Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Summary

Enkelt-partikel analyse i kryo-elektron mikroskopi er en af de vigtigste teknikker, der anvendes til at bestemme strukturen af biologiske ensembler ved høj opløsning. Scipion giver værktøjerne til at skabe hele rørledningen til at behandle de oplysninger, der er erhvervet af mikroskopet og opnå en 3D-rekonstruktion af den biologiske prøve.

Abstract

Kryo-elektronmikroskopi er blevet et af de vigtigste værktøjer i biologisk forskning til at afsløre de strukturelle oplysninger om makromolekyler ved næsten atomare opløsning. I enkeltpartikelanalyse afbildes den vitrified prøve af en elektronstråle, og detektorerne for enden af mikroskopkolonnen producerer film af denne prøve. Disse film indeholder tusindvis af billeder af identiske partikler i tilfældige retninger. Dataene skal gennemgå en arbejdsproces for billedbehandling med flere trin for at få den endelige 3D-rekonstruerede diskenhed. Målet med arbejdsprocessen for billedbehandling er at identificere anskaffelsesparametrene for at kunne rekonstruere den undersøgte prøve. Scipion indeholder alle værktøjerne til at oprette denne arbejdsproces ved hjælp af flere billedbehandlingspakker i en integrerende ramme, hvilket også gør det muligt at spore resultaterne. I denne artikel præsenteres og diskuteres hele billedbehandlingsarbejdsgangen i Scipion med data, der kommer fra en rigtig testsag, der giver alle de detaljer, der er nødvendige for at gå fra de film, der er opnået af mikroskopet, til en 3D-rekonstruktion i høj opløsning. Også styrken ved at bruge konsensusværktøjer, der tillader at kombinere metoder og bekræfte resultater langs hvert trin i arbejdsgangen, forbedre nøjagtigheden af de opnåede resultater, diskuteres.

Introduction

I kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) er enkeltpartikelanalyse (SPA) af vitrified frosne hydrerede prøver en af de mest anvendte og succesfulde varianter af billeddannelse til biologiske makromolekyler, da det gør det muligt at forstå molekylære interaktioner og funktionen af biologiske ^ensembler1. Dette er takket være de seneste fremskridt i denne billeddannelse teknik, der gav anledning til "opløsning revolution"² og har tilladt en vellykket bestemmelse af biologiske 3D-strukturer med næsten atomare opløsning. I øjeblikket var den højeste opløsning opnået i SPA cryo-EM 1,15 Å for apoferritin3 (EMDB post: 11668). Disse teknologiske fremskridt omfatter forbedringer i prøveforberedelsen4, billedopsamlingen5 og billedbehandlingsmetoderne6. Denne artikel er fokuseret på dette sidste punkt.

Kort sagt er målet med billedbehandlingsmetoderne at identificere alle erhvervelsesparametrene for at vende mikroskopets billeddannelsesproces og genvinde 3D-strukturen af den biologiske prøve, der er under undersøgelse. Disse parametre er gevinsten af kameraet, stråle-induceret bevægelse, afvigelser af mikroskop (primært defokusere), 3D kantede orientering og oversættelse af hver partikel, og den kropslige tilstand i tilfælde af at have en prøve med kropslige ændringer. Antallet af parametre er dog meget højt, og cryo-EM kræver brug af lavdosisbilleder for at undgå strålingsskader, hvilket reducerer signal-til-støj-forholdet (SNR) (SNR) for de erhvervede billeder betydeligt. Problemet kan således ikke løses entydigt, og alle de parametre, der kun skal beregnes, kan være skøn. Langs arbejdsgangen for billedbehandling skal de korrekte parametre identificeres, så de resterende endelig kan få en 3D-rekonstruktion i høj opløsning.

De data, der genereres af mikroskopet, indsamles i rammer. Forenkling, en ramme indeholder antallet af elektroner, der er ankommet til en bestemt position (pixel) i billedet, når elektron-tælle detektorer anvendes. I et bestemt synsfelt indsamles flere rammer, og dette kaldes en film. Da lave elektrondoser bruges til at undgå strålingsskader, der kan ødelægge prøven, er SNR meget lav, og de rammer, der svarer til den samme film, skal beregnes i gennemsnit for at få et billede, der afslører strukturelle oplysninger om prøven. Men ikke kun et simpelt gennemsnit anvendes, prøven kan lide skift og andre former for bevægelser i billeddannelsestiden på grund af stråle-induceret bevægelse, der skal kompenseres. De skiftkompensere og i gennemsnitsrammer stammer fra en mikrograf.

Når mikrograferne er opnået, er vi nødt til at estimere de afvigelser, der er indført af mikroskopet for hver af dem, kaldet Contrast Transfer Function (CTF), som repræsenterer ændringerne i kontrasten af mikrografen som en funktion af frekvensen. Derefter kan partiklerne vælges og ekstraheres, som kaldes partikelplukning. Hver partikel skal være et lille billede, der kun indeholder en kopi af den undersøgte prøve. Der er tre familier af algoritmer til partikelplukning: 1) dem, der kun bruger nogle grundlæggende parameterisering af udseendet af partiklen til at finde dem i hele sættet af mikrografer (f.eks partikelstørrelse), 2) dem, der lærer, hvordan partiklerne ser ud fra brugeren eller et forudbestemt sæt, og 3) dem, der bruger billedskabeloner. Hver familie har forskellige egenskaber, der vil blive vist senere.

Det ekstraherede sæt partikler, der findes i mikrograferne, vil blive brugt i en 2D-klassificeringsproces, der har to mål: 1) rengøring af sæt partikler ved at kassere delsættet, der indeholder rene støjbilleder, overlappende partikler eller andre artefakter, og 2) de gennemsnitlige partikler, der repræsenterer hver klasse, kan bruges som indledende oplysninger til at beregne et 3D-oprindeligt volumen.

3D-beregningen af den oprindelige diskenhed er det næste afgørende skridt. Problemet med at opnå 3D-strukturen kan ses som et optimeringsproblem i et flerdimensionalt løsningslandskab, hvor det globale minimum er det bedste 3D-volumen, der repræsenterer den oprindelige struktur, men flere lokale minima, der repræsenterer suboptimale løsninger, kan findes, og hvor det er meget nemt at blive fanget. Den oprindelige diskenhed repræsenterer udgangspunktet for søgeprocessen, så dårlig indledende volumenestimering kan forhindre os i at finde det globale minimum. Fra det første volumen vil et 3D-klassificeringstrin hjælpe med at opdage forskellige kropsbygningstilstande og igen rense sæt partikler; målet er at opnå en strukturelt homogen population af partikler. Derefter vil et 3D-raffinementstrin være ansvarlig for at forfine kantede og oversættelsesparametre for hver partikel for at få det bedst mulige 3D-volumen.

Endelig kan den opnåede 3D-rekonstruktion i de sidste trin skærpes og poleres. Skarphed er en proces med at øge de høje frekvenser af den rekonstruerede volumen, og polering er et skridt til yderligere at forfine nogle parametre, som CTF eller stråle-induceret bevægelse kompensation, på niveau med partikler. Nogle valideringsprocedurer kan også bruges til bedre at forstå den opnåede opløsning i slutningen af arbejdsprocessen.

Efter alle disse trin vil sporings- og ^{dockingprocesserne7} bidrage til at give den opnåede 3D-rekonstruktion en biologisk betydning ved at bygge atommodeller de novo eller montere eksisterende modeller. Hvis der opnås høj opløsning, vil disse processer fortælle os placeringen af de biologiske strukturer, selv af de forskellige atomer, i vores struktur.

^Scipion8 gør det muligt at oprette hele arbejdsgangen, der kombinerer de mest relevante billedbehandlingspakker på en integrerende måde. ^Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, ^Eman12, ^Spider13, ^Cryolo14, ^Ctffind15, ^CCP416, ^Phenix17 og mange flere pakker kan indgå i Scipion. Den indeholder også alle de nødvendige værktøjer til gavn for integration, interoperabilitet, sporbarhed og reproducerbarhed for at foretage en fuld sporing af hele billedbehandlingsarbejdsgangen8.

Et af de mest kraftfulde værktøjer, som Scipion giver os mulighed for at bruge, er konsensus, hvilket betyder at sammenligne de opnåede resultater med flere metoder i et trin af behandlingen, hvilket gør en kombination af de oplysninger, der formidles af forskellige metoder til at generere et mere præcist output. Dette kan bidrage til at øge ydeevnen og forbedre den opnåede kvalitet i de anslåede parametre. Bemærk, at en enklere arbejdsgang kan opbygges uden brug af konsensusmetoder. Vi har dog set kraften i dette ^{værktøj22,25}, og arbejdsgangen, der præsenteres i dette manuskript, vil bruge det i flere trin.

Alle de trin, der er opsummeret i de foregående afsnit, forklares i detaljer i det følgende afsnit og kombineres i en komplet arbejdsproces ved hjælp af Scipion. Også, hvordan man bruger konsensus værktøjer til at opnå en højere aftale i de genererede output vil blive vist. Med henblik herpå er der valgt eksempeldatasæt for Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR-indgang: 10028, EMDB-indgang: 2660). Datasættet er dannet af 600 film af 16 billeder af størrelse 4096x4096 pixels på en pixel størrelse på 1.34Å taget på en FEI POLARA 300 med en FEI FALCON II kamera, med en rapporteret opløsning på EMDB er ^3.2Å18 .

Protocol

1. Oprettelse af et projekt i Scipion og import af data

1. Åbn Scipion, og klik på Opret projekt, angiv navnet på projektet og den placering, hvor det skal gemmes (supplerende figur 1). Scipion åbner projektvinduet, der viser et lærred med et panel med en liste over tilgængelige metoder i venstre side, som hver især repræsenterer ét billedbehandlingsværktøj, der kan bruges til at administrere data.
   BEMÆRK: Ctrl+F kan bruges til at finde en metode, hvis den ikke vises på listen.
2. Hvis du vil importere de film, der er taget af mikroskopet, skal du markere pwem - importere film i venstre panel (eller skrive dem, når du trykker på Ctrl+F).
3. Et nyt vindue vil blive åbnet (supplerende figur 2). Der skal du medtage stien til dataene og anskaffelsesparametrene. I dette eksempel skal du bruge følgende opsætning: Mikroskopspænding 300 kV, sfærisk aberration 2,0 mm, amplitudkontrast 0,1, Forstørrelseshastighed 50000, prøveudtagningshastighedstilstand til Fra billede og Pixelstørrelse 1,34 Å. Når alle parametrene i formen er udfyldt, skal du klikke på knappen Udfør .
   BEMÆRK: Når en metode starter, vises en boks på lærredet i gul farve, der er mærket som kørende. Når en metode er færdig, ændres feltet til grønt, og etiketten ændres til færdig. I tilfælde af en fejl under udførelsen af en metode vises boksen med rødt, mærket som mislykket. I så fald skal du kontrollere den nederste del af lærredet, og der vises en forklaring på fejlen under fanen Outputlog .
4. Når metoden er færdig, skal du kontrollere resultaterne i den nederste del af lærredet under fanen Oversigt . Her præsenteres de output, der genereres af metoden, i dette tilfælde sættet af film. Klik på knappen Analyser resultater, og der vises et nyt vindue med listen over film.

2. Filmjustering: fra film til mikrografer

1. Brug metoden xmipp3 - optisk justering , der implementerer optisk ^flow19. Brug følgende parametre til at udfylde formularen (supplerende figur 3): Inputfilmene er dem, der opnås i trin 1, området i Rammer til ALIGN er fra 2 til 13, de andre indstillinger forbliver med standardværdierne. Udfør programmet.
   BEMÆRK: Parametrene med fed skrift i en formular skal altid udfyldes. De andre vil have en standardværdi eller vil ikke være obligatorisk påkrævet. I den øverste del af formularvinduet kan de felter, hvor beregningsressourcerne fordeles, findes som tråde, MMI'er eller GPU'er.
2. Klik på Analyser resultater for at kontrollere de opnåede mikrografer og forløbet af de anslåede skift (figur 1). For hver mikrograf set: se på magtspektral spektral tæthed (PSD), de baner opnået for at justere filmen (et punkt pr ramme) i kartesiske og polære koordinater, og filnavnet på den opnåede mikrograf (hvis du klikker på det, kan mikrografen inspiceres). Bemærk, at partiklerne i prøven er meget mere synlige i mikrografen sammenlignet med en enkelt ramme af filmen.

3. CTF-skøn: beregning af mikroskopets afvigelser

1. Først skal du bruge metoden grigoriefflab - ctffind15. Opsætningen er: Input Micrographs er outputtet fra trin 2, den manuelle CTF-nedsamplingsfaktor er indstillet til 1,5, og opløsningsområdet går fra 0,06 til 0,42. Desuden skal du angive vinduesstørrelsen til 256 i de avancerede indstillinger (som kan findes ved at vælge dette valg i formularens ekspertniveau). De resterende parametre forbliver med standardværdierne (supplerende figur 4).
   BEMÆRK: I de fleste metoder i Scipion viser indstillingen Avanceret flere konfigurationsparametre. Brug disse indstillinger omhyggeligt, når det program, der skal lanceres, er helt kendt, og betydningen af parametrene forstås. Nogle parametre kan være vanskelige at udfylde uden at kigge på dataene; I så fald viser Scipion en tryllestav på højre side, der viser et guidevindue (supplerende figur 5). I feltet Opløsning i denne form er det f.eks. særligt nyttigt, da disse værdier skal vælges til ca. at dække området fra det første nul til den sidste mærkbare ring i PSD'en.
2. Klik på Udfør og på Analyser resultater (figur 2), når metoden er færdig. Kontroller, at den anslåede CTF matcher den eksperimentelle. Med henblik herpå skal du se på PSD og sammenligne de anslåede ringe i hjørnet med dem, der kommer fra dataene. Kontroller også de opnåede defokuseringsværdier for at finde uventede værdier, og respektive mikrografer kan kasseres eller genberegnes. I dette eksempel kan hele sættet af mikrografer bruges.
   BEMÆRK: Brug knapperne i den nederste del af vinduet til at lave et undersæt af mikrografer (med micrographs rød knap) og til at genberegne en CTF (med genberegne CTF'er rød knap), i tilfælde af behov.
3. Hvis du vil forfine det tidligere skøn, skal du bruge xmipp3 - ctf ^estimation20. Vælg som inputmikrografer outputtet fra trin 2, vælg indstillingen Brug defoci fra et tidligere CTF-estimering, da Forrige CTF-estimering vælger outputtet af grigoriefflab - ctffind, og skift vinduesstørrelsen til 256 (supplerende figur 6) på avanceret niveau. Kør det.
4. Klik på Analyser resultater for at kontrollere de opnåede CF'er. Med denne metode estimeres og repræsenteres flere data i nogle ekstra kolonner. Da ingen af dem viser forkerte anslåede værdier, bruges alle mikrografer i følgende trin.

4. Partikelplukning: finde partikler i mikrograferne

1. Før du starter plukning, skal du udføre en forbehandling af mikrograferne. Åbn xmipp3 - forbehandling mikrografer, der er indstillet som Input mikrografer dem, der opnås i trin 2 og vælge de muligheder Fjern dårlige pixels? Klik på Udfør og kontrollere, at størrelsen af de resulterende mikrografer er blevet reduceret.
2. Til plukbrug xmipp3 - manuel pluk (trin 1) og xmipp3 - automatisk pluk (trin 2)²¹. Den manuelle plukning gør det muligt manuelt at forberede et sæt partikler, som autoplukningstrinnet lærer og genererer det komplette sæt partikler med. Kør først xmipp3 - manuel pluk (trin 1) med inputmikrografer som de mikrografer, der blev opnået i de foregående forbehandlinger. Klik på Udfør , og der vises et nyt interaktivt vindue (figur 3).
3. I dette vindue vises en liste over mikrografer (figur 3a) og andre muligheder. Skift størrelse (px) til 150, dette vil være størrelsen af den boks, der indeholder hver partikel. Den valgte mikrograf vises i et større vindue. Vælg et område, og vælg alle de synlige partikler i den (figur 3b). Klik derefter på Aktivér træning for at starte læringen. De resterende områder af mikrografen plukkes automatisk (figur 3c). Kontroller de plukkede partikler og medtag mere ved at klikke på det, eller fjern de forkerte med skift + klik, hvis det er nødvendigt.
4. Vælg den næste mikrograf i det første vindue. Mikrografen plukkes automatisk. Kontroller igen for at inkludere eller fjerne nogle partikler, hvis det er nødvendigt. Gentag dette trin med ca. 5 mikrografer for at oprette et repræsentativt træningssæt.
5. Når dette er gjort, skal du klikke på Koordinater i hovedvinduet for at gemme koordinaterne for alle de plukkede partikler. Træningssættet af partikler er klar til at gå til auto picking for at fuldføre processen for alle mikrografer.
6. Åbn xmipp3 - autoplukning (trin 2), der angiver i Xmipp partikelplukning, kør den forrige manuelle pluk og Mikrografer, der skal vælges som samme som overvåget. Klik på Udfør. Denne metode genererer som output et sæt på omkring 100000 koordinater.
7. Anvend en konsensus tilgang, så udfør en anden plukmetode til at vælge de partikler, hvor begge metoder er enige. Åbn sphire - cryolo ^picking14 og vælg de forarbejdede mikrografer som inputmikrografer, Brug generel model til Ja, med en tillidstærskel på 0,3 og en kassestørrelse på 150 (supplerende figur 8). Kør det. Denne metode bør også generere omkring 100000 koordinater.
8. Kør xmipp3 - dyb konsensus ^picking22. Da inputkoordinater omfatter output af sphire - cryolo picking (trin 4.7) og xmipp3 - auto-picking (trin 4.6), skal du indstille Vælg modeltype til Pretrained, og Spring træning og score direkte med forudgående model? Til Ja (supplerende figur 9). Kør det.
9. Klik på Analyser resultater og i det nye vindue på øjenikonet ved siden af Vælg partikler /koordinater med høje 'zScoreDeepLearning1'-værdier. Et nyt vindue vil blive åbnet med en liste over alle partikler (figur 4). zScore-værdierne i kolonnen giver et indblik i kvaliteten af en partikel, lave værdier betyder dårlig kvalitet.
   1. Klik på etiketten_xmipp_zScoreDeepLearning for at bestille partiklerne fra højeste til laveste zScore. Vælg partiklerne med zScore højere end 0,75, og klik på Koordinater for at oprette det nye undersæt. Dette skulle skabe et undersæt med ca. 50000 koordinater.
10. Åben xmipp3 - dyb mikrograf renere. Vælg som inputkoordinater det undersæt, der blev opnået i forrige trin, Mikrografer kilde som koordinater, og hold Threshold på 0,75. Kør det. Kontroller under fanen Oversigt , at antallet af koordinater er blevet reduceret, men i dette tilfælde fjernes kun få koordinater.
    BEMÆRK: Dette trin er i stand til desuden at rense sættet af koordinater og kunne være meget nyttigt i rengøring af andre datasæt med flere film artefakter som kulstof zoner eller store urenheder.
11. Kør xmipp3 - ekstrakt partikler (supplerende figur 10). Angiv som input koordinater de koordinater, der er opnået efter det foregående trin, Micrographs kilde som andre, Input mikrografer som output af trin 2, CTF skøn som produktionen af xmipp3 - ctf skøn, Downsampling faktor til 3, og Partikel boks størrelse til 100. Vælg Ja til alle under fanen Forbehandling i formen . Kør det.
12. Kontroller, at udgangen skal indeholde partiklerne i reduceret størrelse på 100x100 pixels og en pixelstørrelse på 4,02Å/px.
13. Kør igen xmipp3 - uddrag partikler , der ændrer følgende parametre: Downsampling-faktor til 1 og partikelboksstørrelse til 300. Kontroller, at outputtet er det samme sæt partikler, men nu ved fuld opløsning.

5. 2D-klassificering: gruppering af lignende partikler

1. Åbn metoden cryosparc2 - 2d ^{klassificering11} med inputpartikler som dem, der opnås i trin 4.11, og i fanen 2D-klassifikation holder antallet af klasser til 128 alle de andre parametre med standardværdierne. Kør det.
2. Klik på Analyser resultater , og klik derefter på øjeikonet ved siden af Vis partikelklasser med Scipion (figur 5). Denne klassificering vil bidrage til at rense sættet af partikler, som flere klasser vil fremstå støjende eller med artefakter. Vælg de klasser, der indeholder en god udsigt. Klik på Partikler (rød knap i den nederste del af vinduet) for at oprette den renere delmængde.
3. Åbn nu xmipp3 - cl2d23 og sæt som inputbilleder billederne opnået i det foregående trin og Antal klasser som 128. Klik på Udfør.
   BEMÆRK: Denne anden klassificering bruges som yderligere rengøringstrin for sæt partikler. Normalt er nyttigt at fjerne så mange støjende partikler som det er muligt. Men hvis der ønskes en enklere arbejdsproces, kan der kun bruges én 2D-klassificeringsmetode.
4. Når metoden er færdig, skal du kontrollere de 128 genererede klasser ved at klikke på Analyser resultater og på Hvad der skal vises: klasser. De fleste af de genererede klasser viser en projektion af makromolekylet med en vis detaljeringsgrad. Nogle af dem ser dog støjende ud (i dette eksempel ca. 10 klasser). Vælg alle de gode klasser, og klik på knappen Klasser for at generere et nyt undersæt med kun de gode. Dette undersæt bruges som input til en af metoderne til at generere en indledende diskenhed. Med de samme valgte klasser skal du klikke på Partikler for at oprette en renere delmængde efter at have fjernet dem, der tilhører de dårlige klasser.
5. Åbn pwem - delmængde med Fuldt sæt elementer som output af 4,13 (alle partikler i fuld størrelse), Lav tilfældig delmængde til Nej, Andet sæt som delmængde af partikler skabt i det foregående trin, og Indstil drift som skæringspunkt. Dette vil udtrække den tidligere delmængde fra partiklerne ved fuld opløsning.

6. Indledende volumen skøn: opbygning af det første gæt af 3D-volumen

1. I dette trin skal du estimere to indledende diskenheder med forskellige metoder og derefter bruge et konsensusværktøj til at generere den endelige anslåede 3D-volumen. Åbn xmipp3 - rekonstruer ^{signifikant24} metode med input klasser som dem, der opnås efter trin 5, Symmetry gruppe som c1, og holde de resterende parametre med deres standardværdier (supplerende figur 11). Udfør det.
2. Klik på Analyser resultater. Kontroller, at der opnås en diskenhed med lav opløsning på størrelse 100x100x100 pixel og en pixelstørrelse på 4,02Å/px.
3. Åbn xmipp3 - Beskær/tilpas størrelsen på diskenheder (supplerende figur 12) ved hjælp af den mængde, der blev opnået i forrige trin, Tilpas diskenheder som inputmængder, indstillingen Tilpas størrelse til Ja, Tilpas størrelse til prøvetagningshastighed og Tilpas størrelsen på prøvetagningshastigheden til 1,34 Å/px. Kør det. Kontroller under fanen Oversigt, at outputdiskenheden har den korrekte størrelse.
4. Opret nu den anden første diskenhed. Åben relion - 3D indledende ^model10, som input partikler bruger de gode partikler ved fuld opløsning (output af 5,5) og indstille partikel maske diameter til 402Å, holde de resterende parametre med standardværdierne. Kør det.
5. Klik på Analyser resultater , og klik derefter på Vis lydstyrke med: udsnit. Kontroller, at der opnås et volumen med lav opløsning, men med strukturens hovedform (supplerende figur 13).
6. Nu skal du åbne pwem - joinsæt for at kombinere de to genererede indledende diskenheder for at skabe input til konsensusmetoden. Du skal blot angive Diskenheder som inputtype og vælge de to første diskenheder i inputsættet. Kør det. Outputtet skal være et sæt, der indeholder to elementer med begge diskenheder.
7. Konsensusværktøjet er det, der indgår i xmipp3 - sværm ^konsensus25. Åbn den. Brug som billeder i fuld størrelse de gode partikler ved fuld opløsning (output på 5,5), som indledende mængder sættet med to elementer genereret i det foregående trin, og sørg for, at Symmetri gruppe er c1. Klik på Udfør.
8. Klik på Analyser resultater. Kontroller, at der opnås en mere detaljeret outputvolumen (figur 6). Selv om der er mere støj omkring strukturen, at have flere detaljer i strukturen kortet vil hjælpe følgende raffinement skridt til at undgå lokale minima.
   BEMÆRK: Hvis UCSF ^Chimera26 er tilgængelig, skal du bruge det sidste ikon i den øverste del af vinduet til at foretage en 3D-visualisering af den opnåede diskenhed.
9. Åbn og udfør relion - 3D auto-forfine10 at gøre en første 3D kantede tildeling af partiklerne. Vælg som inputpartikler output af 5,5, og sæt partikelmaskediameter til 402Å. Under fanen Reference 3D-kort skal du vælge som inputvolumen som den, der blev opnået i forrige trin, Symmetri som c1 og Indledende low-pass-filter til 30Å (supplerende figur 14).
10. Klik på Analyser resultater. I det nye vindue skal du vælge endelig som Volumen, der skal visualiseres, og klik på Vis diskenhed med: udsnit for at se den opnåede diskenhed. Kontroller også FSC (Fourier Shell Korrelation) ved at klikke på Displayopløsningsplot i resultatvinduet og den kantede dækning i Display kantet fordeling: 2D-plot (figur 7). Det rekonstruerede volumen indeholder meget flere detaljer (sandsynligvis med nogle slørede områder i den ydre del af strukturen), og FSC krydser tærsklen på 0,143 omkring 4,5Å. Den kantede dækning dækker hele 3D-kuglen.

7.3D klassificering: opdage kropsbygningstilstande

1. Ved hjælp af en konsensus tilgang, hvis forskellige kropsbygning stater er i dataene kan opdages. Åben relion - 3D-klassifikation10 (supplerende figur 15). Som Input partikler bruger dem, der netop er opnået i 6,10, og sæt Partikel maske diameter til 402Å. Brug som inputvolumen som inputvolumen, den, der er opnået efter trin 6.10, angiv Symmetri til c1 og Indledende low-pass-filter til 15Å. Endelig skal du under fanen Optimering angive antallet af klasser til 3. Kør det.
2. Kontroller resultaterne ved at klikke på Analyser resultater, vælg Vis klassifikation i Scipion. De tre genererede klasser og nogle interessante foranstaltninger vises. De to første klasser skal have et lignende antal tildelte billeder (størrelseskolonne ) og se meget ens ud, mens den tredje har færre billeder og et mere sløret udseende. Desuden bør rlnAccuracyRotations og rlnAccuracyTranslations være klart bedre for de to første klasser. Vælg de to bedste klasser, og klik på knappen Klasser for at generere et undersæt, der indeholder dem.
3. Gentag trin 7.1 og 7.2 for at generere en anden gruppe af gode klasser. Begge dele vil være inputtet til konsensusværktøjet.
4. Åbn og kør xmipp3 - konsensusklasser 3D og vælg som inputklasser de to undersæt, der er genereret i de foregående trin.
5. Klik på Analyser resultater. Antallet af sammenfaldende partikler mellem klasser præsenteres: den første værdi er antallet af sammenfaldende partikler i den første klasse af delmængde 1 og den første klasse af delmængde 2, den anden værdi er antallet af sammenfaldende partikler i den første klasse af delmængde 1 og anden klasse af delmængde 2 osv. Kontroller, at partiklerne tilfældigt tildeles klasserne et eller to, hvilket betyder, at 3D-klassificeringsmetoden ikke er i stand til at finde kropslige ændringer. I betragtning af dette resultat vil hele sættet af partikler blive brugt til at fortsætte behandlingen.

8.3D raffinement: raffinering af kantede opgaver af en homogen population

1. Igen, anvende en konsensus tilgang i dette trin. Først skal du åbne og køre pwem - delmængde med Fuldt sæt elementer som output af 6,9, Lav tilfældig delmængde til Ja og Antal elementer til 5000. Med dette oprettes et undersæt af billeder med en tidligere justering for at træne den metode, der bruges i det følgende trin.
2. Åbn xmipp3 - dybjustering, indstil Inputbilleder som output af gode partikler opnået i 5.5, Volumen som den, der opnås efter 6.10, Inputtræning indstillet som den, der blev oprettet i det foregående trin, Målopløsning til 10Å, og hold de resterende parametre med standardværdierne (supplerende figur 16). Klik på Udfør.
3. Klik på Analyser resultater for at kontrollere den opnåede vinkelfordeling, hvor der ikke mangler retninger, og den kantede dækning forbedres lidt sammenlignet med den af 6.10 (figur 8).
4. Åbn og udfør xmipp3 - sammenlign vinkler og vælg som inputpartikler 1 output af 6,9 og inputpartikler 2 output af 8,2, sørg for, at Symmetri gruppen er c1. Denne metode beregner aftalen mellem xmipp3 - dybjustering og relion - 3D auto forfine.
5. Klik på Analyser resultater, listen over partikler, med de opnåede forskelle i skift og vinkler, er vist. Klik på søjleikonet i den øverste del af vinduet, et andet vindue åbnes, der gør det muligt at lave plots af de beregnede variabler. Vælg _xmipp_angleDiff og klik på Plot for at se en repræsentation af de kantede forskelle pr partikel. Gør det samme med _xmipp_shiftDiff. I disse tal er begge metoder ca. halvdelen af partiklerne enige (figur 9). Vælg partiklerne med vinkelforskelle, der er lavere end 10º, og opret en ny delmængde.
6. Nu skal du åbne xmipp3 - highres27 for at lave en lokal raffinement af de tildelte vinkler. Først skal du vælge som billeder i fuld størrelse, som de billeder, der blev opnået i forrige trin, og som indledende diskenheder skal outputtet på 6,9 indstille partikelradius til 150 pixel og symmetrigruppen som c1. Angiv justeringen billede til Lokal, Antal gentagelser til 1 og Maks. under fanen Kantede tildelinger. Målopløsning som 5Å/px (supplerende figur 17). Kør det.
7. Kontroller under fanen Oversigt , at outputenheden er mindre end 300 x 300 x 300 pixel og med en lidt højere pixelstørrelse.
8. Klik på Analyser resultater for at se de opnåede resultater. Klik på Displayopløsningsplotter for at se FSC og på displayvolumen: Rekonstrueret for at se den opnåede volumen (supplerende figur 18). En god opløsning volumen tæt på 4-3.5Å er opnået.
9. Klik på Vis outputpartikler , og klik på søjleikonet i vinduet med listen over partikler. Vælg Skriv som histogram med 100 placeringer i det nye vindue, vælg _xmipp_cost etiket, og tryk til sidst på Plot (supplerende figur 19). På denne måde præsenteres omkostningsetikettens histogramme, som indeholder korrelationen af partiklen med projektionsretningen valgt til den. I dette tilfælde opnås en unimodal tæthedsfunktion, hvilket er et tegn på ikke at have forskellige populationer i sæt partikler. De vil således alle blive brugt til at fortsætte forfinelsen
   BEMÆRK: I tilfælde af at se en multimodal tæthedsfunktion bør sættet af partikler, der tilhører det højere maksimum, vælges for kun at fortsætte arbejdsgangen med dem.
10. Åbn og udfør igen xmipp3 - highres med Fortsæt fra en tidligere kørsel? til Ja, angiv som Billeder i fuld størrelse dem, der er opnået efter 8,5, og Vælg forrige kørsel med den tidligere udførelse af Xmipp Highres. Angiv justeringen billede til Lokal under fanen Kantede tildelinger med 1 gentagelse og 2,6Å/px som målopløsning (fuld opløsning).
11. Nu skal outputtet indeholde en diskenhed med fuld opløsning (størrelse 300x300x300 pixels). Klik på Analyser resultater for igen at kontrollere den opnåede volumen og FSC, som nu skal være en høj opløsning volumen på omkring 3Å (Figur 10).

9. Evaluering og efterbehandling

1. Åbn xmipp3 - lokal MonoRes28. Denne metode beregner opløsningen lokalt. Angiv som inputvolumen den, der er opnået efter 8.10, indstille Vil du bruge halve diskenheder? til Ja og Opløsningsområde fra 1 til 10Å. Kør det.
2. Klik på Analyser resultater, og vælg Vis opløsning histogram og Vis farvede udsnit (figur 11). Opløsningen i de forskellige dele af diskenheden vises. De fleste voxels i den centrale del af strukturen bør præsentere beslutninger omkring 3Å, mens de værste beslutninger opnås i de ydre dele. Også et histogramme af opløsningerne pr voxel er vist med en top rundt (selv under) 3Å.
3. Åbn og kør xmipp3 - localdeblur slibning29 for at anvende en skarphed. Vælg som inputkort den, der blev opnået i 8.10, og som opløsning Kort den, der blev opnået i det foregående trin med MonoRes.
4. Klik på Analyser resultater for at kontrollere de opnåede mængder. Åbn den sidste, svarende til den sidste gentagelse af algoritmen. Det anbefales at åbne lydstyrken med andre værktøjer, såsom UCSF ^Chimera26, for bedre at se volumenets egenskaber i 3D (figur 12).
5. Endelig skal du åbne valideringsværktøjet, der er inkluderet i xmipp3 - validere overmontering30, der viser, hvordan opløsningen ændres med antallet af partikler. Åbn den og inkluder som inputpartikler partiklerne opnået i trin 8.5, sæt Beregn støjen, der er på vej til opløsning? til Ja, med indledende 3D-referencevolumen som output på 8.10. Angiv antallet af partikel til "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (supplerende figur 20) i Avancerede indstillinger. Kør det.
6. Klik på Analyser resultater. To parceller vises (figur 13) med udviklingen af opløsningen, i den grønne linje, da antallet af partikler, der anvendes i genopbygningen vokser. Den røde linje repræsenterer den opløsning, der er opnået med en rekonstruktion af justeret gaussisk støj. Opløsningen forbedres med antallet af partikler, og der observeres en stor forskel i rekonstruktionen fra partikler sammenlignet med den fra støj, hvilket er en indikator for at have partikler med god strukturel information.
7. Fra de tidligere resultater kunne der udføres en montering af en model i det efterbehandlede volumen, hvilket ville gøre det muligt at opdage makromolekylets biologiske strukturer.

Representative Results

Vi har brugt datasættet af Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR-indgang: 10028, EMDB-indgang: 2660) til at udføre testen, og med Scipion-protokollen, der blev præsenteret i forrige afsnit, er der opnået et 3D-rekonstrueret volumen i høj opløsning i dette særlige eksempel, begyndende med de oplysninger, der er indsamlet af mikroskopet, der består af meget støjende billeder, der indeholder 2D-fremskrivninger i enhver retning af prøven.

De vigtigste resultater, der opnås efter at have kørt hele protokollen, er præsenteret i figur 10, figur 11 og figur 12. Figur 10 repræsenterer den opnåede 3D-diskenhed før efterbehandlingen. I figur 10a kan man se en FSC på 3 Å, at den ligger meget tæt på Nyquist-grænsen (med data med en pixelstørrelse på 1,34 Å er Nyquist-grænsen 2,6 Å). Figur 10b viser nogle udsnit af det rekonstruerede 3D-volumen med høje detaljer og veldefinerede strukturer. I figur 11 præsenteres resultaterne efter lokalt analyse af opløsningen af det opnåede 3D-volumen. Det kan ses, at de fleste voxels i strukturen opnår en opløsning under 3 Å, hovedsagelig dem, der ligger i den centrale del af strukturen. Den ydre del viser imidlertid værre opløsninger, hvad der er i overensstemmelse med sløringen, der forekommer i disse områder i skiverne i figur 10b. Figur 12 viser det samme 3D-kort efter efterbehandling, der er i stand til at fremhæve de højere frekvenser af volumen, afslører flere detaljer og forbedrer repræsentationen, hvilket især kan ses i 3D-præsentationen i figur 12c.

I figur 14 blev ^Chimera26 brugt til at se en 3D-repræsentation af det opnåede volumen (figur 14a), den efterbehandlede (figur 14b) og opløsningskortet (figur 14c), farvet med farvekoden for de lokale opløsninger. Dette kan give endnu flere oplysninger om den opnåede struktur. Dette værktøj er meget nyttigt for at få et indblik i kvaliteten af det opnåede volumen, da meget små detaljer i hele 3D-konteksten af strukturen kan ses. Når den opnåede opløsning er nok, kan selv nogle biokemiske dele af strukturen findes (f.eks alfa-helices i figur 14d. I dette tal skal det fremhæves den høje opløsning, der opnås i alle de centrale dele af 3D-strukturen, som kan ses som de mørkeblå områder i figur 14c.

Alle de tidligere resultater blev opnået takket være en god præstation af hele protokollen, men dette er måske ikke tilfældet. Der er flere måder at identificere en dårlig opførsel på. I det mest generelle tilfælde sker dette, når den opnåede struktur har lav opløsning, og den ikke er i stand til at udvikle sig til en bedre. Et eksempel herpå er vist i figur 15. Et sløret volumen (Figur 15c) resulterer i en lav FSC, som kan ses i FSC-kurven (figur 15a) og histogrammet af det lokale skøn (Figur 15b). Dette eksempel blev genereret ved hjælp af en 3D-raffinementsmetode med forkerte inputdata, da det forventede nogle specifikke egenskaber i inputsættet af partikler, som de ikke opfylder. Som det kan ses, er det altid meget vigtigt at vide, hvordan de forskellige metoder forventer at modtage dataene og forberede dem ordentligt. Generelt, når et output som det i figur 15 opnås, kan der være et problem i behandlingsarbejdsgangen eller de underliggende data.

Der er flere kontrolpunkter langs arbejdsprocessen, der kan analyseres for at vide, om protokollen udvikler sig korrekt eller ej. For eksempel, lige efter plukning, kan flere af de metoder, der diskuteres tidligere, rangere partiklerne og give en score for hver af dem. I tilfælde af at have dårlige partikler gør disse metoder det muligt at identificere og fjerne dem. 2D-klassificeringen kan også være en god indikator for at have et dårligt sæt partikler. Figur 16 viser et eksempel på et så dårligt sæt. I figur 16a vises gode klasser, der indeholder nogle detaljer om strukturen, mens figur 16b viser dårlige klasser, som er støjende eller ucentrerede, i dette sidste tilfælde kan det ses, at plukningen var forkert, og to partikler synes at dukke op sammen. Et andet kontrolpunkt er det oprindelige volumen skøn, Figur 17 viser et eksempel på gode (Figur 17a) og dårlige (Figur 17b) indledende skøn. Det forkerte forkalkulation blev oprettet ved hjælp af en forkert opsætning for metoden. Det skal tages i betragtning, at alle opsætninger skal udføres omhyggeligt og vælge passende hver parameter i henhold til de data, der analyseres. I tilfælde af ikke at have et kort med nogle minimale strukturelle oplysninger, vil følgende raffinement ikke være i stand til at opnå en god genopbygning.

Når problemet er en dårlig erhvervelse, hvor filmene ikke bevarer strukturelle oplysninger, vil det være umuligt at udtrække gode partikler fra dem og få en vellykket behandling. I så fald bør der indsamles flere film for at få en 3D-rekonstruktion i høj opløsning. Men hvis dette ikke er tilfældet, er der flere måder at håndtere problemer langs behandlingsarbejdsgangen på. Hvis plukning ikke er god nok, er der flere måder at forsøge at løse det, f.eks. at gentage plukningen, bruge forskellige metoder eller forsøge manuelt at vælge flere partikler for at hjælpe metoderne til at lære af dem. Under 2D-klassificeringen, hvis bare et par klasser er gode, kan du også overveje at gentage plukprocessen. I den indledende volumen estimering, så prøv at bruge flere metoder, hvis nogle af dem gav unøjagtige resultater. Det samme gælder for 3D-raffinementet. Efter dette ræsonnement er der i dette manuskript blevet præsenteret flere konsensusværktøjer, som kunne være meget nyttige for at undgå problemer og fortsætte behandlingen med nøjagtige data. Takket være at bruge konsensus blandt flere metoder kan vi kassere data, der er vanskelige at vælge, klassificere, justere osv., Hvilket sandsynligvis er en indikator for dårlige data. Men hvis flere metoder er i stand til at blive enige i det genererede output, indeholder disse data sandsynligvis værdifulde oplysninger, som de kan fortsætte behandlingen med.

Vi opfordrer læseren til at downloade flere datasæt og forsøge at behandle dem efter anbefalingerne i dette manuskript og til at skabe en lignende arbejdsgang, der kombinerer behandlingspakker ved hjælp af Scipion. Forsøger at behandle et datasæt er den bedste måde at lære styrken af de behandlingsværktøjer til rådighed i state-of-the-art i Cryo-EM, at kende de bedste regler for at overvinde de mulige ulemper vises under behandlingen, og at øge udførelsen af de tilgængelige metoder i hver enkelt prøvesag.

Figur 1. Resultat af filmjustering. a) Resultatvinduets hovedvindue med en liste over alle de genererede mikrografer og yderligere oplysninger: effektspektral densitet, forløbet for den anslåede justering i polarkoordinater, den samme i kartesiske koordinater, filnavnet på den genererede mikrograf. b) Den tilpasningsbane, der er repræsenteret i kartesiske koordinater. c) Den genererede mikrograf. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. CTF estimering med Ctffind resultat. Hovedvinduet med resultaterne omfatter et tal med den anslåede PSD (i et hjørne) sammen med PSD kommer fra data, og flere defokus params. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Manuel pluk af vinduer med Xmipp. (a) Hovedvinduet med listen over mikrografer til behandling og nogle andre parametre. b) Manuel plukning af partikler i et område af en mikrograf. c) og d) Automatisk plukkede partikler, der skal overvåges for at skabe et sæt træningspartikler til Xmipp autoplukningsmetoden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Dyb konsensus picking med Xmipp resultat. Parameteren zScoreDeepLearning giver vægt til godheden af en partikel, og det er nøglen til at opdage dårlige partikler. (a) De laveste zScores-værdier er knyttet til artefakter. (b) De højeste zScores er forbundet med partikler, der indeholder makromolekylet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. 2D-klassificering med Cryosparc resultat. De genererede klasser (gennemsnit af delmængder af partikler, der kommer fra samme retning) vises. Flere gode klasser valgt i rødt (med en vis detaljeringsgrad) og nogle dårlige klasser ikke-valgte (støjende og uncentered klasser). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. 3D indledende volumen med sværm konsensus resultat. En visning af 3D indledende volumen opnået efter at have kørt konsensusværktøjet xmipp3 - sværm konsensus, ved hjælp af de tidligere 3D indledende volumen skøn over Xmipp og Relion. a) Diskenheden repræsenteres af udsnit. b) 3D-visualisering af diskenheden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. Raffinering af en 3D-startvolumen med Relion-resultatet. a) FSC-kurve opnået, krydser tærsklen på en 4,5Å, ca. b) Kantet dækning vist som øverste visning af 3D-kuglen. I dette tilfælde, da der ikke er symmetri, skal de tildelte partikler dække hele kuglen. c) Raffineret volumen repræsenteret ved skiver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8. 3D-justering baseret på deep learning med Xmipp resultat. De resultater, der genereres af xmipp3 - dybjustermetode til 3D-justering . (a) Den kantede opgave for hver partikel i form af transformation matrix. b) Den kantede dækning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9. 3D tilpasning konsensus resultat. a) Liste over partikler med de opnåede forskelle i skift- og vinklerparametre. b) Plot af de kantede forskelle pr partikel. c) Plot af skiftforskellen pr. partikel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10. Endelig gentagelse af 3D-raffinementsresultatet. a) FSC-kurve. b) Opnået volumen ved fuld opløsning ved skiver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 11. Lokal opløsningsanalyse med Xmipp-resultat. Resultater af metoden xmipp3 - lokale MonoRes. (a) Nogle repræsentative udsnit, der er farvet med opløsningsværdien pr. voxel, som angivet i farvekoden. b) Histogram for lokal opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 12. Skarphed med Xmipp resultat. Resultater af xmipp3 - localdeblur skarphed metode. a) Liste over de opnåede mængder pr. gentagelse. b) 3D-volumen, der er opnået efter den sidste gentagelse, der repræsenteres af skiver. c) En 3D-repræsentation af det endelige bind. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 13. Valider overmonteringsværktøj i Xmipp-resultatet. Resultater af xmipp3 - validering overfitting. Den grønne linje svarer til rekonstruktion fra data, den røde linje fra støj. a) Invers af den kvadrerede opløsning med logaritmen af antallet af partikler. b) Opløsning med antallet af partikler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 14. Flere 3D-repræsentationer af det opnåede volumen. a) Forbehandlet volumen. b) Efterbehandlet volumen. (c) Lokal opløsning, mørkeblå voxels er dem med højere opløsning (2.75Å) og mørkerøde voxels er dem med lavere opløsning (10.05Å). d) Zoom ind på den efterbehandlede diskenhed, hvor der kan ses en alfa-helix (rød oval). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 15. Eksempel på en dårlig 3D-rekonstruktion. a) FSC-kurve med et kraftigt fald og overskrider tærsklen ved lav opløsning. b) Histogram for lokal opløsning. c) 3D-volumen efter skiver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 16. Eksempel på 2D-klasser. (a) Gode klasser, der viser en vis detaljeringsgrad. (b) Dårlige klasser, der indeholder støj og artefakter (øverste del opnået med Xmipp, lavere med CryoSparc). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 17. Eksempel på 3D indledende volumen med forskellige kvaliteter. a) God indledende volumen, hvor makromolekylets form kan observeres. b) Forkert startvolumen, hvor den opnåede form er helt forskellig fra den forventede. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Oprettelse af et Scipion-projekt. Vindue, der vises med Scipion, hvor et gammelt projekt kan vælges, eller hvor der kan oprettes et nyt projekt med et navn og en placering til det pågældende projekt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2. Importér filmmetode. Vindue, der vises af Scipion, når pwem - importfilm er åbne. Her skal de vigtigste anskaffelsesparametre medtages for at lade de film, der kan behandles i Scipion. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3. Filmjusteringsmetode. Vindue, der vises af Scipion, når xmipp3 - optisk justering bruges. Inputfilmene, rækken af rammer, der overvejes til justering, og nogle andre parametre til behandling af filmene skal udfyldes. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4. CTF estimeringsmetode med Ctffind. Formen i Scipion med alle de felter, der er nødvendige for at køre programmet Ctffind. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5. Troldmand i Scipion. En guide, der kan hjælpe brugeren med at udfylde nogle parametre i formularen. I dette tilfælde er guiden at fuldføre opløsningsfeltet i grigoriefflab - ctffind-metoden . Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6. CTF raffinement metode med Xmipp. Formen af xmipp3 - ctf skøn med alle parametrene for at foretage en raffinement af en tidligere anslået CTF. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7. Forbehandler mikrografer metode. Formen af xmipp3 - forbehandler mikrografer , der gør det muligt at udføre nogle operationer over dem. I dette eksempel er Fjern dårlige pixels og Downsample-mikrografer den nyttige. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 8. Plukmetode med Cryolo. Formen til at køre Cryolo-plukmetoden ved hjælp af et forududdannet netværk. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 9. Konsensusplukningsmetode med Xmipp. Form af xmipp3 - dyb konsensus picking baseret på dyb læring til at beregne en konsensus af koordinater, ved hjælp af et prætræt netværk over flere sæt af koordinater opnået med forskellige plukmetoder. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 10. Uddrag partikler metode. Indgangs - og forbehandlingsfaner af xmipp3 - ekstraktpartikler. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 11.3D første volumenmetode med Xmipp. Metodens form xmipp3 - rekonstruere betydelig for at opnå et indledende 3D-kort. Fanerne Input og Kriterier vises. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 12. Tilpas størrelsen på lydstyrkemetoden. Den form, der skal beskæres eller ændre størrelsen på en diskenhed. I dette eksempel bruges denne metode til at generere en volumen i fuld størrelse efter xmipp3 - rekonstruere betydelig. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 13.3D første bind med Relion resultat. En visning af den opnåede 3D indledende volumen med relion - 3D indledende model metode af skiver. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 14. Forfining af den oprindelige diskenhed med Relion. Formen af metoden relion - 3D auto-forfine. I dette eksempel blev det brugt til at forfine en indledende mængde anslået efter konsensus. Fanerne Input og Reference 3D-kort vises. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 15.3D klassificeringsmetode. Form for relion - 3D-klassificering. Fanerne Input, Reference 3D-kort og Optimering vises. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 16.3D tilpasning baseret på en deep learning-metode. Formularen åbnes for metoden xmipp3 - dybjustering. Her er det nødvendigt at træne et netværk med et træningssæt, så vil dette netværk forudsige den kantede opgave pr. Partikel. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 17.3D raffinementsmetode. Form af xmipp3 - highres metode. Faner Input og kantede tildeling vises. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 18. Første iteration af 3D raffinement resultat. a) FSC-kurve. b) Opnået volumen (af mindre størrelse end den fulde opløsning) repræsenteret som skiver. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 19. Første iteration af 3D raffinement korrelation analyse. Et nyt vindue vises ved at klikke på søjleikonet i den øverste del af vinduet med listen over partikler. I vinduet Plotkolonner kan der oprettes et histogramme med den ønskede anslåede parameter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 20. Værktøjet til overmontering af validering. Form af xmipp3 - validere overfitting metode. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I øjeblikket er cryo-EM et vigtigt værktøj til at afsløre 3D-strukturen af biologiske prøver. Når gode data indsamles med mikroskopet, giver de tilgængelige behandlingsværktøjer os mulighed for at opnå en 3D-rekonstruktion af det makromolekyle, der undersøges. Cryo-EM databehandling er i stand til at opnå nær-atomare opløsning, som er nøglen til at forstå den funktionelle adfærd af en makromolekyle og er også afgørende i opdagelse af lægemidler.

Scipion er en software, der gør det muligt at oprette hele arbejdsgangen, der kombinerer de mest relevante billedbehandlingspakker på en integrerende måde, hvilket hjælper sporbarheden og reproducerbarheden af hele billedbehandlingsarbejdsgangen. Scipion giver et meget komplet sæt værktøjer til at udføre behandlingen; Opnåelse af rekonstruktioner med høje opløsninger afhænger imidlertid helt af kvaliteten af de erhvervede data, og hvordan disse data behandles.

For at få en 3D-rekonstruktion i høj opløsning er det første krav at få gode film fra mikroskopet, som bevarer strukturel information til høj opløsning. Hvis dette ikke er tilfældet, kan arbejdsprocessen ikke udtrække high definition-oplysninger fra dataene. Derefter bør en vellykket behandlingsarbejdsgang være i stand til at udtrække partikler, der virkelig svarer til strukturen og finde retningerne af disse partikler i 3D-rummet. Hvis et af trinnene i arbejdsprocessen mislykkes, forringes kvaliteten af den rekonstruerede diskenhed. Scipion giver mulighed for at bruge forskellige pakker i nogen af behandlingstrinnene, hvilket hjælper med at finde den mest hensigtsmæssige tilgang til at behandle dataene. Takket være mange pakker til rådighed kan der desuden anvendes konsensusværktøjer, der øger nøjagtigheden ved at finde en aftale i de anslåede output af forskellige metoder. Det er også blevet diskuteret i detaljer i sektionen Repræsentative resultater flere valideringsværktøjer, og hvordan man identificerer nøjagtige og unøjagtige resultater i hvert trin i arbejdsgangen, at opdage potentielle problemer, og hvordan man forsøger at løse dem. Der er flere kontrolpunkter langs protokollen, der kan hjælpe med at indse, om protokollen kører korrekt eller ej. Nogle af de mest relevante er: pluk, 2D-klassificering, indledende volumenestimering og 3D-justering. Kontrol af input, gentage trinnet med en anden metode, eller ved hjælp af konsensus, er muligheder tilgængelige i Scipion, at brugeren kan bruge til at finde løsninger, når problemer vises.

Med hensyn til de tidligere tilgange til pakkeintegration på Cryo-EM-området er ^Appion31 den eneste, der giver mulighed for reel integration af forskellige softwarepakker. Appion er dog tæt forbundet med ^Leginon32, et system til automatiseret indsamling af billeder fra elektronmikroskoper. Den største forskel med Scipion er, at datamodel og lagring er mindre koblet. På en sådan måde, for at skabe en ny protokol i Scipion, skal der kun udvikles et Python-script. I Appion skal udvikleren dog skrive scriptet og ændre den underliggende database. Sammenfattende blev Scipion udviklet for at forenkle vedligeholdelse og udvidelsesmuligheder.

Vi har i dette manuskript præsenteret en komplet arbejdsgang for Cryo-EM-behandling ved hjælp af det virkelige tilfælde datasæt af Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR post: 10028, EMDB post: 2660). De trin, der er omfattet og diskuteret her, kan opsummeres som filmjustering, CTF-estimering, partikelplukning, 2D-klassificering, indledende kortberegning, 3D-klassificering, 3D-raffinement, evaluering og efterbehandling. Der er anvendt forskellige pakker, og der blev anvendt konsensusværktøjer i flere af disse trin. Det endelige 3D-rekonstruerede volumen opnåede en opløsning på 3 Å, og i det postbehandlede volumen kan nogle sekundære strukturer skelnes, som alfa-helices, hvilket hjælper med at beskrive, hvordan atomer er arrangeret i rummet.

Arbejdsgangen i dette manuskript viser, hvordan Scipion kan bruges til at kombinere forskellige Cryo-EM-pakker på en enkel og integrerende måde for at forenkle behandlingen og samtidig opnå et mere pålideligt resultat.

I fremtiden vil udviklingen af nye metoder og pakker fortsætte med at vokse, og software som Scipion til nemt at integrere dem alle vil være endnu vigtigere for forskerne. Konsensustilgange vil være mere relevante, selv da der vil være masser af metoder med forskelligt grundlag til rådighed, hvilket vil bidrage til at opnå mere nøjagtige skøn over alle de parametre, der er involveret i genopbygningsprocessen i Cryo-EM. Sporing og reproducerbarhed er nøglen i forskningsprocessen og lettere at opnå med Scipion takket være at have en fælles ramme for udførelse af komplette arbejdsgange.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
no material is used in this article	-	-	-