Forberedelse af bestrålede og markerede mandlige Aedes aegypti myg til frigivelse i et operationelt sterilt insektteknikprogram

Summary

Den sterile insektteknik (SIT) bruges til at kontrollere specifikke, medicinsk vigtige mygpopulationer, der kan være resistente over for kemiske kontroller. Her beskriver vi en metode til masseopdræt og forberedelse af sterile hanmyg til frigivelse i et operationelt SIT-program rettet mod Aedes aegypti-myggen .

Abstract

Kontrollen af sådanne menneskelige sygdomme som dengue, Zika og chikungunya er afhængig af kontrollen af deres vektor, Aedes aegypti myg, fordi der ikke er nogen forebyggelse. Kontrol af mygvektorer kan stole på kemikalier, der påføres umodne og voksne stadier, hvilket kan bidrage til dødeligheden af ikke-mål og endnu vigtigere føre til insekticidresistens i vektoren. Den sterile insektteknik (SIT) er en metode til bekæmpelse af populationer af skadedyr gennem frigivelse af steriliserede voksne mænd, der parrer sig med vilde hunner for at producere ikke-levedygtige afkom. Dette papir beskriver processen med at producere sterile hanner til brug i et operationelt SIT-program til bekæmpelse af Aedes aegypti myg. Skitseret her er de trin, der bruges i programmet, herunder opdræt og vedligeholdelse af en koloni, adskillelse af mandlige og kvindelige pupper, bestråling og mærkning af voksne hanner og forsendelse af Aedes aegypti-hanner til frigivelsesstedet. Der diskuteres også proceduremæssige forbehold, programbegrænsninger og fremtidige mål.

Introduction

Overførsel af myggebårne patogener til mennesker forårsager millioner af tilfælde af sygdom og dødsfald hvert år over hele verden. I mangel af effektive, godkendte vacciner mod myggebårne sygdomme, såsom Zika eller denguefeber, er en af de mest effektive måder at reducere transmission på at reducere sygdomsvektormygpopulationer. Det er ærgerligt, at et stigende antal myggearter, der traditionelt er mål for pesticider, udviser stigende niveauer af pesticidresistens¹. Samtidig har offentlige myndigheder aggressivt afregistreret eller forbudt tidligere godkendte pesticider, og der udvikles få nye, effektive kemiske kontrolforanstaltninger ^2,3. Denne konstellation af hindringer for myggekontrol har motiveret udforskningen af alternative ikke-kemiske teknikker til at reducere mygpopulationer.

Visse myggearter udgør udfordringer med at kontrollere spørgsmål om resistens og pesticidregistrering. Aedes aegypti (L.) er en fremtrædende sygdomsvektormyg, der er ekstremt vanskelig at kontrollere gennem traditionel integreret vektorstyring på grund af det kryptiske peridomestic habitat, der udnyttes af denne art til umoden udvikling og voksen hvile ^4,5. Udfordringer i forbindelse med udnyttelsen af det kryptiske habitat omkring boliger omfatter vanskeligheden ved at nå disse steder med pesticidsprayteknikker samt den potentielle manglende accept fra offentligheden for gentagen adgang til privat ejendom for folkesundhedsvektorkontrolagenturer til at udføre de intensive overvågnings- og kontrolaktiviteter, der er afgørende for effektiv integreret vektorforvaltning (IVM) for denne art.

Heldigvis anvendes SIT, en tilgang, der har vist sig at være vellykket til varig kontrol af andre meget udfordrende insektarter⁶, på Aedes aegypti-problemet i en banebrydende række eksperimenter og operationelle forsøg baseret i St. Augustine, Florida (KJL, RLA, SCB upublicerede data). SIT er blevet anvendt på en række insektarter, herunder myg, og er blevet gennemgået i dybden ^7,8. SIT udnytter massefrigivelsen af koloniopdrættede hanner, der er steriliseret, for eksempel ved udsættelse for ioniserende stråling eller kemikalier, til at overvælde magevalget af naturlige populationer af kvinder. Steriliserede hanner, der parrer sig med vilde hunner, gør æggene ufrugtbare på grund af skader, som mandlige kønsceller lider, og hvis de er til stede i tilstrækkeligt antal, kan de teoretisk nedbryde den naturlige Aedes aegypti-befolkning.

Et SIT-program blev indledt for at forsøge at reducere populationerne af Aedes aegypti i et byområde i Atlanterhavskysten Florida, hvor denne art for nylig blev genkoloniseret og udvider og udgør en folkesundhedsrisiko for overførsel af vira som Zika, dengue eller chikungunya. For at maksimere potentialet for kompatibilitet med vilde hunner blev der etableret en ny koloni ved hjælp af vildtfanget Aedes aegypti fra målpopulationen til at producere hanner til programmet⁹. Dette var baseret på hypotesen om, at lokalt afledte, koloniopdrættede hanner ville være mere tilbøjelige til at være konkurrencedygtige med lokale vilde hanner til parring med lokale vilde hunner. For at SIT skal være effektiv, skal der ikke kun være et overvældende antal sterile hanner til stede i målområdet, men de skal også være i stand til effektivt at kurtisere og parre sig med lokale vilde hunmyg.

En række eksperimenter blev udført for at bestemme det optimale antal sterile hanner, der skulle frigives (KJL, RLA, SCB upublicerede data) samt optimale doser af stråling, der ville gøre mændene ufrugtbare uden at forstyrre overlevelse, adfærd eller accept af vilde hunner (KJL, RLA, SCB upublicerede data). Disse data kommer i allierede publikationer fra denne gruppe, men nogle af disse fund er også fanget i denne protokol og kan bruges som udgangspunkt for nye SIT Aedes aegypti-kontrolprogrammer andre steder. Denne art udvider konstant sit sortiment, og SIT-programmer viser stort løfte om at være omkostningseffektive, langsigtede løsninger til at kontrollere denne befolkning. Formålet med denne protokol er at producere steriliserede, mandlige, koloniopdrættede Aedes aegypti-myg til systematisk frigivelse i udendørs områder for at forstyrre de naturlige reproduktive cyklusser for lokale Aedes aegypti-populationer i et operationelt folkesundhedsvektorkontrolprogram.

Mens lignende protokoller og arbejdsgange er blevet offentliggjort til produktion af transgene Aedes aegypti-hanner og produktionsarbejdsgange for Aedes SIT, eller Wolbachia-baserede inkompatibilitetsprogrammer er blevet offentliggjort andetsteds, illustrerer denne protokol, hvordan eksisterende protokoller er blevet tilpasset til Aedes aegypti-produktion, adskillelse og bestråling af mandlige pupper, mærkning og emballering af voksne mænd og forsendelse til udgivelsesstedet for dette program ^9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Mærkningskomponenten i denne protokol er muligvis ikke påkrævet i et modent operationelt SIT-program; Det er dog medtaget her, fordi det er en måde at overvåge effektiviteten og kontrollere kvaliteten af hele processen i de tidlige år med at etablere SIT-programmet. Myggekontrolprogrammer drives typisk af lokale myndigheder, så de kan variere meget i mange aspekter af deres organisation fra størrelse og finansieringsbase til tuning af kontroltaktik for at maksimere lokal succes. Den protokol, der er beskrevet heri, bør derfor evalueres med hensyn til kompatibilitet med tilgængelige ressourcer.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol er specifik for håndtering af Aedes aegypti, men kan ændres til at være effektiv for andre mygarter.

1. Produktion og vedligeholdelse af en Aedes aegypti koloni

1. Bageste voksne Aedes aegypti og producerer æg.
   1. Forbered en 0,6 m x 0,6 m x 0,6 m sammenklappelig aluminiumsramme, stort opdrætsbur med 20 x 20 glasfibernetafskærmning og en reach-in stockinette sleeve på en lodret væg.
   2. Placer en 1900 ml plastbalje med Aedes aegypti-pupper (1: 1 kønsforhold) i hvert opdrætsbur, bind ærmet lukket, og lad kopperne være på plads til eclosion, indtil der ikke kommer flere voksne (dvs. ca. 4 dage). På dette tidspunkt skal du fjerne kopperne og holde de voksne opdrætsbure ved 28-30 ° C, >50% relativ luftfugtighed (Rh) og en 12:12 eller 14:10 lys: mørk (L: D) cyklus.
      BEMÆRK: Produktion af Aedes aegypti pupper er beskrevet i afsnit 1.2. Tætheden af pupper i 1900 ml karret skal være sådan, at der er plads nok til, at alle pupper kan komme op for luft samtidigt.
   3. Fireogtyve timer efter, at pupperne er anbragt i opdrætsburene, skal du placere en beholder med 10% saccharoseopløsning med en svampevæge og suspendere en 10 cm x 2 cm svamp gennemblødt i honning fra en trådkrog i hvert bur for at give separate kilder til hydrering og ernæring til voksne myg. Overvåg svampene og saccharosebeholderen for tørhed eller skimmelvækst, og genopfyld eller skift efter behov.
      BEMÆRK: Brug en 120 ml plastkop med en 10 cm x 2 cm svampevæge monteret gennem en udskæring i låget i små opdrætsbure og en 460 ml plastkop med en 12 cm x 8 cm svampevæge i store bure.
   4. Giv et blodmåltid til hvert opdrætsbur 48-72 timer, efter at de fleste voksne er dukket op og hver 2-3 dage derefter for at opretholde et stort antal blodfodrede hunner for at maksimere ægudbyttet. Fyld et lammeskindskondom med 50-100 ml defibrineret kvægblod, og varm til ca. 37 °C i et varmtvandsbad. Brug derefter en klud eller køkkenrulle til at klappe ned og tørre kondomet delvist, inden du lægger det på en papirforet petriskål inde i buret i 30-60 minutter.
      BEMÆRK: Før brug skylles indersiden og ydersiden af hvert kondom med vand 2-3x for at fjerne smøremidler eller andre underlag og kontrollere, om der er huller. Kondomer kan genbruges til 3-5 fodringer ved at skylle blodet ud og opbevare dem i en kop køligt vand. Da nogle kolonier kan opleve myreangreb, kan det være nødvendigt at suspendere kondomer for at begrænse adgangen.
   5. Vent 48-72 timer efter hver blodfodring, og indfør derefter en ovipositionskop i hvert voksent opdrætsbur. Forbered ovipositionskopperne ved at tilføje 200 ml filtreret puppevand (dvs. vandlarverne og pupperne blev opdrættet i) i en plastik 460 ml kop udstyret med en 8-10 cm høj x 30 cm bred ark frøspiringspapir (ovipositionspapir) monteret flush langs koppens indre omkreds. Kontroller ovipositionspapirerne dagligt, udskift dem hver 2-4 dage, og opbevar omhyggeligt de ægbelastede ovipositionspapirer ved at lade dem tørre i 24-48 timer ved >50% Rh¹⁹.
      BEMÆRK: Lad æggebægrene stå i avlsburene i højst 72 timer for at forhindre æggene i at klække.
   6. Vedligehold de voksne opdrætsbure i op til 3-4 uger, før du bryder dem ned og opretter nye voksne opdrætsbure.
      1. For at nedbryde et opdrætsbur skal du fjerne og rense ovipositionskoppen, opbevare det ægbelastede ovipositionspapir, fjerne og rense saccharoseopløsningsbeholderen og honningsvampen og fryse buret for at dræbe alle myg.
      2. Fjern alle myggekroppe, og rengør grundigt indersiden og ydersiden af hvert bur med fortyndet sæbe og vand ved hjælp af papirhåndklæder og skuresvampe med svampe. Lad det rene bur tørre i mindst 24 timer, før det bruges i den næste opdrætscyklus.
         BEMÆRK: Brug vakuumudstyr udstyret med højeffektiv filtrering til at fjerne partikler, der kan føre til allergi. Beholdere med saccharoseopløsning kan rengøres og genbruges 3-5x.
2. Opdræt af Aedes aegypti larver fra æg
   1. Forbered en bestand af larveernæringsopslæmning ved at blande 80 g af et 3: 2-forhold af kvægleverpulver: brygergær i 2200 ml ledningsvand. Forbered pulveriseret fiskemad. Hæld fiskeflager i en krydderikværn og slib til det er et fint pulver.
      BEMÆRK: Denne gylle er udpeget som brun i dette laboratorium.
   2. Brug ægbelastet (5.000-10.000 æg) ovipositionspapir fra trin 1.1.5 til at skære en 3-7 cm del af æggepapiret vinkelret på ovipositionslinjen og læg det i en 460 ml beholder halvt fyldt med ledningsvand sammen med en knivspids pulveriserede fiskemadflager. Dæk til og agiter kraftigt i mindst 1 min.
      BEMÆRK: Æggepapir skal opbevares i mindst 7 dage (men ikke mere end 90 dage, hvilket kan reducere udklækning) efter oviposition, før udklækningsprocessen påbegyndes for at tillade embryonation. Bakterier og alger, der er til stede i fiskefoderet, deoxygenerer hurtigt vandet, hvilket udløser larveudvikling.
   3. Hele beholderens indhold fra trin 1.2.2 hældes i en larveopdrætspande tilberedt med 3 liter ledningsvand og 50 ml brun gylle. Marker gryden med startdato, stammeoplysninger, fodringsplanen pr. tabel 1, og opbevar ved 28-30 ° C, >50% Rh og en 12: 12 eller 14: 10 L: D cykle.
      BEMÆRK: Det brune forhold på 3 liter vand til 50 ml er baseret på vanddybden i de særlige larvepander, der er nævnt i materialetabellen. Pander i forskellige størrelser understøtter forskellige puppetætheder og kræver derfor forskellige mængder vand og brun gylle. Larvefodringshastigheder i tabel 1 er angivet som et interval; udvælgelse af den anvendte mængde er baseret på erfaring og bestemmelse af den generelle sundhed hos de udviklende larver ved hjælp af variabler som vandturbiditet, farve og lugt; tilstedeværelse af bakteriefilm på vandet; antal eller forhold mellem levende og døde larver og larvernes bevægelighed. På dag 3 til 6 fodrer umodne myg pulveriseret fiskemad i henhold til tabel 1. Tilsætning af vand, reduktion af mad og opsætning af 2-3 ekstra pander, end projektet kræver, er måder at håndtere usunde larvepander på.

Dag	Volumen ernæringsmæssig opslæmning tilsat	Tilsat volumen vand	Handlinger
1	50 ml (gylle)	3000 ml
2	(ingen mad)	(intet vand)
3	1/4 - 1/2 tsk (pulveriseret fiskemad)	500-1000 ml
4	1/2 - 3/4 tsk (pulveriseret fiskemad)	500-1000 ml
5	1/2 - 3/4 tsk (pulveriseret fiskemad)	500-1000 ml
6	1/4 - 1/2 tsk (pulveriseret fiskemad)	500-1000 ml
7	(ingen mad)	(intet vand)	stamme pupper og larver

Tabel 1: Foderplan for masseopdræt af Aedes aegypti larver.

2. Adskillelse af mandlige Aedes aegypti pupper

1. Koncentrer pupper fra larvepanderne. Når den omtrentlige tærskelandel af pupper er nået, hældes indholdet af hver gryde gennem en sigte (størrelse 20-40). Brug en klemmeflaske postevand til at vaske pupper og larver ud af sigten til et 3000 ml gradueret plastbægerglas.
   BEMÆRK: Kun 2-3 larvepander bør overføres til hvert 3000 ml bægerglas for at undgå overfyldning, så pupper kan nå overfladen komfortabelt. Pupper forventes at udvikle sig mellem 130-140 timer efter ægklække under de temperatur- og lysforhold, der er nævnt i trin 1.2.3. Forvent mærkbar ægklække samme dag, som æggene sættes op. Afhængigt af miljøforholdene vil ca. 20-70% af larverne have forpuppet og være klar til at blive sigtet inden for 6 dage. Ved at opdele pupperne på flere 3000 ml bægre sikres det, at der kan hældes håndterbare mængder i separatoren.
2. Adskil mandlige pupper fra larverne og kvindelige pupper.
   BEMÆRK: Dette trin kan udføres af en operatør eller to operatører.
   1. For en enkelt operatør, der adskiller hanpupper:
      1. Indholdet af hvert 3000 ml bægerglas, der genereres i trin 2.1, opdeles i flere 1900 ml plastbeholdere for at reducere spild og overbelastning af separatoren. Pladeseparatoren klargøres ved at placere en stiv opsamlingsbeholder på 4000 ml under slusen i bunden af separatoren (figur 1). Fyld to 3000 ml graduerede plastbægre ca. 3/4 fulde af postevand.
         BEMÆRK: Brug en vaskeslange som et alternativ til 3000 ml plastgraduerede bægreglas. Ellers skal bægerglas løbende genopfyldes under hele separationsprocessen. Yderligere detaljer for betjening af puppeseparatoren findes i reference^12,20.
      2. Hæld vand gennem mellemrummet mellem glaspladerne, og juster top- og bundknapperne med eller mod uret, så vandet kontinuerligt kan strømme igennem, samtidig med at der genereres stående vand til en højde på ca. 1,25 cm fra bunden af pladerne. Marker startpositionerne for de nederste knapper med tape. Når stående vand er jævnt fordelt over bunden af glaspladerne med samme højde og afløbshastighed, skal du begynde at hælde indholdet af beholderne med pupper og larver gennem mellemrummet mellem pladerne.
         BEMÆRK: En klar adskillelse skal være til stede mellem små (mandlige) og store (kvindelige) pupper; Ellers skal du skylle dette parti igennem og justere de øverste knapper for at reducere mellemrummet mellem pladerne.
      3. Mens du langsomt hælder vand gennem separatoren, skal du løbende dreje de nederste knapper som et par mod uret ~ 1-2 cm fra den tapemærkede startposition, indtil de fleste eller alle larver er skyllet igennem og gledet ned ad slusen i opsamlingsbeholderen.
         BEMÆRK: Da den ene hånd bruges til at hælde vand, drejer den anden hånd drejeknapperne en ad gangen, men lige og i små trin for langsomt at åbne pladerne. De fleste larver vaskes hurtigt igennem, men der vil være nogle larver fanget med hanpupperne. Disse straggler larver vil blive bestrålet, men vil halte i udvikling og ikke tæt på voksne med fokal kohorte af pupper.
      4. Kassér eller genbrug larverne tilbage i kolonien, men fjern dem i begge tilfælde fra opsamlingsbeholderen, før hanpupperne begynder at vaske gennem separatoren. Sæt processen på pause ved at stoppe vandstrømmen, mens opsamlingsbeholderen i bunden af slusen renses for larver ved at hælde gennem en #30 sigte, som tilbagevaskes i en separat beholder.
         BEMÆRK: Larver strømmer først igennem, efterfulgt af hanpupper og til sidst hunnerne (figur 1).
      5. Fortsæt med at hælde vand og drej bundknapperne, indtil hanlarverne vaskes igennem og adskilles i opsamlingsbeholderen. Sæt processen på pause for at kontrollere og fjerne larver fra opsamlingsbeholderen, før hanpupperne overføres i næste trin.
         BEMÆRK: Antallet af skylninger, der er nødvendige for at adskille hannerne, afhænger af tempoet i vandhældningen og den hastighed, hvormed knapperne drejes. Det tager normalt 2000-2500 ml vand at skylle larverne ud, 1000-1500 ml at skylle hanpupperne ud og 200-400 ml at skylle hunpupperne ud.
      6. Hæld hanpupperne ud af opsamlingsbeholderen gennem en #20 sigte over en vask. Brug en 1000 ml klemmeflaske postevand til at tilbagevaske hanpupperne fra sigten, mens de hældes i en separat 1900 ml beholder.
      7. Når alle hanpupperne er blevet adskilt, skal du fortsætte med at hælde vand gennem separatoren og justere de nederste knapper for at skylle gennem hunpupperne. Overfør hunnerne ved hjælp af sigteprocessen beskrevet i trin 2.2.1.6 i en separat beholder, indtil alle umodne myg skylles ud af separatoren. Kassér hunpupperne. Når batchen er blevet behandlet, skal du returnere knapperne til deres oprindelige startpositioner og gentage processen med den næste batch. Når alle partier er behandlet, skal pladerne stå åbne, så separatoren kan tørre.
         BEMÆRK: Der er ingen perfekt adskillelse ved hjælp af denne enhed, hvilket kræver tålmodighed og øvelse. Stædige pupper eller larver kan løsnes med en kraftig strøm af vand, men ikke i det omfang, at det skubber dem til siderne, hvilket kan forurene fremtidige oversvømmelser.
   2. For to operatorer, der adskiller hanpupperne, ændres punkt 2.2.1 som følger.
      1. Første operatør: Hæld vand gennem separatoren, og drej knapperne trinvist for at adskille larver, hanpupper og hunpupper.
      2. Anden operatør: Når hvert trin er opsamlet i slusebeholderen, sigtes slusebeholderens indhold ud for at opdele larverne, hanpupperne og hunpupperne i flere, separate sluseopsamlingsbeholdere. Hold de store bægre fyldt med vand, hvis der ikke er en vaskeslange til rådighed.

Figur 1: Pupal separator indeholdende et parti umodne Aedes aegypti. Adskillelsen begynder med at hælde vand gennem separatoren, mens de nederste knapper drejes 1-2 cm mod uret, indtil det målrettede sæt, dvs. larver, hanpupper eller hunpupper, er blevet isoleret så meget som muligt fra de sæt, der er tilbage (venstre billede). Højre billede viser adskillelse af larver (laveste bånd), hanpupper (mellembånd) og hunpupper (øvre bånd). Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Tilberedning af Aedes aegypti-hanpupper til bestråling

1. Opdel hanpupperne i plastik 60 mm petriskåle.
   BEMÆRK: Antallet af petriskåle, der er nødvendige, afhænger af, hvor mange hanpupper der er til rådighed til bestråling: en larveopdrætspande fra trin 1.2 fylder ca. 1,5 petriskåle. Puppernes alder varierer fra 1 til 40 timer gammel. I denne protokol kaldes den mindre diameter dybere halvdel af petriskålen bunden, og den lavere halvdel med større diameter kaldes toppen.
   1. Forbered forskårne skiver af filterpapir, så de passer til den indvendige diameter på petriskålbunden. Anbring en vandfugtet filterpapirskive i hver af bunden af petriskålene for at holde pupperne hydreret under hele transporten og bestrålingsprocessen.
   2. Overfør pupperne til petriskåle. Spænd hanpupperne opsamlet i trin 2.2.1.6 med en sigte, og pupperne vaskes i et 1000 ml gradueret bægerglas med så lidt vand som muligt. Hæld forsigtigt pupperne i petriskåle, indtil hver filterpapirskive er jævnt dækket med et enkelt lag pupper (figur 2A - C). Arranger petriskålene ved kanten af et bord i træk for at lette hældningen.
      BEMÆRK: Et alternativ til at spænde pupperne er at klippe spidsen af en plastik 3 ml Pasteur-pipette til en diameter, der er stor nok til at rumme pupperne. Brug pipetten til at overføre pupperne fra beholderen produceret i trin 2.2.1.6 direkte til filterpapirskiverne, så der er et enkelt, tæt pakket lag pupper i hver petriskål. Dette er kun praktisk for små partier.
   3. Brug en uændret 3 ml Pasteur-pipette til at fjerne stående vand fra petriskålens bund for at forhindre puppebevægelse under kønningstrinnet (3.2) og transport.

Figur 2: Overførsel af pupper til petriskåle til bestråling. A) Pupper, der sigtes, hældes og tilbagevaskes til et 1000 ml plastbægerglas. B) Der tilbageholdes mindst muligt vand i bægerglasset for at gøre det lettere at hælde petriskåle i. (C) Petriskåle opstillet langs kanten af en overflade for at lette hældning i et enkelt lag pupper. D) Petriskåle fyldt med pupper stables og sikres til levering til bestrålingsanlægget. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Sex pupperne for at kontrollere for forurening med kvinder. Under et dissekeringsomfang skal du bruge sonder til at rotere hver puppe for at kontrollere den ventrale overflade for en stor størrelse kønslap (figur 3), der angiver mandligt køn. Fjern og kassér pupperne med reducerede eller små kønslober, der angiver hunner, og erstat med et lige antal mandlige pupper for at opretholde det korrekte antal.
   BEMÆRK: I et operationelt program er dette trin ikke praktisk på grund af et stort antal myg, og det faktum, at adskillelse, overførsel, bestråling og forberedelse af bur efter bestråling alle udføres på en dag med begrænset tid. Kvalitetskontrol af en prøve fra udvalgte petriskåle kan udføres, især i tidlige faser af udviklingen af SIT-programmet.

Figur 3: Kønning af pupper ved hjælp af kønsloben . (A) Ventrale og (B) laterale syn på kvindelige () og mandlige (♀ ♂) Aedes aegypti pupper, med genital lobes angivet for at vise den seksuelle dimorfisme. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Dæk bunden med toppen af petriskålene, og fastgør med laboratorietape. De tapede petriskåle pakkes med elastikker i stakke, der er dimensioneret til at passe ind i bestrålingskammeret, og forsegl inde i en mærket 3,8 L genlukkelig pose (figur 2D). Lad ikke pupper forblive afdækket i >1 time.

4. Bestråling af mandlige Aedes aegypti pupper

1. Forbered dosimetrifilm fra samme parti ved at skære 1 cm² firkanter af film og placere hver firkant i sin individuelle konvolut.
   BEMÆRK: Al film, der bruges hver dag, klippes på samme tid. Dette reducerer den lille mængde variation, der induceres af opbevaring. Antallet af firkanter, der er nødvendige for hver stak, er 1 + (antal petriskåle).
2. Forbered et sæt til at tage ind i bestrålingsanlægget, som skal omfatte en laboratorietimer, laboratorietape, permanent markør, forberedte konvolutter af dosimetrifilm, dosimetri-badge og et laboratorienoteark med tjeklister for at holde styr på nøgleoplysninger (figur 4).

Figur 4: Laboratoriebogsoversigt-IR-ark udfyldt for et dosisresponssæt. Tekstfelter med rødt (markeret med røde pile) angiver nyttige noter om de forskellige afsnit og gentager vigtige oplysninger. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Transport af pupperne til bestrålingsanlægget. Anbring petriskålene af hanpupper fra trin 3.3 i isolerede beholdere og opbevar uden for direkte sollys og med aircondition under transport.
4. Forbered stakke af petriskåle til bestråling ved bestrålingen. Stak det passende antal petriskåle, så de passer i bestrålingskammeret, med en dosimetrifilmkuvert centreret mellem hvert fad og øverst og nederst i stakken. Fastgør konvolutterne og hele stakken med laboratorietape for at forhindre spild og lette placeringen af stakken i kammeret.
5. Bestråle petriskålene af mandlige pupper. Stakken af petriskåle anbringes på det stive metalnet i kammeret for at placere den korrekte højde for den optimale eksponeringskegle baseret på tidligere dosiskortlægning af den specifikke bestrålingsenhed²¹. Aktiver pladespilleren på bestrålingen og bestråling, samtidig med at laboratorietimeren startes. Bestråle i det passende interval for at opnå den ønskede dosis (eksempler er vist i tabel 2).
   BEMÆRK: Denne protokol er baseret på en cæsium-137 bestråler (se materialetabellen) og en måldosis på 50 Gy. Da Cs-137 henfalder over tid, justeres dosishastigheden hvert år ved at udføre en dosis-respons-serie ved hjælp af alanindosimetre, suppleret med radiokromisk film til rutinemæssig dosimetri og alanin i ca. 10% af bestrålede prøver. I betragtning af den nuværende dosishastighed på 8,8 Gy / min kræver opnåelse af måldosis på 50 Gy 5 min, 41 s eksponering. Rutinemæssig filmdosimetri forekommer som beskrevet i trin 4.7. Alanine pellet dosimetri udføres på enten National Center for Electron Beam Research ved Texas A &M University eller på National Institute of Standards and Technology i Gaithersburg, MD, USA.

Dosering (Gy)	Tid (baseret på 8,8 Gy/min)
0	NA
10	1 minut 8 s
30	3 minutter 24 s
50	5 minutter 41 s
65	7 minutter 23 s
85	9 minutter 39 s
100	11 minutter 22 s
110	12 minutter 30 s

Tabel 2: Eksempel doseringstider for Cæsium-137 bestråleren.

6. Når den foreskrevne tid er gået, skal du fjerne petriskålene fra bestrålingen og forsigtigt demontere stakken. Mærk alle petriskåle og filmkuverter med dato og sted i stakken. Forsegl konvolutterne og opbevar til dosimetri. Pak petriskålene i den isolerede beholder til transport tilbage til hovedlaboratoriet.
   BEMÆRK: Registrer, om der er opstået voksne under bestrålingen, og markér den berørte petriskål, så den eller de voksne ikke slipper ud, når pupperne sættes i opdrætsburene (trin 5.2).
7. Bekræft bestrålingsdosis med dosimetrifilm ved at måle filmen ca. 24 timer efter eksponering. Aktiver dosimetrilæseren, og lad den balancere til stuetemperatur. Filmen indlæses med tang, der følger med læseren, og følg fabrikantens anvisninger for læsning af den bestrålede film samt den ubestrålede blankfilm fra samme parti. Nul læseren uden film mellem aflæsningerne, og optag data som i eksemplet på databladet vist i figur 5.
   BEMÆRK: Denne protokol er baseret på ND0.5 og ND1.0 QA Filter Set standarder. Det er vigtigt at måle filmen med den matte side vendt mod operatøren.

Figur 5: Dosimetridatablad udfyldt med eksempeldata. Kolonneoverskrifterne beder operatøren om at registrere nøgledata til senere analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Opdræt af bestrålede Aedes aegypti-hanpupper til voksne

1. Rengør og klargør små plastbure af 30 cm x 30 cm x 30 cm, så de er klar til bestrålede pupper, når de vender tilbage til hovedlaboratoriet. For hver 2 petriskåle af bestrålede hanpupper tilberedes 1 opdrætsbur. Hvert opdrætsbur skal udstyres med et halvfyldt plastikbæger indeholdende 460 ml postevand og en beholder med 10 % saccharoseopløsning som beskrevet i trin 1.1.3.
2. De bestrålede pupper overføres straks til de forberedte opdrætsbure efter hjemkomsten fra bestrålingsanlægget. Brug en klemmeflaske vand til forsigtigt at vaske pupperne fra hver petriskål i de 460 ml vand i plastikkoppen i hvert opdrætsbur. Efter 24 timer overføres kopperne til nye, rene opdrætsbure, der indeholder ernæringskilden, og afventer resterende eclosion af voksen, mandlig bestrålet Aedes aegypti.
   BEMÆRK: Hvis der er opstået pupper under bestrålingsprocessen, skal petriskålene med løbesedlerne åbnes i et tomt bur, og derefter fortsætte med trin 5.2. Kassér mændene samlet i dette bur. Pupper overføres til nye opdrætsbure efter 24 timer, fordi hanner dukker op før hunner i samme kohorte, og isolering af dagene for fremkomsten kan reducere forekomsten af kvindelig forurening og sikre nøjagtig aldring af hanner.

6. Mærkning og vejning af bestrålede voksne Aedes aegypti-hanner

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen forudsætter, at to personer udfører opgaverne; for 1 person, se 6.4.

Figur 6: Pakning af mærket, bestrålet, mandlig Aedes aegypti i frigivelsesbeholdere. (A) Slip beholderen, der viser stockinette fastgjort til et hul, der er skåret i siden af kartoncylinderen med maskeringstape, hæfteklammer og varm lim. Rammen er på plads med en maskeringstape etiket bagside fastgjort til siden. Rammen bevarer det tæt trukne tylnetdæksel; Et elastikbånd (ikke synligt) holder også tyllen på plads under rammen. (B) Parti bedøvede hanner i færd med at blive tumlet i lyserødt farvestof i en lille kartap. (C) Fire frigørelsescontainere inde i isoleret skibscontainer. Bemærk, at stockinette-ærmerne er orienteret mod midten af forsendelsesbeholderen, emballagematerialer er gemt rundt om frigivelsesbeholderne, og ernærings- og hydreringskilder er på plads oven på hver frigivelsesbeholder dækket af en omvendt petriskålsbund, der holdes fast af krydsede elastikker og stykker tape. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Forbered kartonfrigivelsesbeholdere.
   1. Skær et hul på 11,5 cm i diameter i siden af en låget, cylindrisk 3,9 L kartonbeholder på 1,5-3,0 cm fra bunden, så hullet ikke dækkes af låget (figur 6A).
   2. Skær en 40-50 cm længde stockinette, og hæfte den ene ende af den omkring indersiden af hullet på 11,5 cm, der er skåret i 6.1.1. Brug en standard kontorhæftemaskine, der er åbnet, så hæfteklammer kan tvinges gennem lageret og kartonen fra indersiden af beholderen og ind i en passende arbejdsflade, såsom en blok hårdt ekstruderet polystyrenskum. Krymp hæfteklammerne ved hjælp af en fladhovedet skruetrækker for at fastgøre stockinetten tæt til hullets omkreds og fastgør maskeringstape over den krympede side for at forhindre snags. Forsegl kanten af stockinetten på indersiden af cylinderen til kartonen med varm lim og krydstjek hele samlingen for flugthuller.
   3. Opret en fastholdelsesramme ved at fjerne den indre skive fra låget og skære en 33 cm x 33 cm firkantet nylontyllnet fint nok til at bevare voksne mandlige Aedes aegypti myg. Placer masken på den åbne ende af cylinderen, og monter rammen over masken for at holde den på plads uden huller. Træk masken nedad, så den stikker ud under rammen for at gøre masken lært over den åbne ende, og forsegl det fremspringende net tæt mod cylinderen med et gummibånd.
   4. Placer et 10 cm stykke maskeringstape på siden af rammen, der er dækket med et 8 cm stykke mærkningstape, så mærkningsbåndet let kan udskiftes uden at rive rammen.
      BEMÆRK: Frigivelsesbeholdere er holdbare og kan genbruges >10x med korrekt håndtering. Før du introducerer hvert nyt parti mærkede, bestrålede, voksne, mandlige myg, skal du kontrollere, at lageret er sikkert fastgjort til beholderen, og straks foretage reparationer, hvis det er nødvendigt.
2. Forbered veje- og mærkningsstationen.
   1. Hæld ca. 50 mg mærkningsfarvestof i en 240 ml kartonbeholder, og fordel farvestoffet jævnt ud som et lag pulver jævnt rundt om beholderens indre overflader. Tryk forsigtigt for at kassere overskydende farvestof. Brug tydeligt mærkede kopper til flere farvestoffer for at holde farverne adskilt.
   2. Tjare en 100-500 g vejebåd på en 0,0001 g elektronisk vægt; oprette en dataformular (tabel 3) og tape fire ark med 215,9 mm x 355,6 mm kopipapir sammen for at lave en 431,8 mm x 711,2 mm arbejdsflade.

Slip container	Vægt af myg	Bur nummer	Kvinder i batch	Antal mænd	Slip container	Samlet masse
LYSERØD I	0.024	D1 #1		25	LYSERØD I	2.03
LYSERØD I	2.007	D1 #1	7		LYSERØD II	1.99
LYSERØD II	1.990	D1 #1			LYSERØD III	2.03
LYSERØD III	0.026	D1 #3		25
LYSERØD III	2.000	D1 #3	18

Tabel 3: Tabel over vejestationsdata.

3. Mærke kvantificerede partier af voksne bestrålede mænd med fluorescerende pigment.
   1. Overfør voksne myg (2,5-3,5 dage gamle) fra hvert opdrætsbur til aspiratorhætteglas. Fjern ernæringskilder fra opdrætsburet fra trin 5.2, og placer hele buret i et stort CO₂ -kammer i 5-7 minutter, og bank siderne af beholderen for at fjerne myg, der kan klamre sig til opdrætsburet. Når eksponeringstiden er gået, skal du fjerne opdrætsburet fra kammeret og opsuge alle de voksne myg i en række plastikhætteglas.
      BEMÆRK: Administration af 99,5-100% CO₂ er fra en tank med en regulator, messingmodhage og silikonerør kanaliseret ind i kammeret med en strømningshastighed på 6 L / min. Antallet af hætteglas, der er nødvendige for at rydde opdrætsburet, afhænger af, hvor mange myg der er i buret og operatørens færdigheder, men der kræves typisk 3-5 hætteglas pr. Bur. Vælg en aspirator, der har små hurtigskifthætteglas for at lette håndteringen af voksne myg i partier, for eksempel en ved hjælp af et 60 ml polystyrenopsamlingshætteglas forseglet med 20 x 20 mesh aluminiumsskærm i den ene ende og en klar acetatklapventil i den anden. Hele buret bedøves før aspiration for at reducere tiden til at overføre myg til hætteglas for at reducere stresset på myg og holde protokollen medgørlig.
   2. Sorter alle voksne myg fra hvert opdrætsbur efter køn.
      1. Det første hætteglas udsættes fra trin 6.3.1 til CO 2 i et lille kammer i 4 minutter, og ryst derefter forsigtigt de bedøvede myg ud og spreder dem over den hvide papirarbejdsflade, der er forberedt i trin 6.2.2.
      2. Læg et nyt tomt hætteglas i aspiranten, og opsug forsigtigt alle hanner fra arbejdsfladen, og send dette hætteglas til vejestationen (trin 6.3.3.). Tal eventuelle efterladte hunner, og sug dem ind i et separat hætteglas og kassér sammen med eventuelle knuste hanner.
      3. Gentag denne proces med de resterende hætteglas fra 6.3.1, men på et tidspunkt i kønssorteringsprocessen genereres et separat hætteglas med kun 25 hanner, der også overføres til vejestationen. Gentag trin 6.3.2. for hvert opdrætsbur.
         BEMÆRK: Mens du behandler bestrålede voksne mænd til køn, vejning og mærkning, skal du holde styr på antallet af hunner i hver batch, som er nøgledata til fejlfinding og kvalitetssikring af pupal sex sortering og hele processen. Hvis antallet af kvinder er højere end forventet, skal en anden person udtrække hunner, mens hovedoperatøren aspirerer hannerne. Det er vigtigt at veje en prøve på 25 hanner fra hvert opdrætsbur for at beregne en gennemsnitsvægt pr. myg, som vil blive brugt til at estimere antallet af markerede bestrålede hanner, der frigives i slutningen af protokollen.
   3. Vej og farv partier af voksne mandlige myg.
      1. Ved vejestationen anbringes det første hætteglas med voksne hanmyg fra kønsstationen (pkt. 6.3.2) i et lille CO 2 -kammer i 2 minutter, og myggene rystes forsigtigt ind i den tjærede vejebåd, der er klargjort i trin 6.2.2. Registrer myggenes vægt og hæld myggene i farvekoppen fremstillet i 6.2.1.
      2. Vip og drej langsomt koppen 1 fuld rotation med uret og mod uret, så myggene kommer i kontakt med pulverbelægningen på koppens indre overflader og alle er let støvet med farvestof (figur 6B). Hæld de markerede myg i en vejebåd.
      3. Fortsæt hurtigt til næste trin, så myggene ikke kommer sig og undslipper. Gentag dette trin, indtil alle hætteglas fra punkt 6.3.2 er blevet behandlet.
         BEMÆRK: Hannernes vægt fra det separate hætteglas med 25 hanner, der genereres for hvert opdrætsbur i punkt 6.3.2, registreres og anvendes til at beregne gennemsnitsvægten pr. handyr fra det pågældende bur.
   4. Slip beholderne med mærkede bestrålede voksne hanner. Vejebåden, der indeholder bedøvede, markerede, bestrålede hanmyg, foldes let fra slutningen af punkt 6.3.3. for at oprette en kanal og derefter lede denne kanal gennem stockinette-ærmet for at overføre hannerne til frigivelsesbeholderen. Fortsæt med at tilføje myg, indtil ca. 2,0 g eller 1500-3000 mandlige myg er i frigivelsesbeholderen og bind stockinette-ærmet lukket. Marker mærkningsbåndet på rammen af frigivelsesbeholderen med farvefarve, beholdernummer og total vægt af myg, og kopier disse data til formularen fra trin 6.2.2.
      BEMÆRK: Håndtering af myg på ethvert livsstadium fremkalder stress og kan reducere overlevelse eller kraft. Rækken af bedøvelser beskrevet i denne protokol kan påvirke myggene; forsøg på at forfølge og aspirere ikke-bedøvede myg ved hvert trin ville imidlertid fremkalde større stress og en uholdbar protokol. Den samlede vægt af myg i hver udsætningsbeholder divideres med gennemsnitsvægten pr. hanmyg, der genereres i afsnit 6.3.3, for at udlede et skøn over antallet af hanner i den pågældende udsætningsbeholder. Hver udsætningsbeholder må ikke have mere end 2 g hanner, hvilket svarer til ca. 1 stort opdrætsbur.
4. Ændringer af mærkningsprotokollen for en enkelt operatør
   1. Udfør sexsortering for alle store bure først. Udsæt hvert stort bur for CO₂ i 4-5 minutter og opsæt alle myggene i 4-5 hætteglas. Udsæt hvert hætteglas for CO 2 i_2-3 minutter, tip alle myggene ud på det hvide papirs arbejdsflade, fjern hunnerne og tal, og returner hannerne til deres store bestandsbur.
   2. Vejning og mærkning
      1. Start med det første hanbur, der produceres i trin 6.4.1: Fjern ernæringskilden og bedøm hannerne i et stort CO₂ -kammer i 5-7 min. Aspirer de bedøvede mænd jævnt i separate hætteglas. Gentag dette trin med hvert holdebur i den rækkefølge, de blev produceret.
         BEMÆRK: Der vil blive produceret ca. 2-3 overfyldte hætteglas pr. holdebur. Forarbejdning af mandlige holdebure i den rækkefølge, de blev produceret, maksimerer restitutionstiden for hvert bur af mænd.
      2. Anæstetiser det første hætteglas, der er fremstillet i trin 6.4.2.1. i 1-2 min i et lille CO₂ kammer. Hæld et lille antal myg ud på arbejdsfladen på hvidt papir, opsæt 25 hanmyg i et nyt hætteglas, og behandl som i 6.3.2 for at bestemme gennemsnitsvægten pr. han for det pågældende bur. Returner eventuelle yderligere hanner til kildehætteglasset, eller aspirer ind i et nyt separat hætteglas, der skal behandles senere; Fortsæt med vejning, mærkning og overførsel til frigivelsesbeholderne for resten af hannerne i det første hætteglas som beskrevet i resten af trin 6.3. Gentag trin 6.4.2.2. (bortset fra isolering af 25 hanner i et separat hætteglas) for resten af hætteglassene produceret i trin 6.4.2.1. i den rækkefølge, de blev produceret, og derefter gå videre til det næste kønssorterede opdrætsbur, der blev produceret i 6.4.1.
         BEMÆRK: Arbejdsgange med en person er langsommere, og nogle mandlige myg skal bedøves flere gange. Søg konstant efter og fjern kvindelige myg.

7. Paknings- og forsendelsescontainere med mærket, bestrålet, voksen han-Aedes aegypti

1. Forbered frigivelsescontainerne til forsendelse. Når en frigivelsesbeholder er fyldt med markerede hanner, skal du placere 4 bomuldskugler fugtet med 10% saccharoseopløsning på maskelåget og dække med en omvendt bund af en petriskål, der holdes på plads af to elastikker strakt rundt om hele beholderen og over petriskålen for at danne et kryds. Placer et stykke maskeringstape over X af de to elastikker for at holde dem på plads oven på den omvendte petriskål.
   BEMÆRK: Sørg for, at bomuldskuglerne med 10% saccharoseopløsning ikke er mættet til dryp, hvilket vil beskadige beholderen og fælde og dræbe myg.
2. Pak kartonfrigivelsesbeholdere i en ekstruderet polystyrenskumforsendelseskøler. Stik 4 ventilationshuller gennem kølelåget og okkluder med bomuld for at holde myrer ude og holde undslupne myg inde. Placer 4 frigørelsesbeholdere lodret i forsendelseskøleren med lageret på hver beholder vendt mod midten (figur 6C). Stik bobleplast mellem hver beholder og i midten for at stabilisere dem. Udfyld resten af pladsen i forsendelseskøleren med luftpuder eller stak et andet lag af 4 frigørelsesbeholdere direkte oven på det første lag og stabiliser på samme måde med luftpuder.
   BEMÆRK: Frigivelsesbeholderne skal være tilstrækkeligt stabiliserede til ikke at bevæge sig, når de rystes. Temperaturen inde i pakken er omgivende.
3. Forbered forsendelseskøleren til levering. Forsegl forsendelseskøleren med det ventilerede låg, og læg den i papoverpakningen, tape lukket, og send via overnight express til frigivelsesstedet.

Representative Results

Årvågen og tilstrækkelig myggeopdræt består af velafbalanceret tilgængelighed af hanner og hunner i kolonibure, vedligeholdelse af frisk saccharoseopløsning og honning og konsekvent blodfodring af høj kvalitet. Disse betingelser vil give mulighed for tætpakkede ægplader, der er optimale til brug i SIT-larveopdrætspander. Korrekt opbevaring og brug af tørrede ægplader, såsom systematisk mærkning for at lette brugen fra ældste til nyeste, vil understøtte ensartet ruge på tværs af alle pander. Fyldning af alle larveopdrætspander med vand inden udklækning kan mindske den tid, som ægpladerne er i lugebeholdere i, og fremme en sund udvikling. Vedligeholdelse af larvepander fra luge til forpuppning kræver omhyggeligt engagement af kolonipersonale, da nogle pander kan have brug for mere eller mindre mad eller yderligere vand afhængigt af udviklingsstadier og miljøvariabler. Hvis der er problemer med udviklingsstadiet på den planlagte dag for puppesexseparation, skal justeringer foretages tidligere i processen, såsom udklækning tidligere eller senere, justering af mad eller ændring af inkubatortemperaturen.

Opdrætsprocessen i denne protokol gør ikke, at alle æg klækkes i tide til at udvikle sig til pupper, der kan bestråles og anvendes til kontrolformål. Mellem 20 og 50% af de koloniopdrættede myg vil stadig være larver, når pupperne skal adskilles. Disse larver spildes dog ikke, men får lov til at modnes i 24 timer for at gøre yderligere pupper, der kan kombineres med hunpupper fra den foregående dags adskillelse og genbruges tilbage i kolonibure. I koloniburene får pupper lov til at modnes til voksne, parre sig, blodfodre og producere æg, der opretholder SIT-projektet.

Adskillelse af pupper, hældning af pupper i petriskåle, bestråling og anbringelse i bure til voksne efter bestråling skal ske på en dag; Derfor bør der afsættes tilstrækkelig tid til at behandle alle trin komfortabelt. Montering og forberedelse af frigivelsesbeholdere skal ske inden mærkningsprocessen. Når forsendelseskasser returneres fra frigivelsesstedet, skal frigivelsesbeholdere inspiceres og forberedes til deres næste brug. Kassation af våde bomuldskugler, udluftning af våde frigivelsesbeholdere, rengøring af petriskåle, udskiftning af net og fjernelse af elastikker fra beholderen, mens de ikke er i brug, vil i høj grad forlænge frigivelsesbeholdernes levetid.

I betragtning af den verdensomspændende virkelighed af COVID-19-viruspandemien er denne protokol, der typisk er en flerpersonsoperation, blevet ændret til at kunne medbringes af en person, der arbejder alene i et laboratorium for hvert trin. De trin i processen, der hindres mest af et enkeltpersonsscenarie, er vedligeholdelsestrinnene til kønning, mærkning, vejning og koloniopdræt. Det bør være tilstrækkeligt at adskille pupper efter køn af én person, hvis der er flere separatorer, der fungerer samtidigt i forskellige rum. I en pandemisk situation, hvor social afstand forekommer på arbejdspladsen, er det nødvendigt at udstyre flere stationer for at gennemføre trin fra sexing til pakning. Afhængigt af operatørens hastighed tager det en person ~ 4 timer at kønne 15.000 myg og derefter yderligere 1-2 timer at markere, veje og pakke dem. Et to-personers scenario mindsker den tid, hvor myg bedøves til mærkning og reducerer den samlede arbejdstid. Men selv i et to-personers scenarie kan tildeling af de fulde 2,0 g myg pr. frigivelsesbur være udfordrende på grund af begrænset arbejdstid, mens myggene bedøves. Selvom processen med rengøring og tilberedning af larver og voksne opdrætsmaterialer er ekstremt tidskrævende og arbejdskrævende, kan den opdeles således, at individuelle operatører kan arbejde uafhængigt og sikkert under en pandemi.

Frigivelse af voksne, markerede, bestrålede Aedes aegypti-hanner ligger uden for denne protokols anvendelsesområde, men præsenteres her i korte træk. Processen med at frigive mærkede, bestrålede hanmyg starter med at bestemme en ensartet frigivelsesfordeling af frigivelsesbeholderne baseret på vægt (og dermed udledt antal sterile hanner), som rapporteret i tabel 3. Når forsendelserne er leveret til vektorkontroldistriktet, åbnes kasserne, og frigivelsesbeholderne evalueres for eventuelle problemer med dødelighed eller tilstand af frigivelsescontainerne. Myg i frigivelsesbeholderne får derefter lov til at akklimatisere sig til omgivelsestemperatur og fugtighed i 1-2 timer inden transport til behandlingsområdet. Udsætningssteder i behandlingsområdet identificeres efter intensiv overvågning for hot spots af vilde populationer af Aedes aegypti. Timingen, hyppigheden og tætheden af udsætninger afbalanceres af artens bionomik samt meteorologi, offentlig støtte og laboratorieopdrætskapacitet.

Da specifikke frigivelsesbeholdere matches med bestemte udsætningssteder, skal etiketten krydstjekkes, inden frigivelsesbeholderen åbnes, ved at skære masken på toppen, så operatøren kan deformere masken, så en del af hannerne kan slippe ud. Denne fraktionerede frigivelsesmetode gentages ved hvert tildelt frigivelsespunkt for beholderen, indtil alle frit flyvende hanner er blevet frigivet. Denne proces gentages derefter for hver frigivelsescontainer på deres respektive tildelte frigivelsessted, indtil alle containere er blevet behandlet. Valgfrit, efter at myggene er blevet frigivet, kan alle døde eller handicappede myg, der ikke forlod frit, samles i petriskåle og mærkes til at blive talt i hånden eller vejet for at korrigere det anslåede antal frigivet. Løbende og gennemgribende overvågning af voksne, æg og umodne stadier af vilde Aedes aegypti i målområdet og muligvis på ikke-interventionskontrolsteder udføres for at vurdere effektiviteten af SIT-operationen.

Discussion

Indledning af et kontrolprogram med SIT, der bruger stråling, kræver etablering af en lokal stamme af Aedes aegypti. Dette trin er kritisk og kan give SIT mulighed for virkelig at skelne sig fra lignende kontrolteknologier. Ved at udvikle projektet fra en lokal stamme af myg, vil de genererede hanner sandsynligvis have adfærd, der giver dem mulighed for at tilpasse sig miljøændringer og signaler og lokalisere og parre sig med vilde hunner i nærheden. Desuden kan udsætning af bestrålede lokale hanner ikke skabe negativ offentlig mening sammenlignet med f.eks. udsætning af en ikke-lokal stamme af genetisk modificerede myg, der f.eks. kan indføre nye alleler i den lokale mygpopulation.

At bruge betydelige ressourcer på at opdrætte store mængder myg kun for at kunne bruge omkring halvdelen af dem til kontrolformål er en begrænsning af Aedes aegypti SIT-programmet. Der bør foretages forbedringer af opdrætsprotokollen for at kondensere modningen af larver til mere definerede tidsrammer, når pupperne er klar. Dette ville gøre det muligt at indsamle flere pupper på det optimale tidspunkt for adskillelse. Yderligere pupper til forarbejdning øger dog risikoen for, at flere hunner forpupper sig, når pupperne samles, og øger dermed sandsynligheden for, at hunnerne ender i petriskåle med hanner og muligvis bliver genudsat. Selvom levetiden, blodfodringsadfærden og ovipositionsadfærden hos bestrålede kvindelige Aedes aegypti-pupper er reduceret hos voksne, er det ikke en god strategi at frigive hunner tilfældigt sammen med bestrålede hanner²². Derfor bør det fortsat være en prioritet at minimere antallet af hunner, der utilsigtet adskilles, bestråles, markeres og frigives med mænd.

Succes med et SIT-program afhænger i sidste ende af vellykket magekonkurrence fra koloniopdrættede, bestrålede hanner. Bevarelse af mandlig konkurrenceevne afhænger af udtømmende eksperimentelt afledt udvælgelse af dosis og maksimering af det estimerede forhold mellem sterile: vilde hanner i befolkningen. Dosisvalg bestemmes af flere nøglefaktorer, der inkluderer lang levetid, fertilitet, fecundity og puppedødelighed. Det er blevet observeret, at mandlige myg vil udvise en asymptotisk fertilitetskurve, der nærmer sig nul, når strålingen stiger (KJL, RLA, SCB upublicerede data). Samtidig mindskes mandlig mygs levetid og aktivitetsniveauer eksponentielt, når strålingsdosis stiger (KJL, RLA, SCB upublicerede data). Derfor, snarere end at identificere en dosis, der giver 99,9% sterilitet hos mænd, er det at foretrække at fokusere på en lavere sterilitetsprocent, samtidig med at man støtter overlevelse. Når der er identificeret et dosisinterval, der ikke adskiller bestrålede hanners levetid eller puppedødelighed fra ikke-bestrålede hanner, bør der foretages yderligere vurderinger af fertiliteten for at identificere en dosis, der gør hannerne overvældende sterile, men konkurrencedygtige.

Samtidig er det afgørende at sammenligne antallet af hanmyg i befolkningen med antallet af genudsatte bestrålede hanner. Dette kan opnås ved at indsamle hanner fra forskellige steder i og omkring målfrigivelsesområdet gentagne gange fra samme sted og før, under og efter initiering af SIT-programmet. Der bør gennemføres en mark-, release-, genfangstundersøgelse for at vurdere forholdet mellem vilde hanmyg og frigivne myg. En mark-, release-, recapture-undersøgelse er afhængig af frigivelsen af et kendt antal markerede myg fra et bestemt punkt og deres senere genfangst på steder i nærheden omkring det oprindelige frigivelsespunkt. Ved at sammenligne antallet af genfangede hanner og vilde hanner på afstande fra udsætningsstedet er det muligt at estimere den generelle vilde population af hanner i området, så konkurrenceforholdene for sterile hanner kan frigives²³. Maksimering af forholdet mellem sterile: vilde hanner kan opnås ved at frigive flere sterile hanner og / eller ved at reducere den vilde befolkning ved hjælp af klassiske kontrolmidler såsom kildereduktion, umoden kontrol eller adulticide behandlinger.

For at måle effektiviteten af sterile mandlige udsætninger kan voksensamlinger sammenlignes kronologisk med et ikke-interventionsområde. Da sterile hanner frigives, og antallet af indsamlede hanner og hunner i et område falder i forhold til et sammenligneligt ikke-interventionsområde, kan det antages, at det skyldes, at de frigivne sterile hanner med succes udkonkurrerer lokale frugtbare hanner. Denne effekt kan også observeres i ovipositionsfældebægre, der anvendes i både interventions- og ikke-interventionsstederne. Æg kan stadig produceres på interventionsstedet, men hvis færre klækkes end dem fra ikke-interventionsstedet, kan det antages, at de ikke befrugtes på grund af hunner, der parrer sig med sterile hanner. Flere og flere ovipositioner af ubefrugtede æg kan i sidste ende føre til reduceret oviposition på grund af ikke-udskiftning af hunner på interventionsstedet ^8,24.

Fremtidige retninger af SIT-teknologi og -programmer udvides naturligt til yderligere medicinsk vigtige mygarter. For eksempel kan denne teknologi let tilpasses til at kontrollere Aedes albopictus i betragtning af de meget lignende bionomics af Aedes aegypti og Aedes albopictus. Andre sygdomsvektormygarter af interesse omfatter Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis og forskellige Anopheles-arter. Forbedring af effektiviteten af denne teknologi afhænger af at øge kapaciteten af mandlige pupper produceret på et givet tidspunkt, hvilket kan opnås gennem genetisk manipulation eller kunstig selektion, og forbedre mandlig konkurrenceevne, hvilket kan opnås ved at øge virilitet, frugtbarhed eller lang levetid.

I sidste ende er SIT-programmer ikke en sølvkugle til bekæmpelse af myg. De er i stedet et værktøj i en række andre kontrolteknikker, såsom IVM-programmer, der krydskompenserer for svagheder blandt teknikker. Der henviser til, at kemisk bekæmpelse f.eks. giver hurtig og billig kontrol, men at den også fremmer udviklingen af resistens og ikkemåldødelighed; og mens SIT er artsspecifik og sandsynligvis ikke vil generere resistens, skal SIT-hanner produceres og frigives i al evighed for at kontrollere immigrerende populationer uden for vektorkontroldistriktet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm)	Craftsman	CMMT44707
1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)	Science Supplies WLE corp	1/2 pint
1/4" tubing - tygon	Hudson Extrusions	LLDPE1/8 X 1/4 BLK	to attach to CO2 gas regulator
1/8" brass barb w/ MIP connection	B&K	BHB-85NLB	to attach to CO2 gas regulator
1000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-1000
3000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-3000
Adult large cage	Bioquip	1450D
Aspirator vials	Bioquip	2809V
Bovine liver powder	MP Biomedicals	290039601
Brewers yeast	MP Biomericals	02903312-CF
CO2 regulator	Randor	64003038
CO2 tank (20# canister)	Praxair	CDBEVCARB20
Collection basin	Treasure Gurus	KI-ENAMELBOWL	for separator
Cotton balls - large	Fisher Scientific	22-456-883
Deli cups w/lids - 470 mL	Pactiv DELItainer	PCTYSD2516
Deli cups w/lids - 1900 mL	Berry Global	T60764
DoseReader 4			ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards
Dosimetry film	Far West Technology, Inc.
Filter paper	Millipore	AP10045S0
Flashlight aspirator	Bioquip	2809D
Forceps - fine featherweight	Bioquip	4748 or 4750	featherweight
GAFchromic			radiochromic film
Gammator M	Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ		Cesium-137 irradiator
Hand held mechanical aspirator	Clarke Mosquito	13500
Lambskin condoms	Trojan	Naturalamb
Large CO2 chamber	Sterilite	Walmart # 568789514
Larval rearing pans	Blue Ridge Thermoforming	01-FG-400-3N-ABS	Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)
Magnets - 20# pull	Master magnetics	MHHH20BX
Marking dye	Dayglo	ECO-11	Aurora Pink
Marking dye	Dayglo	ECO-17	Saturn Yellow
Mesh	Falk		T301
Pasture pipettes	Thermo Scientific	02-708-006
Petri dishes - large	VWR International	25384-090 CS
Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)	Fisher Brand	FB0875713A
Pupa separator	J.W. Hock	1512
Red rubber hose	Welch	331040-5
Release containers	Science Supplies WLE corp	1 gallon
Rubber bands - cross #19	Alliance	ALL37196
Rubber bands - latitude #64	Skillcraft	NSN0589974
Scale	Ohaus	H-4737
Seed germination paper - Heavy stock 76#	Anchor Paper	#76
Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5"	MrBoxonline.com	Husky Foam Cooler kit
Sieve #20	Advantech	20BS8F
Sieve #30	Advantech	30BS8F
Small cage - Bug Dorm	MegaView	Bug Dorm-1
Small CO2 chamber	Mainstays	Walmart # 562922221
Souffle cup lid	SOLO	41165277456
Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)	SOLO	41165024104
Sponge	ocelo	MMM7274FD
Squeeze bottle	Dynalon	3UUP6
Stereoscope	Meiji Techno	EMZ-5
Stockinette	BSN Medical	30-1006
Styrofoam			extruded polystyrene foam
Tropical fish flake food	Tetra	4.52 pound
Vaccum chamber - desiccator	BelArt	T9FB892757
Weigh boats	Globe Scientific	3621