Summary
ここでは、ヒドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、粘性慣性力を交互に駆動する穏やかな3D印刷技術を紹介します。自家製ノズルは柔軟性を提供し、異なる材料や直径を簡単に交換できます。直径50〜500μmの細胞結合マイクロ担体を取得し、さらなる培養のために回収することができる。
Abstract
マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、大規模細胞培養用担体として一般的に使用されています。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の1つとなっており、大規模な細胞増殖の分野で一般的に使用されている。マイクロキャリアはまた、 インビトロ 組織工学構築および臨床薬物スクリーニングにおいてますます重要な役割を果たすことが示されている。マイクロキャリアを調製するための現在の方法には、マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷が含まれ、これらはしばしば複雑な流路設計、互換性のない二相界面、および固定ノズル形状に依存する。これらの方法は、複雑なノズル加工、不便なノズル交換、および複数のバイオインクに適用した場合の過度の押出力の課題に直面しています。本研究では、直径100~300μmのハイドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、交互粘性慣性力噴射と呼ばれる3Dプリンティング技術を適用した。その後、細胞をマイクロキャリア上に播種し、組織工学モジュールを形成した。既存の方法と比較して、この方法は、幅広い生物活性材料に対して、自由なノズル先端直径、柔軟なノズル切り替え、印刷パラメータの自由な制御、および穏やかな印刷条件を提供する。
Introduction
マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、細胞の大規模培養に一般的に使用されています1,2。それらの外表面は細胞に豊富な増殖部位を提供し、内部は空間的増殖のための支持構造を提供する。球状構造はまた、pH、O2、栄養素および代謝産物の濃度を含むパラメータの監視および制御において利便性を提供する。撹拌槽バイオリアクターと組み合わせて使用すると、マイクロキャリアは従来の培養物と比較して比較的少量でより高い細胞密度を達成することができ、それによって大規模培養を達成するための費用対効果の高い方法を提供する3。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の一つとなっており、幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞などの大規模増殖の分野では大きな進歩を遂げています4。また、理想的な薬物送達ビヒクルおよびボトムアップユニットであることも判明しており、臨床薬物スクリーニングおよびインビトロ組織工学修復においてますます重要な役割を果たしています5。
異なるシナリオにおける機械的特性要件を満たすために、マイクロキャリアの構築に使用するために複数のタイプのヒドロゲル材料が開発されている6,7,8,9,10,11。アルギン酸およびヒアルロン酸(HA)ヒドロゲルは、その良好な生体適合性および架橋性のために、最も使用されるマイクロ担体材料の2つである12,13。アルギン酸塩は塩化カルシウムによって容易に架橋することができ、その機械的特性は架橋時間を変えることによって調節することができる。チラミン共役HAは、過酸化水素および西洋ワサビペルオキシダーゼによって触媒されるチラミン部分の酸化的結合によって架橋される14。コラーゲンは、その独特のスパイラル構造と架橋繊維ネットワークのために、細胞付着をさらに促進するためにマイクロキャリアに混合するためのアジュバントとしてしばしば使用される15,16。
マイクロキャリアを調製するための現在の方法には、マイクロ流体チップ、インクジェット印刷、およびエレクトロスプレー17、18、19、20、21、22、23が含まれる。マイクロ流体チップは、均一なサイズのマイクロキャリアを製造するのに迅速かつ効率的であることが証明されています24。しかし、この技術は複雑な流路の設計と製造プロセスに依存しています25。インクジェット印刷中の高温または過剰な押出力、ならびにエレクトロスプレーアプローチにおける強烈な電界は、材料の特性、特にその生物学的活性に悪影響を及ぼす可能性がある19。さらに、さまざまな生体材料および直径に適用すると、これらの方法で使用されるカスタマイズされたノズルは、処理の複雑さ、高コスト、および柔軟性の低下を限定する。
マイクロ担体調製のための便利な方法を提供するために、交互粘性慣性力噴射(AVIFJ)と呼ばれる3D印刷技術がヒドロゲルマイクロキャリアを構築するために適用されている。この技術は、垂直振動時に発生する下向きの駆動力と静圧を利用してノズル先端の表面張力を克服し、液滴を形成する。厳しい力や熱条件の代わりに、小さな急激な変位が印刷中にノズルに直接作用し、バイオインクの物理化学的特性にわずかな影響を与え、生物活性材料に大きな魅力をもたらします。AVIFJ法を利用して、直径100~300μmの複数の生体材料のマイクロキャリアの形成に成功しました。その上、マイクロキャリアは、細胞によく結合し、接着した細胞に適切な増殖環境を提供することがさらに証明された。
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Protocol
1. 細胞培養
- 高グルコースダルベッコの改変最小必須培地(H-DMEM)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1%ペニシリンGおよびストレプトマイシン、および1%グルタミンサプリメントでA549細胞の培養培地として補充する。
- A549細胞を37°CのCO2インキュベーターで5%のCO2で培養する
- 継代培養のために細胞を約80%のコンフルエントでトリプシンを用いて解離させる。
- 3 mLのトリプシンを使用して、T75培養フラスコ内の細胞を37°Cで3分間処理し、次いで6 mLの培養培地を加えてトリプシン処理を停止した。
- 培養液をピペットでピペットし、緩く接着した細胞を回収した。
- 72.5 x g で3分間遠心分離機。上清を除去し、3mLの新鮮な培地で再懸濁する。
- 1mLの細胞懸濁液を、10mLの新鮮な培地を含む新しいT75培養フラスコに移す。2日ごとに培養液を交換する。
2. ノズルの作製
- ガラス製マイクロピペットをメーカーの指示に従ってプーラーにロードします。マイクロジェットパイプの外径、内径、長さは、それぞれ1.5mm、1.1mm、100mmです。
- プーラーの引っ張りパラメータを設定します。具体的には、HEAT、PULL、VELOCITY、TIME、および PRESSURE の値は、デフォルトでそれぞれ 560、255、255、150、および 500 に設定されます。これらのパラメータでノズルを引き出します。
警告: 引き抜いた後に得られるノズルは非常に鋭く、不注意な操作は怪我の原因となります。 - 得られたノズルをメーカーの指示に従ってマイクロフォージ装置で指定直径で切断し(ステップ2.2)、特定の先端直径を得る。具体的には、ノズルの指定された直径を加熱された白金線上に配置します。ワイヤを60°Cまで約5秒間加熱し、ノズルを引き離します。
- ノズルのプリントヘッドを疎水性薬剤に30分間浸漬し、続いて滅菌水ですすぎの3サイクルを行った。
- 印刷する前に、ノズルをアルコールで5分間滅菌し、滅菌水で3回すすぎ、残留アルコールを除去します。
ヒドロゲルバイオインクの調製
- NaCl(0.45 g)を50 mLの滅菌水に溶解し、0.9%(w/v)NaCl溶液を得た。溶液を振動させて溶解を促進する。完全に溶解した後、0.45μmのポリエチレンテレフタレート濾過膜を通して溶液を濾過する。
- 低粘度アルギン酸ナトリウム粉末(1g)を秤量し、60〜80°Cの高温で一晩25mLのNaCl溶液(ステップ3.1)に溶解し、4%(w / v)アルギン酸ナトリウムストック溶液を得た。原液は4°Cで1ヶ月間保存することができる。
- アルギン酸ナトリウム原液をオーブン(70°C)で30分間3回加熱して殺菌する(工程3.2)。
- 適切な量のアルギン酸ナトリウムストック溶液(ステップ3.3)を0.9%NaCl溶液(ステップ3.1)に2%、1.5%、および0.5%(w / v)の濃度で希釈する。
注:オーブンでの加熱に加えて、アルギン酸ナトリウム溶液の他の調製プロセスはフード内で行うべきである。 - ゼラチン粉末1gを25mLのNaCl溶液に溶解(工程3.1)し、60〜80°Cの高温で一晩、4%(w/v)ゼラチン原液を得た。原液は4°Cで1ヶ月間保存することができる。
- ゼラチン原液をオーブン(70°C)で30分間3回加熱して殺菌する(工程3.5)。
- 適切な量のゼラチン原液(ステップ3.6)を0.9%NaCl溶液(ステップ3.1)に1.5%(w/v)の濃度で希釈する。
注:オーブンでの加熱に加えて、ゼラチン溶液の他の調製プロセスはフード内で行うべきである。 - マイクロキャリア上の細胞結合を促進するために、ラット尾部からの2%(w/v)アルギン酸ナトリウム溶液とI型コラーゲン溶液(4mg/mL)を3:1の割合で混合してアルギン酸 - コラーゲン溶液を調製する。0.1 M NaOH溶液で溶液をpH 7.2に調整し、調製直後に使用する。
- チロシン修飾HA凝集性固体をリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)溶液に60-80°Cで一晩溶解し、0.8%w/wチロシン修飾ヒアルロン酸PBS溶液を得た。原液は4°Cで1ヶ月間保存することができる。
- チロシン修飾HA PBS溶液をオーブン(70°C)中で30分間3回加熱して滅菌する。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ粉末(500酵素活性単位/mg)をPBS溶液に溶解し、8酵素活性単位/mg西洋ワサビペルオキシダーゼPBS溶液を得る。
- 過酸化水素水(30%、w/w)をDI水で4mMに希釈する。
- チロシン修飾ヒアルロン酸PBS溶液と西洋ワサビペルオキシダーゼPBS溶液を1:1の割合で混合して変性HA-西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を調製する。
注:オーブンでの加熱に加えて、HA-西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液の他の調製プロセスはフード内で行うべきである。
4. AVIFJに基づく微小液滴形成
- 以前に報告したように、自家製のセル印刷システムを使用します(図1A)26。波形発生器によって出力された電気信号は、まず増幅され、次に圧電セラミックスを駆動して制御可能な変形を生成する。圧電セラミックに固定されたノズルは、制御可能な振動を生成します。
- 75%(v/v)アルコールと紫外線(UV)暴露で一晩拭き取って印刷システムを滅菌します。
- 5 mLのバイオインク(ステップ3.1)を使い捨て滅菌シリンジにロードします。シリンジポンプにシリンジを取り付けます。
- シリンジ(ステップ4.3)とノズル(ステップ2.5)を内径1mmのシリコーンホースで接続します。
- クランプネジの気密性を調整して、印刷に使用するノズルを固定します(ステップ4.4)。設置中は、損傷や汚染を避けるためにノズルの先端を基板から遠ざけてください。
警告: 取り付け中にノズルが壊れた場合は、厚手の手袋を着用し、ガラスの破片や残留物を慎重に清掃してください。 - シリンジポンプを素早く押し、バイオインクをノズルにロードします(ステップ4.5)。流量を30μL/分に設定します。先端の余分な材料を拭き取ります。
- 信号発生器のパラメータを設定します。500,000サンプリングポイントを含む自己設計波形をインポートします。サンプリングレートとピークツーピーク電圧(Vpp)をそれぞれ500万サンプル/秒と10Vに設定します。
- スライドやペトリ皿を脱イオン水できれいにする。印刷基材としてノズルの下に置きます。
- モーションパスとトリガモードの振動をドロップオンデマンドとしてプリセットします。
- 事前に設計されたパターンに従って液滴を印刷します。
5. AVIFJに基づくマイクロキャリア形成
- バイオインクを2%(w/v)アルギン酸溶液(ステップ3.4)、アルギン酸コラーゲン溶液(ステップ3.8)、または修飾HA-西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液(ステップ3.13)に変更する以外は、ステップ4.1〜4.4を繰り返します。
- 3gの塩化カルシウムを100mLの滅菌水に溶解し、3%(w/v)塩化カルシウム溶液を得る。完全に溶解した後、0.45μmのポリエチレンテレフタレート濾過膜を通して溶液を濾過する。
- 5mLの架橋溶液(塩化カルシウム溶液または過酸化水素溶液)をシャーレに加える。基板として機能するようにノズルの下にシャーレを置きます。
- 印刷後、マイクロキャリアを3分間架橋する。
- マイクロキャリア懸濁液を遠沈管に集め、29 x g で3分間遠心分離してマイクロキャリアを濃縮する。マイクロキャリアを約600マイクロキャリア/mLで培養培地に再懸濁する。
6. マイクロキャリア表面への細胞接種
- A549細胞をセルトラッカーグリーンCMFDAで染色し、細胞の観察を容易にします。具体的には、培養液を除去し、10 μM Cell Tracker色素を含む無血清培地5 mLを加え、インキュベーター内で細胞を30分間インキュベートする。次いで、色素溶液を新鮮な媒体と交換する。
- A549細胞懸濁液を1.6 x 106 細胞/mLの密度で再懸濁する。
- 1 mLのアルギン酸-コラーゲンマイクロキャリア懸濁液(ステップ5.3)および1 mLのA549細胞懸濁液(ステップ6.1)を低接着性6ウェル培養プレートに加える。
- プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーター内の30rpmでシェーカー上に置きます。
- プレートをシェーカーから取り出し、マイクロキャリアが落ち着くまで30分間待ちます。2日ごとに培地を半分交換する。
7. 微小液滴/マイクロキャリア形成の解析
- ノズル(ステップ2.2)、シャーレ(ステップ4.10およびステップ5.4)、およびマイクロキャリアを有する細胞(ステップ6.5)を明視野顕微鏡または共焦点顕微鏡下で観察および測定する。具体的には、対物レンズ倍率は4倍、10倍、または20倍であり、接眼レンズ倍率は10倍である。
- マイクロキャリアの直径をImageJソフトウェアで測定します。写真で撮影するときは顕微鏡に付属のスケールバーに従って、画像Jでスケールの実際のサイズを設定し、マイクロキャリアの半径または半長径の10本の線を引きます。ImageJ は、これらの線分の平均サイズと標準偏差を取得できます。
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Representative Results
さまざまな収束速度と直径のプリントヘッドが製造され、複数のタイプの材料の印刷が実現しました。引っ張り強度の増加に伴って得られたノズルを 図1Bに示す。ノズルは、リザーバ(III)、収縮(II)、およびプリントヘッド(I)の3つの領域に分割された。リザーバはノズルの未処理部分であり、液体が静圧を提供し、印刷用のバイオインク入力を行った。収縮領域は、下向きの駆動力を生成するための主要な部分でした。引っ張り強度はプリントヘッドに大きな影響を与え、引っ張り強度が伸びると収束率が低くなりました。プリントヘッドが狭く長くなると、印刷中の表面張力が上昇し、離散的な微小液滴の形成がより困難になったが、その後の操作でより小さな直径の先端の切断が容易になった。その後、針鍛造装置を用いて、プリントヘッドを指定された直径で切断した(図1C)。100、120、150、および200μmを含む様々な直径のチップは、様々な インビトロ マイクロ組織の要件を満たす、異なるサイズのマイクロキャリアを生成するために利用可能であった。
印刷プロセスの安定性と制御性は、最初にペトリ皿に液滴を印刷することによって検証されました。30μmの先端ノズルで、PBS、アルギン酸1.5%、ゼラチン1.5%を含む複数のバイオインクを安定して印刷しました(図2A、B)。特定のバイオインクを印刷することの難しさは、印刷に使用されるサンプリングレートおよびVppに反映された。NaCl溶液などの低粘度バイオインクは、より小さなパラメータで印刷され、その結果、液滴直径が小さくなった。粘度が上昇するにつれて、より大きな駆動力が必要となり、より大きな液滴が得られるため、印刷プロセスはそれに応じてより困難になりました(図2B)。このメカニズムにより、 図2Cに示すように、特定のバイオインクのパラメータと駆動力の調整を使用して、さまざまな液滴サイズを調整することができます。 図2D は、平坦な表面上に特定の文字「THU」を形成する液滴の配置を示す。さらに、顕微鏡観察の組み合わせにより、100μm以内のより小さなスケールでの微小液滴の局在化が可能になった。
アルギン酸マイクロキャリア(図3A)およびHAマイクロキャリア(図3C)を、異なる直径の先端で印刷した。アルギン酸マイクロキャリア直径に対する先端直径の影響を図3Bに示す。サイズが小さすぎる場合の溶液の揮発による閉塞によって制限され、印刷されたアルギン酸マイクロ担体の最小直径は約100μmであった。最大の直径は最大300μmに達する可能性がありますが。印刷されたマイクロキャリアの直径は、先端の直径に沿って増加し、常に後者よりも大きい。先端の直径が250μmより大きい場合、バイオインクをプリントアウトすることはできません。印刷された改変HAマイクロキャリアの直径は76.7±1.8μm、先端直径は75μmであった(図3C)。
A549細胞およびアルギン酸コラーゲンマイクロキャリアをプレートに播種し、インキュベーター内のシェーカー上に置いた。細胞を2日間混合した後にアルギン酸コラーゲンマイクロキャリアに接着することが観察された。細胞は、増殖によってマイクロキャリアのより大きな表面を徐々に覆う。6日間の培養後、A549細胞はマイクロキャリア表面をほぼ完全に覆った。この結果は、開発されたマイクロキャリアが細胞とよく結合し、細胞に適切な増殖環境を提供できることを確認しています。マイクロキャリアの表面に接着および増殖するA549細胞の明視野画像および共焦点画像を 図4に示す。
図1:AVIFJ印刷システムと様々な直径のノズルの準備。(B)特定のPULLパラメータの下では、ノズルのプリントヘッドは異なる速度で収束するように成形された。スケールバー:200μm。(C)針鍛造器では、先端を所定の位置で切断した。スケールバー:200μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:AVIFJによる様々な濃度の複数種類の生体材料の印刷 (A)結果のこのセクションで使用したノズル。先端の直径は30μmであった。スケールバー:100μm。(B)PBS、アルギン酸1.5%、ゼラチン1.5%を含む複数種類のハイドロゲル材料を様々なパラメータで印刷する。M:毎秒100万サンプル、単一の振動の持続時間を反映する。V:ピークツーピーク電圧、単一の振動のストロークを反映する。スケールバー:100μm。(c)種々のパラメータで0.5%アルギン酸塩の印刷。スケールバー:100μm。(D)液滴の2D配置および近接配置。スケールバー:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ノズル先端の異なる直径で印刷されたマイクロキャリア。 (A)2%アルギン酸マイクロキャリアは、それぞれ70、100、130、160、210、および250μmのノズル先端直径で印刷された。スケールバー:100μm。(B)マイクロキャリアのサイズに対するノズル先端径の影響。異なる直径のノズルで印刷されたマイクロキャリアのサイズを、ImageJソフトウェアを使用して統計的に分析した。各ノズルについて10個のマイクロキャリアを選択し、計算した。データは、(C)75μmの先端直径を有する印刷された改変HAマイクロキャリアの平均±s.d.として提示される。スケールバー:100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アルギン酸コラーゲンマイクロキャリア上に細胞を播種する (A)マイクロキャリアの表面に接着および増殖するA549細胞の明視野画像。スケールバー:100μm。(b)マイクロキャリアの表面に接着・増殖しているA549細胞の共焦点画像。スケールバー:100μm。点線の楕円は、マイクロキャリアの境界を強調表示するために使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコールは、マルチタイプのヒドロゲルマイクロキャリアの調製およびその後の細胞播種のための指示を提供する。マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷方法と比較して、マイクロキャリアを構築するためのAVIFJアプローチは、より大きな柔軟性および生体適合性を提供する。独立したノズルにより、ガラスマイクロピペットを含む幅広い軽量ノズルをこれらの印刷システムで使用できます。高度に制御可能な処理により、リザーバの体積、内径、プリントヘッドの形状などのパラメータを自由に調整できます。さらに、使い捨てノズルは、複数の材料間で切り替えるための滅菌を容易にし、繰り返し使用による潜在的な汚染を回避します。最後に、厳しい力や熱条件の代わりに、小さくて急速な変位が印刷プロセス中にノズルに直接作用し、印刷されたバイオインクの元の物理的および化学的特性を最大限に維持します。この機能は、生体材料アプリケーションにとって非常に魅力的です。
正しいサイズのマイクロキャリアの製造を成功させるための最も重要なステップは、1)適切な直径の先端を有するノズルを準備すること、および2)印刷されたバイオインクの粘度に応じて適切なサンプリングレートおよびVppを適合させることである。マイクロキャリア構造の安定性は、衛星の飛沫を除去し、外部駆動力を加えることによってさらに達成される。増加したパラメータはマイクロキャリアの形成を促進するが、過剰な駆動力が衛星マイクロキャリア形成の主な理由であり、不均一なマイクロキャリアサイズをもたらす。したがって、マイクロキャリアサイズの均一性を改善するために、適切な(過剰ではない)サンプリングレートおよびVppを使用することが推奨される。マイクロキャリア安定性を向上させるための別の態様は、外部駆動力の付与である。外部駆動力は静圧と下向きの駆動力を補完し、先端の表面張力を克服するために一緒に働きます。シリンジポンププッシュは、ノズルと補足的な追加のプッシュ力を供給するために実験されました。具体的には、ノズルをシリンジに接続し、その押し込み速度を精密シリンジポンプによって調整した。この方法は、同じ濃度のヒドロゲル溶液が限られたパラメータで微小液滴を形成することを可能にし、これはマイクロキャリアのサイズを小さくするのに有益である。他の研究では、微小液滴印刷を促進するために静電場または圧搾リザーバの使用が報告されている27,28。
外部駆動力を加えることで、印刷可能なインクの種類や濃度の幅が広がることが期待されますが、ここで用いられる印刷技術は依然として駆動力の制限という課題に直面しており、高粘度インクには未だ効果がありません。
AVIFJ 3Dプリンタを用いたマイクロキャリア調製および細胞接着の実現可能性を予備的に検証した。その後の研究は、生物学的モデルの構築におけるマイクロキャリアの潜在的な用途に焦点を当てる。今後の研究では、細胞接着プロセスを最適化して、細胞の数と種類をさらに増加させ、富化させ、機能的な組織または血管網を形成することが期待されます。その上、バイオインクはさらに細胞と共同印刷され、機能的な不均一な構造単位を形成する。マイクロカプセル、微粒子、および他の構造もまた、マイクロキャリアの内部に装填して、臨床使用のための持続薬物放出モデルを形成することができる。要約すると、組織マイクロユニットを構築するための方法が開発されており、イン ビトロで 機能的なマイクロ組織を形成するためにスケールアップされることが期待されている。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、北京自然科学財団(3212007)、清華大学イニシアチブ科学研究プログラム(20197050024)、清華大学春風基金(20201080760)、中国国家自然科学財団(51805294)、中国国家重点研究開発プログラム(2018YFA0703004)、および111プロジェクト(B17026)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
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