Summary
Den sterile insektteknikken (SIT) brukes til å kontrollere spesifikke, medisinsk viktige myggpopulasjoner som kan være resistente mot kjemiske kontroller. Her beskriver vi en metode for masseoppdrett og forberedelse av sterile mannlige mygg for utgivelse i et operativt SIT-program rettet mot Aedes aegypti-myggen .
Abstract
Kontrollen av slike menneskelige sykdommer som dengue, Zika og chikungunya er avhengig av kontrollen av vektoren deres, Aedes aegypti mygg, fordi det ikke er noen forebygging. Kontroll av myggvektorer kan stole på kjemikalier som brukes på umodne og voksne stadier, noe som kan bidra til dødeligheten av ikke-mål og enda viktigere, føre til insektmiddelresistens i vektoren. Den sterile insektteknikken (SIT) er en metode for å kontrollere populasjoner av gjennom frigjøring av steriliserte voksne hanner som parrer seg med ville kvinner for å produsere ikke-levedyktige avkom. Dette papiret beskriver prosessen med å produsere sterile hanner til bruk i et operativt SIT-program for kontroll av Aedes aegypti mygg. Skissert her er trinnene som brukes i programmet, inkludert oppdrett og vedlikehold av en koloni, skille mannlige og kvinnelige pupper, bestråle og markere voksne menn og sende Aedes aegypti-menn til utgivelsesstedet. Også diskutert er prosessuelle forbehold, programbegrensninger og fremtidige mål.
Introduction
Overføring av myggbårne patogener til mennesker forårsaker millioner av tilfeller av sykdom og dødsfall hvert år over hele verden. I mangel av effektive, godkjente vaksiner for myggbårne sykdommer, som Zika eller denguefeber, er en av de mest effektive måtene å redusere overføring å redusere sykdomsvektormyggpopulasjoner. Det er urovekkende at et økende antall myggarter, tradisjonelt målrettet av plantevernmidler, viser økende nivåer av plantevernmiddelresistens1. Samtidig har offentlige etater aggressivt avregistrert eller forbudt tidligere godkjente plantevernmidler, og få nye, effektive kjemiske kontrolltiltak utvikles 2,3. Denne konstellasjonen av hindringer for myggkontroll har motivert utforskningen av alternative ikke-kjemiske teknikker for å redusere myggpopulasjoner.
Enkelte myggarter gir utfordringer med å kontrollere resistens og registrering av plantevernmidler. Aedes aegypti (L.) er en fremtredende sykdomsvektormygg som er ekstremt vanskelig å kontrollere gjennom tradisjonell integrert vektorstyring på grunn av det kryptiske perihomede habitatet som utnyttes av denne arten for umoden utvikling og voksen hvile 4,5. Utfordringer knyttet til utnyttelse av det kryptiske habitatet rundt boliger inkluderer vanskeligheten med å nå disse stedene med sprøyteteknikker for plantevernmidler, samt potensiell mangel på aksept fra publikum for gjentatt tilgang til privat eiendom for offentlige helsevektorkontrollbyråer for å utføre intensive overvåkings- og kontrollaktiviteter som er avgjørende for effektiv integrert vektorstyring (IVM) for denne arten.
Heldigvis blir SIT, en tilnærming som har vist seg vellykket for varig kontroll av andre svært utfordrende insektarter6, brukt på Aedes aegypti-problemet i en banebrytende serie eksperimenter og operasjonelle forsøk basert i St. Augustine, Florida (KJL, RLA, SCB upubliserte data). SIT har blitt brukt på en rekke insektarter, inkludert mygg, og har blitt gjennomgått i dybden 7,8. SIT utnytter massefrigivelsen av kolonioppdrettede hanner sterilisert, for eksempel ved eksponering for ioniserende stråling eller kjemikalier for å overvelde kompisvalget av naturlige populasjoner av kvinner. Steriliserte hanner som parrer seg med ville hunner gjør eggene ufruktbare på grunn av skader påført hanngameter, og hvis de er til stede i tilstrekkelig antall, kan de teoretisk krasje den naturlige Aedes aegypti-populasjonen.
Et SIT-program ble initiert for å forsøke å redusere populasjoner av Aedes aegypti i et byområde i Atlanterhavskysten Florida hvor denne arten nylig re-koloniserte og utvider og presenterer en folkehelserisiko for overføring av virus som Zika, dengue eller chikungunya. For å maksimere potensialet for kompatibilitet med ville hunner, ble en ny koloni etablert ved hjelp av villfangede Aedes aegypti fra målpopulasjonen for å produsere hanner til programmet9. Dette var basert på hypotesen om at lokalt avledede, kolonioppdrettede hanner ville være mer sannsynlig å være konkurransedyktige med lokale villhanner for parring med lokale ville hunner. For at SIT skal være effektiv, må ikke bare overveldende antall sterile hanner være til stede i målområdet, men de må også være i stand til effektivt å kurtisere og parre seg med lokale ville kvinnelige mygg.
En rekke eksperimenter ble utført for å bestemme det optimale antallet sterile hanner som skulle frigjøres (KJL, RLA, SCB upubliserte data) samt optimale doser av stråling som ville gjøre hannene ufruktbare uten å forstyrre overlevelse, oppførsel eller aksept av ville kvinner (KJL, RLA, SCB upubliserte data). Disse dataene kommer i allierte publikasjoner fra denne gruppen, men noen av disse funnene er også fanget opp i denne protokollen og kan brukes som utgangspunkt for nye SIT Aedes aegypti-kontrollprogrammer andre steder. Denne arten utvider stadig sitt sortiment, og SIT-programmer viser stort løfte om å være kostnadseffektive, langsiktige løsninger for å kontrollere denne befolkningen. Målet med denne protokollen er å produsere steriliserte, mannlige, kolonioppdrettede Aedes aegypti-mygg for systematisk utslipp til utendørsområder for å forstyrre de naturlige reproduktive syklusene til lokale Aedes aegypti-populasjoner i et operativt folkehelsevektorkontrollprogram.
Mens lignende protokoller og arbeidsflyter er publisert for produksjon av transgene Aedes aegypti-hanner og produksjonsarbeidsflyter for Aedes SIT, eller Wolbachia-baserte inkompatibilitetsprogrammer har blitt publisert andre steder, illustrerer denne protokollen hvordan eksisterende protokoller er tilpasset Aedes aegypti-produksjon, separasjon og bestråling av hannpupper, merking og pakking av voksne menn, og forsendelse til utgivelsesstedet for dette programmet 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Merkingskomponenten i denne protokollen er kanskje ikke nødvendig i et modent operativt SIT-program; Det har imidlertid blitt inkludert her fordi det er en måte å overvåke effekten og kontrollere kvaliteten på hele prosessen i de første årene med å etablere SIT-programmet. Myggkontrollprogrammer drives vanligvis av lokale myndigheter, slik at de kan variere mye i mange aspekter av organisasjonen fra størrelse og finansieringsbase til tuning kontrolltaktikk for å maksimere lokal suksess. Dermed bør protokollen beskrevet her evalueres for kompatibilitet med tilgjengelige ressurser.
Protocol
MERK: Denne protokollen er spesifikk for håndtering av Aedes aegypti , men kan endres for å være effektiv for andre myggarter.
1. Produksjon og vedlikehold av en Aedes aegypti-koloni
- Bakre voksen Aedes aegypti og produsere egg.
- Forbered en 0,6 m x 0,6 m x 0,6 m sammenleggbar aluminiumsramme, stort oppdrettsbur med 20 x 20 glassfibernetting og en reach-in stockinette hylse på en vertikal vegg.
- Plasser et 1900 ml plastkar med Aedes aegypti-pupper (1: 1 kjønnsforhold) i hvert oppdrettsbur, bind hylsen lukket og la kopper være på plass for eclosion til det ikke kommer flere voksne (dvs. ca. 4 dager). På dette tidspunktet fjerner du koppene og opprettholder de voksne oppdrettsburene ved 28-30 ° C, >50% relativ fuktighet (Rh) og en 12: 12 eller 14: 10 lys: mørk (L: D) syklus.
MERK: Produksjon av Aedes aegypti pupper er beskrevet i avsnitt 1.2. Tettheten av pupper i 1900 ml karet skal være slik at det er nok plass til at alle pupper kommer opp for luft samtidig. - Tjuefire timer etter at puppene er plassert i oppdrettsburene, plasser en beholder med 10% sukroseløsning med en svampveke, og suspender en 10 cm x 2 cm svamp gjennomvåt i honning fra en trådkrok i hvert bur for å gi separate kilder til hydrering og ernæring til voksne mygg. Overvåk svampene og sukrosebeholderen for tørrhet eller muggvekst, og fyll på eller bytt etter behov.
MERK: Bruk en 120 ml plastkopp med en 10 cm x 2 cm svampveke montert gjennom en utskjæring i lokket i små oppdrettsbur og en 460 ml plastkopp med en 12 cm x 8 cm svampveke i store bur. - Gi et blodmåltid til hvert oppdrettsbur 48-72 timer etter at flertallet av voksne har dukket opp og hver 2-3 dager deretter for å opprettholde et høyt antall blodfødte kvinner for å maksimere eggutbyttet. Fyll et lammeskinnskondom med 50-100 ml defibrinert storfeblod, og varm opp til ca. 37 °C i et varmtvannsbad. Bruk deretter en klut eller et papirhåndkle til å klappe ned og delvis tørke kondomet før du legger det på en papirforet petriskål inne i buret i 30-60 minutter.
MERK: Før bruk, skyll innsiden og utsiden av hvert kondom med vann 2-3x for å fjerne smøremidler eller andre underlag, og se etter hull. Kondomer kan gjenbrukes til 3-5 matinger ved å skylle ut blodet og lagre dem i en kopp kaldt vann. Som noen kolonier kan oppleve maurangrep, kan kondomer må suspenderes for å begrense tilgangen. - Vent 48-72 timer etter hver blodmating, og introduser deretter en oviposisjonskopp i hvert voksenoppdrettsbur. Forbered oviposisjonskoppene ved å tilsette 200 ml filtrert puppetvann (dvs. vannlarvene og puppene ble oppdrettet i) i en plastkopp på 460 ml utstyrt med et 8-10 cm høyt x 30 cm bredt ark med frøspiringspapir (oviposisjonspapir) montert flush langs koppens indre omkrets. Kontroller oviposisjonspapirene daglig, bytt dem ut hver 2-4 dag, og oppbevar de eggbelastede oviposisjonspapirene nøye ved å la dem tørke i 24-48 timer ved >50% Rh19.
MERK: La oviposisjonskoppene stå i oppdrettsburene i ikke mer enn 72 timer for å forhindre at eggene klekkes. - Oppretthold de voksne oppdrettsburene i opptil 3-4 uker før du bryter dem ned og setter opp nye oppdrettsbur for voksne.
- For å bryte ned et oppdrettsbur, fjern og rengjør oviposisjonskoppen, oppbevar det eggbelastede oviposisjonspapiret, fjern og rengjør sukroseløsningsbeholderen og honningsvampen, og frys buret for å drepe alle mygg.
- Fjern alle mygglegemer, og rengjør innsiden og utsiden av hvert bur grundig med fortynnet såpe og vann ved hjelp av papirhåndklær og skureputer med svamper. La det rene buret tørke i minst 24 timer før du bruker det i neste oppdrettssyklus.
MERK: Bruk vakuumutstyr utstyrt med høyeffektiv filtrering for å fjerne partikler som kan føre til allergi. Sukroseløsningsbeholdere kan rengjøres og gjenbrukes 3-5x.
- Oppdrett av Aedes aegypti larver fra egg
- Forbered et lager av larve ernæringsmessig oppslemming ved å blande 80 g av et 3: 2-forhold av storfeleverpulver: bryggergær i 2200 ml vann fra springen. Tilbered pulverisert fiskemat. Hell fiskeflak i en krydderkvern og slip til det er et fint pulver.
MERK: Denne slammet er betegnet som brunt i dette laboratoriet . - Bruk eggbelastet (5.000-10.000 egg) oviposisjonspapir fra trinn 1.1.5, kutt en 3-7 cm del av eggpapiret vinkelrett på oviposisjonslinjen, og legg det i en 460 ml beholder halvfylt med vann fra springen sammen med en klype pulveriserte fiskematflak. Dekk til og agiter kraftig i minst 1 min.
MERK: Eggpapir må oppbevares i minst 7 dager (men ikke mer enn 90 dager, noe som kan redusere klekking) etter oviposisjon før klekkingsprosessen påbegynnes for å tillate embryonasjon. Bakterier og alger som er tilstede i fiskematen, deoksygenerer raskt vannet, noe som utløser larveutvikling. - Hell hele innholdet i beholderen fra trinn 1.2.2 i en larveoppdrettspanne tilberedt med 3 liter vann fra springen og 50 ml brun slam. Merk pannen med startdato, belastningsinformasjon, fôringsplan per tabell 1, og oppbevar ved 28-30 °C, >50 % Rh og 12:12 eller 14:10 L:D sykkel.
MERK: 3 liter vann til 50 ml brunt forhold er basert på vanndybden i de spesielle larvepannene som er nevnt i materialtabellen. Panner i forskjellige størrelser vil støtte forskjellige puppetettheter og dermed kreve forskjellige mengder vann og brun slam. Larvefôringsrater i tabell 1 er angitt som et område; valg av mengden som brukes er basert på erfaring og bestemmelse av den generelle helsen til de utviklende larver ved hjelp av variabler som vannturbiditet, farge og lukt; Tilstedeværelse av bakteriell film på vannet; antall eller forhold mellom levende og døde larver; og larvers motilitet. På dag 3 til 6 pulveriserte fôr umodne mygg fiskemat i henhold til tabell 1. Å tilsette vann, redusere mat og sette opp 2-3 ekstra panner enn prosjektet krever, er måter å håndtere usunne larvepanner på.
- Forbered et lager av larve ernæringsmessig oppslemming ved å blande 80 g av et 3: 2-forhold av storfeleverpulver: bryggergær i 2200 ml vann fra springen. Tilbered pulverisert fiskemat. Hell fiskeflak i en krydderkvern og slip til det er et fint pulver.
| Dag | Volum ernæringsmessig slurry tilsatt | Volum vann tilsatt | Handlinger |
| 1 | 50 ml (slam) | 3000 ml | |
| 2 | (ingen mat) | (ingen vann) | |
| 3 | 1/4 - 1/2 ts (pulverisert fiskemat) | 500-1000 ml | |
| 4 | 1/2 - 3/4 ts (pulverisert fiskemat) | 500-1000 ml | |
| 5 | 1/2 - 3/4 ts (pulverisert fiskemat) | 500-1000 ml | |
| 6 | 1/4 - 1/2 ts (pulverisert fiskemat) | 500-1000 ml | |
| 7 | (ingen mat) | (ingen vann) | stammepupper og larver |
Tabell 1: Fôringsplan for masseoppdrett av Aedes aegypti larver.
2. Separasjon av mannlige Aedes aegypti pupper
- Konsentrat pupper fra larvepannene. Når den omtrentlige terskelandelen av pupper er nådd, hell innholdet i hver panne gjennom en sigte (størrelse 20-40). Bruk en klemmeflaske vann fra springen til å vaske puppene og larvene ut av silen til et 3000 ml gradert plastbeger.
MERK: Bare 2-3 larvepanner skal overføres til hvert 3000 ml beger for å unngå overbefolkning slik at pupper kan nå overflaten komfortabelt. Puppene forventes å utvikle seg mellom 130-140 timer etter eggeyngling under temperatur- og lysforholdene nevnt i trinn 1.2.3. Forvent merkbar eggeluke samme dag som eggene settes opp. Avhengig av miljøforholdene vil ca 20-70% av larvene ha forpuppet seg og være klare til å bli siktet innen 6 dager. Partisjonering av puppene over flere 3000 ml beger sikrer håndterbare volumer å helle i separatoren. - Separat mannlige pupper fra larver og kvinnelige pupper.
MERK: Dette trinnet kan utføres av én operatør eller to operatorer.- For en enkelt operatør som skiller hannpupper:
- Del opp innholdet i hvert 3000 ml beger som genereres i trinn 2.1, i flere 1900 ml plastbeholdere for å redusere søl og overbelaste separatoren. Forbered plateseparatoren ved å plassere en stiv, grunn, 4000 ml oppsamlingsbeholder under slusen ved bunnen av separatoren (figur 1). Fyll to 3000 ml graderte plastbeger ca 3/4 fulle av vann fra springen.
MERK: Bruk en vaskeslange som et alternativ til 3000 ml plastgraderte beger. Ellers må beger kontinuerlig etterfylles gjennom separasjonsprosessen. Ytterligere detaljer for bruk av puppeseparatoren finner du i referanser 12,20. - Hell vann gjennom rommet mellom glassplatene og juster topp- og bunnknappene med eller mot klokken for å la vann kontinuerlig strømme gjennom samtidig som det genererer stående vann til en høyde på ca. 1,25 cm fra bunnen av platene. Merk startposisjonene til bunnknappene med tape. Når stående vann er jevnt fordelt over bunnen av glassplatene med samme høyde og dreneringshastighet, begynner du å helle innholdet i beholderne med pupper og larver gjennom rommet mellom platene.
MERK: En klar separasjon bør være tilstede mellom små (mannlige) og store (kvinnelige) pupper; Ellers skyll denne batchen gjennom, og juster de øvre knappene for å redusere avstanden mellom platene. - Mens du sakte heller vann gjennom separatoren, roterer du kontinuerlig de nederste knottene som et par mot klokken ~ 1-2 cm fra tapemerket startposisjon til de fleste eller alle larver har vasket gjennom og sklidd ned slusen i oppsamlingsbeholderen.
MERK: Når den ene hånden brukes til å helle vann, roterer den andre hånden knottene en om gangen, men like og i små trinn, for sakte å åpne platene. De fleste larver vaskes raskt gjennom, men det vil bli fanget noen larver med hannpuppene. Disse stragglerlarvene vil bli bestrålt, men vil henge etter i utvikling og ikke eclose til voksne med fokalkohorten av pupper. - Kast eller resirkuler larvene tilbake i kolonien, men fjern dem i begge tilfeller fra oppsamlingsbeholderen før hannpuppene begynner å vaske gjennom separatoren. Pause prosessen ved å stoppe vannstrømmen mens oppsamlingsbeholderen ved foten av sluse blir ryddet av larver ved å helle gjennom en # 30 sil, som er tilbakevasket i en separat beholder.
MERK: Larvene strømmer gjennom først, etterfulgt av hannpupper, og til slutt hunnene (figur 1). - Fortsett å helle vann og roter bunnknappene til hannlarvene vaskes gjennom og separeres i oppsamlingsbeholderen. Sett prosessen på pause for å se etter og fjerne larver fra oppsamlingsbeholderen før overføring av hannpuppene i neste trinn.
MERK: Antall spylinger som trengs for å skille hannene, avhenger av tempoet på vannhellingen og hastigheten som knottene roteres med. Det tar vanligvis 2000-2500 ml vann å skylle larvene ut, 1000-1500 ml for å skylle ut hannpuppene, og 200-400 ml for å skylle ut hunnpuppene. - Hell hannpuppene ut av oppsamlingsbeholderen gjennom en #20-sil over en vask. Bruk en 1000 ml klemmeflaske med vann fra springen til å vaske hannpuppene fra silen mens du heller i en separat 1900 ml beholder.
- Når alle hannpuppene er separert, fortsett å helle vann gjennom separatoren, og juster de nedre knottene for å skylle gjennom hunnpuppene. Overfør hunnene ved hjelp av silprosessen beskrevet i trinn 2.2.1.6 i en separat beholder til alle umodne mygg er skyllet ut av separatoren. Kast de kvinnelige puppene. Når batchen er behandlet, returnerer du knottene til de opprinnelige startposisjonene, og gjentar prosessen med neste batch. Når alle partiene er behandlet, la platene stå åpne slik at separatoren kan tørke.
MERK: Det er ingen perfekt separasjon ved hjelp av denne enheten, noe som krever tålmodighet og øvelse. Sta pupper eller larver kan løsnes med en tung strøm av vann, men ikke i den grad at det skyver dem til sidene, noe som kan forurense fremtidige oversvømmelser.
- Del opp innholdet i hvert 3000 ml beger som genereres i trinn 2.1, i flere 1900 ml plastbeholdere for å redusere søl og overbelaste separatoren. Forbered plateseparatoren ved å plassere en stiv, grunn, 4000 ml oppsamlingsbeholder under slusen ved bunnen av separatoren (figur 1). Fyll to 3000 ml graderte plastbeger ca 3/4 fulle av vann fra springen.
- For to operatorer som skiller hannpuppene, endrer du avsnitt 2.2.1 som følger.
- Første operatør: Hell vann gjennom separatoren, og roter knottene trinnvis for å skille larver, hannpupper og hunnpupper.
- Andre operatør: Når hvert trinn er samlet inn i slusebeholderen, sil ut innholdet i slusebeholderen for å dele larver, hannpupper og kvinnelige pupper i flere, separate sluseoppsamlingsbeholdere. Hold de store begerglassene fylt med vann hvis en vaskeslange ikke er tilgjengelig.
- For en enkelt operatør som skiller hannpupper:
Figur 1: Pupal separator som inneholder et parti umoden Aedes aegypti. Separasjon begynner med å helle vann gjennom separatoren mens du roterer de nederste knottene 1-2 cm mot klokken til det målrettede settet, dvs. larver, hannpupper eller kvinnelige pupper, har blitt isolert så mye som mulig fra settene som gjenstår (venstre bilde). Høyre bilde viser separasjon av larver (laveste bånd), hannpupper (midtbånd) og hunnpupper (øvre bånd). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Fremstilling av mannlige Aedes aegypti pupper for bestråling
- Del hannpuppene i 60 mm petriskåler av plast.
MERK: Antall petriskåler som trengs, avhenger av hvor mange hannpupper som er tilgjengelige for bestråling: en larveoppdrettspanne fra trinn 1.2 vil fylle omtrent 1,5 petriskåler. Alderen på puppene varierer fra 1 til 40 timer gammel. I denne protokollen kalles den mindre diameteren dypere halvdel av petriskålen bunnen, og den grunnere halvdelen med større diameter kalles toppen.- Forbered forhåndskuttede disker av filterpapir for å passe til den indre diameteren på petriskålbunnen. Plasser en vannfuktet filterpapirskive i hver av bunnene på petriskålene for å holde puppene hydrert gjennom transport og bestrålingsprosessen.
- Overfør puppene til petriskåler. Sil hannpuppene samlet i trinn 2.2.1.6 med en sil og vask puppene til et 1000 ml gradert beger med så lite vann som mulig. Hell puppene forsiktig i petriskåler til hver filterpapirskive er jevnt dekket med et enkelt lag med pupper (figur 2A - C). Ordne petriskålene på kanten av et bord på rad for å lette hellingen.
MERK: Et alternativ til å sile puppene er å klippe tuppen av en plastpipette på 3 ml Pasteur til en diameter som er stor nok til å romme puppene. Bruk pipetten til å overføre puppene fra beholderen produsert i trinn 2.2.1.6 direkte til filterpapirdiskene, slik at det er et enkelt, tettpakket lag med pupper i hver petriskål. Dette er bare praktisk for små batcher. - Bruk en uendret 3 ml Pasteur-pipette for å fjerne stående vann fra petriskålbunnen for å forhindre puppebevegelse under sexingtrinnet (3.2) og transport.
Figur 2: Overføring av pupper til petriskåler for bestråling. (A) Siktede pupper helles og tilbakevaskes i et 1000 ml plastbeger. (B) Minimalt med vann holdes i begeret for å lette hellingen i petriskåler. (C) Petriskåler stilt opp langs kanten av en overflate for å lette helling i et enkelt lag med pupper. (D) Petri-retter lastet med pupper stables og sikres for levering til bestrålingsanlegget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Sex puppene for å se etter forurensning med kvinner. Under et dissekeringsomfang, bruk sonder for å rotere hver puppe for å sjekke ventraloverflaten for en stor størrelse genital lobe (figur 3) som indikerer mannlig kjønn. Fjern og kast puppene med reduserte eller små kjønnslapper som indikerer hunner og erstatt med like mange hannpupper for å opprettholde riktig telling.
MERK: I et operativt program er dette trinnet ikke praktisk på grunn av et stort antall mygg, og det faktum at separasjon, overføring, bestråling og forberedelse av bur etter bestråling gjøres på en dag med begrenset tid. Kvalitetskontroll av en prøve fra utvalgte petriskåler kan gjøres, spesielt i tidlige faser av utviklingen av SIT-programmet.
Figur 3: Kjønnspupper med underlappen . (A) Ventrale og (B) laterale syn på kvinnelige () og mannlige (♀ ♂) Aedes aegypti pupper, med kjønnslapper indikert for å vise seksuell dimorfisme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Dekk bunnene med toppen av petriskålene, og fest med laboratorietape. Pakk de teipede petriskålene med elastiske bånd i stabler som passer i bestrålingskammeret, og forsegl inne i en merket 3,8 L gjenlukkbar pose (figur 2D). Ikke la pupper forbli avdekket i >1 time.
4. Bestråling av mannlige Aedes aegypti pupper
- Forbered dosimetrifilm fra samme parti ved å kutte 1 cm2 firkanter av filmer og plassere hver firkant i sin individuelle konvolutt.
MERK: All film som brukes på hver dag er kuttet på samme tid. Dette reduserer den lille variasjonen som induseres av lagring. Antall firkanter som trengs for hver stabel er 1 + (antall petriskåler). - Forbered et sett som skal tas inn i bestrålingsanlegget, som skal inneholde en laboratorietimer, laboratoriebånd, permanent markør, forberedte konvolutter med dosimetrifilm, dosimetrimerke og et laboratorienotatark med sjekklister for å holde oversikt over nøkkelinformasjon (figur 4).
Figur 4: Laboratoriebok disposisjon-IR-ark fullført for et doseresponssett. Tekstbokser skissert i rødt (merket med røde piler) indikerer nyttige notater om de forskjellige seksjonene og gjentar nøkkelinformasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Transport puppene til bestrålingsanlegget. Plasser petriskålene til hannpupper fra trinn 3.3 i isolerte beholdere og oppbevar uten direkte sollys og med klimaanlegg under transport.
- Forbered stabler med petriskåler for bestråling ved bestråleren. Stable riktig antall petriskåler som passer i bestrålingskammeret med en dosimetrifilmkonvolutt sentrert mellom hver tallerken og øverst og nederst i stabelen. Fest konvoluttene og hele stabelen med laboratorietape for å forhindre søl og forenkle plassering av stabelen i kammeret.
- Bestråle petriskålene til mannlige pupper. Plasser bunken med petriskåler på det stive metallnettet i kammeret for å plassere i riktig høyde for optimal eksponeringskjegle basert på tidligere dosekartlegging av den spesifikke bestrålingsenheten21. Aktiver platespilleren på bestråleren og bestråle, samtidig som du starter laboratorietimeren. Bestråle for riktig intervall for å oppnå ønsket dose (eksempler er vist i tabell 2).
MERK: Denne protokollen er basert på en cesium-137 bestråler (se materialtabellen) og en måldose på 50 Gy. Fordi Cs-137 henfaller over tid, justeres dosehastigheten hvert år ved å utføre en dose-respons-serie ved bruk av alanindosimetre, supplert med radiokromisk film for rutinemessig dosimetri og alanin i omtrent 10% av bestrålte prøver. Gitt den nåværende dosehastigheten på 8,8 Gy/min, krever det 5 min, 41 s eksponering for å oppnå måldosen på 50 minutter, 41 s. Rutinemessig filmdosimetri forekommer som beskrevet i trinn 4.7. Alanin pelletsdosimetri utføres enten ved National Center for Electron Beam Research ved Texas A&M University eller ved National Institute of Standards and Technology i Gaithersburg, MD, USA.
| Dosering (Gy) | Tid (basert på 8,8 Gy/min) |
| 0 | NA |
| 10 | 1 min 8 s |
| 30 | 3 min 24 s |
| 50 | 5 min 41 s |
| 65 | 7 min 23 s |
| 85 | 9 min 39 s |
| 100 | 11 min 22 s |
| 110 | 12 min 30 s |
Tabell 2: Eksempel doseringstider for Cesium-137 bestråler.
- Når den foreskrevne tiden er gått, fjern petriskålene fra bestråleren og demonter stabelen forsiktig. Merk alle petriskålene og filmkonvoluttene med dato og sted i bunken. Forsegl konvoluttene og oppbevar for dosimetri. Pakk petriskålene om i den isolerte beholderen for transport tilbake til hovedlaboratoriet.
MERK: Registrer om voksne dukket opp under bestråling og merk den berørte petriskålen slik at de voksne ikke slipper ut når puppene settes inn i oppdrettsburene (trinn 5.2). - Bekreft bestrålingsdosen med dosimetrifilm ved å måle filmen ca. 24 timer etter eksponering. Aktiver dosimetrileseren og la den balansere til romtemperatur. Legg filmen med tang som følger med leseren, og følg produsentens instruksjoner for å lese den bestrålte filmen samt den bestrålte blanke filmen fra samme batch. Null leseren uten film mellom avlesningene, og registrer data som i eksempeldatabladet vist i figur 5.
MERK: Denne protokollen er basert på standardene ND0.5 og ND1.0 QA Filter Set. Det er viktig å måle filmen med den matte siden vendt mot operatøren.
Figur 5: Dosimetri datablad fylt med eksempeldata. Kolonneoverskriftene ber operatøren om å registrere nøkkeldata for senere analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Oppdrett av bestrålte mannlige Aedes aegypti pupper til voksne
- Rengjør og klargjør små plast 30 cm x 30 cm x 30 cm oppdrettsbur slik at de er klare for bestrålte pupper ved retur til hovedlaboratoriet. For hver 2 petriskåler av bestrålte hannpupper, tilbered 1 oppdrettsbur. Lager hvert oppdrettsbur med en halvfylt plastkopp som inneholder 460 ml vann fra springen og en 10% sukroseløsningsbeholder, som beskrevet i trinn 1.1.3.
- Overfør straks de bestrålte puppene til de forberedte oppdrettsburene etter retur fra bestrålingsanlegget. Bruk en klemmeflaske med vann til å vaske puppene fra hver petriskål forsiktig inn i 460 ml vann i plastkoppen i hvert oppdrettsbur. Etter 24 timer, overfør koppene til nye, rene oppdrettsbur som inneholder næringskilden, og vent på gjenværende eklose av voksen, mannlig bestrålt Aedes aegypti.
MERK: Hvis det har oppstått pupper under bestrålingsprosessen, åpner du petriskålene med løpesedlene i et tomt bur, og fortsetter deretter med trinn 5.2. Kast mennene samlet i dette buret. Pupper overføres til nye oppdrettsbur etter 24 timer fordi hanner dukker opp før kvinner i samme kohort, og isolering av dagene med fremvekst kan redusere forekomsten av kvinnelig forurensning og sikre nøyaktig aldring av hanner.
6. Merking og veiing av bestrålte voksne Aedes aegypti-hanner
MERK: Denne delen av protokollen forutsetter at to personer utfører oppgavene; for 1 person, se 6.4.
Figur 6: Pakking merket, bestrålt, mannlig Aedes aegypti i utløsningsbeholdere. (A) Utløserbeholder som viser stockinette festet til et hull kuttet i siden av kartongsylinderen med maskeringstape, stifter og varmt lim. Rammen er på plass med en maskeringstapeetikett festet til siden. Rammen beholder det tett trukket tyllnettdekselet; Et elastisk bånd (ikke synlig) holder også tyllen på plass under rammen. (B) Batch av bedøvede hanner i ferd med å bli tumlet i rosa fargestoff i en liten kartongkopp. (C) Fire utløsercontainere inne i isolert fraktcontainer. Legg merke til at stockinette-ermene er orientert mot midten av fraktbeholderen, pakkematerialene er gjemt rundt utløserbeholderne, og ernærings- og hydreringskilder er på plass på toppen av hver utløserbeholder dekket av en omvendt petriskålbunn som holdes fast av kryssede elastiske bånd og biter av tape. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Forbered beholdere for frigjøring av kartonger.
- Klipp et hull på 11,5 cm i diameter på siden av en lokket, sylindrisk 3,9 L kartongbeholder på 1,5-3,0 cm fra bunnen slik at hullet ikke blir dekket av lokket (figur 6A).
- Skjær en 40-50 cm lengde på stockinette, og stift den ene enden av den rundt innsiden av 11,5 cm hullet kuttet i 6.1.1. Bruk en standard kontorstiftemaskin åpnet slik at stifter kan tvinges gjennom lageret og kartongen fra innsiden av beholderen og inn i en passende arbeidsflate, for eksempel en blokk med hardt ekstrudert polystyrenskum. Krympe stiftene ved hjelp av en flathodet skrutrekker for å feste lageret tett til omkretsen av hullet og fest maskeringstape over den krympede siden for å forhindre snags. Forsegl kanten av lageret på innsiden av sylinderen til kartongen med varmt lim og kryssjekk hele forsamlingen for rømningshull.
- Lag en festeramme ved å fjerne den indre disken fra lokket og kutte en 33 cm x 33 cm firkant av nylon tyll mesh fint nok til å beholde voksne mannlige Aedes aegypti mygg. Plasser nettet på den åpne enden av sylinderen og sett rammen over nettet for å holde den på plass uten hull. Trekk masken nedover slik at den stikker ut under rammen for å få nettet til å skinne over den åpne enden og forsegle det fremspringende nettet tett mot sylinderen med et gummibånd.
- Plasser et 10 cm stykke maskeringstape på siden av rammen dekket med et 8 cm stykke merkebånd slik at merkebåndet enkelt kan byttes ut uten å rive rammen.
MERK: Utløserbeholdere er holdbare og kan gjenbrukes >10x med riktig håndtering. Før du introduserer hver ny gruppe merkede, bestrålte, voksne, mannlige mygg, må du kontrollere at lageret er forsvarlig festet til beholderen, og straks foreta reparasjoner om nødvendig.
- Forbered veie- og merkestasjonen.
- Hell ca. 50 mg merkefargestoff i en 240 ml kartongbeholder, og fordel fargestoffet som et lag pulver jevnt rundt beholderens indre overflater. Trykk forsiktig for å kaste overflødig fargestoff. Bruk tydelig merkede kopper for flere fargestoffer for å holde fargene skilt.
- Ta en 100-500 g veiebåt på en 0,0001 g elektronisk balanse; opprette et dataskjema (tabell 3); og tape sammen fire ark med 215,9 mm x 355,6 mm kopipapir for å lage en arbeidsflate på 431,8 mm x 711,2 mm.
| Slipp beholder | Vekt av mygg | Bur nummer | Kvinner i batch | Antall menn | Slipp beholder | Total masse |
| ROSA I | 0.024 | D1 # 1 | 25 | ROSA I | 2.03 | |
| ROSA I | 2.007 | D1 # 1 | 7 | ROSA II | 1.99 | |
| ROSA II | 1.990 | D1 # 1 | ROSA III | 2.03 | ||
| ROSA III | 0.026 | D1 # 3 | 25 | |||
| ROSA III | 2.000 | D1 # 3 | 18 |
Tabell 3: Datatabell for veiestasjon.
- Merk kvantifiserte partier av voksne bestrålte hanner med fluorescerende pigment.
- Overfør voksne mygg (2,5-3,5 dager gamle) fra hvert oppdrettsbur til aspiratorflasker. Fjern næringskilder fra oppdrettsburet fra trinn 5.2 og legg hele buret i et stort CO2-kammer i 5-7 minutter, bank sidene av beholderen for å løsne mygg som kan klamre seg til oppdrettsburet. Etter at eksponeringstiden er gått, fjern oppdrettsburet fra kammeret, og aspirer alle de voksne myggene i en serie plast aspirasjonsflasker.
MERK: Administrasjon av 99,5-100% CO2 er fra en tank med en regulator, messingstang og silikonrør kanalisert inn i kammeret med en strømningshastighet på 6 l / min. Antall hetteglass som trengs for å rydde oppdrettsburet, avhenger av hvor mange mygg som er i buret og operatørens ferdigheter, men 3-5 hetteglass er vanligvis nødvendig per bur. Velg en aspirator som har små hetteglass med hurtigbytte for å lette håndteringen av voksne mygg i grupper, for eksempel en som bruker et 60 ml polystyrenoppsamlingshetteglass forseglet med 20 x 20 mesh aluminiumsskjerm i den ene enden og en klar acetatklaffventil i den andre. Hele buret bedøves før aspirasjon for å redusere tiden for å overføre mygg til hetteglass for å redusere stresset på mygg og holde protokollen trekkbar. - Sorter alle voksne mygg fra hvert oppdrettsbur etter kjønn.
- Utsett det første hetteglasset fra trinn 6.3.1 til CO 2 i et lite kammer i 4 minutter, og rist deretter de bedøvede myggene forsiktig ut og spre dem over arbeidsflaten på hvitt papir tilberedt i trinn 6.2.2.
- Legg et nytt tomt hetteglass inn i aspiratoren, og aspirer forsiktig alle hanner fra arbeidsflaten, og pass dette hetteglasset til veiestasjonen (trinn 6.3.3.). Tell eventuelle kvinner som er igjen, og aspirer dem i et eget hetteglass og kast, sammen med eventuelle knuste hanner.
- Gjenta denne prosessen med de resterende hetteglassene fra 6.3.1, men på et tidspunkt i kjønnssorteringsprosessen, generer et eget hetteglass med bare 25 hanner som også sendes til veiestasjonen. Gjenta trinn 6.3.2. for hvert oppdrettsbur.
MERK: Mens du behandler bestrålte voksne menn for sexing, veiing og merking, hold oversikt over antall kvinner i hver batch, som er nøkkeldata for feilsøking og kvalitetssikring av puppesexsortering og hele prosessen. Hvis kvinnetallet er høyere enn forventet, bør en annen person trekke ut kvinner mens hovedoperatøren aspirerer hannene. Det er viktig å veie en prøve på 25 hanner fra hvert oppdrettsbur for å beregne en gjennomsnittlig vekt per mygg, som vil bli brukt til å estimere antall merkede bestrålte hanner som slippes ut på slutten av protokollen.
- Veie og fargelegge partier av voksne mannlige mygg.
- På veiestasjonen plasserer du det første hetteglasset med voksne hannmygg fra sexingstasjonen (pkt. 6.3.2) i et lite CO2-kammer i 2 minutter, og rister myggen forsiktig inn i den tjærede veiebåten som er tilberedt i trinn 6.2.2. Ta opp myggens vekt og hell myggene i fargekoppen tilberedt i 6.2.1.
- Vipp og roter koppen 1 sakte full rotasjon med klokken og mot klokken slik at myggene kommer i kontakt med pulverlakken på koppens indre overflater og er lett støvet med fargestoff (figur 6B). Hell de merkede myggene i en veiebåt.
- Fortsett raskt til neste trinn slik at myggene ikke gjenoppretter og unnslipper. Gjenta dette trinnet til alle hetteglassene fra pkt. 6.3.2 er behandlet.
MERK: Vekten av hannene fra det separate hetteglasset med 25 hanner generert for hvert oppdrettsbur i pkt. 6.3.2 registreres og brukes til å beregne gjennomsnittsvekten per hann fra buret.
- Legg i utløserbeholderne med merkede bestrålte voksne hanner. Brett veiebåten som inneholder bedøvede, merkede, bestrålte, hannmygg litt fra slutten av seksjon 6.3.3. for å opprette en kanal, og deretter lede denne kanalen gjennom stockinette-hylsen for å overføre hannene til utløserbeholderen. Fortsett å legge til mygg til ca 2,0 g eller 1500-3000 mannlige mygg er i utløserbeholderen og bind stockinettehylsen lukket. Merk merkingsbåndet på rammen til utløserbeholderen med fargestofffarge, beholdernummer og total vekt av mygg, og kopier disse dataene til skjemaet fra trinn 6.2.2.
MERK: Håndtering av mygg i alle livsfaser induserer stress og kan redusere overlevelse eller kraft. Serien av bedøvelsesmidler beskrevet i denne protokollen kan påvirke myggene; Imidlertid vil forsøk på å forfølge og aspirere ikke-bedøvede mygg på hvert trinn indusere større stress og en uholdbar protokoll. Del den totale vekten av mygg i hver utløsningsbeholder med gjennomsnittsvekten per mannlig mygg generert i avsnitt 6.3.3 for å utlede et estimat av antall hanner i den utløserbeholderen; Hver utløsningsbeholder skal ikke ha mer enn 2 g hanner, noe som tilsvarer ca. 1 stort oppdrettsbur.
- Overfør voksne mygg (2,5-3,5 dager gamle) fra hvert oppdrettsbur til aspiratorflasker. Fjern næringskilder fra oppdrettsburet fra trinn 5.2 og legg hele buret i et stort CO2-kammer i 5-7 minutter, bank sidene av beholderen for å løsne mygg som kan klamre seg til oppdrettsburet. Etter at eksponeringstiden er gått, fjern oppdrettsburet fra kammeret, og aspirer alle de voksne myggene i en serie plast aspirasjonsflasker.
- Endringer i merkeprotokollen for en enkelt operatør
- Utfør sexsortering for alle store bur først. Utsett hvert stort bur for CO2 i 4-5 min og aspirer alle myggene i 4-5 hetteglass. Utsett hvert hetteglass for CO 2 i2-3 min, tipp ut alle myggene på arbeidsflaten på hvitt papir, fjern hunnene og telleapparatet, og returner hannene til deres store populasjonsbur.
- Veiing og merking
- Start med det første hannholderburet produsert i trinn 6.4.1: fjern næringskilden og bedøv hannene i et stort CO2-kammer i 5-7 min. Aspirer de bedøvede hannene jevnt i separate hetteglass. Gjenta dette trinnet med hvert holdebur i den rekkefølgen de ble produsert.
MERK: Det vil bli produsert ca. 2-3 overfylte hetteglass per oppbevaringsbur. Behandling av hannholderbur i den rekkefølgen de ble produsert maksimerer restitusjonstiden for hvert bur av hanner. - Bedøv det første hetteglasset produsert i trinn 6.4.2.1. i 1-2 min i et lite CO2-kammer . Hell ut et lite antall mygg på det hvite papirets arbeidsflate, aspirer 25 hannmygg i et nytt hetteglass, og behandle som i 6.3.2 for å bestemme gjennomsnittsvekten per hann for det buret. Returner eventuelle ekstra hanner til hetteglasset med kilden, eller aspirer til et nytt separat hetteglass som skal behandles senere; Fortsett med veiing, merking og overføring til beholderne for resten av hannene i det første hetteglasset som beskrevet i resten av trinn 6.3. Gjenta trinn 6.4.2.2. (bortsett fra isolering av 25 hanner i et separat hetteglass) for resten av hetteglassene produsert i trinn 6.4.2.1. i den rekkefølgen de ble produsert, og deretter gå videre til neste kjønnssorterte oppdrettsmerd produsert i 6.4.1.
MERK: Arbeidsflyter med en person er tregere, og noen mannlige mygg må bedøves flere ganger. Søk kontinuerlig etter og fjern kvinnelige mygg.
- Start med det første hannholderburet produsert i trinn 6.4.1: fjern næringskilden og bedøv hannene i et stort CO2-kammer i 5-7 min. Aspirer de bedøvede hannene jevnt i separate hetteglass. Gjenta dette trinnet med hvert holdebur i den rekkefølgen de ble produsert.
7. Emballasje- og forsendelsesbeholdere med merket, bestrålt, voksen hann Aedes aegypti
- Forbered utgivelsesbeholderne for forsendelse. Når en utløserbeholder er fylt med markerte hanner, legg 4 bomullsballer fuktet med 10% sukroseløsning på maskelokket og dekk med en omvendt bunn av en petriskål holdt på plass av to gummibånd strukket rundt hele beholderen og over petriskålen for å danne et kors. Legg et stykke maskeringstape over X-en på de to gummibåndene for å holde dem på plass på toppen av den omvendte petriskålen.
MERK: Forsikre deg om at bomullskulene med 10% sukroseoppløsning ikke er mettet til drypp, noe som vil skade beholderen og fange og drepe mygg. - Pakk kartongbeholdere i en ekstrudert polystyrenskum som sender kjøler. Stikk 4 ventilasjonshull gjennom kjølelokket og okkluder med bomull for å holde maur ute og hold i rømte mygg. Plasser 4 utløsningsbeholdere oppreist i fraktkjøleren med lageret til hver container vendt mot midten (figur 6C). Tuck bobleplast mellom hver beholder og i midten for å stabilisere dem. Fyll ut resten av plassen i fraktkjøleren med luftputer eller stable et andre lag med 4 utløserbeholdere direkte på toppen av det første laget og stabiliser på samme måte med luftputer.
MERK: Utløserbeholderne skal være tilstrekkelig stabilisert til ikke å bevege seg når de ristes. Temperaturen inne i pakken er omgivende. - Forbered fraktkjøleren for levering. Forsegl fraktkjøleren med det ventilerte lokket, og sett i papppakningen, tape lukket og send via ekspress over natten til utløsningsstedet.
Representative Results
Årvåken og tilstrekkelig myggoppdrett består av velbalansert tilgjengelighet av menn og kvinner i kolonibur, vedlikehold av fersk sukroseløsning og honning, og konsekvent blodfôring av høy kvalitet. Disse forholdene vil sørge for tettpakkede eggplater som er optimale for bruk i SIT-larvepanner. Riktig lagring og bruk av tørkede eggplater, for eksempel systematisk merking for å lette bruk fra eldste til nyeste, vil støtte jevn klekking på tvers av alle panner. Fylling av alle larvepanner med vann før klekking kan redusere tiden eggplatene er i lukebeholdere og fremme sunn utvikling. Vedlikehold av larvepanner fra luke til valp krever nøye engasjement av kolonipersonell, da noen panner kan trenge mer eller mindre mat eller ekstra vann, avhengig av utviklingsstadier og miljøvariabler. Hvis det er problemer med utviklingsstadiet innen den planlagte dagen for puppekjønnsseparasjon, bør justeringer gjøres tidligere i prosessen, for eksempel klekking tidligere eller senere, justering av mat eller endring av inkubatortemperaturen.
Oppdrettsprosessen i denne protokollen gjør ikke alle egg klekket i tide for å utvikle seg til pupper som kan bestråles og brukes til kontrollformål. Mellom 20 og 50% av de kolonioppdrettede myggene vil fortsatt være larver når puppene må skilles. Disse larvene blir imidlertid ikke sløst bort, men får modnes i 24 timer for å lage ekstra pupper som kan kombineres med hunnpupper fra forrige dags separasjon og resirkuleres tilbake i kolonibur. I koloniburene vil puppene få lov til å modnes til voksne, parre seg, blodfôre og produsere egg som opprettholder SIT-prosjektet.
Å skille pupper, helle pupper i petriskåler, bestråling og plassering i voksne holdebur etter bestråling må skje på en dag; Derfor bør det tildeles tilstrekkelig tid til å behandle alle trinnene komfortabelt. Montering og klargjøring av utløserbeholdere bør gjøres før merkingsprosessen. Når fraktesker returneres fra utgivelsesstedet, bør utløserbeholdere inspiseres og klargjøres for neste bruk. Å kaste våte bomullsballer, lufte ut beholdere med våt frigjøring, rengjøre petriskåler, erstatte mesh og fjerne elastiske bånd fra beholderen, mens de ikke er i bruk, vil i stor grad forlenge levetiden til utløserbeholderne.
Gitt den verdensomspennende virkeligheten av COVID-19-viruspandemien, har denne protokollen som vanligvis er en flerpersonsoperasjon blitt endret for å kunne håndteres av en person som jobber alene i et laboratorium for hvert trinn. Trinnene i prosessen som hindres mest av et enpersonsscenario er trinnene for sexing, merking, veiing og vedlikehold av kolonioppdrett. Å skille pupper etter kjønn av en person bør være tilstrekkelig hvis det er flere separatorer som opererer samtidig i forskjellige rom. I en pandemisituasjon der sosial distansering skjer på arbeidsplassen, er det nødvendig å utstyre flere stasjoner for å fullføre trinn fra sex til pakking. Avhengig av operatørens hastighet, tar det en person ~ 4 timer til sex 15.000 mygg og deretter ytterligere 1-2 timer for å markere, veie og pakke dem. Et to-personers scenario reduserer tiden hvor mygg bedøves for merking og reduserer den totale arbeidstiden. Likevel, selv i et to-personers scenario, kan tildeling av hele 2,0 g mygg per utløsningsbur være utfordrende på grunn av begrenset arbeidstid mens myggene er bedøvet. Selv om prosessen med rengjøring og forberedelse av larve- og voksenoppdrettsmaterialer er ekstremt tidkrevende og arbeidskrevende, kan den deles slik at individuelle operatører kan jobbe selvstendig og trygt under en pandemi.
Frigivelse av voksne, merkede, bestrålte Aedes aegypti-hanner er utenfor rammen av denne protokollen, men presenteres her i korte trekk. Prosessen med å slippe ut merkede, bestrålte, mannlige mygg starter med å bestemme en jevn utløsningsfordeling av utløserbeholderne basert på vekter (og dermed utledet antall sterile hanner), som rapportert i tabell 3. Etter at forsendelsene er levert til vektorkontrolldistriktet, åpnes boksene, og utgivelsesbeholderne evalueres for eventuelle problemer med dødelighet eller tilstand av utgivelsesbeholderne. Mygg i utløserbeholderne får deretter akklimatisere seg til omgivelsestemperatur og fuktighet i 1-2 timer før transport til behandlingsområdet. Utslippssteder i behandlingsområdet er identifisert etter intensiv overvåking for hot spots av ville bestander av Aedes aegypti. Tidspunktet, frekvensen og tettheten av utslipp balanseres av artens bionomikk, samt meteorologi, offentlig støtte og laboratorieoppdrettsevner.
Siden spesifikke utløserbeholdere er tilpasset bestemte utgivelsessteder, må etiketten kryssjekkes før utløserbeholderen åpnes ved å kutte nettet på toppen, slik at operatøren kan deformere nettet slik at en del av hannene kan unnslippe. Denne fraksjonelle frigjøringsmetoden gjentas ved hvert tildelte frigjøringspunkt for beholderen til alle fritt flygende hanner er frigjort. Denne prosessen gjentas deretter for hver frigivelsesbeholder på deres respektive tilordnede frigivelsessted til alle containere er behandlet. Eventuelt, etter at myggene er sluppet ut, kan eventuelle døde eller deaktiverte mygg som ikke forlot fritt, samles inn i petriskåler og merkes for å telles for hånd eller veies for å korrigere det estimerte antallet som slippes ut. Pågående og gjennomgripende overvåking av voksne, egg og umodne stadier av vill Aedes aegypti i målområdet, og muligens i ikke-intervensjonskontrollsteder, utføres for å vurdere effekten av SIT-operasjonen.
Discussion
Initiering av et kontrollprogram med SIT som bruker stråling krever etablering av en lokal stamme av Aedes aegypti. Dette trinnet er kritisk og kan tillate SIT å virkelig skille seg fra lignende kontrollteknologier. Ved å utvikle prosjektet fra en lokal myggstamme, vil hannene som genereres sannsynligvis ha atferd som gjør at de kan tilpasse seg miljøendringer og signaler og å lokalisere og parre seg med ville kvinner i nærheten. Videre kan utgivelsen av bestrålte lokale menn ikke generere negativ opinion sammenlignet med, for eksempel, frigjøring av en ikke-lokal stamme av genetisk modifiserte mygg som for eksempel kan introdusere nye alleler i den lokale myggpopulasjonen.
Å bruke betydelige ressurser på å bake store mengder mygg bare for å kunne bruke omtrent halvparten av dem til kontrollformål, er en begrensning av Aedes aegypti SIT-programmet. Forbedringer bør gjøres til oppdrettsprotokollen for å kondensere modningen av larver til mer definerte tidsrammer når puppene vil være klare. Dette vil tillate flere pupper å bli samlet på det optimale tidspunktet for separasjon. Imidlertid øker flere pupper å behandle risikoen for at flere hunner forpupper seg når puppene samles inn, og øker dermed sannsynligheten for at hunnene havner i petriskåler med hanner og muligens blir sluppet fri. Selv om levetid, blodfôringsadferd og oviposisjonsadferd hos bestrålte kvinnelige Aedes aegypti-pupper reduseres hos voksne, er det ikke en god strategi å frigjøre kvinner tilfeldigvis sammen med bestrålte hanner22. Derfor bør det forbli en prioritet å minimere antall kvinner utilsiktet separert, bestrålt, merket og utgitt med menn.
Suksessen til et SIT-program er til syvende og sist avhengig av vellykket kompiskonkurranse av kolonioppdrettede, bestrålte hanner. Bevaring av mannlig konkurranseevne er avhengig av uttømmende eksperimentelt avledet valg av dosen og maksimering av det estimerte forholdet mellom sterile: ville menn i befolkningen. Dosevalg bestemmes av flere viktige faktorer som inkluderer lang levetid, fruktbarhet, fecundity og puppedødelighet. Det har blitt observert at mannlige mygg vil vise en asymptotisk fruktbarhetskurve som nærmer seg null når strålingen øker (KJL, RLA, SCB upubliserte data). Samtidig reduseres mannlig myggs levetid og aktivitetsnivå eksponentielt etter hvert som strålingsdosen øker (KJL, RLA, SCB upubliserte data). Derfor, i stedet for å identifisere en dose som gir 99,9% sterilitet hos menn, er det å foretrekke å fokusere på en lavere sterilitetsprosent mens du støtter overlevelse. Når et doseområde er identifisert som ikke skiller levetiden eller puppedødeligheten hos bestrålte hanner fra dødeligheten hos ikke-bestrålte hanner, bør det foretas ytterligere vurderinger av fertilitet for å identifisere en dose som gjør hannene overveldende sterile, men konkurransedyktige.
Samtidig er det viktig å sammenligne antall mannlige mygg i befolkningen med det for frigjorte bestrålte hanner. Dette kan gjøres ved å samle hanner fra forskjellige steder i og rundt målfrigjøringsområdet gjentatte ganger fra samme sted og før, under og etter oppstart av SIT-programmet. En, release, recapture studie bør utføres for å vurdere forholdet mellom ville mannlige mygg og frigjorte mygg. En, release, recapture-studie er avhengig av frigjøring av et kjent antall merkede mygg fra et bestemt punkt og deres senere gjenfangst på punkter i nærheten av det første utgivelsespunktet. Ved å sammenligne antall gjenfangede hanner og ville hanner i avstander fra utløsningspunktet, er det mulig å estimere den generelle ville populasjonen av hanner i området slik at konkurranseforholdene for sterile hanner kan frigjøres23. Maksimering av forholdet mellom sterile: ville hanner kan oppnås ved å frigjøre mer sterile hanner og / eller ved å redusere den ville befolkningen ved klassiske kontrollmidler som kildereduksjon, umoden kontroll eller adulticide behandlinger.
For å måle effektiviteten av sterile mannlige utgivelser, kan voksensamlinger sammenlignes kronologisk mot et ikke-intervensjonsområde. Etter hvert som sterile hanner frigjøres og antallet innsamlede hanner og hunner i et område avtar i forhold til et sammenlignbart ikke-intervensjonsområde, kan det hypoteses at det skyldes at de frigjorte sterile hannene lykkes med å utkonkurrere lokale fertile hanner. Denne effekten kan også observeres i oviposisjonsfellekopper utplassert både på intervensjons- og ikke-intervensjonsstedene. Egg kan fortsatt produseres på intervensjonsstedet, men hvis færre klekkes enn de fra ikke-intervensjonsstedet, kan det antas at de ikke befruktes på grunn av at hunner parrer seg med sterile hanner. Flere og flere oviposisjoner av ubefruktede egg kan etter hvert føre til redusert oviposisjon på grunn av manglende erstatning av hunner på intervensjonsstedet 8,24.
Fremtidige retninger av SIT-teknologi og programmer utvides naturlig til flere medisinsk viktige myggarter. For eksempel kan denne teknologien lett tilpasses for å kontrollere Aedes albopictus, gitt den svært like bionomikken til Aedes aegypti og Aedes albopictus. Andre sykdomsvektormyggarter av interesse inkluderer Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis og forskjellige Anopheles-arter. Forbedring av effekten av denne teknologien avhenger av å øke kapasiteten til mannlige pupper produsert på et gitt tidspunkt, noe som kan oppnås gjennom genetisk manipulasjon eller kunstig utvalg, og forbedre mannlig konkurranseevne, som kan oppnås ved å øke virilitet, fruktbarhet eller lang levetid.
Til syvende og sist er SIT-programmer ikke en sølvkule for å kontrollere mygg. De er i stedet et verktøy i en rekke andre kontrollteknikker, for eksempel IVM-programmer, som krysskompenserer for svakheter mellom teknikker. For eksempel, mens kjemisk kontroll gir rask og billig kontroll, fremmer den også utviklingen av resistens og ikke-måldødelighet; og mens SIT er artsspesifikk og sannsynligvis ikke vil generere motstand, må SIT-hanner produseres og frigjøres i det uendelige for å kontrollere innvandrende populasjoner fra utenfor vektorkontrolldistriktet.
Disclosures
Alle forfattere har ikke oppgitt noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Drs. R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls og V. Aryaprema fra Anastasia Mosquito Control District, St. Augustine, Florida, for partnerskap i utviklingen av SIT-programmet og ekspertinnsikt om effektiv operativ frigjøring av sterile mannlige Aedes aegypti. Denne forskningen ble støttet av USDA-ARS og Florida Department of Agriculture and Consumer Services (FDACS). Omtale av handelsnavn eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende med det formål å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke anbefaling eller godkjenning av USDA eller FDACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm) | Craftsman | CMMT44707 | |
| 1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL) | Science Supplies WLE corp | 1/2 pint | |
| 1/4" tubing - tygon | Hudson Extrusions | LLDPE1/8 X 1/4 BLK | to attach to CO2 gas regulator |
| 1/8" brass barb w/ MIP connection | B&K | BHB-85NLB | to attach to CO2 gas regulator |
| 1000 mL graduated plastic beakers with handle | Thermo Scientific | 1223-1000 | |
| 3000 mL graduated plastic beakers with handle | Thermo Scientific | 1223-3000 | |
| Adult large cage | Bioquip | 1450D | |
| Aspirator vials | Bioquip | 2809V | |
| Bovine liver powder | MP Biomedicals | 290039601 | |
| Brewers yeast | MP Biomericals | 02903312-CF | |
| CO2 regulator | Randor | 64003038 | |
| CO2 tank (20# canister) | Praxair | CDBEVCARB20 | |
| Collection basin | Treasure Gurus | KI-ENAMELBOWL | for separator |
| Cotton balls - large | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Deli cups w/lids - 470 mL | Pactiv DELItainer | PCTYSD2516 | |
| Deli cups w/lids - 1900 mL | Berry Global | T60764 | |
| DoseReader 4 | ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards | ||
| Dosimetry film | Far West Technology, Inc. | ||
| Filter paper | Millipore | AP10045S0 | |
| Flashlight aspirator | Bioquip | 2809D | |
| Forceps - fine featherweight | Bioquip | 4748 or 4750 | featherweight |
| GAFchromic | radiochromic film | ||
| Gammator M | Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ | Cesium-137 irradiator | |
| Hand held mechanical aspirator | Clarke Mosquito | 13500 | |
| Lambskin condoms | Trojan | Naturalamb | |
| Large CO2 chamber | Sterilite | Walmart # 568789514 | |
| Larval rearing pans | Blue Ridge Thermoforming | 01-FG-400-3N-ABS | Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches) |
| Magnets - 20# pull | Master magnetics | MHHH20BX | |
| Marking dye | Dayglo | ECO-11 | Aurora Pink |
| Marking dye | Dayglo | ECO-17 | Saturn Yellow |
| Mesh | Falk | T301 | |
| Pasture pipettes | Thermo Scientific | 02-708-006 | |
| Petri dishes - large | VWR International | 25384-090 CS | |
| Petri dishes - small (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875713A | |
| Pupa separator | J.W. Hock | 1512 | |
| Red rubber hose | Welch | 331040-5 | |
| Release containers | Science Supplies WLE corp | 1 gallon | |
| Rubber bands - cross #19 | Alliance | ALL37196 | |
| Rubber bands - latitude #64 | Skillcraft | NSN0589974 | |
| Scale | Ohaus | H-4737 | |
| Seed germination paper - Heavy stock 76# | Anchor Paper | #76 | |
| Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5" | MrBoxonline.com | Husky Foam Cooler kit | |
| Sieve #20 | Advantech | 20BS8F | |
| Sieve #30 | Advantech | 30BS8F | |
| Small cage - Bug Dorm | MegaView | Bug Dorm-1 | |
| Small CO2 chamber | Mainstays | Walmart # 562922221 | |
| Souffle cup lid | SOLO | 41165277456 | |
| Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL) | SOLO | 41165024104 | |
| Sponge | ocelo | MMM7274FD | |
| Squeeze bottle | Dynalon | 3UUP6 | |
| Stereoscope | Meiji Techno | EMZ-5 | |
| Stockinette | BSN Medical | 30-1006 | |
| Styrofoam | extruded polystyrene foam | ||
| Tropical fish flake food | Tetra | 4.52 pound | |
| Vaccum chamber - desiccator | BelArt | T9FB892757 | |
| Weigh boats | Globe Scientific | 3621 |
References
- Moyes, C. L., et al. Contemporary status of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses infecting humans. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (7), 0005625 (2017).
- Baldacchino, F., et al. Control methods against invasive Aedes mosquitoes in Europe: a review. Pest Management Science. 71 (11), 1471-1485 (2015).
- Burkett, D. A., Cope, S. E., Strickman, D. A., White, G. B. The Deployed Warfighter Protection (DWFP) Research Program: Developing new public health pesticides, application technologies, and repellent systems. Journal of Integrated Pest Management. 4 (2), 1-7 (2013).
- Harwood, J. F., et al. Controlling Aedes aegypti in cryptic environments with manually carried ultra-low volume and mist blower pesticide applications. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (3), 217-223 (2016).
- Morrison, A. C., Zielinski-Gutierrez, E., Scott, T. W., Rosenberg, R. Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS Medicine. 5 (3), 68 (2008).
- Klassen, W., Curtis, C. F. History of the sterile insect technique. Sterile insect technique: principles and practice in area-wide integrated pest management. InDyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases: an analysis. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 10 (3), 295-311 (2010).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 (2009).
- FAO IAEA. Guidelines for colonization of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www.naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-colonisation-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.final.pdf (2018).
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PloS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta Tropica. 157, 115-130 (2016).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e3579 (2014).
- Carvalho, D. O., et al. Aedes aegypti lines for combined sterile insect technique and incompatible insect technique applications: the importance of host genomic background. Entomologia experimentalis et applicata. 168 (6-7), 560-572 (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mass-rearing of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-mass-rearingofAedes-mosquitoes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mark-release-recapture procedures of Aedes mosquitoes. Bouyer, J., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-MRR-Aedes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for Routine Colony Maintenance of Aedes Mosquito Species, Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
- Mamai, W., et al. Aedes aegypti larval development and pupal production in the FAO/IAEA mass-rearing rack and factors influencing sex sorting efficiency. Parasite. 27, 43 (2020).
- Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
- BEI Resources. Methods in Aedes Research. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods%20in%20Aedes%20Research%202016.pdf (2016).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes, and species of mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 17 (6), 567-568 (1980).
- International Atomic Energy Agency. Manual of Dosimetry in Radiotherapy. Technical Reports Series No. 110. , Vienna. (1970).
- Aldridge, R. L., et al. Gamma-irradiation reduces survivorship, feeding behavior, and oviposition of female Aedes aegypti. Journal of the American Mosquito Control Association. 36 (3), 152-160 (2020).
- Cianci, D., et al. Estimating mosquito population size from mark-release-recapture data. Journal of Medical Entomology. 50 (3), 533-542 (2013).
- Knipling, E. F. The basic principles of insect population suppression and management. , United States Department of Agriculture. Washington, DC. (1979).
