T75培养瓶中的细胞3分钟，然后加入6mL培养基以停止胰蛋白酶消化。
- 移液培养基以收获松散粘附的细胞。
- 以72.5× g 离心3分钟。除去上清液，用3 mL新鲜培养基重悬。
- 将1mL细胞悬浮液转移到含有10mL新鲜培养基的新T75培养瓶中。每2天更换培养基。
2. 喷嘴的准备
- 按照制造商的说明将玻璃微量移液器装载到拉拔器上。微射流管的外径、内径和长度分别为1.5 mm、1.1 mm和100 mm。
- 设置拉拔器的拉取参数。具体而言，默认情况下，"热量"、"拉力"、"速度"、"时间"和"压力"的值分别设置为 560、255、255、150 和 500。在这些参数下拉出喷嘴。
注意：拉开后获得的喷嘴非常锋利，不小心操作可能会造成伤害。 - 按照制造商的说明，通过微锻造设备在指定直径处切断生成的喷嘴（步骤2.2），以获得特定的尖端直径。具体而言，将喷嘴的指定直径定位到加热的铂丝上。将电线加热至60°C约5秒，然后将喷嘴拉开。
- 将喷嘴的打印头浸入疏水剂中30分钟，然后用灭菌水冲洗三个循环。
- 印刷前，将喷嘴在酒精中灭菌5分钟，并用灭菌水冲洗三次，以除去残留的酒精。
3. 水凝胶生物墨水的制备
- 将NaCl（0.45g）溶解到50mL无菌水中，以获得0.9%（w / v）NaCl溶液。振动溶液以促进溶解。完全溶解后，通过0.45μm聚对苯二甲酸乙二醇酯过滤膜过滤溶液。
- 称取低粘度海藻酸钠粉末（1g），并将其溶解在25mL NaCl溶液（步骤3.1）中，在60-80°C的高温下过夜，以获得4%（w / v）海藻酸钠储备溶液。储备溶液可以在4°C下储存1个月。
- 通过将海藻酸钠储备溶液（步骤3.2）在烤箱（70°C）中加热三次30分钟来灭菌。
- 在0.9%NaCl溶液（步骤3.1）中以2%，1.5%和0.5%（w / v）的浓度稀释适当体积的海藻酸钠储备溶液（步骤3.3）。
注意：除了在烘箱中加热外，海藻酸钠溶液的其他制备过程应在通风橱中进行。 - 将1g明胶粉在25mL NaCl溶液（步骤3.1）中溶解，在60-80°C的高温下过夜，以获得4%（w / v）明胶储备溶液。储备溶液可以在4°C下储存1个月。
- 通过在烤箱（70°C）中加热三次30分钟来灭菌明胶储备溶液（步骤3.5）。
- 在0.9%NaCl溶液（步骤3.1）中以1.5%（w / v）的浓度稀释适当体积的明胶储备溶液（步骤3.6）。
注意：除了在烘箱中加热外，明胶溶液的其他制备过程应在烟罩中进行。 - 为了促进细胞在微载体上的结合，通过将2%（w / v）海藻酸钠溶液和来自大鼠尾巴的I型胶原溶液（4mg / mL）以3：1的比例混合来制备海藻酸盐 - 胶原溶液。用0.1 M NaOH溶液将溶液调节至pH 7.2，并在制备后立即使用。
- 将酪氨酸修饰的HA絮状固体溶解在60-80°C的磷酸盐水缓冲盐水（PBS）溶液中过夜，得到0.8%w/w酪氨酸修饰的透明质酸PBS溶液。储备溶液可以在4°C下储存1个月。
- 通过在烤箱（70°C）中加热三次30分钟来灭菌酪氨酸修饰的HA PBS溶液。
- 将辣根过氧化物酶粉（500酶活性单位/mg）溶解在PBS溶液中，得到8个酶活性单位/mg辣根过氧化物酶PBS溶液。
- 用去离子水稀释过氧化氢溶液（30%，w / w）至4mM。
- 通过将酪氨酸修饰的透明质酸PBS溶液和辣根过氧化物酶PBS溶液以1：1的比例混合，制备修饰的HA-辣根过氧化物酶溶液。
注意：除了在烤箱中加热外，HA-辣根过氧化物酶溶液的其他制备过程应在烟罩中进行。
4. 基于AVIFJ的微滴形成
- 使用先前报告的家庭建立的电池打印系统（图1A）26。波形发生器输出的电信号首先被放大，然后驱动压电陶瓷产生可控的变形。因此，固定在压电陶瓷上的喷嘴会产生可控的振动。
- 通过用75%（v / v）酒精和紫外线（UV）暴露过夜来消毒印刷系统。
- 将5毫升生物墨水（步骤3.1）装入一次性无菌注射器中。将注射器安装在注射器泵上。
- 将注射器（步骤4.3）和喷嘴（步骤2.5）与内径为1 mm的硅胶软管连接。
- 通过调整夹紧螺钉的密封度来固定用于打印的喷嘴（步骤4.4）。在安装过程中，保持喷嘴尖端远离基板，以避免损坏和污染。
注意：如果喷嘴在安装过程中破裂，请戴上较厚的手套，并仔细清理玻璃碎片和残留物。 - 快速推动注射泵并将生物墨水（步骤4.3）加载到喷嘴（步骤4.5）。将流速设置为30 μL/min。擦去尖端处多余的材料。
- 设置信号发生器参数。导入包含500，000个采样点的自行设计的波形。将采样率和峰峰值电压（Vpp）分别设置为500万采样/秒和10 V。
- 用去离子水清洁载玻片或培养皿。将它们放在喷嘴下作为印刷基材。
- 将振动的运动路径和触发模式预设为按需下降。
- 按照预先设计的图案打印液滴。
5. 基于AVIFJ的微载体形成
- 重复步骤4.1-4.4，除了将生物墨水更换为2%（w / v）海藻酸盐溶液（步骤3.4），海藻酸盐胶原蛋白溶液（步骤3.8）或改良的HA-辣根过氧化物酶溶液（步骤3.13）。
- 将3克氯化钙溶解到100毫升无菌水中，得到3%（w / v）氯化钙溶液。完全溶解后，通过0.45μm聚对苯二甲酸乙二醇酯过滤膜过滤溶液。
- 将5mL交联溶液（氯化钙溶液或过氧化氢溶液）加入培养皿中。将培养皿放在喷嘴下方，作为基材工作。
- 打印后，交联微载体3分钟。
- 在离心管中收集微载体悬浮液，并通过以29× g 离心3分钟来富集微载体。将微载体重悬于培养基中约600微载体/mL。
6.在微载体表面接种细胞
- 用细胞追踪器绿色CMFDA染色A549细胞，以促进细胞观察。具体而言，除去培养基，加入5mL含有10μM细胞追踪器染料的无血清培养基，并在培养箱中孵育细胞30分钟。然后，用新鲜培养基替换染料溶液。
- 以1.6×10 6 个细胞/mL的密度重悬A549细胞悬浮液。
- 将1 mL海藻酸盐胶原蛋白微载体悬浮液（步骤5.3）和1 mL A549细胞悬浮液（步骤6.1）加入低粘附的6孔培养板中。
- 将板以30rpm的速度放入37°C和5%CO 2的培养箱中的振荡器上。
- 将盘子从摇摇杯上取下，等待30分钟，让微型载体稳定下来。一半每2天更换一半培养基。
7. 微滴/微载体形成分析
- 在明场显微镜或共聚焦显微镜下观察和测量喷嘴（步骤2.2），培养皿（步骤4.10和步骤5.4）和具有微载体的细胞（步骤6.5）。具体而言，物镜放大倍率为4倍、10倍或20倍，目镜放大倍率为10倍。
- 通过ImageJ软件测量微载体的直径。根据图片中拍摄时显微镜随附的比例尺，在ImageJ中设置比例尺的实际尺寸，绘制微载体半径或半长轴的10条线。ImageJ可以得到这些线段的平均大小和标准偏差。
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Representative Results
制造了不同收敛速率和直径的打印头，以实现多种类型的材料的打印。随着拉力的增加而获得的喷嘴如图 1B所示。喷嘴分为三个区域：储液槽（III），收缩（II）和打印头（I）。储液罐是喷嘴的未加工部分，其中液体提供静压和生物墨水输入以进行打印。收缩区域是产生向下驱动力的主要部分。拉力对打印头有显著影响，显示出较低的收敛率和扩展的拉力。较窄和较长的打印头增加了印刷过程中的表面张力，使得离散微滴的形成更加困难，但在随后的操作中有利于切割较小直径的尖端。之后，使用针锻仪器，以指定直径切断打印头（图1C）。具有各种直径（包括100，120，150和200μm）的尖端可用于产生不同尺寸的微载体，满足各种 体外 微组织的要求。
首先通过在培养皿上打印液滴来验证印刷过程的稳定性和可控性。使用30μm尖端喷嘴，稳定地打印了多个生物墨水，包括PBS，1.5%海藻酸盐和1.5%明胶（图2A，B）。打印某种生物墨水的难度反映在用于打印的采样率和Vpp上。低粘度的生物墨水，如NaCl溶液，以较小的参数打印，导致较小的液滴直径。随着粘度的增加，印刷过程相应地变得更加困难，因为需要更大的驱动力和更大的液滴（图2B）。通过这种机制，给定生物墨水的参数和驱动力的调整可用于调整不同的液滴尺寸，如图 2C所示。 图2D 显示了液滴在平坦表面上形成特定字母"THU"的排列。此外，微观观察的组合允许在100μm内的较小尺度上定位微滴。
海藻酸盐微载体（图3A）和HA微载体（图3C）用不同直径的尖端打印。尖端直径对海藻酸盐微载体直径的影响如图 3B所示。当尺寸太小时，受溶液挥发引起的阻塞的限制，印刷海藻酸盐微载体的最小直径约为100μm。而最大直径可达300μm。印刷的微载体的直径随着尖端直径的增加而增加，并且始终大于后者。当尖端的直径大于250μm时，无法打印出生物墨水。印刷改性HA微载体的直径为76.7±1.8μm，尖端直径为75μm（图3C）。
将A549细胞和海藻酸盐 - 胶原蛋白微载体接种在平板中并放置在培养箱中的振荡器上。观察细胞在混合2天后粘附在海藻酸盐 - 胶原微载体上。细胞通过增殖逐渐覆盖微载体的较大表面。培养6天后，A549细胞几乎完全覆盖了微载体表面。这一结果证实，所开发的微载体可以很好地结合细胞，并为细胞提供合适的生长环境。A549细胞粘附和增殖在微载体表面的明场图像和共聚焦图像如图 4所示。
图1：AVIFJ打印系统和各种直径喷嘴的制备。（B）在特定的PULL参数下，喷嘴的打印头被塑造成以不同的速率收敛。比例尺：200 μm。（三）用针锻仪器，在指定位置切断针尖。比例尺：200 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：AVIFJ打印不同浓度的多种类型的生物材料。尖端的直径为30μm。比例尺：100 μm。（B）在各种参数下打印多种类型的水凝胶材料，包括PBS，1.5%海藻酸盐和1.5%明胶。M：每秒一百万个样本，反映单个振动的持续时间。V：峰峰值电压，反映单次振动的行程。比例尺：100 μm。（三）印刷0.5%海藻酸盐在各种参数。比例尺：100 μm。（D）液滴的二维排列和紧密定位。比例尺：200 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：用不同直径的喷嘴尖端打印的微载体（A）2%的海藻酸盐微载体，用喷嘴尖端直径分别为70，100，130，160，210和250μm打印。比例尺：100 μm。（B）喷嘴尖端直径对微型载波尺寸的影响。使用ImageJ软件对用不同直径的喷嘴打印的微载体的尺寸进行了统计分析。为每个喷嘴选择并计算十个微载体。数据以平均± s.d. （C）印刷的改性HA微载体表示，尖端直径为75μm。比例尺：100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：藻酸盐胶原微载体上的种子细胞 （A）A549细胞在微载体表面粘附和增殖的明场图像。比例尺：100 μm。（B）A549细胞在微载体表面粘附和增殖的共聚焦图像。比例尺：100 μm。虚线椭圆用于突出显示微载体的边框。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
这里描述的方案为制备多种类型的水凝胶微载体和随后的细胞接种提供了说明。与微流控芯片和喷墨打印方法相比，AVIFJ构建微载体的方法具有更大的灵活性和生物相容性。独立的喷嘴使各种轻质喷嘴（包括玻璃微量移液器）可用于这些印刷系统。高度可控的加工使储液器体积、内径和打印头形状等参数可以自由调整。此外，一次性喷嘴便于在多种材料之间切换进行灭菌，从而避免了重复使用的潜在污染。最后，小而快速的位移，而不是严重的力和热条件，在印刷过程中直接作用于喷嘴，最大限度地保持印刷生物墨水的原始物理和化学性质;此功能对生物材料应用极具吸引力。
成功生产正确尺寸的微载体的最关键步骤是：1）制备具有适当直径尖端的喷嘴，以及2）根据印刷生物墨水的粘度调整合适的采样率和Vpp。通过去除卫星液滴和施加外部驱动力，进一步实现了微载体结构的稳定性。增加的参数有利于微载波的形成，但驱动力过大是卫星微载波形成的关键原因，导致微载波尺寸不均匀。因此，为了提高微载体尺寸的均匀性，建议使用适当（不过度）的采样率和Vpp。提高微载体稳定性的另一个方面是外部驱动力的应用。外部驱动力与静压和向下驱动力相辅相成，共同克服了尖端的表面张力。试验了注射泵推力，以向喷嘴供给并补充额外的推力。具体而言，喷嘴连接到注射器，其推动速度由精密注射器泵调节。该方法允许相同浓度的水凝胶溶液在有限参数下形成微滴，这有利于减小微载体的尺寸。其他研究报告了使用静电场或挤压储液槽来促进微滴打印27，28。
虽然应用外部驱动力有望拓宽可印刷油墨的类型和浓度范围，但这里使用的印刷技术仍然面临驱动力有限的挑战，并且对于高粘度油墨仍然无效。
初步验证了使用AVIFJ 3D打印机制备微载体和细胞粘附的可行性。随后的工作将集中在微载体在生物模型构建中的潜在应用。在未来的研究中，将优化细胞粘附过程，使细胞的数量和类型进一步增加和丰富，从而有望形成功能性组织或血管网络。此外，生物墨水将进一步与细胞共印，以形成功能异质结构单元。微胶囊，微颗粒和其他结构也可以加载到微载体内，以形成临床使用的持续药物释放模型。总之，已经开发了一种用于构建组织微单元的方法，这些微单元有望扩大规模以形成 体外 功能微组织。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由北京市自然科学基金（3212007）、清华大学计划科研计划（20197050024）、清华大学春风基金（20201080760）、国家自然科学基金（51805294）、国家重点研发计划（2018YFA0703004）和111工程（B17026）共同资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
