Summary
クライオ電子顕微鏡における単粒子分析は、高分解能での生体アンサンブルの構造を決定するために使用される主な技術の1つです。Scipionは、顕微鏡で取得した情報を処理し、生物学的標本の3D再構成を達成するためのパイプライン全体を作成するためのツールを提供します。
Abstract
クライオ電子顕微鏡は、原子に近い分解能で高分子の構造情報を明らかにする生物研究において最も重要なツールの1つとなっています。単粒子分析では、ガラス化されたサンプルを電子ビームで画像化し、顕微鏡カラムの最後にある検出器がそのサンプルのムービーを生成します。これらの映画には、ランダムな向きで同一の粒子の何千もの画像が含まれています。データは、最終的な3D再構成されたボリュームを取得するために、複数のステップで画像処理ワークフローを通過する必要があります。画像処理ワークフローの目的は、調査中の標本を再構築できるように取得パラメータを特定することです。Scipion は、統合フレームワークで複数の画像処理パッケージを使用してこのワークフローを作成するためのすべてのツールを提供し、結果のトレーサビリティも可能にします。この記事では、Scipionの画像処理ワークフロー全体が、実際のテストケースから得られたデータと共に提示され、議論され、顕微鏡で得られた映画から高解像度の最終的な3D再構成に必要なすべての詳細を提供します。また、組み合わせ方法を可能にするコンセンサスツールを用い、ワークフローのあらゆるステップに沿って結果を確認し、得られた結果の精度を向上させる力について議論する。
Introduction
クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)では、ガラス化凍結水和標本の単粒子分析(SPA)は、分子相互作用と生体アンサンブルの機能を理解することができるため、生体高分子のイメージングの最も広く使用され、成功した変異体の1つです。これは、このイメージング技術の最近の進歩のおかげで、「分解能革命」2 を生み出し、ほぼ原子分解能で生物学的3D構造の決定に成功しました。現在、SPAクライオEMで達成された最高の解像度は、アポフェリチン3 (EMDBエントリ:11668)のための1.15 Åでした。これらの技術の進歩は、サンプル調製4、画像取得5、および画像処理方法6における改良を含む。この記事では、この最後のポイントに焦点を当てています。
簡単に言えば、画像処理方法の目的は、顕微鏡の撮像プロセスを反転させ、研究中の生物学的標本の3D構造を回収するための全ての取得パラメータを特定することである。これらのパラメータは、カメラのゲイン、ビーム誘導運動、顕微鏡の収差(主に焦点が短い)、各粒子の3D角方向と平行移動、および立体構造変化を伴う標本を有する場合の立体状態である。しかし、パラメータの数は非常に多く、cryo-EMは放射線損傷を避けるために低線量の画像を使用する必要があり、取得した画像の信号対雑音比(SNR)を大幅に減少させます。したがって、問題を明確に解決することはできず、計算されるすべてのパラメータは推定値に過ぎません。画像処理ワークフローに沿って、正しいパラメータを特定し、残りのパラメータを破棄して最終的に高解像度の3D再構築を取得する必要があります。
顕微鏡で生成されたデータはフレームで収集されます。単純化すると、フレームには、電子計数検出器が使用されるたびに、画像内の特定の位置(ピクセル)に到着した電子の数が含まれます。特定の視野では、いくつかのフレームが収集され、これをムービーと呼ばれます。低電子線量は、サンプルを破壊する可能性のある放射線損傷を避けるために使用されるため、SNRは非常に低く、同じ映画に対応するフレームを平均化して、サンプルに関する構造情報を明らかにする画像を得る必要があります。しかし、単純な平均が適用されるだけでなく、補償が必要なビーム誘導運動のために、イメージング時間中にサンプルがシフトやその他の種類の動きを受ける可能性があります。シフト補正および平均フレームは、顕微鏡写真を生成します。
顕微鏡写真が得られたら、マイクログラフのコントラストの変化を周波数の関数として表すコントラスト伝達関数(CTF)と呼ばれる、それぞれの顕微鏡によって導入された収差を推定する必要があります。そして、粒子を選択して抽出することができ、これは粒子ピッキングと呼ばれる。すべての粒子は、研究中の標本のコピーを1つだけ含む小さな画像でなければなりません。パーティクルピッキングには、粒子の外観の基本的なパラメータ化を使用して顕微鏡写真の全セット(粒子サイズなど)、2)パーティクルがどのように見えるかを学習する要素、および3)画像テンプレートを使用する3つのアルゴリズムがあります。各ファミリには、後で表示されるさまざまなプロパティがあります。
マイクログラフで見つかった一連のパーティクルは、純粋なノイズ画像、重なり合うパーティクル、またはその他のアーティファクトを含むサブセットを破棄してパーティクルのセットを消去する 2 つの目標を持つ 2D 分類プロセスで使用され、2) 各クラスを表す平均粒子を初期情報として使用して 3D 初期ボリュームを計算できます。
3D 初期ボリュームの計算は、次の重要なステップです。3D構造を得る問題は、グローバル最小が元の構造を表す最良の3Dボリュームである多次元ソリューションランドスケープにおける最適化の問題と見なすことができますが、最適でないソリューションを表すいくつかのローカルミニマが見つかり、トラップされやすい場所です。初期ボリュームは検索プロセスの開始点を表すため、初期ボリューム推定が不適切な場合、グローバル最小を見つけることができない可能性があります。初期ボリュームから、3D分類ステップは、異なる立体構造状態を発見し、再び粒子のセットをきれいにするのに役立ちます。目標は、粒子の構造的に均質な集団を得る。その後、3D の改良ステップが、すべてのパーティクルの角度と変換のパラメータを改良して、最高の 3D ボリュームを得る必要があります。
最後に、最後のステップで、得られた3D再構成を研ぎ、磨くことができる。シャープニングは、再構築された体積の高周波数を高めるプロセスであり、研磨は、粒子のレベルでCTFまたはビーム誘導運動補償として、いくつかのパラメータをさらに洗練するためのステップです。また、ワークフローの最後に達成された解像度を理解するために、いくつかの検証手順を使用することもできます。
これらすべてのステップの後、トレースとドッキングプロセス7 は、原子モデルde novoを構築するか、既存のモデルをフィッティングすることによって、取得した3D再構築に生物学的意味を与えるのに役立ちます。高解像度が達成されれば、これらのプロセスは、私たちの構造における異なる原子の生物学的構造の位置を教えてくれます。
Scipion8は統合的な方法で最も関連性の高い画像処理パッケージを組み合わせたワークフロー全体を作成することができます。Xmipp9、Relion10、クライオSPARC11、Eman12、Spider13、クライオロ14、Ctffind15、CCP416、Phenix17、およびより多くのパッケージをシピオンに含めることができます。また、統合、相互運用性、トレーサビリティ、再現性を活用して画像処理ワークフロー全体を完全に追跡するために必要なすべてのツールを組み込んでいます8。
Scipionが使用できる最も強力なツールの1つはコンセンサスであり、これは、得られた結果を処理の一つのステップで複数の方法と比較し、より正確な出力を生成するために異なる方法で伝えられる情報の組み合わせを作ることを意味します。これは、パフォーマンスを向上させ、推定パラメータで達成された品質を向上させるのに役立ちます。より単純なワークフローは、コンセンサスメソッドを使用せずに構築できることに注意してください。しかし、我々はこのツールの力を見てきました22,25と、この原稿で提示されたワークフローは、いくつかのステップでそれを使用します。
前の段落で要約されたすべての手順は、次のセクションで詳しく説明し、Scipion を使用して完全なワークフローで組み合わされます。また、生成された出力でより高い合意を達成するためにコンセンサスツールを使用する方法が示されます。そのために、熱帯熱マラリア原虫80Sリボソームのサンプルデータセットが選択されました(EMPIARエントリ:10028、EMDBエントリ:2660)。このデータセットは、FEI FALCON IIカメラで撮影した1.34Åのピクセルサイズ1.34Åのサイズ4096x4096ピクセルの16フレームの600本のムービーによって形成され、EMDBでの報告解像度は3.2Å18である。
Protocol
1. Scipionでプロジェクトを作成し、データをインポートする
- Scipionを開き、[ プロジェクトの作成] をクリックし、プロジェクトの名前と保存場所を指定します (図 1 を補足)。Scipionは、キャンバスを示すプロジェクトウィンドウを開き、左側に使用可能なメソッドのリストを持つパネルが表示され、それぞれがデータの管理に使用できる1つの画像処理ツールを表します。
注: Ctrl+F を使用すると、リストに表示されないメソッドを検索できます。 - 顕微鏡で撮影したムービーをインポートするには、左側のパネルで 映画をインポート する (または Ctrl+F を押すと、それを入力) を選択します。
- 新しいウィンドウが開きます (補足図 2)。そこに、データへのパスと取得パラメータを含めます。この例では、 マイクロスコープ電圧 300kV、 球面収差 2.0mm、 振幅コントラスト 0.1、 倍 率50000、 サンプリングレートモード から From画像、 ピクセルサイズ 1.34Åの設定を使用します。フォーム内のすべてのパラメータが入力されたら、[ 実行 ]ボタンをクリックします。
注: メソッドが開始されると、キャンバスに黄色の黄色で「 実行中」と表示されたボックスが表示されます。メソッドが終了すると、ボックスが緑に変わり、ラベルが [完了] に変わります。メソッドの実行中にエラーが発生した場合、ボックスは赤で表示され、 失敗と表示されます。その場合は、キャンバスの下部を確認し、[ 出力ログ ]タブにエラーの説明が表示されます。 - メソッドが終了したら、[ 概要] タブでキャンバスの下部で結果を確認します。ここでは、メソッドによって生成された出力が表示され、この場合は、一連のムービーが表示されます。[ 結果の分析 ] ボタンをクリックすると、ムービーのリストが新しいウィンドウに表示されます。
2.映画のアライメント:映画から顕微鏡写真へ
- オプティカルフロー19を実装する方法xmipp3 - 光学アライメントを使用してください。次のパラメータを使用してフォームに入力します(補足図3):入力ムービーはステップ1で取得したものですが、ALIGNまでのフレームの範囲は2~13で、その他のオプションはデフォルト値にとどまります。プログラムを実行します。
注記: フォーム内の太字のパラメータは、常に入力する必要があります。他のユーザーはデフォルト値を持つか、義務的に要求されません。フォーム ウィンドウの上部には、計算リソースが分散されているフィールドが、スレッド、MPI、または GPU として表示されます。 - [ 結果を分析 ]をクリックして、取得した顕微鏡写真と推定シフトの軌跡を確認します(図1)。見られるすべての顕微鏡写真について:パワースペクトル密度(PSD)、デカルト座標と極座標でムービーを整列させるために得られた軌道(フレームごとに1ポイント)、および得られた顕微鏡写真のファイル名(クリックすると、顕微鏡写真を検査することができる)。標本の粒子は、ムービーの単一のフレームに比べて、顕微鏡写真ではるかに見えることに注意してください。
3. CTF推定:顕微鏡の収差を計算する
- まず、グリゴリエフラブ - ctffind15の方法を使用します。設定は、入力顕微鏡写真はステップ2の出力であり、手動CTFダウンサンプリング係数は1.5に設定され、解像度の範囲は0.06から0.42に設定されます。さらに、詳細オプション (フォームのエキスパート レベルでこの選択を選択すると表示されます) で、ウィンドウ サイズを 256 に設定します。残りのパラメーターはデフォルト値のままです (補足図 4)。
注: Scipion のほとんどのメソッドでは 、詳細設定 オプションにより多くの設定パラメータが表示されます。起動するプログラムが完全にわかっている場合、パラメーターの意味が理解されている場合は、これらのオプションを慎重に使用します。一部のパラメーターは、データを見ずに入力するのが難しい場合があります。その場合、Scipion は右側に魔法の杖を表示し、ウィザード ウィンドウを表示します (補足図 5)。たとえば、このフォームの [解像度] フィールドでは、PSDの最初のゼロから最後の目立つリングまでの領域をカバーするように選択する必要があります。 - メソッドが終了したら、[ 実行 ] をクリックし、[ 結果の分析 ] (図 2) をクリックします。推定CTFが実験用のCTFと一致することを確認します。そのために、PSDを見て、コーナーの推定リングとデータから来るリングを比較します。また、取得したデフォーカス値をチェックして、予期しない値を見つけ、それぞれの顕微鏡写真を破棄または再計算することができます。この例では、マイクログラフのセット全体を使用できます。
注: ウィンドウの下部にあるボタンを使用して、マイクログラフのサブセット( マイクログラフ の赤いボタン付き)を作成し、必要に応じてCTFを再計算します( CTFを再計算 する赤いボタンを使用)。 - 以前の推定値を調整するには、xmipp3 - ctf 推定20を使用します。ステップ2の出力を入力顕微鏡で選択し、以前のCTF推定でグリゴリエフラボ- ctffindの出力を選択し、アドバンスレベルでウィンドウサイズを256に変更する(補足図6)として、以前のCTF推定からdefociを使用するオプションを選択します。それを実行します。
- [結果の分析] をクリックして、取得した CTF を確認します。この方法では、さらに多くのデータが推定され、いくつかの余分な列で表されます。いずれも間違った推定値を示すため、すべての顕微鏡写真は次の手順で使用されます。
4. 粒子ピッキング:顕微鏡写真で粒子を見つける
- ピッキングを開始する前に、顕微鏡写真の前処理を行ってください。オープンxmipp3 - プリプロセス顕微鏡写真は、ステップ2で得られた入力顕微鏡写真として設定され、オプションを選択して、Stddevの倍数を5に、ダウンサンプルマイクログラフは2(補足図7)。。[実行] をクリックし、作成されるマイクログラフのサイズが縮小されていることを確認します。
- ピッキング用 xmipp3 - 手動ピッキング (ステップ 1) および xmipp3 - 自動ピッキング (ステップ 2)21.手動ピッキングでは、自動ピッキングステップが学習し、パーティクルの完全なセットを生成する一連のパーティクルを手動で準備することができます。まず、前の前処理で得られた顕微鏡写真として入力顕微鏡写真を使用して、xmipp3 - 手動ピッキング(ステップ1)を実行します。[実行] をクリックすると、新しい対話型ウィンドウが表示されます (図 3)。
- このウィンドウでは、マイクログラフのリスト (図 3a) とその他のオプションが表示されます。 サイズ(px)を 150に変更すると、各パーティクルを含むボックスのサイズになります。選択した顕微鏡写真が大きなウィンドウに表示されます。領域を選択し、その中のすべての可視パーティクルを選択します(図 3b)。次に、[ トレーニングの有効化 ] をクリックして学習を開始します。顕微鏡写真の残りの領域は自動的に選択されます(図3c)。選択したパーティクルをチェックし、クリックして追加を追加するか、必要に応じて Shift+クリックで誤ったものを削除します。
- 最初のウィンドウで次の顕微鏡写真を選択します。顕微鏡写真は自動的に選択されます。必要に応じて、パーティクルを含めたり削除したりするには、もう一度チェックします。この手順を約 5 つの顕微鏡写真で繰り返して、代表的なトレーニング セットを作成します。
- これが完了したら、メインウィンドウの 座標 をクリックして、選択したすべてのパーティクルの座標を保存します。パーティクルのトレーニングセットは、自動ピッキングに進み、すべての顕微鏡写真のプロセスを完了する準備が整いました。
- 開いたxmipp3 - Xmippパーティクルピッキングで示す自動ピッキング(ステップ2)は、前の手動ピッキングを実行し、監督と同じとして選択する顕微鏡写真。実行をクリックします。このメソッドは、約 100000 座標のセットを出力として生成します。
- コンセンサスアプローチを適用するので、2番目のピッキング方法を実行して、両方の方法が一致する粒子を選択します。オープンスファイア - cryoloピッキング14と入力顕微鏡として前処理された顕微鏡写真を選択し、一般モデルを使用しますか?はい、信頼度しきい値0.3、ボックスサイズ150(補足図8)。それを実行します。このメソッドは、約 100000 座標も生成する必要があります。
- 実行xmipp3 - 深いコンセンサスピッキング22。入力座標には、スファイア - クライオロピッキング(ステップ4.7)とxmipp3 - 自動ピッキング(ステップ4.6)の出力が含まれるように、モデルタイプを事前トレーニング済みに設定し、トレーニングをスキップして事前トレーニングモデルで直接スコアを付けますか?[はい](補足図9)。それを実行します。
- [結果の分析] をクリックし、新しいウィンドウで[zScoreDeepLearning1] の値が高いパーティクル/座標を選択する横の目のアイコンをクリックします。新しいウィンドウが開き、すべてのパーティクルのリストが表示されます(図4)。列の zScore 値は、パーティクルの品質に関する洞察を与え、低い値は品質が悪いということを意味します。
- ラベルをクリック_xmipp_zScoreDeepLearning パーティクルを最高から最低 の zScore に並べ替えます。 zScore が 0.75 より大きいパーティクルを選択し、[ 座標 ]をクリックして新しいサブセットを作成します。これにより、約 50000 座標のサブセットが作成されます。
- オープンxmipp3 - ディープマイクログラフクリーナー。[入力座標] を選択すると、前の手順で取得したサブセット、マイクログラフのソースは座標と同じになり、しきい値は 0.75 に保ちます。それを実行します。[サマリー] タブで座標の数が減っていることを確認します。
注: この手順では、さらに座標のセットをクリーンアップすることができ、カーボンゾーンや大きな不純物として、より多くのムービーアーティファクトを持つ他のデータセットをクリーニングするのに非常に役立つ可能性があります。 - xmipp3 - 粒子を抽出します(補足図10)。入力座標として、前のステップの後に取得した座標、マイクログラフソース他、ステップ2の出力としての入力マイクログラフ、xmipp3-ctf推定の出力としてのCTF推定、3までのダウンサンプリング係数、および100の粒子ボックスサイズを示す。フォームの [前処理] タブで 、[すべて] に [はい] を選択します。それを実行します。
- 出力に、100 x 100 ピクセルの縮小サイズと 4.02Å/px のピクセル サイズのパーティクルが含まれていることを確認します。
- もう一度 実行 xmipp3 - 次のパラメータを変更するパーティクルを抽出します: ダウンサンプリング係数 を 1 に、 パーティクル ボックスのサイズ を 300 にします。出力が同じパーティクル セットですが、現在はフル解像度であることを確認します。
5. 2D分類:類似する粒子をグループ化
- ステップ 4.11 で取得した入力パーティクルを使用して方法 cryosparc2 - 2d classification11 を開き、[2D 分類] タブの [クラス数] を 128 にして、他のすべてのパラメータをデフォルト値のままにします。それを実行します。
- [ 結果を分析 ]をクリックし、[ Scipion でパーティクル クラスを表示 ]の横にある目のアイコンをクリックします(図 5)。この分類は、複数のクラスが騒がしい、またはアーティファクトを伴うように見えるように、パーティクルのセットをクリーンアップするのに役立ちます。良いビューを含むクラスを選択します。 パーティクル (ウィンドウの下部にある赤いボタン)をクリックして、クリーナサブセットを作成します。
- さて、xmipp3 - cl2d23を開き、入力画像として前のステップで取得した画像と128クラスの数として設定します。実行をクリックします。
注: この 2 番目の分類は、パーティクルセットの追加のクリーニング ステップとして使用されます。通常、可能な限り多くの騒がしい粒子を除去するのに役立ちます。ただし、より単純なワークフローが必要な場合は、2D 分類方法を 1 つだけ使用できます。 - メソッドが終了したら、[ 結果の分析 ] と [ 表示するもの: クラス] をクリックして、生成された 128 のクラスを確認します。生成されたクラスのほとんどは、ある程度の詳細を持つ高分子の投影を示しています。ただし、一部のクラスは騒がしいようです(この例では約 10 クラス)。すべての良いクラスを選択し、[ クラス ]ボタンをクリックして、良いクラスだけを含む新しいサブセットを生成します。このサブセットは、初期ボリュームを生成する方法の 1 つへの入力として使用されます。同じ選択したクラスで、悪いクラスに属するものを削除した後、よりクリーンなサブセットを作成するために パーティクル をクリックします。
- 開く pwem - 4.13 の出力としてアイテムのフル セットを持つサブセット (フル サイズのすべてのパーティクル)、ランダムサブセットを No にする、前のステップで作成したパーティクルのサブセットとして設定するその他、および[交差として操作を設定]。これにより、パーティクルから前のサブセットが完全な解像度で抽出されます。
6. 初期容積推定: 3D ボリュームの最初の推定値を構築する
- このステップでは、異なる方法で2つの初期ボリュームを推定し、コンセンサスツールを使用して最終的な推定3Dボリュームを生成します。開く xmipp3 - ステップ 5 の後に取得した入力クラス、対称グループを c1 として、有意な 24 メソッドを再構築し、残りのパラメーターをデフォルト値に保ちます (補足図 11)。それを実行します。
- [ 結果の分析] をクリックします。サイズが 100 x 100x100 ピクセルの低解像度ボリュームと 4.02Å/px のピクセル サイズが得られていることを確認します。
- xmipp3 を開く - 前のステップで取得したものを入力ボリュームとして使用するボリュームのトリミング/サイズ変更ボリューム (補足図 12)、ボリュームのサイズ変更、サンプリング レートへのサイズ変更オプション、[サンプリング レート] のサイズ変更オプション、サンプリング レートを 1.34 Å/px に変更します。それを実行します。[概要] タブで、出力ボリュームのサイズが正しいことを確認します。
- 次に、2 番目の初期ボリュームを作成します。オープン relion - 3D 初期 model10 は、入力パーティクルがフル解像度で良好なパーティクル(出力 5.5 の出力)を使用し、パーティクル マスクの直径を 402Å に設定するので、残りのパラメータをデフォルト値のままにします。それを実行します。
- [結果の分析] をクリックし、[ボリュームを表示する: スライス] をクリックします。低解像度の容積が、構造の主な形状を有していることを確認します(補足図13)。
- さて、オープンpwem - 結合セットは、コンセンサスメソッドへの入力を作成するために、生成された2つの初期ボリュームを結合します。入力タイプとしてボリュームを指定し、入力セットで2つの初期ボリュームを選択するだけです。それを実行します。出力は、両方のボリュームを持つ 2 つの項目を含むセットである必要があります。
- コンセンサスツールは、 xmipp3 - 群れのコンセンサス25に含まれるものです。開けて下さい。 フルサイズ画像 として使用するフル解像度(出力5.5)で、初期ボリュームは前のステップで生成された2つのアイテムを含むセットを ボリューム し、 Symmetryグループ がc1であることを確認します。実行をクリック します。
- [ 結果の分析] をクリックします。より詳細な出力ボリュームが得られたことを確認します(図6)。構造を取り巻くノイズは多くなりますが、構造マップに詳細を表示すると、ローカルミニマを回避するための次の細分化手順に役立ちます。
注: UCSF Chimera26 が使用可能な場合は、ウィンドウ上部の最後のアイコンを使用して、取得したボリュームを 3D で視覚化します。 - 開いて、リリオンを実行 - 3D自動 refine10パーティクルの最初の 3D 角度の割り当てを行います。入力粒子として出力5.5を選択し、粒子マスクの直径を402Åに設定します。[参照 3D マップ] タブで、前の手順で取得した入力ボリューム、c1 として[シンメトリ]、初期ローパス フィルタを 30Å に選択します(補足図 14)。
- [結果の分析] をクリックします。新しいウィンドウで、最終ボリュームを選択して[ボリュームを表示]をクリックし、取得したボリュームを表示します。 また、結果ウィンドウの解像度プロットの表示と、角度分布の表示:2Dプロット(図7)で表示解像度プロットをクリックして、フーリエシェル相関(FSC)をチェックします。再構築されたボリュームには、より詳細な部分(おそらく構造の外側の部分にぼやけた領域がある)が含まれ、FSCは4.5Åの周りに0.143のしきい値を超えます。角度カバレッジは、3D 球全体をカバーします。
7.3D分類:立体構造状態の発見
- コンセンサスアプローチを使用すると、異なる立体構造状態がデータ内にある場合に、探索することができます。開いた リリオン - 3D分類10 (補足図15)。 入力粒子 としては6.10で得たものを使用し、 粒子マスク径 を402Åに設定します。[ 参照 3D マップ ] タブで、ステップ 6.10 以降に取得した 入力ボリューム として、 対称を c1 に設定し、 初期ローパス フィルタ を 15Å に設定します。最後に、[ 最適化] タブで[ クラス数] を 3 に設定します。それを実行します。
- 結果を分析] をクリックして 結果を確認し、[ Scipion で分類を表示] を選択します。生成された 3 つのクラスといくつかの興味深いメジャーが示されています。最初の 2 つのクラスは、割り当てられた画像の数が似ており (サイズ 列) が非常に似ている必要があり、3 番目のクラスはイメージが少なく、外観がぼやけています。また、最初の 2 つのクラスでは 、rlnAccuracy 回転 と rlnAccuracy トランスレーション が明確に優れているはずです。最適な 2 つのクラスを選択し、[ クラス ] ボタンをクリックして、クラスを含むサブセットを生成します。
- 手順 7.1 と 7.2 を繰り返して、2 番目の良いクラスのグループを生成します。どちらもコンセンサスツールの入力になります。
- 開いて実行 xmipp3 - コンセンサスクラス 3D 前の手順で生成された 2 つのサブセットを 入力クラス として選択します。
- [ 結果の分析] をクリックします。クラス間の一致するパーティクルの数が表示されます:最初の値は、サブセット 1 の最初のクラスとサブセット 2 の最初のクラスの一致するパーティクルの数、2 番目の値はサブセット 1 の最初のクラスとサブセット 2 の 2 番目のクラスの一致するパーティクルの数です。パーティクルがクラス 1 または 2 にランダムに割り当てられていることを確認します。この結果を考えると、パーティクルのセット全体が処理を続行するために使用されます。
8.3D洗練:均質な集団の角度割り当てを精製する
- この手順では、コンセンサス アプローチを適用します。まず、pwem を開いて実行する - 6.9 の出力として項目の完全なセットを持つサブセット、ランダムなサブセットを Yes に、要素の数を 5000 にします。これにより、次の手順で使用される方法をトレーニングするための前の配置を持つイメージのサブセットが作成されます。
- 開いた xmipp3 - 深い位置合わせ、5.5で得られた良い粒子の出力として 入力画像 を設定し、6.10の後に得られたものとして ボリューム 、前のステップで作成されたものとして 入力トレーニングセット 、 目標解像度 を10Åに設定し、残りのパラメータをデフォルト値に保ちます(補足図16)。実行をクリック します。
- [結果の解析] をクリックして、取得した角度分布をチェックします(6.10 の角度と比較して、角度カバレッジがわずかに改善されます)。
- 開いて実行 xmipp3 - 角度を比較 し 、入力パーティクル 1 として 6.9 の出力と 8.2 の出力 を入力パーティクル 2 として選択し、 シンメトリグループ が c1 であることを確認します。この方法は、 xmipp3 - 深い位置合わせ と リリオン - 3D 自動リファインの間のアグリーメントを計算します。
- [ 結果を解析]をクリックすると、取得したシフトと角度の違いを含むパーティクルのリストが表示されます。ウィンドウの上部にあるバーアイコンをクリックすると、計算変数のプロットを作成できる別のウィンドウが開きます。 _xmipp_angleDiff 選択し、[ プロット ]をクリックして、パーティクルごとの角度差の表現を表示します。 _xmipp_shiftDiffと同じことを行います。これらの図では、およそ半数の粒子の方法が一致する(図9)。角度の差が 10º 未満のパーティクルを選択し、新しいサブセットを作成します。
- 今、xmipp3を開く - highres27は、割り当てられた角度のローカルの洗練を行います。最初に、前の手順で取得した画像を [フルサイズイメージ] として選択し、[初期ボリューム] で [6.9]の出力、[パーティクルの半径] を 150 ピクセルに設定し、[シンメトリ] グループを c1 として設定します。[角度]割り当てタブで、[イメージの配置]を[ローカル]、[反復回数]、および[最大]に設定します。目標解像度を 5Å/px (補足図 17)それを実行します。
- [ 概要] タブで、出力ボリュームが300x300x300ピクセルより小さく、ピクセルサイズがわずかに大きいかどうかを確認します。
- [結果の分析] をクリックして、取得した結果を確認します。[解像度プロットを表示]をクリックしてFSCを表示し、[表示ボリューム: 再構築]で取得したボリュームを確認します(補足図18)。4-3.5Åに近い解像度のボリュームが得られます。
- [出力パーティクルを表示]をクリックし、パーティクルのリストを表示するウィンドウでバーアイコンをクリックします。新しいウィンドウで、[100 ビンで、ヒストグラムとして入力] を選択し、ラベル_xmipp_cost選択し、最後に [プロット] を押します (補足図 19)。これにより、コスト ラベルのヒストグラムが提示され、パーティクルと選択された投影方向との相関関係が含まれます。この場合、一連の粒子に異なる集団を持たない兆候であるユニモーダル密度関数が得られる。したがって、それらのすべては、洗練を継続するために使用されます
注: マルチモーダル密度関数を表示する場合は、より高い最大値に属するパーティクルのセットを選択して、その一方でのみワークフローを続行する必要があります。 - 開いて、再び 実行 xmipp3 - 前の 実行から続行してハイレス?は い、8.5以降に取得した フルサイズの画像 に設定し、 Xmipp Highresの前回の実行で以前の 実行 を選択します。 [角度]割り当て タブで、[ イメージの配置 ]を[ ローカル]に設定し、1 回の反復で、2.6Å/px をターゲット解像度(フル解像度)に設定します。
- 出力には、フル解像度のボリューム (サイズ 300x300x300 ピクセル) が含まれるはずです。[結果の分析] をクリックして、取得したボリュームと FSC をもう一度確認します。
9. 評価・後処理
- オープンxmipp3 - ローカルMonoRes28。このメソッドは、解像度をローカルで計算します。入力ボリュームとして 8.10 以降に取得したものを設定し、半分のボリュームを使用しますか?はい、解像度の範囲を 1 ~ 10Å に設定します。それを実行します。
- [ 結果の分析 ] をクリックし、[ 解像度ヒストグラムを表示] と [ 色付きスライスを表示] を選択します (図 11)。ボリュームの異なる部分の解像度が表示されます。構造の中央部のボクセルのほとんどは、外側の部分で最悪の解像度が達成されている間、3Åの周りの解像度を提示する必要があります。また、ボクセルあたりの解像度のヒストグラムは、3Åの周りのピーク(下でも)で示されています。
- 開いて実行 xmipp3 - シャープニングを適用する29をローカルデブラーシャープン29。入力マップとして 8.10 で取得したものを選択し、MonoRes で前のステップで取得したものを解像度マップとして選択します。
- [結果の分析] をクリックして、取得したボリュームを確認します。アルゴリズムの最後の反復に対応する最後の 1 つを開きます。3D でボリュームの機能を確認するには、UCSF Chimera26 などの他のツールでボリュームを開くことをお勧めします(図 12)。
- 最後に、xmipp3に含まれる検証ツールを開き、パーティクルの数によって解像度がどのように変化するかを示すオーバーフィット30を検証します。ステップ 8.5 で取得したパーティクルを[入力パーティクル]として開き、[解像度に対するノイズのバインドを計算する]を[はい]に設定し、初期 3D 参照ボリュームを出力 8.10 にします。[詳細オプション]で、[500 1000 1500 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000」にパーティクルの数を設定します(補足図20)。それを実行します。
- [ 結果の分析] をクリックします。再構成に使用されるパーティクルの数が増えるにつれて、解像度の進化とともに 2 つのプロット (図 13) が緑色の線で表示されます。赤い線は、整列したガウスノイズの再構成によって達成される解像度を表します。解像度は粒子の数とノイズからの粒子と比較した再構成の大きな違いが観察され、良好な構造情報を持つ粒子を有する指標である。
- 前の結果から、後処理された容積のモデルのフィッティングを行うことができ、これは高分子の生物学的構造を発見することを可能にする。
Representative Results
熱帯熱マラリア原虫80Sリボソーム(EMPIARエントリ:10028、 EMDBエントリー:2660)試験を実施し、前項で提示されたScipionプロトコルを用いて、この特定の例における高分解能3D再構成された高分解能の体積は、標本の任意の方向に2D投影を含む非常に騒がしい画像からなる顕微鏡によって収集された情報から始まり、達成された。
プロトコル全体を実行した後で得られた主な結果は、図 10、図 11、および図 12 に示されています。図10は、後処理前に取得した3D容積を表す。図10aでは、3 ÅのFSCが、ナイキスト限界に非常に近いことがわかります(ピクセルサイズが1.34Åのデータでは、ナイキスト制限は2.6Åです)。図10bは、高レベルの詳細と明確に定義された構造を持つ再構築された3Dボリュームのいくつかのスライスを示しています。図11では、取得した3Dボリュームの解像度をローカルで解析した後の結果が示されている。構造中のボクセルのほとんどは、主に構造の中央部に位置する3 Å以下の解像度を達成することが分かる。ただし、外側の部分は解像度が悪く、図 10b のスライス内のこれらの領域に表示されるブラーと一致します。図12は、ボリュームの高い周波数を強調し、より詳細な情報を明らかにし、特に図12cの3Dプレゼンテーションで見ることができる表現を改善することができる後処理後の同じ3Dマップを示しています。
図14では、得られた容積(図14a)、後処理された(図14b)、解像度マップ(図14c)の3D表現を見るために使用され、局所解像度のカラーコードで着色された。これにより、取得した構造に関する情報をさらに詳細に示すことができます。このツールは、構造の全体の3Dコンテキストで非常に小さな詳細が見ることができるように、得られたボリュームの品質に関する洞察を得るために非常に有用です。達成された分解能が十分である場合、構造の生化学的な部分が見つかる(例えば、図14dのα-ヘリックス)。この図では、図 14c の濃い青色の領域と見なすことができる 3D 構造のすべての中央部分で実現される高解像度を強調表示する必要があります。
プロトコル全体のパフォーマンスが良好な結果が得られたのは、すべてその結果ですが、これはそうではないかもしれません。不正な動作を識別する方法はいくつかあります。最も一般的なケースでは、これは得られた構造が低解像度で、より良いものに進化することができないときに起こります。この 1 つの例を 図 15 に示します。ボリュームがぼやけた(図15c)は、FSC曲線(図15a)および局所推定のヒストグラムに見られる低FSCをもたらす(図15b)。この例は、パーティクルの入力セットで満たされない特定のプロパティを期待していたため、不正な入力データを含む 3D 細分化メソッドを使用して生成されました。見ることができるように、さまざまな方法がデータを受信し、それを適切に準備することを期待する方法を知ることは常に非常に重要です。一般に、 図 15 のような出力が得られると、処理ワークフローまたは基礎データに問題がある可能性があります。
プロトコルが適切に進化しているかどうかを知るために分析できるチェックポイントがワークフローに沿っていくつかあります。たとえば、選択直後に、先ほど説明したいくつかの方法で、パーティクルをランク付けし、それぞれのスコアを指定できます。悪い粒子を有する場合、これらの方法はそれらを識別し、除去することを可能にする。また、2D分類は、悪い粒子のセットを持つ良い指標になることができます。 図16 は、このような不良セットの例を示す。 図16aでは、構造の詳細を含む良いクラスが示されていますが、 図16b は騒がしいまたは不全な悪いクラスを示していますが、この最後のケースでは、ピッキングが間違っていて、2つの粒子が一緒に現れているようです。別のチェックポイントは初期容積推定であり、 図17 は、良好(図17a)および不良(図17b)初期推定の例を示す。不正な見積もりは、メソッドの不適切な設定を使用して作成されました。分析対象のデータに応じてすべてのパラメータを適切に選択し、すべての設定を慎重に行う必要があることを考慮する必要があります。構造情報が少ない地図を持たない場合、以下の改良は良好な再構成を得ることができない。
問題が悪い取得である場合、映画は構造情報を保存しません、それらから良い粒子を抽出し、処理を成功させるのは不可能になります。その場合、高解像度の3D再構成を得るために、より多くの映画を収集する必要があります。ただし、この場合、処理ワークフローに沿って問題を管理する方法はいくつかあります。ピッキングが十分でない場合は、例えば、ピッキングを繰り返したり、異なる方法を使用したり、より多くの粒子を手動で選んでから学ぶ方法を試みたり、それを修正しようとするいくつかの方法があります。2D分類中に、少数のクラスが良い場合は、ピッキングプロセスを繰り返すこともできます。初期の体積推定では、不正確な結果が得られる場合は、いくつかの方法を使用してみてください。同じことが 3D 絞り込みにも当てはまります。この推論に従って、この原稿では、いくつかのコンセンサスツールが提示されており、問題を回避し、正確なデータで処理を続けるのに非常に役立つ可能性があります。いくつかの方法の中でコンセンサスを使用することで、選択、分類、整列などが困難なデータを破棄することができ、これはおそらくデータの不良の指標です。ただし、生成された出力で複数の方法が一致する場合、おそらくこれらのデータには、処理を継続するための貴重な情報が含まれています。
読者は、より多くのデータセットをダウンロードし、この原稿に記載されている推奨事項に従ってそれらを処理し、Scipionを使用して処理パッケージを組み合わせた同様のワークフローを作成することを奨励します。データセットの処理を試みることは、Cryo-EM の最先端の処理ツールの能力を学習し、処理中に発生する可能性のある欠点を克服するための最適なルールを知り、各特定のテスト ケースで使用可能なメソッドのパフォーマンスを向上させる最良の方法です。
図 1.ムービーの配置結果。(a) 結果のメインウィンドウは、生成されたすべての顕微鏡写真のリストと追加情報:パワースペクトル密度、極座標における推定アライメントの軌道、デカルト座標で同じ、生成された顕微鏡写真のファイル名。 (b) デカルト座標で表される位置合わせ軌道。 (c) 生成された顕微鏡写真。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.Ctffind 結果による CTF 推定。 結果を含むメインウィンドウには、推定PSD(コーナー)とデータからのPSD、およびいくつかの焦点の解除パラメータを持つ図が含まれています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.Xmippで手動ピッキングウィンドウ。(a) 処理する顕微鏡写真のリストと他のいくつかのパラメータを含むメインウィンドウ。 (b) 顕微鏡写真の領域内でパーティクルを手動で選択する。 (c) および (d) Xmipp 自動ピッキング方法のトレーニング パーティクルのセットを作成するために監視するパーティクルを自動的に選択します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.Xmippの結果と深いコンセンサスピッキング。 パラメーター zScoreDeepLearning は、パーティクルの良さに重みを与え、悪い粒子を発見する鍵です。 (a) zScores の最小値はアーティファクトに関連付けられます。 (b) 最も高いzScoresは、高分子を含む粒子と関連している。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.クライオスパルク結果を伴う2D分類。 生成されたクラス(同じ方向から来るパーティクルのサブセットの平均)が表示されます。いくつかの良いクラスは赤で選択され (詳細なレベルがある)、いくつかの悪いクラスは選択されていません (騒がしいクラスと未入力のクラス)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.群れのコンセンサス結果を持つ3D初期容積。コンセンサスツールxmipp3を実行した後に得られた3D初期容積のビュー - Swarmコンセンサス、XmippとRelionの以前の3D初期体積推定を使用して。(a) ボリュームはスライスで表されます。(b) ボリュームの 3D 視覚化。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.Relion 結果を使用した 3D 初期ボリュームの細分化。(a) 得られたFSC曲線は、4.5Åで閾値を越え、おおよそ。 (b) 3D 球の上側のビューとして示される角度カバレッジ。この場合、対称性がないため、割り当てられたパーティクルが球全体を覆う必要があります。 (c) スライスで表される細分化されたボリューム。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8.Xmippの結果を使用したディープラーニングに基づく3Dアライメント。xmipp3 - 3D アライメントのための深い位置合わせ法によって生成された結果。(a) 変換行列の形式ですべてのパーティクルに対する角度の割り当て。(b) 角度カバレッジ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9.3Dアライメントコンセンサス結果。(a) シフトパラメータと角度パラメータで得られた違いを持つ粒子のリスト。 (b) 粒子ごとの角度差のプロット。 (c) 粒子ごとのシフト差のプロット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10。3D 絞り込み結果の最終反復。(a) FSC曲線。 (b) スライスでフル解像度でボリュームを取得。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11。Xmipp の結果を使用したローカル解像度分析。 メソッド の結果 xmipp3 - ローカル MonoRes. (a) カラーコードに示されているように、ボクセルあたりの解像度値で色付けされた代表的なスライス。 (b) 局所解像度ヒストグラム この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図12。Xmippの結果でシャープ。xmipp3の結果 - 局地的に研削法。(a) 反復ごとに取得したボリュームのリスト。(b) スライスで表される最後の反復の後に得られる3Dボリューム。(c) 最終ボリュームの 3D 表現。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図13。Xmipp の結果でオーバーフィット ツールを検証します。xmipp3 の結果 - 検証オーバーフィット。緑色の線はデータからの再構築に対応し、ノイズからの赤い線です。 (a) 粒子数の対数を伴う二乗分解能の逆数。(b) パーティクルの数を含む解像度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図14。取得したボリュームのいくつかの 3D 表現。(a) 前処理されたボリューム。 (b) 後処理されたボリューム。 (c) ローカル解像度、濃い青色のボクセルは、より高い解像度(2.75Å)を有するものであり、濃赤色ボクセルは低解像度(10.05Å)のものである。 (d) アルファヘリックス(赤い楕円)が見える後処理されたボリュームを拡大します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図15。悪い3D再構成の例。(a) 急激な落下を伴い、低解像度でしきい値を超える FSC カーブ。 (b) 局所解像度ヒストグラム (c) スライスによる 3D ボリューム。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図16。2D クラスの例(a) ある程度の詳細を示す良いクラス。 (b) ノイズとアーティファクトを含む悪いクラス (Xmipp で得られる上部, CryoSparcと下段). この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 17.異なる品質を持つ3D初期ボリュームの例。(a) 高分子の形状が観察できる良好な初期体積。 (b) 取得した形状が予想と完全に異なる初期ボリュームが不良。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 1.シピオンプロジェクトの作成 古いプロジェクトを選択できる、または新しいプロジェクトを作成できる、Scipionによって表示されるウィンドウ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 2.ムービーのインポート方法。pwem - インポートムービーが開いているときにScipionによって表示されるウィンドウ。ここでは、Scipionで映画を処理できるように、主な取得パラメータを含める必要があります。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 3.ムービーの配置方法。xmipp3 - 光学アライメントが使用されているときに、Scipionによって表示されるウィンドウ。入力ムービー、アライメントと見なされるフレームの範囲、およびムービーを処理するための他のいくつかのパラメータを埋める必要があります。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 4.Ctffindを用いたCTF推定法 プログラムCtffindを実行するために必要なすべてのフィールドを持つScipionのフォーム。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 5.シピオンのウィザード。 ユーザーがフォームの一部のパラメーターを入力するためのウィザード。この場合、ウィザードは 、グリゴリエフラボ - ctffind メソッドの解決フィールドを完了します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 6.XmippによるCTF精製法。xmipp3の形式 - 以前に推定されたCTFの洗練を行うためにすべてのパラメータを伴うctf推定。
補足図 7.マイクログラフ法を前処理する。xmipp3の形式 - それらの上にいくつかの操作を実行することを可能にする前処理顕微鏡写真。この例では、不適切なピクセルを削除し、ダウンサンプルの顕微鏡写真が便利です。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 8.クライオロとのピッキング方法。 事前に訓練されたネットワークを使用して Cryolo ピッキングメソッドを実行するフォーム。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 9.Xmippとのコンセンサスピッキング方法。xmipp3の形式 - 異なるピッキング方法で得られた座標のいくつかのセットにわたって事前に訓練されたネットワークを使用して、座標のコンセンサスを計算するために深い学習に基づいて深いコンセンサスピッキング。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 10.粒子を抽出する方法。 xmipp3の入力と前処理タブ - 粒子を抽出します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図11.3D Xmippによる初期体積法。 メソッドの形式 xmipp3 - 初期 3D マップを取得するために重要な再構築します。[入力] タブと [抽出条件] タブが表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 12.ボリュームのサイズを変更する方法。 ボリュームのトリミングまたはサイズ変更を行うフォーム。この例では、このメソッドを使用して 、xmipp3 - 再構築の後にフルサイズのボリュームを生成します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図13.3Dリオン結果を伴う初期容積。 取得した 3D 初期容積のビューで 、スライスによるリライオン - 3D 初期モデル 法。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 14.リリオンを使用した初期ボリュームの細分化。 メソッド の形式は、relion - 3D 自動調整します。この例では、コンセンサス後に推定される初期体積を改良するために使用しました。 入力 および 参照 3D マップ タブが表示されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図15.3D分類法。リライオンの形式 - 3D分類。[入力]、[参照 3D マップ]、および [最適化] タブが表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図16.3D深層学習法に基づくアライメント。 メソッド xmipp3 - 深い整列のために開かれたフォーム。ここでは、トレーニングセットを使用してネットワークをトレーニングする必要があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図17.3D精製方法。xmipp3の形式 - ハイレス法。タブ入力と角度の割り当てが表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 18.3D 絞り込み結果の最初の反復。(a) FSC曲線。 (b) スライスとして表される(フル解像度より小さいサイズの)得られたボリューム。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 19.3D 絞り込み相関分析の最初の反復。 パーティクルのリストを表示するウィンドウ上部のバーアイコンをクリックすると、新しいウィンドウが表示されます。 プロット列 ウィンドウで、希望の推定パラメータのヒストグラムを作成できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 20.検証オーバーフィット ツール。xmipp3 の形式 - オーバーフィットメソッドを検証します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
現在、cryo-EMは、生物学的サンプルの3D構造を明らかにする重要なツールです。顕微鏡で良いデータを収集すると、利用可能な加工ツールを使用して、研究中の高分子の3D再構成を得ることができます。Cryo-EMデータ処理は、高分子の機能的挙動を理解する鍵であり、創薬においても重要な原子分解能を達成することができます。
Scipionは、最も関連性の高い画像処理パッケージを統合的に組み合わせたワークフロー全体を作成できるソフトウェアで、画像処理ワークフロー全体のトレーサビリティと再現性を助けます。Scipionは、処理を実行するための非常に完全なツールのセットを提供します。しかし、高解像度の再構築を得ることは、取得したデータの品質とこれらのデータの処理方法に完全に依存します。
高解像度の3D再構成を得るためには、最初の要件は、高解像度に構造情報を保存する顕微鏡から良い映画を取得することです。この場合、ワークフローはデータから高精細情報を抽出できません。次に、処理ワークフローが成功すれば、構造に実際に対応するパーティクルを抽出し、3D 空間内でこれらのパーティクルの向きを見つけることができます。ワークフローのいずれかの手順が失敗すると、再構築されたボリュームの品質が低下します。Scipionは、処理手順のどれでも異なるパッケージを使用できるため、データを処理するのに最適なアプローチを見つけるのに役立ちます。さらに、利用可能な多くのパッケージのおかげで、異なる方法の推定出力で合意を見つけることによって精度を高めるコンセンサスツールを使用することができます。また、いくつかの検証ツールの「代表結果」セクションで詳しく説明し、ワークフローの各ステップで正確で不正確な結果を特定する方法、潜在的な問題を検出する方法、および解決方法についても詳しく説明しています。プロトコルにはいくつかのチェックポイントがあり、プロトコルが正しく動作しているかどうかを認識するのに役立ちます。最も関連性の高いのは、ピッキング、2D分類、初期容積推定、3D 線形です。入力を確認したり、別の方法でステップを繰り返したり、コンセンサスを使用したりすることは、Scipionで利用可能なオプションで、問題が発生したときに解決策を見つけるために使用できます。
Cryo-EM分野でのパッケージ統合に関するこれまでのアプローチに関しては、Appion31 は、異なるソフトウェアパッケージの実際の統合を可能にする唯一のアプローチです。しかし、アッピオンは、電子顕微鏡からの画像を自動的に収集するシステムであるLeginon32と緊密に接続されています。Scipionとの主な違いは、データモデルとストレージの結合が少なくて済むということです。このようにして、Scipion で新しいプロトコルを作成するには、Python スクリプトを開発するだけで済みます。ただし、Appion では、開発者はスクリプトを作成し、基になるデータベースを変更する必要があります。要約すると、Scipionはメンテナンスと拡張性を簡素化するために開発されました。
我々は、この原稿で、 熱帯熱マラリア原虫 80Sリボソーム(EMPIARエントリ:10028、EMDBエントリ:2660)の実際のケースデータセットを使用して、Cryo-EM処理のための完全なワークフローを提示しました。ここで説明する手順は、ムービーアライメント、CTF推定、粒子ピッキング、2D分類、初期マップ推定、3D分類、3D 絞り込み、評価、後処理として要約できます。さまざまなパッケージが使用され、コンセンサス ツールがこれらの手順のいくつかで適用されました。最終的な3D再構成された容積は3Åの分解能を達成し、後処理された容積では、宇宙における原子の配置方法を記述するのに役立つアルファヘリックスのようないくつかの二次構造を区別することができる。
この原稿に示すワークフローは、サイピオンを使用して、異なるCryo-EMパッケージを簡単かつ統合的に組み合わせて処理を簡素化し、より信頼性の高い結果を同時に得る方法を示しています。
将来的には、新しい方法やパッケージの開発は成長し続け、Scipionのようなソフトウェアがそれらのすべてを簡単に統合することは、研究者にとってさらに重要になります。コンセンサスアプローチは、異なる基礎を持つ多くの方法が利用可能になるときでさえ、より関連性が高く、Cryo-EMの再建プロセスに含まれるすべてのパラメータのより正確な推定を得るのに役立ちます。追跡と再現性は、完全なワークフローを実行するための共通のフレームワークを持つことのおかげで、研究プロセスの鍵であり、サイピオンで達成することが容易です。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、助成金を通じたスペイン科学イノベーション省からの経済的支援を認めたい:PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033、グラントを通じて「コモニダ・オートノマ・デ・マドリード」:S2017/BMD-3817、 インスティトゥート・デ・サルド・カルロス3世,PT17/0009/0010(ISCIII-SGEFI/ERDF)、欧州連合(EU)、ホライズン2020助成金:指示 - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, 提案: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, 提案: 824087)、iNEXT - ディスカバリー(提案:871037)、ハイレスセル(ERC - 2018 - SyG、提案:810057)。これらの成果を生み出したプロジェクトは、「ラカイシャ」財団(ID 100010434)からフェローシップの支援を受けました。フェローシップコードはLCF/BQ/DI18/11660021です。このプロジェクトは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第713673日に、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから資金を受け取りました。著者らは、ランドマークESFRIプロジェクトである「指示」のサポートとリソースの使用を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
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References
- Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
- Kühlbrandt, W.
- Yip, K. M., Fischer, N., Chari, A., Stark, H. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope. , Available from: https://www.rcsb.org/structure/7A6A (2021).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Faruqi, A. R., McMullan, G. Direct imaging detectors for electron microscopy. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).
- Vilas, J. L., et al. Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead. Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).
- Martinez, M., et al. Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion. Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).
- Scheres, S. H. W. Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , Academic Press. 125-157 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14, 290-296 (2017).
- Ludtke, S. J. 3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN. Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).
- Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications Biology. 2, (2019).
- Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).
- Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).
- Wong, W., et al. Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine. eLife. 3, 03080 (2014).
- Abrishami, V., et al. Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach. Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).
- Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function. Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).
- Abrishami, V., et al. A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs. Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).
- Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy. IUCrJ. 5, 854-865 (2018).
- Sorzano, C. O. S., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).
- Sorzano, C. O. S., et al. A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).
- Sorzano, C. O. S., et al. Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume. Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).
- Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps. Structure. 26, 337-344 (2018).
- Ramirez-Aportela, E., et al. Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps. Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).
- Heymann, J. B. Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise. AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).
- Lander, G. C., et al. Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).
