Summary
Præsenteret her er en mild 3D-udskrivningsteknik drevet af vekslende viskøse inertikræfter for at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere. Hjemmelavede dyser giver fleksibilitet, hvilket gør det nemt at udskifte forskellige materialer og diametre. Cellebindende mikrobærere med en diameter på 50-500 μm kan opnås og opsamles til yderligere dyrkning.
Abstract
Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal, som almindeligvis anvendes som bærere til store cellekulturer. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning og anvendes almindeligvis inden for celleudvidelse i stor skala. Mikrobærere har også vist sig at spille en stadig vigtigere rolle i in vitro-vævsteknisk konstruktion og screening af kliniske lægemidler. Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere omfatter mikrofluidiske chips og inkjetudskrivning, som ofte er afhængige af komplekst flowkanaldesign, en inkompatibel tofaset grænseflade og en fast dyseform. Disse metoder står over for udfordringerne ved kompleks dysebehandling, ubelejlige dyseændringer og overdrevne ekstruderingskræfter, når de påføres flere bioblæk. I denne undersøgelse blev en 3D-udskrivningsteknik, kaldet vekslende viskøs-inertial kraftstråle, anvendt til at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere med en diameter på 100-300 μm. Celler blev efterfølgende podet på mikrobærere for at danne vævstekniske moduler. Sammenlignet med eksisterende metoder tilbyder denne metode en fri dysespidsdiameter, fleksibel dyseskift, fri kontrol over udskrivningsparametre og milde udskrivningsforhold for en lang række bioaktive materialer.
Introduction
Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal og anvendes almindeligvis til storstilet dyrkning af celler1,2. Deres ydre overflade giver rigelige vækststeder for celler, og interiøret giver en støttestruktur til rumlig spredning. Den sfæriske struktur giver også bekvemmelighed ved overvågning og kontrol af parametre, herunder pH, O2 og koncentration af næringsstoffer og metabolitter. Når mikrobærere anvendes i kombination med omrørte tankbioreaktorer, kan de opnå højere celletætheder i et relativt lille volumen sammenlignet med konventionelle kulturer og derved give en omkostningseffektiv måde at opnå store kulturer på3. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning, og der er gjort store fremskridt inden for storstilet udvidelse af stamceller, hepatocytter, chondrocytter, fibroblaster og andre strukturer4. De har også vist sig at være ideelle lægemiddelleveringskøretøjer og bottom-up-enheder og påtager sig derfor en stadig vigtigere rolle i klinisk lægemiddelscreening og reparation af in vitro-vævsteknik5.
For at opfylde mekaniske egenskabskrav i forskellige scenarier er der udviklet flere typer hydrogelmaterialer til brug ved konstruktion af mikrobærere6,7,8,9,10,11. Hydrogeler af alginat og hyaluronsyre (HA) er to af de mest anvendte mikrobærermaterialer på grund af deres gode biokompatibilitet og tværbindbarhed12,13. Alginat kan let krydsbindes af calciumchlorid, og dets mekaniske egenskaber kan moduleres ved at ændre tværbindingstiden. Tyraminkonjugeret HA er tværbundet ved den oxidative kobling af tyraminmoieties katalyseret af hydrogenperoxid og peberrodsperoxidase14. Kollagen bruges på grund af sin unikke spiralstruktur og tværbundne fibernetværk ofte som en adjuvans til at blande sig i mikrobærerne for yderligere at fremme cellefastgørelse15,16.
Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere inkluderer mikrofluidiske chips, inkjetudskrivning og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist sig at være hurtige og effektive til at producere mikrobærere i ensartet størrelse24. Denne teknologi er imidlertid afhængig af et komplekst flowkanaldesign og fremstillingsproces25. Høj temperatur eller overdreven ekstruderingskræfter under inkjetudskrivning samt intense elektriske felter i elektrospray-tilgangen kan påvirke materialets egenskaber negativt, især dets biologiske aktivitet19. Desuden resulterer de tilpassede dyser, der anvendes i disse metoder, når de anvendes på forskellige biomaterialer og diametre, i begrænset behandlingskompleksitet, høje omkostninger og lav fleksibilitet.
For at tilvejebringe en bekvem metode til mikrobærerforberedelse er en 3D-udskrivningsteknik kaldet vekslende viskøse inertielle kræfter jetting (AVIFJ) blevet anvendt til at konstruere hydrogelmikrobærere. Teknikken udnytter nedadgående drivkræfter og statisk tryk, der genereres under lodret vibration, til at overvinde dysespidsens overfladespænding og dermed danne dråber. I stedet for alvorlige kræfter og termiske forhold virker små hurtige forskydninger direkte på dysen under udskrivning, hvilket forårsager en mindre effekt på bioblækets fysisk-kemiske egenskaber og præsenterer stor tiltrækning for bioaktive materialer. Ved hjælp af AVIFJ-metoden blev mikrobærere af flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm dannet med succes. Desuden blev mikrobærerne yderligere bevist at binde celler godt og give et passende vækstmiljø for klæbede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Suppler højglukose Dulbeccos modificerede Minimum Essential Medium (H-DMEM) med 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% ikke-essentiel aminosyreopløsning (NEAA), 1% penicillin G og streptomycin og 1% glutamintilskud som kulturmedie til A549-celler.
- Kultur A549-celler i en CO2-inkubator ved 37 °C og med 5 % CO2
- Dissociere celler til subkultur ved hjælp af trypsin ved ca. 80% sammenløb.
- Brug 3 ml trypsin til behandling af cellerne i T75-kulturkolben ved 37 °C i 3 minutter, og tilsæt derefter 6 ml dyrkningsmedium for at stoppe trypsiniseringen.
- Pipette kulturmediet for at høste løst klæbede celler.
- Centrifuge ved 72,5 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspend med 3 ml frisk medium.
- 1 ml cellesuspension overføres til en ny T75-dyrkningskolbe indeholdende 10 ml frisk medium. Skift kulturmedium hver anden dag.
2. Forberedelse af dyser
- Læg mikropipetter af glas på aftrækkeren efter producentens anvisninger. Den ydre diameter, indvendige diameter og længde af mikrostrålerøret er henholdsvis 1,5 mm, 1,1 mm og 100 mm.
- Indstil trækparametrene for aftrækeren. Specifikt er værdierne for HEAT, PULL, VELOCITY, TIME og PRESSURE som standard indstillet til henholdsvis 560, 255, 255, 150 og 500. Træk dysen af under disse parametre.
FORSIGTIG: Dysen, der opnås efter at have trukket af, er meget skarp, og skødesløs drift kan forårsage kvæstelser. - Afskær den resulterende dyse (trin 2.2) ved den angivne diameter med en mikrosmedeanordning efter producentens anvisninger for at opnå en bestemt spidsdiameter. Find specifikt dysens specificerede diameter på den opvarmede platintråd. Varm ledningen op til 60 °C i ca. 5 s, og træk dysen fra hinanden.
- Dænk dysens skrivehoved i et hydrofobt middel i 30 minutter efterfulgt af tre cyklusser med skylning med steriliseret vand.
- Før udskrivning steriliseres dysen i alkohol i 5 minutter og skylles med steriliseret vand tre gange for at fjerne den resterende alkohol.
3. Fremstilling af hydrogelbioink
- NaCl (0,45 g) opløses i 50 ml sterilt vand for at opnå en NaCl-opløsning på 0,9 % (w/v). Vibrer opløsningen for at fremme opløsning. Efter at være blevet fuldstændigt opløst filtreres opløsningen gennem en 0,45 μm polyethylenterephthalatfiltermembran.
- Natriumalginatpulver med lav viskositet vejes (1 g), og det opløses i 25 ml NaCl-opløsning (trin 3.1) ved en høj temperatur på 60-80 °C natten over for at opnå en 4 % (w/v) natriumalginatopløsning. Stamopløsningen kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Steriliser natriumalginatopløsningen (trin 3.2) ved at opvarme den tre gange i en ovn (70 °C) i 30 minutter.
- Fortynd det korrekte volumen natriumalginatopløsning (trin 3.3) i 0,9% NaCl-opløsning (trin 3.1) i koncentrationer på 2%, 1,5% og 0,5% (w/v).
BEMÆRK: Ud over opvarmning i ovnen skal andre fremstillingsprocesser af natriumalginatopløsning udføres i emhætten. - 1 g gelatinepulver opløses i 25 ml NaCl-opløsning (trin 3.1) ved en høj temperatur på 60-80 °C natten over for at opnå en gelatineopløsning på 4 % (w/v). Stamopløsningen kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Steriliser gelatineopløsningen (trin 3.5) ved at opvarme den tre gange i en ovn (70 °C) i 30 minutter.
- Fortynd den korrekte mængde gelatineopløsning (trin 3.6) i 0,9 % NaCl-opløsning (trin 3.1) i en koncentration på 1,5 % (w/v).
BEMÆRK: Ud over opvarmning i ovnen skal andre tilberedningsprocesser af gelatineopløsning udføres i emhætten. - For at fremme cellebinding på mikrobærerne fremstilles alginat-kollagenopløsningen ved at blande 2 % (w/v) natriumalginatopløsningen og type I-kollagenopløsningen fra rottehalen (4 mg/ml) i et forhold på 3:1. Opløsningen justeres til pH 7,2 med 0,1 M NaOH-opløsning og anvendes umiddelbart efter tilberedning.
- Det tyrosinmodificerede HA-flokkuleringsfaste faste stof opløses i phosphatbuffersaltvand (PBS)-opløsning ved 60-80 °C natten over for at opnå en 0,8 % w/w tyrosinmodificeret PBS-opløsning af hyaluronsyre. Stamopløsningen kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Steriliser den tyrosinmodificerede HA PBS-opløsning ved at opvarme den tre gange i en ovn (70 °C) i 30 minutter.
- Peberrodsperoxidasepulver (500 enzymaktivitetsenhed/mg) opløses i PBS-opløsning for at opnå 8 enzymaktivitetsenhed/mg peberrodsperoxidase PBS-opløsning.
- Fortynd hydrogenperoxidopløsning (30%, w/w) med DI-vand til 4 mM.
- Den modificerede HA-peberrodsperoxidaseopløsning fremstilles ved at blande tyrosinmodificeret hyaluronsyre PBS-opløsning og peberrodsperoxidase PBS-opløsning i et forhold på 1:1.
BEMÆRK: Ud over opvarmning i ovnen skal andre fremstillingsprocesser af HA-peberrodsperoxidaseopløsning udføres i emhætten.
4. Dannelse af mikrodråber baseret på AVIFJ
- Brug et hjemmeetableret celleudskrivningssystem som tidligere rapporteret (figur 1A)26. Den elektriske signaludgang fra bølgeformgeneratoren forstærkes først og driver derefter piezoelektrisk keramik for at generere kontrollerbar deformation. Dysen fastgjort på den piezoelektriske keramik producerer således kontrollerbare vibrationer.
- Steriliser printsystemet ved at tørre af med 75% (v/v) alkohol og ultraviolet (UV) eksponering natten over.
- Læg 5 ml bioblæk (trin 3.1) i en steril engangssprøjte. Installer sprøjten på sprøjtepumpen.
- Tilslut sprøjten (trin 4.3) og dysen (trin 2.5) med en silikoneslange med en indvendig diameter på 1 mm.
- Fastgør dysen (trin 4.4), der skal bruges til udskrivning, ved at justere spændeskruens tæthed. Hold spidsen af dysen væk fra underlaget under installationen for at undgå skader og forurening.
FORSIGTIG: Hvis dysen er brudt under installationen, skal du bære tykkere handsker og omhyggeligt rydde op i glasfragmenter og rester. - Skub hurtigt sprøjtepumpen, og læg bioblæk (trin 4.3) i dysen (trin 4.5). Indstil strømningshastigheden til 30 μL/min. Tør det overskydende materiale af i spidsen.
- Indstil signalgeneratorparametre. Importer selvdesignet bølgeform indeholdende 500.000 prøvetagningssteder. Indstil samplingshastigheden og peak-to-peak-spændingen (Vpp) til henholdsvis 5 millioner prøver / s og 10 V.
- Rengør dias eller petriskåle med deioniseret vand. Placer dem under dysen som udskrivningssubstrat.
- Forudindstille bevægelsesstien og udløsertilstanden for vibration som drop-on-demand.
- Udskriv dråberne efter de foruddesignede mønstre.
5. Dannelse af mikrobærere baseret på AVIFJ
- Gentag trin 4.1-4.4, undtagen at ændre bioblækket til 2 % alginatopløsning (w/v) (trin 3.4), alginat-kollagenopløsning (trin 3.8) eller modificeret HA-peberrodsperoxidaseopløsning (trin 3.13).
- 3 g calciumchlorid opløses i 100 ml sterilt vand for at opnå 3% (w/v) calciumchloridopløsning. Efter at være blevet fuldstændigt opløst filtreres opløsningen gennem en 0,45 μm polyethylenterephthalatfiltermembran.
- Der tilsættes 5 ml tværbindingsopløsning (calciumchloridopløsning eller hydrogenperoxidopløsning) i en petriskål. Placer petriskålen under dysen for at fungere som et substrat.
- Efter udskrivning skal du krydsbinde mikrobærerne i 3 minutter.
- Opsaml mikrobærerophæng i et centrifugerør, og berig mikrobærere ved centrifugering ved 29 x g i 3 minutter. Resuspend mikrobærerne i kulturmedier ved ca. 600 mikrobærere/ml.
6. Inokulering af celler på overfladen af mikrobærere
- Plet A549-celler med Cell Tracker Green CMFDA for at lette observationen af celler. Fjern specifikt kulturmedier, tilsæt 5 ml serumfrit medium indeholdende 10 μM Cell Tracker-farvestof, og inkuber celler i 30 minutter i en inkubator. Udskift derefter farvestofopløsningen med frisk medium.
- Resuspend A549-cellesuspensionen ved densiteten af 1,6 x 106 celler / ml.
- Tilsæt 1 ml alginat-kollagen mikrobærersuspension (trin 5.3) og 1 ml A549-cellesuspension (trin 6.1) i en lavkhævende 6-brønds kulturplade.
- Anbring pladen på en shaker ved 30 o / min i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Tag pladen af rysteren og vent i 30 min for at lade mikrobærerne slå sig ned. Halvdelen ændrer kulturmediet hver anden dag.
7. Analyse af dannelsen af mikrodråber/mikrobærere
- Overhold og mål dysen (trin 2.2), petriskålene (trin 4.10 og trin 5.4) og celler med mikrobærere (trin 6.5) under et lyst feltmikroskop eller konfokalmikroskop. Specifikt er den objektive forstørrelse 4x, 10x eller 20x, og okularforstørrelsen er 10x.
- Mål diameteren af mikrobærerne med ImageJ-software. I henhold til skalalinjen, der følger med mikroskopet, når du optager på billedet, skal du indstille den faktiske størrelse af skalaen i ImageJ og tegne 10 linjer i mikrobærernes radius eller halvstrækkende akse. ImageJ kan få den gennemsnitlige størrelse og standardafvigelse for disse linjesegmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skrivehoveder med varierende konvergenshastigheder og diametre blev fremstillet for at opnå udskrivning af flere typer materialer. Dyserne opnået med stigende trækstyrke er vist i figur 1B. Dyserne blev opdelt i tre områder: reservoir (III), sammentrækning (II) og skrivehoved (I). Reservoiret var den uforarbejdede del af dysen, hvor væsken leverede statisk tryk og bioblækindgang til udskrivning. Sammentrækningsområdet var hoveddelen til at generere nedadgående drivkræfter. Trækstyrken havde en signifikant effekt på skrivehovedet, hvilket viste en lavere konvergenshastighed med udvidet trækstyrke. Det smallere og længere skrivehoved øgede overfladespændingen under udskrivning, hvilket gjorde dannelsen af diskrete mikrodråber vanskeligere, men lettede skæringen af spidser med mindre diameter i efterfølgende operationer. Derefter blev skrivehovedet skåret af med nålesmedningsinstrumentet med den angivne diameter (figur 1C). Spidser med forskellige diametre, herunder 100, 120, 150 og 200 μm, var tilgængelige for at generere mikrobærere i forskellige størrelser, der opfylder kravene i forskellige in vitro-mikrotiser .
Stabiliteten og kontrollerbarheden af trykprocessen blev først verificeret ved at udskrive dråber på petriskåle. Med en 30 μm spidsdyse blev flere bioblæk, herunder PBS, 1,5% alginat og 1,5% gelatine stabilt trykt (figur 2A, B). Vanskeligheden ved at udskrive en bestemt bioink blev afspejlet i prøveudtagningshastigheden og Vpp, der blev brugt til udskrivning. Bioblæk med lav viskositet såsom NaCl-opløsning blev trykt ved mindre parametre, hvilket resulterede i mindre dråbediametre. Med stigende viskositet blev trykprocessen tilsvarende vanskeligere, da de større drivkræfter var nødvendige, og større dråber ville opnå (figur 2B). Med denne mekanisme kan justeringen af parametre og drivkræfter for en given bioblæk bruges til at justere forskellige dråbestørrelser, som vist i figur 2C. Figur 2D viser arrangementet af dråber, der danner de specifikke bogstaver "THU" på en plan overflade. Desuden tillod kombinationen af mikroskopiske observationer lokalisering af mikrodråber i mindre skalaer inden for 100 μm.
Alginatmikrobærere (figur 3A) og HA-mikrobærere (figur 3C) blev trykt med spidser med forskellige diametre. Virkningerne af spidsdiameteren på alginatmikrobærerdiameteren er vist i figur 3B. Begrænset af blokering forårsaget af fordampning af opløsningen, når størrelsen er for lille, var den mindste diameter af de trykte alginatmikrobærere ca. 100 μm. Mens den største diameter kunne nå op til 300 μm. Diameteren af de trykte mikrobærere stiger i takt med spidsdiameteren og er altid større end sidstnævnte. Når spidsens diameter er større end 250 μm, kan bioblækket ikke udskrives. Diameteren af trykte modificerede HA-mikrobærere var 76,7 ± 1,8 μm med spidsdiametre på 75 μm (figur 3C).
A549-celler og alginat-kollagenmikrobærere blev podet i en plade og anbragt på en ryster i inkubatoren. Cellerne blev observeret for at klæbe til alginat-kollagenmikrobærerne efter blanding i 2 dage. Celler dækker gradvist større overflade af mikrobærere ved spredning. Efter dyrkning i 6 dage dækkede A549-celler næsten fuldt ud mikrobæreroverfladerne. Dette resultat bekræfter, at de udviklede mikrobærere kan binde celler godt og give et passende vækstmiljø for cellerne. Lysfeltbilleder og konfokale billeder af A549-celler, der klæber og formerer sig på mikrobærerens overflade, er vist i figur 4.
Figur 1: AVIFJ-tryksystemet og klargøring af dyser med forskellige diametre. (A) Installation af AVIFJ-dyse. (B) Under specifikke PULL-parametre blev dysens skrivehoved formet til at konvergere med forskellige hastigheder. Vægtstang: 200 μm. (C) Med nålesmedeinstrumentet blev spidsen afskåret på bestemte positioner. Vægtstang: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: AviFJ's udskrivning af flere typer biomaterialer i forskellige koncentrationer. (A) Dysen, der anvendes i dette afsnit af resultaterne. Spidsens diameter var 30 μm. Vægtstang: 100 μm. (B) Udskrivning af flere typer hydrogelmaterialer, herunder PBS, 1,5% alginat og 1,5% gelatine ved forskellige parametre. M: en million prøver i sekundet, hvilket afspejler varigheden af en enkelt vibration. V: peak-to-peak spænding, der afspejler slagtilfælde af en enkelt vibration. Vægtstang: 100 μm. (C) Udskrivning af 0,5% alginat ved forskellige parametre. Vægtstang: 100 μm. D) 2D-arrangementer og tæt placering af dråber. Vægtstang: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mikrobærere trykt med forskellige diametre på dysespidsen. (A) 2% alginatmikrobærere, trykt med dysespidsdiametre på henholdsvis 70, 100, 130, 160, 210 og 250 μm. Vægtstang: 100 μm. B) Dysespidsdiameterens virkning på mikrobærerens størrelse. Størrelserne på mikrobærerne trykt med dyser med forskellige diametre blev statistisk analyseret ved hjælp af ImageJ-software. Ti mikrobærere for hver dyse blev udvalgt og beregnet. Data præsenteres som gennemsnitlige ± s.d. (C) Trykte modificerede HA-mikrobærere med spidsdiametre ved 75 μm. Vægtstang: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Såning af celler på alginat-kollagenmikrobærere. (A) Lyse feltbilleder af A549-celler, der klæber og formerer sig på overfladen af mikrobærerne. Vægtstang: 100 μm. B) Konfokale billeder af A549-celler, der klæber og formerer sig på mikrobærerens overflade. Vægtstang: 100 μm. Prikkede ellipser bruges til at fremhæve grænsen til mikrobærere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her giver instruktioner til fremstilling af multityper af hydrogelmikrobærere og efterfølgende cellesåning. Sammenlignet med mikrofluidiske chip- og inkjetudskrivningsmetoder giver AVIFJ's tilgang til konstruktion af mikrobærere større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uafhængig dyse gør det muligt at anvende en bred vifte af letvægtsdyser, herunder mikropipetter af glas, i disse tryksystemer. Den meget kontrollerbare behandling gør det muligt frit at justere parametre, herunder reservoirets volumen, den indre diameter og skrivehovedets form. Desuden letter engangsdysen sterilisering til skift mellem flere materialer, hvilket undgår potentiel forurening ved gentagen brug. Endelig virker små og hurtige forskydninger i stedet for alvorlige kræfter og termiske forhold direkte på dysen under trykprocessen og opretholder de oprindelige fysiske og kemiske egenskaber af det trykte bioink i det maksimale omfang; denne funktion er yderst attraktiv til biomaterialeapplikationer.
De mest kritiske trin for en vellykket produktion af mikrobærere af den korrekte størrelse er: 1) Klargøring af dyser med spidser med passende diametre og 2) tilpasning af den passende prøveudtagningshastighed og Vpp i henhold til viskositeten af den trykte bioink. Stabiliteten af mikrobærerkonstruktionen opnås yderligere ved at fjerne satellitdråber og anvende eksterne drivkræfter. De øgede parametre letter dannelsen af mikrobærere, men overdrevne drivkræfter er hovedårsagen til dannelsen af satellitmikrobærere, hvilket resulterer i en inhomogen mikrobærerstørrelse. For at forbedre ensartetheden af mikrobærerstørrelsen anbefales det derfor at anvende passende (ikke overdrevne) prøveudtagningshastigheder og Vpp. Et andet aspekt til forbedring af mikrobærerstabiliteten er anvendelsen af eksterne drivkræfter. De eksterne drivkræfter supplerer det statiske tryk og de nedadgående drivkræfter og arbejder sammen for at overvinde overfladespændingen ved spidsen. En sprøjtepumpe skubbe blev eksperimenteret med at fodre dysen og supplere yderligere skubbekræfter. Specifikt var dysen forbundet til en sprøjte, hvis skubbehastighed blev justeret af en præcisionssprøjtepumpe. Denne metode tillod den samme koncentration af hydrogelopløsning at danne mikrodråber ved begrænsede parametre, hvilket er gavnligt for at reducere mikrobærernes størrelse. Andre undersøgelser har rapporteret brugen af elektrostatiske felter eller klemningsreservoirer for at fremme mikrodrømmeudskrivning27,28.
Selv om anvendelsen af eksterne drivkræfter forventes at udvide udvalget af typer og koncentrationer af trykbare blæk, står den trykteknik, der anvendes her, stadig over for udfordringen med begrænsede drivkræfter og er stadig ineffektiv til blæk med høj viskositet.
Muligheden for mikrobærerforberedelse og celleadhæsion ved hjælp af en AVIFJ 3D-printer blev foreløbigt verificeret. Efterfølgende arbejde vil fokusere på mikrobærernes potentielle anvendelser i konstruktionen af biologiske modeller. I fremtidig forskning vil celleadhæsionsprocessen blive optimeret, så antallet og typerne af celler vil blive yderligere øget og beriget, hvilket forventes at danne et funktionelt væv eller vaskulært netværk. Desuden vil bioink blive yderligere co-printet med celler for at danne funktionelle heterogene strukturelle enheder. Mikrokapsler, mikropartikler og andre strukturer kan også indlæses inde i mikrobærerne for at danne en vedvarende lægemiddelfrigivelsesmodel til klinisk brug. Sammenfattende er der udviklet en metode til konstruktion af vævsmikroenheder, som forventes at blive skaleret op til at danne in vitro-funktionelle mikrovæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) og 111 Project (B17026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
