Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Summary

Enpartikkelanalyse i kryo-elektronmikroskopi er en av de viktigste teknikkene som brukes til å bestemme strukturen til biologiske ensembler ved høy oppløsning. Scipion gir verktøy for å lage hele rørledningen for å behandle informasjonen som er oppnådd av mikroskopet og oppnå en 3D-rekonstruksjon av den biologiske prøven.

Abstract

Kryo-elektronmikroskopi har blitt et av de viktigste verktøyene i biologisk forskning for å avsløre strukturell informasjon om makromolekyler ved nesten atomoppløsning. I enpartikkelanalyse er den vitrifiserte prøven avbildet av en elektronstråle, og detektorene på slutten av mikroskopkolonnen produserer filmer av den prøven. Disse filmene inneholder tusenvis av bilder av identiske partikler i tilfeldige retninger. Dataene må gå gjennom en arbeidsflyt for bildebehandling med flere trinn for å få det endelige 3D-rekonstruerte volumet. Målet med arbeidsflyten for bildebehandling er å identifisere anskaffelsesparametrene for å kunne rekonstruere prøven som studeres. Scipion inneholder alle verktøyene for å opprette denne arbeidsflyten ved hjelp av flere bildebehandlingspakker i et integrert rammeverk, noe som også gjør det mulig å spore resultatene. I denne artikkelen presenteres og diskuteres hele arbeidsflyten for bildebehandling i Scipion med data som kommer fra et ekte testtilfelle, og gir alle detaljene som er nødvendige for å gå fra filmene oppnådd av mikroskopet til en høyoppløselig endelig 3D-rekonstruksjon. Også kraften i å bruke konsensusverktøy som tillater å kombinere metoder, og bekrefte resultater langs hvert trinn i arbeidsflyten, forbedre nøyaktigheten av de oppnådde resultatene, diskuteres.

Introduction

I kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er enkeltpartikkelanalyse (SPA) av vitrifiserte frosne hydrerte prøver en av de mest brukte og vellykkede varianter av avbildning for biologiske makromolekyler, da det gjør det mulig å forstå molekylære interaksjoner og funksjonen til biologiske ^ensembler1. Dette er takket være de siste fremskrittene i denne bildeteknikken som ga opphav til "oppløsningsrevolusjonen"² og har tillatt vellykket bestemmelse av biologiske 3D-strukturer med nesten atomisk oppløsning. For tiden var den høyeste oppløsningen oppnådd i SPA cryo-EM 1,15 Å for apoferritin3 (EMDB-oppføring: 11668). Disse teknologiske fremskrittene omfatter forbedringer i prøveprepareringen4, bildeinnhentingen5 og bildebehandlingsmetodene6. Denne artikkelen er fokusert på dette siste punktet.

Kort sagt er målet med bildebehandlingsmetodene å identifisere alle anskaffelsesparametrene for å invertere avbildningsprosessen til mikroskopet og gjenopprette 3D-strukturen til den biologiske prøven som studeres. Disse parametrene er forsterkningen av kameraet, den stråleinduserte bevegelsen, mikroskopets avvik (hovedsakelig defokus), vinkelretningen og oversettelsen av hver partikkel, og konformasjonstilstanden i tilfelle å ha et eksemplar med konformasjonsendringer. Imidlertid er antall parametere svært høyt, og cryo-EM krever bruk av lavdosebilder for å unngå strålingsskader, noe som reduserer signal-til-støy-forholdet (SNR) til de oppkjøpte bildene betydelig. Dermed kan problemet ikke løses utvetydig, og alle parametrene som skal beregnes, kan bare estimeres. Langs arbeidsflyten for bildebehandling bør de riktige parametrene identifiseres, og de resterende forkastes for endelig å få en 3D-rekonstruksjon med høy oppløsning.

Dataene som genereres av mikroskopet, samles inn i rammer. Forenkling inneholder en ramme antall elektroner som har kommet til en bestemt posisjon (piksel) i bildet, når elektrontellingsdetektorer brukes. I et bestemt synsfelt samles flere rammer, og dette kalles en film. Siden lave elektrondoser brukes til å unngå strålingsskader som kan ødelegge prøven, er SNR svært lav og rammene som tilsvarer samme film må beregnes i gjennomsnitt for å få et bilde som avslører strukturell informasjon om prøven. Imidlertid brukes ikke bare et enkelt gjennomsnitt, prøven kan lide skift og andre typer bevegelser i løpet av bildetiden på grunn av den stråleinduserte bevegelsen som må kompenseres. De skiftkompenserte og gjennomsnittlige rammene kommer fra en mikrograf.

Når mikrografene er oppnådd, må vi estimere avvikene introdusert av mikroskopet for hver av dem, kalt Contrast Transfer Function (CTF), som representerer endringene i mikrografens kontrast som en frekvensfunksjon. Deretter kan partiklene velges og ekstraheres, som kalles partikkelplukking. Hver partikkel skal være et lite bilde som bare inneholder en kopi av prøven som studeres. Det er tre familier av algoritmer for partikkelplukking: 1) de som bare bruker noen grunnleggende parameterisering av partikkelens utseende for å finne dem i hele settet med mikrografer (f.eks. partikkelstørrelse), 2) de som lærer hvordan partiklene ser ut fra brukeren eller et forhåndsskolert sett, og 3) de som bruker bildemaler. Hver familie har forskjellige egenskaper som vil bli vist senere.

Det ekstraherte settet med partikler som finnes i mikrografene, vil bli brukt i en 2D-klassifiseringsprosess som har to mål: 1) rengjøring av settet med partikler ved å kaste delsettet som inneholder rene støybilder, overlappende partikler eller andre artefakter, og 2) de gjennomsnittlige partiklene som representerer hver klasse, kan brukes som innledende informasjon for å beregne et 3D-startvolum.

Den første volumberegningen for 3D er det neste avgjørende trinnet. Problemet med å skaffe 3D-strukturen kan sees på som et optimaliseringsproblem i et flerdimensjonalt løsningslandskap, hvor det globale minimumet er det beste 3D-volumet som representerer den opprinnelige strukturen, men flere lokale minima som representerer suboptimale løsninger kan bli funnet, og hvor det er veldig enkelt å bli fanget. Det første volumet representerer utgangspunktet for søkeprosessen, så dårlig innledende volumestimering kan hindre oss i å finne det globale minimumet. Fra det første volumet vil et 3D-klassifiseringstrinn bidra til å oppdage forskjellige konformasjonstilstander og å rengjøre igjen settet av partikler; målet er å oppnå en strukturelt homogen populasjon av partikler. Etter det vil et 3D-raffineringstrinn være ansvarlig for å raffinere vinkel- og oversettelsesparametrene for hver partikkel for å få best mulig 3D-volum.

Til slutt, i de siste trinnene, kan den oppnådde 3D-rekonstruksjonen gjøres skarpere og polert. Skarpgjøring er en prosess for å øke de høye frekvensene til det rekonstruerte volumet, og poleringen er et skritt for å ytterligere avgrense noen parametere, som CTF eller stråleindusert bevegelseskompensasjon, på nivået av partikler. Noen valideringsprosedyrer kan også brukes til å få en bedre forståelse av den oppnådde løsningen på slutten av arbeidsflyten.

Etter alle disse trinnene vil sporings- og dokkingprosessene7 bidra til å gi en biologisk betydning for den oppnådde 3D-rekonstruksjonen, ved å bygge atommodeller de novo eller montere eksisterende modeller. Hvis høy oppløsning oppnås, vil disse prosessene fortelle oss posisjonene til de biologiske strukturene, selv av de forskjellige atomene, i vår struktur.

^Scipion8 gjør det mulig å opprette hele arbeidsflyten ved å kombinere de mest relevante bildebehandlingspakkene på en integrerende måte. ^Xmipp9, ^Relion10, CryoSPARC11, ^Eman12, ^Spider13, ^Cryolo14, ^Ctffind15, CCP416, Phenix17 og mange flere pakker kan inkluderes i Scipion. Den inneholder også alle nødvendige verktøy for å dra nytte av integrasjon, interoperabilitet, sporbarhet og reproduserbarhet for å gjøre en full sporing av hele arbeidsflyten for ^{bildebehandling8}.

Et av de kraftigste verktøyene som Scipion lar oss bruke er konsensus, noe som betyr å sammenligne resultatene oppnådd med flere metoder i ett trinn av behandlingen, noe som gjør en kombinasjon av informasjonen formidlet av forskjellige metoder for å generere en mer nøyaktig utgang. Dette kan bidra til å øke ytelsen og forbedre den oppnådde kvaliteten i de estimerte parametrene. Legg merke til at en enklere arbeidsflyt kan bygges uten bruk av konsensusmetoder. Vi har imidlertid sett kraften i dette ^{verktøyet22,25} og arbeidsflyten som presenteres i dette manuskriptet vil bruke det i flere trinn.

Alle trinnene som er oppsummert i de forrige avsnittene, vil bli forklart i detalj i den følgende delen og kombinert i en fullstendig arbeidsflyt ved hjelp av Scipion. Også hvordan du bruker konsensusverktøyene for å oppnå en høyere avtale i de genererte utgangene vil bli vist. For dette formål er eksempeldatasettet til Plasmodium falciparum 80S Ribosome valgt (EMPIAR-oppføring: 10028, EMDB-oppføring: 2660). Datasettet er dannet av 600 filmer av 16 bilder av størrelse 4096x4096 piksler i en pikselstørrelse på 1.34Å tatt på en FEI POLARA 300 med en FEI FALCON II kamera, med en rapportert oppløsning på EMDB er ^3.2Å18 .

Protocol

1. Opprette et prosjekt i Scipion og importere dataene

1. Åpne Scipion og klikk på Opprett prosjekt, spesifiser navnet på prosjektet og stedet der det skal lagres (Supplerende figur 1). Scipion vil åpne prosjektvinduet som viser et lerret med, på venstre side, et panel med en liste over tilgjengelige metoder, hver av dem representerer ett bildebehandlingsverktøy som kan brukes til å administrere data.
   MERK: Ctrl+F kan brukes til å finne en metode hvis den ikke vises i listen.
2. Hvis du vil importere filmene som er tatt av mikroskopet, velger du pwem - importer filmer på venstre panel (eller skriver dem inn når du trykker Ctrl+F).
3. Et nytt vindu åpnes (tilleggsfigur 2). Der inkluderer du banen til dataene og anskaffelsesparameterne. I dette eksemplet bruker du følgende oppsett: Mikroskopspenning 300 kV, Sfærisk avvik 2,0 mm, Amplitude Contrast 0,1, Forstørrelseshastighet 50000, Samplingsfrekvensmodus til Fra bilde og Pikselstørrelse 1,34 Å. Når alle parameterne i skjemaet er fylt ut, klikker du utfør - knappen.
   MERK: Når en metode starter, vises en boks på lerretet i gul farge merket som løping. Når en metode er ferdig, endres boksen til grønn, og etiketten endres til ferdig. I tilfelle en feil under utførelsen av en metode, vises boksen i rødt, merket som mislykket. I så fall kontrollerer du den nederste delen av lerretet, i kategorien Utdatalogg vises en forklaring på feilen.
4. Når metoden er ferdig, kontrollerer du resultatene i den nederste delen av lerretet i kategorien Sammendrag . Her presenteres utgangene som genereres av metoden, i dette tilfellet settet med filmer. Klikk på Analyser resultater-knappen , og et nytt vindu vises med listen over filmer.

2. Filmjustering: fra filmer til mikrografer

1. Bruk metoden xmipp3 - optisk justering som implementerer optisk ^flyt19. Bruk følgende parametere til å fylle ut skjemaet (tilleggsfigur 3): Inndatafilmene er de som er oppnådd i trinn 1, området i Frames to ALIGN er fra 2 til 13, de andre alternativene forblir med standardverdiene. Kjør programmet.
   MERK: Parameterne med fet skrift i et skjema må alltid fylles ut. De andre vil ha en standardverdi eller vil ikke være obligatorisk påkrevd. I den øvre delen av skjemavinduet finner du feltene der beregningsressursene distribueres, som tråder, MPIer eller GPU-er.
2. Klikk på Analyser resultater for å sjekke de oppnådde mikrografene og banen til de estimerte skiftene (figur 1). For hver mikrograf sett: Se på kraftspektral tetthet (PSD), banene som er oppnådd for å justere filmen (ett punkt per ramme) i kartesiske og polare koordinater, og filnavnet til den oppnådde mikrografen (ved å klikke på den, kan mikrografen inspiseres). Legg merke til at partiklene av prøven er mye mer synlige i mikrografen, sammenlignet med en enkelt ramme av filmen.

3. CTF-estimering: beregning av avvikene i mikroskopet

1. Bruk først metoden grigoriefflab - ctffind15. Oppsettet er: Input Micrographs er utgangen av trinn 2, den manuelle CTF-reduksjonsfaktoren er satt til 1,5, og oppløsningsområdet går fra 0,06 til 0,42. I avanserte alternativer (som du finner ved å velge dette valget på ekspertnivå i skjemaet), setter du dessuten vindusstørrelsen til 256. De gjenværende parameterne beholdes med standardverdiene (tilleggs figur 4).
   MERK: I de fleste metodene i Scipion viser Avansert alternativet flere konfigurasjonsparametere. Bruk disse alternativene nøye, når programmet som skal startes er helt kjent og betydningen av parametrene forstås. Noen parametere kan være vanskelige å fylle uten å se på dataene. I så fall viser Scipion en tryllestav på høyre side som viser et veiviservindu (supplerende figur 5). I Løsning-feltet i dette skjemaet er det for eksempel spesielt nyttig, siden disse verdiene bør velges for å omtrent dekke området fra første null til den siste merkbare ringen til PSD.
2. Klikk på Utfør og på Analyser resultater (figur 2) når metoden er ferdig. Kontroller at den estimerte CTF samsvarer med den eksperimentelle. For det formål, se på PSD og sammenlign de estimerte ringene i hjørnet med de som kommer fra dataene. Kontroller også de oppnådde defokusverdiene for å finne uventede verdier, og respektive mikrografer kan forkastes eller beregnes på nytt. I dette eksemplet kan hele settet med mikrografer brukes.
   MERK: Bruk knappene i den nederste delen av vinduet til å lage et delsett av mikrografer (med micrographs rød knapp) og for å omberegne en CTF (med Oppdater CTFer rød knapp), i tilfelle behov.
3. For å avgrense forrige estimering, bruk xmipp3 - ctf estimat20. Velg som Inndatamikrografer utdataene for trinn 2, velg alternativet Bruk defoci fra en tidligere CTF-estimering, ettersom tidligere CTF-estimering velger utdataene for grigoriefflab - ctffind, og endre vindusstørrelsen til 256 (supplerende figur 6) på avansert nivå. Kjør den.
4. Klikk på Analyser resultater for å sjekke de oppnådde CTFene. Med denne metoden beregnes og representeres flere data i noen ekstra kolonner. Siden ingen av dem viser feil estimerte verdier, vil alle mikrografene bli brukt i følgende trinn.

4. Partikkelplukking: finne partikler i mikrografene

1. Før du starter plukkingen, utfør en forprosess av mikrografene. Åpne xmipp3 - preprosessmikrografer, sett som Input-mikrografer de som er oppnådd i trinn 2 og velg alternativene Fjern dårlige piksler? med Multiple of Stddev til 5, og Downsample mikrografer? med en Downsampling-faktor på 2 (Supplerende figur 7). Klikk på Utfør og kontroller at størrelsen på de resulterende mikrografene er redusert.
2. For plukking bruker du xmipp3 - manuell plukking (trinn 1) og xmipp3 - automatisk plukking (trinn 2)²¹. Den manuelle plukkingen gjør det mulig å manuelt forberede et sett med partikler som automatisk plukktrinn vil lære og generere hele settet med partikler. Først kjører du xmipp3 - manuell plukking (trinn 1) med Input Micrographs som mikrografene oppnådd i forrige forprosess. Klikk på Utfør og et nytt interaktivt vindu vises (figur 3).
3. I dette vinduet presenteres en liste over mikrografene (figur 3a) og andre alternativer. Endre størrelse (px) til 150, dette vil være størrelsen på boksen som inneholder hver partikkel. Den valgte mikrografen vises i et større vindu. Velg en region og velg alle synlige partikler i den (figur 3b). Klikk deretter på Aktiver opplæring for å starte læringen. De resterende områdene av mikrografen velges automatisk (figur 3c). Kontroller de plukkede partiklene og inkluder mer ved å klikke på den, eller fjern de feilene med skift + klikk om nødvendig.
4. Merke neste mikrograf i det første vinduet. Mikrografen velges automatisk. Kontroller om nødvendig på nytt at du inkluderer eller fjerner noen partikler. Gjenta dette trinnet med omtrent 5 mikrografer for å opprette et representativt opplæringssett.
5. Når dette er gjort, klikker du på Koordinater i hovedvinduet for å lagre koordinatene til alle plukkede partikler. Opplæringssettet med partikler er klar til å gå til automatisk plukking for å fullføre prosessen for alle mikrografer.
6. Åpne xmipp3 - automatisk plukking (trinn 2) som indikerer i Xmipp partikkelplukking kjøre forrige manuelle plukking, og Micrographs å velge som Samme som overvåket. Klikk på Utfør. Denne metoden vil generere som utdata et sett med rundt 100000 koordinater.
7. Påfør en konsensus tilnærming, så utfør en annen plukkmetode for å velge partiklene der begge metodene er enige. Åpne sphire - cryolo ^plukke14 og velg forhåndsbehandlede mikrografer som Input Micrographs, Bruk generell modell? til Ja, med en konfidensterskel på 0,3, og en boksstørrelse på 150 (supplerende figur 8). Kjør den. Denne metoden bør også generere rundt 100000 koordinater.
8. Kjør xmipp3 - dyp konsensus ^plukke22. Som Input koordinater inkluderer utgangen av sphire - cryolo plukking (trinn 4.7) og xmipp3 - auto-plukking (trinn 4.6), sett Velg modelltype til Pretrained, og Hopp over trening og score direkte med pretrained modell? Til Ja (supplerende figur 9). Kjør den.
9. Klikk på Analyser resultater og, i det nye vinduet, på øyeikonet ved siden av Velg partikler / koordinater med høye 'zScoreDeepLearning1' verdier. Et nytt vindu åpnes med en liste over alle partikler (figur 4). zScore-verdiene i kolonnen gir et innblikk i kvaliteten på en partikkel, lave verdier betyr dårlig kvalitet.
   1. Klikk på etiketten_xmipp_zScoreDeepLearning for å bestille partiklene fra høyeste til laveste zScore. Velg partiklene med zScore høyere enn 0,75 og klikk koordinater for å opprette det nye delsettet. Dette bør opprette et delsett med omtrent 50 000 koordinater.
10. Åpen xmipp3 - dyp mikrografrenser. Velg som Inndata koordinerer delsettet som ble oppnådd i forrige trinn, Mikrografkilde som koordinater, og behold Terskelverdi på 0,75. Kjør den. Kontroller i kategorien Sammendrag at antall koordinater er redusert, men i dette tilfellet fjernes bare få koordinater.
    MERK: Dette trinnet er i stand til i tillegg å rengjøre settet med koordinater og kan være svært nyttig for rengjøring av andre datasett med flere filmartefakter som karbonsoner eller store urenheter.
11. Kjør xmipp3 - ekstraktpartikler (tilleggsfigur 10). Angi som Input koordinerer koordinatene oppnådd etter forrige trinn, Micrographs kilde som andre, Input mikrografer som utgangen av trinn 2, CTF estimering som utgangen av xmipp3 - ctf estimering, Downsampling faktor til 3, og Partikkel boks størrelse til 100. Velg Ja til alle i kategorien Forhåndsbehandling i skjemaet. Kjør den.
12. Kontroller at utgangen skal inneholde partiklene i redusert størrelse på 100x100 piksler og en pikselstørrelse på 4,02Å/px.
13. Kjør igjen xmipp3 - ekstraktpartikler som endrer følgende parametere: Samplingsreduksjonsfaktor til 1, og Partikkelboksstørrelse til 300. Kontroller at utgangen er det samme settet med partikler, men nå med full oppløsning.

5. 2D-klassifisering: gruppering av lignende partikler sammen

1. Åpne metoden cryosparc2 - 2d ^{klassifisering11} med Inngangspartikler som de som er oppnådd i trinn 4.11, og i kategorien 2D-klassifisering, antall klasser til 128, hold alle de andre parametrene med standardverdiene. Kjør den.
2. Klikk på Analyser resultater og deretter på øyeikonet ved siden av Vis partikkelklasser med scipion (figur 5). Denne klassifiseringen vil bidra til å rense settet av partikler, da flere klasser vil virke støyende eller med artefakter. Velg klassene som inneholder gode visninger. Klikk på Partikler (rød knapp i nedre del av vinduet) for å opprette renere delsett.
3. Nå åpner du xmipp3 - cl2d23 og angir som Inndatabilder bildene hentet i forrige trinn og Antall klasser som 128. Klikk på Utfør.
   MERK: Denne andre klassifiseringen brukes som ekstra rengjøringstrinn i settet med partikler. Vanligvis er nyttig å fjerne så mye støyende partikler som det er mulig. Hvis en enklere arbeidsflyt er ønsket, kan imidlertid bare én 2D-klassifiseringsmetode brukes.
4. Når metoden er ferdig, sjekk de 128 genererte klassene ved å klikke på Analyser resultater og på Hva du skal vise: klasser. De fleste av de genererte klassene viser en projeksjon av makromolekylet med et visst detaljnivå. Noen av dem virker imidlertid støyende (i dette eksemplet ca. 10 klasser). Velg alle de gode klassene og klikk på Klasser-knappen for å generere et nytt delsett med bare de gode. Dette delsettet vil bli brukt som inndata til en av metodene for å generere et innledende volum. Med de samme valgte klassene klikker du på Partikler for å lage en renere undergruppe etter å ha fjernet de som tilhører de dårlige klassene.
5. Åpne pwem - delsett med fullstendig sett med elementer som utgang på 4,13 (alle partikler i full størrelse), Gjør tilfeldig delsett til Nei, Annet angitt som delsett av partikler opprettet i forrige trinn, og Angi operasjon som skjæringspunkt. Dette vil trekke ut forrige delsett fra partiklene med full oppløsning.

6. Innledende volumestimering: bygge den første gjetningen av 3D-volumet

1. I dette trinnet estimerer du to innledende volumer med forskjellige metoder, og deretter bruker du et konsensusverktøy til å generere det endelige estimerte 3D-volumet. Åpne xmipp3 - rekonstruer ^{significant24-metoden} med Input-klasser som de som er oppnådd etter trinn 5, Symmetry-gruppen som c1, og behold de resterende parameterne med standardverdiene (Tilleggsfigur 11). Utfør den.
2. Klikk på Analyser resultater. Kontroller at det oppnås et volum med lav oppløsning på 100 x 100 x 100 piksler og en pikselstørrelse på 4,02Å/px.
3. Åpne xmipp3 - beskjær/endre størrelse på volumer (tilleggsfigur 12) ved hjelp av som inndatavolumer den som ble oppnådd i forrige trinn, Endre størrelse på volumer? til Ja, Endre størrelsesalternativ til Samplingsfrekvens og Endre samplingsfrekvens til 1,34 Å/px. Kjør den. Kontroller i kategorien Sammendrag at utdatavolumet har riktig størrelse.
4. Nå, opprett det andre opprinnelige volumet. Åpen relion - 3D første ^modell10, som Inngangspartikler bruker de gode partiklene ved full oppløsning (utgang 5.5) og sett Partikkelmaske diameter til 402Å, hold de resterende parametrene med standardverdiene. Kjør den.
5. Klikk på Analyser resultater og deretter i Vis volum med: stykker. Kontroller at et volum med lav oppløsning, men med hovedformen til strukturen, er oppnådd (Tilleggs figur 13).
6. Nå åpner du pwem - sammenføyningssett for å kombinere de to genererte innledende volumene for å opprette inngangen til konsensusmetoden. Bare angi Volumer som inndatatype , og velg de to første volumene i Inndatasett. Kjør den. Utdataene bør være et sett som inneholder to elementer med begge volumene.
7. Konsensusverktøyet er det som er inkludert i xmipp3 - swarm ^konsensus25. Åpne den. Bruk som bilder i full størrelse de gode partiklene i full oppløsning (utdata på 5,5), som Første volumer settet med to elementer generert i forrige trinn, og sørg for at Symmetry-gruppen er c1. Klikk på Utfør.
8. Klikk på Analyser resultater. Kontroller at det er oppnådd et mer detaljert utgangsvolum (figur 6). Selv om det er mer støy rundt strukturen, vil det å ha flere detaljer i strukturkartet hjelpe følgende raffineringstrinn for å unngå lokal minima.
   MERK: Hvis UCSF ^Chimera26 er tilgjengelig, bruker du det siste ikonet i den øvre delen av vinduet til å lage en 3D-visualisering av det oppnådde volumet.
9. Åpne og utfør relion - 3D auto-refine10 for å gjøre en første 3D vinkel tildeling av partiklene. Velg som Inngangspartikler utdataene på 5,5, og sett Partikkelmaskediameteren til 402Å. I kategorien Referanse 3D-kart velger du det som ble oppnådd i forrige trinn, Symmetri som c1 og Første low-pass-filter til 30Å (Tilleggsfigur 14).
10. Klikk på Analyser resultater. I det nye vinduet velger du finalen som Volum for å visualisere og klikke på Displayvolum med: skiver for å se det oppnådde volumet. Kontroller også Fourier shell correlation (FSC) ved å klikke på Skjermoppløsningsplott i resultatvinduet og vinkeldekningen i Skjerm vinkelfordeling: 2D-plott (figur 7). Det rekonstruerte volumet inneholder mye flere detaljer (sannsynligvis med noen uskarpe områder i den ytre delen av strukturen), og FSC krysser terskelen på 0,143 rundt 4,5Å. Vinkeldekningen dekker hele 3D-sfæren.

7.3D klassifisering: oppdage konformasjonstilstander

1. Ved hjelp av en konsensustilnærming, hvis forskjellige konformasjonstilstander er i dataene, kan oppdages. Åpen sammenheng - 3D-klassifisering10 (tilleggs figur 15). Som Input partikler bruker de som nettopp er oppnådd i 6.10, og sette partikkelmaske diameter til 402Å. I kategorien Referanse 3D-kart bruker du som inngangsvolum den som er oppnådd etter trinn 6.10, setter Symmetri til c1 og Første low-pass-filter til 15Å. Til slutt, i kategorien Optimalisering, setter du Antall klasser til 3. Kjør den.
2. Sjekk resultatene ved å klikke på Analyser resultater, velg Vis klassifisering i Scipion. De tre genererte klassene og noen interessante tiltak vises. De to første klassene skal ha et lignende antall tilordnede bilder (størrelseskolonne ) og se veldig like ut, mens den tredje har færre bilder og et mer uskarpt utseende. Også rlnAccuracyRotations og rlnAccuracyTranslations bør være klart bedre for de to første klassene. Velg de to beste klassene og klikk på Klasser-knappen for å generere et delsett som inneholder dem.
3. Gjenta trinn 7.1 og 7.2 for å generere en annen gruppe med gode klasser. Begge vil være inngangen til konsensusverktøyet.
4. Åpne og kjør xmipp3 - konsensusklasser 3D og velg som Inndataklasser de to delsettene som ble generert i de forrige trinnene.
5. Klikk på Analyser resultater. Antall tilfeldige partikler mellom klasser presenteres: den første verdien er antall tilfeldige partikler i første klasse av delsett 1 og første klasse av delsett 2, den andre verdien er antall tilfeldige partikler i første klasse av delsett 1 og den andre klassen av delsett 2, etc. Kontroller at partiklene er tilfeldig tilordnet klasser en eller to, noe som betyr at 3D-klassifiseringsmetoden ikke er i stand til å finne konformasjonsendringer. Gitt dette resultatet, vil hele settet med partikler bli brukt til å fortsette behandlingen.

8.3D raffinement: raffinering vinkeloppgaver av en homogen befolkning

1. Igjen, bruk en konsensus tilnærming i dette trinnet. Først åpner og kjører du pwem - delsett med fullstendig sett med elementer som utdata fra 6.9, Gjør tilfeldig delsett til Ja og Antall elementer til 5000. Med dette opprettes et delsett av bilder med en tidligere justering for å lære opp metoden som brukes i følgende trinn.
2. Åpne xmipp3 - dypjuster, sett Inngangsbilder som utgang av gode partikler oppnådd i 5.5, Volum som den som er oppnådd etter 6.10, Input-opplæring angitt som den som ble opprettet i forrige trinn, Måloppløsning til 10Å, og hold de resterende parametrene med standardverdiene (Tilleggsfigur 16). Klikk på Utfør.
3. Klikk på Analyser resultater for å sjekke den oppnådde vinkelfordelingen, der det ikke mangler veibeskrivelser og vinkeldekningen forbedres litt sammenlignet med den av 6.10 (figur 8).
4. Åpne og utfør xmipp3 - sammenlign vinkler og velg som inngangspartikler 1 utgangen på 6,9 og inngangspartikler 2 utgangen på 8,2, sørg for at Symmetry-gruppen er c1. Denne metoden beregner avtalen mellom xmipp3 - deep align og relion - 3D auto refine.
5. Klikk på Analyser resultater, listen over partikler, med de oppnådde forskjellene i skift og vinkler, vises. Klikk på stolpeikonet i den øvre delen av vinduet, et annet vindu åpnes som gjør det mulig å lage plott av de beregnede variablene. Velg _xmipp_angleDiff og klikk på Plot for å se en representasjon av vinkelforskjellene per partikkel. Gjør det samme med _xmipp_shiftDiff. I disse tallene er omtrent halvparten av partiklene begge metodene enige (figur 9). Velg partiklene med vinkelforskjeller lavere enn 10º og opprett et nytt delsett.
6. Nå åpner du xmipp3 - highres27 for å lage en lokal forbedring av de tilordnede vinklene. Først velger du som bilder i full størrelse som bildene fikk i forrige trinn, og som innledende volumer er utdataene på 6,9, angitt radius for partikkel til 150 piksler og Symmetry-gruppen som c1. I kategorien Vinkeltilordning setter du Bildejustering til Lokal, Antall gjentakelser til 1 og Maks. Måloppløsning som 5Å/px (tilleggsfigur 17). Kjør den.
7. I kategorien Sammendrag kontrollerer du at utdatavolumet er mindre enn 300 x 300 x 300 piksler og med litt høyere pikselstørrelse.
8. Klikk på Analyser resultater for å se de oppnådde resultatene. Klikk på Skjermoppløsningsplott for å se FSC, og på Displayvolum: Rekonstruert for å se det oppnådde volumet (tilleggsfigur 18). Et godt oppløsningsvolum nær 4-3,5Å oppnås.
9. Klikk på Vis utgangspartikler , og i vinduet med listen over partikler, klikk på barikonet. I det nye vinduet velger du Skriv inn som histogram med 100 hyller, velger _xmipp_cost etikett og trykker til slutt Påtegning (tilleggsfigur 19). På denne måten presenteres histogrammet til kostnadsetiketten , som inneholder korrelasjonen mellom partikkelen og projeksjonsretningen som er valgt for den. I dette tilfellet oppnås en uimodal tetthetsfunksjon, som er et tegn på ikke å ha forskjellige populasjoner i settet av partikler. Dermed vil alle av dem bli brukt til å fortsette raffinementet
   MERK: Ved å se en multimodal tetthetsfunksjon, bør settet med partikler som tilhører det høyere maksimumet velges for å fortsette arbeidsflyten bare med dem.
10. Åpne og utfør igjen xmipp3 - highres med Fortsett fra en tidligere kjøring? til Ja, angi som bilder i full størrelse som er oppnådd etter 8.5, og Velg forrige kjøring med forrige kjøring av Xmipp Highres. I kategorien Vinkeltilordning setter du Bildejustering til Lokal, med 1 gjentakelse og 2,6Å/piksler som måloppløsning (full oppløsning).
11. Nå skal utgangen inneholde et volum med full oppløsning (størrelse 300x300x300 piksler). Klikk på Analyser resultater for å sjekke igjen det oppnådde volumet og FSC, som nå skal være et høyoppløselig volum på rundt 3Å (figur 10).

9. Evaluering og etterbehandling

1. Åpne xmipp3 - lokale MonoRes28. Denne metoden beregner oppløsningen lokalt. Angi som inndatavolum den som er oppnådd etter 8.10, sett Vil du bruke halve volumer? til Ja og Oppløsningsområde fra 1 til 10Å. Kjør den.
2. Klikk Analyser resultater, og velg Vis oppløsningshistogram og Vis fargede stykker (figur 11). Oppløsningen i de ulike delene av volumet vises. De fleste voxels av den sentrale delen av strukturen bør presentere resolusjoner rundt 3Å, mens de verste oppløsningene oppnås i de ytre delene. Også et histogram av oppløsningene per voxel vises med en topp rundt (selv under) 3Å.
3. Åpne og kjør xmipp3 - localdeblur sharpening29 for å påføre en skarphet. Velg som Inndatakart den som ble oppnådd i 8.10, og som oppløsningskart den som ble oppnådd i forrige trinn med MonoRes.
4. Klikk på Analyser resultater for å sjekke de oppnådde volumene. Åpne den siste, som tilsvarer den siste gjentakelsen av algoritmen. Det anbefales å åpne volumet med andre verktøy, for eksempel UCSF ^Chimera26, for å se bedre egenskapene til volumet i 3D (figur 12).
5. Til slutt åpner du valideringsverktøyet som er inkludert i xmipp3 - valider overmontering30 som viser hvordan oppløsningen endres med antall partikler. Åpne den og inkluder partiklene som ble oppnådd i trinn 8.5, sett Beregn støyen som er bundet til oppløsning? I Avanserte alternativer setter du Antall partikkeler til "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (Tilleggs figur 20). Kjør den.
6. Klikk på Analyser resultater. To tomter vil dukke opp (figur 13) med utviklingen av oppløsningen, i den grønne linjen, etter hvert som antall partikler som brukes i rekonstruksjonen vokser. Den røde linjen representerer oppløsningen oppnådd med en rekonstruksjon av justert gaussisk støy. Oppløsningen forbedres med antall partikler og en stor forskjell i rekonstruksjonen fra partikler sammenlignet med den fra støy observeres, noe som er en indikator på å ha partikler med god strukturell informasjon.
7. Fra de forrige resultatene kunne en montering av en modell i det etterbehandlede volumet utføres, noe som ville tillate å oppdage makromolekylets biologiske strukturer.

Representative Results

Vi har brukt datasettet til Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR oppføring: 10028, EMDB-oppføring: 2660) for å gjennomføre testen, og med Scipion-protokollen presentert i forrige avsnitt, har et høyoppløselig 3D-rekonstruert volum av makromolekylet i dette eksemplet oppnådd, og begynner med informasjonen samlet inn av mikroskopet som består av svært støyende bilder som inneholder 2D-projeksjoner i enhver orientering av prøven.

Hovedresultatene oppnådd etter kjøring av hele protokollen er presentert i figur 10, figur 11 og figur 12. Figur 10 representerer det oppnådde 3D-volumet før etterbehandling. I figur 10a kan man se en FSC på 3 Å, at den ligger svært nær Nyquist-grensen (med data med en pikselstørrelse på 1,34 Å, Nyquist-grensen er 2,6 Å). Figur 10b viser noen skiver av det rekonstruerte 3D-volumet med høye detaljnivåer og veldefinerte strukturer. I figur 11 presenteres resultatene etter lokal analyse av oppløsningen til det oppnådde 3D-volumet. Det kan ses at de fleste voxels i strukturen oppnår en resolusjon under 3 Å, hovedsakelig de som ligger i den sentrale delen av strukturen. Den ytre delen viser imidlertid verre oppløsninger, hva som er i samsvar med uskarpheten som vises i disse områdene i stykkene i figur 10b. Figur 12 viser det samme 3D-kartet etter etterbehandling som er i stand til å markere de høyere frekvensene av volumet, avsløre flere detaljer og forbedre representasjonen, noe som kan ses spesielt i 3D-presentasjonen i figur 12c.

I figur 14 ble ^Chimera26 brukt til å se en 3D-representasjon av det oppnådde volumet (figur 14a), den etterbehandlede (figur 14b) og oppløsningskartet (figur 14c), farget med fargekoden for de lokale oppløsningene. Dette kan gi enda mer informasjon om den oppnådde strukturen. Dette verktøyet er veldig nyttig for å få et innblikk i kvaliteten på det oppnådde volumet, da svært små detaljer i hele 3D-konteksten av strukturen kan ses. Når den oppnådde oppløsningen er nok, kan selv noen biokjemiske deler av strukturen bli funnet (f.eks. alfa-helikvier i figur 14d. I denne figuren må det fremheves den høye oppløsningen som oppnås i alle de sentrale delene av 3D-strukturen, som kan ses på som de mørkeblå områdene i figur 14c.

Alle de tidligere resultatene ble oppnådd takket være en god ytelse av hele protokollen, men dette er kanskje ikke tilfelle. Det er flere måter å identifisere en dårlig oppførsel på. I det mest generelle tilfellet skjer dette når den oppnådde strukturen har lav oppløsning og den ikke er i stand til å utvikle seg til en bedre. Et eksempel på dette er presentert i figur 15. Et uskarpt volum (figur 15c) resulterer i en lav FSC, som kan ses i FSC-kurven (figur 15a) og histogrammet for den lokale beregningen (figur 15b). Dette eksemplet ble generert ved hjelp av en 3D-raffineringsmetode med feil inndata, da det forventet noen spesifikke egenskaper i inngangssettet med partikler som de ikke oppfyller. Som det fremgår, er det alltid veldig viktig å vite hvordan de forskjellige metodene forventer å motta dataene og forberede dem riktig. Når en utdata som den i figur 15 hentes, kan det generelt være et problem i behandlingsarbeidsflyten eller de underliggende dataene.

Det finnes flere kontrollpunkter langs arbeidsflyten som kan analyseres for å vite om protokollen utvikler seg riktig eller ikke. For eksempel, rett etter plukking, kan flere av metodene som er diskutert tidligere rangere partiklene og gi en poengsum for hver av dem. Ved å ha dårlige partikler, tillater disse metodene å identifisere og fjerne dem. 2D-klassifiseringen kan også være en god indikator på å ha et dårlig sett med partikler. Figur 16 viser et eksempel på et så dårlig sett. I figur 16a vises gode klasser som inneholder noen detaljer om strukturen, mens figur 16b viser dårlige klasser, som er støyende eller usentrert, i dette siste tilfellet kan det ses at plukkingen var feil og to partikler ser ut til å vises sammen. Et annet kontrollpunkt er den første volumestimeringen, figur 17 viser et eksempel på gode (figur 17a) og dårlige (figur 17b) innledende beregninger. Den ugyldige beregningen ble opprettet ved hjelp av feil oppsett for metoden. Det må tas hensyn til at alle oppsettene skal gjøres nøye, og velge riktig hver parameter i henhold til dataene som analyseres. Ved ikke å ha et kart med minimal strukturell informasjon, vil følgende raffinement ikke kunne oppnå en god rekonstruksjon.

Når problemet er et dårlig oppkjøp, der filmene ikke bevarer strukturell informasjon, vil det være umulig å trekke ut gode partikler fra dem og få en vellykket behandling. I så fall bør flere filmer samles inn for å få en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon. Men hvis dette ikke er tilfelle, er det flere måter å håndtere problemer langs behandlingsarbeidsflyten. Hvis plukkingen ikke er god nok, er det flere måter å prøve å fikse det på, for eksempel å gjenta plukkingen, bruke forskjellige metoder eller prøve å manuelt plukke flere partikler for å hjelpe metodene til å lære av dem. Under 2D-klassifiseringen, hvis bare noen få klasser er gode, bør du også vurdere å gjenta plukkprosessen. I den første volumestimeringen, prøv å bruke flere metoder hvis noen av dem ga unøyaktige resultater. Det samme gjelder 3D-raffinementet. Etter dette resonnementet, i dette manuskriptet, har flere konsensusverktøy blitt presentert, noe som kan være svært nyttig for å unngå problemer og fortsette behandlingen med nøyaktige data. Takket være å bruke en konsensus blant flere metoder, kan vi kaste data som er vanskelige å plukke, klassifisere, justere, etc., som sannsynligvis er en indikator på dårlige data. Imidlertid, hvis flere metoder er i stand til å bli enige i de genererte utgangene, inneholder disse dataene sannsynligvis verdifull informasjon som du kan fortsette behandlingen med.

Vi oppfordrer leseren til å laste ned flere datasett og prøve å behandle dem etter anbefalingene som presenteres i dette manuskriptet, og å lage en lignende arbeidsflyt som kombinerer behandlingspakker ved hjelp av Scipion. Å prøve å behandle et datasett er den beste måten å lære kraften i behandlingsverktøyene som er tilgjengelige i toppmoderne i Cryo-EM, å kjenne de beste reglene for å overvinne de mulige ulempene som vises under behandlingen, og for å øke ytelsen til de tilgjengelige metodene i hvert enkelt testtilfelle.

Figur 1. Resultat av filmjustering. (a) Hovedvinduet i resultatene, med en liste over alle mikrografene generert og tilleggsinformasjon: kraftspektral tetthet, banen til den estimerte justeringen i polarkoordinater, det samme i kartesiske koordinater, filnavnet til den genererte mikrografen. (b) Justeringsbanen som er representert i kartesiske koordinater. (c) Den genererte mikrografen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2. CTF-estimering med Ctffind-resultat. Hovedvinduet med resultatene inkluderer en figur med estimert PSD (i et hjørne) sammen med PSD som kommer fra dataene, og flere defokusparamer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3. Manuell plukkvindu med Xmipp. (a) Hovedvinduet med listen over mikrografer som skal behandles og noen andre parametere. (b) Manuelt plukke partikler inne i en region av en mikrograf. (c) og (d) Automatisk plukkede partikler som skal overvåkes for å lage et sett med treningspartikler for Xmipp autoplukkingsmetode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4. Dyp konsensusplukking med Xmipp-resultat. Parameteren zScoreDeepLearning legger vekt på godheten til en partikkel, og det er nøkkelen til å oppdage dårlige partikler. (a) De laveste zScores-verdiene er knyttet til artefakter. (b) De høyeste zScores er forbundet med partikler som inneholder makromolekylet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5. 2D-klassifisering med Cryosparc-resultat. Klassene som genereres (gjennomsnitt av undergrupper av partikler som kommer fra samme retning) vises. Flere gode klasser valgt i rødt (med et visst detaljnivå) og noen dårlige klasser ikke-valgte (støyende og usentrert klasser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6. 3D første volum med sverm konsensus resultat. En visning av det opprinnelige 3D-volumet oppnådd etter å ha kjørt konsensusverktøyet xmipp3 - swarm konsensus, ved hjelp av de tidligere 3D-innledende volumestimatene for Xmipp og Relion. (a) Volumet representeres av stykker. (b) 3D-visualisering av volumet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7. Presisering av et opprinnelig 3D-volum med Relion-resultat. (a) FSC-kurve oppnådd, krysser terskelen på en 4,5Å, ca. (b) Vinkeldekning vist som øvre visning av 3D-sfæren. I dette tilfellet, da det ikke er symmetri, bør de tildelte partiklene dekke hele sfæren. (c) Raffinert volum representert av stykker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8. 3D-justering basert på dyp læring med Xmipp-resultat. Resultatene generert av xmipp3 - deep align metode for 3D-justering. (a) Vinkeloppdraget for hver partikkel i form av transformasjonsmatrise. (b) Vinkeldekningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9. Konsensusresultat for 3D-justering. (a) Liste over partikler med oppnådde forskjeller i skift- og vinkelparametere. (b) Plott av vinkelforskjellene per partikkel. (c) Plott av skiftforskjellen per partikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 10. Endelig gjentakelse av 3D-raffineringsresultat. (a) FSC-kurve. (b) Oppnådd volum med full oppløsning av stykker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 11. Lokal oppløsningsanalyse med Xmipp-resultat. Resultater av metoden xmipp3 - lokale MonoRes. (a) Noen representative stykker farget med oppløsningsverdien per voxel, som angitt i fargekoden. (b) Histogram med lokal oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 12. Gjør Xmipp-resultatet skarpere. Resultater av xmipp3 - localdeblur skarphetsmetode . (a) Liste over oppnådde volumer per gjentakelse. (b) 3D-volum oppnådd etter siste gjentakelse representert av stykker. (c) En 3D-representasjon av det endelige volumet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 13. Valider overmonteringsverktøyet i Xmipp-resultatet. Resultater av xmipp3 - validering overfitting. Den grønne linjen tilsvarer rekonstruksjon fra data, den røde linjen fra støy. (a) Den inverse av den kvadrert oppløsning med logaritmen til antall partikler. (b) Oppløsning med antall partikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 14. Flere 3D-representasjoner av det oppnådde volumet. (a) Forhåndsbehandlet volum. (b) Etterbehandlet volum. (c) Lokal oppløsning, mørkeblå voxels er de med høyere oppløsning (2.75Å) og mørkerøde voxels er de med lavere oppløsning (10.05Å). (d) Zoom inn det etterbehandlede volumet der en alfa-helix (rød oval) kan sees. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 15. Eksempel på en dårlig 3D-rekonstruksjon. (a) FSC-kurve med et kraftig fall og krysse terskelen ved lav oppløsning. (b) Histogram med lokal oppløsning. (c) 3D-volum etter skiver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 16. Eksempel på 2D-klasser. (a) Gode klasser som viser et visst detaljnivå. (b) Dårlige klasser som inneholder støy og artefakter (øvre del oppnådd med Xmipp, lavere med CryoSparc). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 17. Eksempel på 3D første volum med forskjellige kvaliteter. (a) Godt innledende volum der formen på makromolekylet kan observeres. (b) Ugyldig startvolum der den oppnådde formen er helt forskjellig fra den forventede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1. Opprette et Scipion-prosjekt. Vindu som vises av Scipion der et gammelt prosjekt kan velges, eller et nytt, kan opprettes med et navn og en plassering for prosjektet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Importer filmmetode. Vinduet som vises av Scipion når pwem - importer filmer er åpent. Her må de viktigste anskaffelsesparametrene inkluderes for å la filmene som er tilgjengelige for behandling i Scipion. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3. Metode for filmjustering. Vindu som vises av Scipion når xmipp3 - optisk justering brukes. Inndatafilmene, utvalget av rammer som vurderes for justering, og noen andre parametere for å behandle filmene, bør fylles. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4. CTF-estimeringsmetode med Ctffind. Skjemaet i Scipion med alle nødvendige felt for å kjøre programmet Ctffind. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 5. Veiviser i Scipion. En veiviser som hjelper brukeren med å fylle ut noen parametere i skjemaet. I dette tilfellet er veiviseren å fullføre løsningsfeltet i grigoriefflab - ctffind -metoden. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 6. CTF-raffineringsmetode med Xmipp. Formen av xmipp3 - ctf estimering med alle parametrene for å gjøre en raffinement av en tidligere estimert CTF. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 7. Metode for preprosessmikrografer. Formen av xmipp3 - preprosessmikrografer som gjør det mulig å utføre noen operasjoner over dem. I dette eksemplet er Fjern ugyldige piksler og Nedsampbare mikrografer den nyttige. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 8. Plukkmetode med Cryolo. Skjemaet for å kjøre Cryolo-plukkmetoden ved hjelp av et forhåndsskolert nettverk. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 9. Konsensus plukkmetode med Xmipp. Formen av xmipp3 - dyp konsensusplukking basert på dyp læring for å beregne en konsensus av koordinater, ved hjelp av et forhåndsskolert nettverk over flere sett med koordinater oppnådd med forskjellige plukkmetoder. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 10. Ekstraktpartikler metode. Inngangs- og forprosessfaner av xmipp3 - ekstraktpartikler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggs figur 11.3D første volummetode med Xmipp. Formen på metoden xmipp3 - rekonstruere betydelig for å få et innledende 3D-kart. Kategoriene Inndata og Vilkår vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 12. Endre størrelse på volummetode. Skjemaet for å beskjære eller endre størrelse på et volum. I dette eksemplet brukes denne metoden til å generere et volum i full størrelse etter xmipp3 - rekonstruere betydelig. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 13.3D første volum med Relion-resultat. En visning av det oppnådde 3D-startvolumet med relion - 3D første modellmetode av stykker. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 14. Presisering av det opprinnelige volumet med Relion. Formen på metoden relion - 3D auto-refine. I dette eksemplet ble det brukt til å avgrense et innledende volum estimert etter konsensus. Kategoriene 3D-kart for inndata og referanse vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 15.3D klassifiseringsmetode. Form for relion - 3D-klassifisering. Kategoriene Inndata, Referanse 3D-kart og Optimalisering vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 16.3D justering basert på en dyplæringsmetode. Skjemaet åpnet for metoden xmipp3 - dyp justering. Her er det nødvendig å trene et nettverk med et treningssett, da vil det nettverket forutsi vinkeloppdraget per partikkel. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 17.3D presiseringsmetode. Form av xmipp3 - highres-metoden . Tabulatorer Inndata og Vinkeltilordning vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 18. Første gjentakelse av 3D-raffineringsresultat. (a) FSC-kurve. (b) Oppnådd volum (av mindre størrelse enn full oppløsning) representert som stykker. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 19. Første gjentakelse av 3D-presiseringskorrelasjonsanalyse. Et nytt vindu vises ved å klikke på linjeikonet i den øvre delen av vinduet med listen over partikler. I Vinduet Plott kolonner kan det opprettes et histogram av den ønskede estimerte parameteren. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 20. Verktøy for overmontering av validering. Form av xmipp3 - valider overmonteringsmetode . Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

For tiden er cryo-EM et nøkkelverktøy for å avsløre 3D-strukturen til biologiske prøver. Når det samles inn gode data med mikroskopet, vil de tilgjengelige prosesseringsverktøyene tillate oss å få en 3D-rekonstruksjon av makromolekylet som studeres. Cryo-EM-databehandling er i stand til å oppnå nesten atomisk oppløsning, noe som er nøkkelen til å forstå den funksjonelle oppførselen til en makromolekyl og er også avgjørende for narkotikaoppdagelse.

Scipion er en programvare som gjør det mulig å lage hele arbeidsflyten som kombinerer de mest relevante bildebehandlingspakkene på en integrerende måte, noe som hjelper sporbarheten og reproduserbarheten til hele arbeidsflyten for bildebehandling. Scipion gir et veldig komplett sett med verktøy for å utføre behandlingen; Imidlertid avhenger det å få rekonstruksjoner med høye oppløsninger helt av kvaliteten på de innsamvede dataene og hvordan disse dataene behandles.

For å få en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon er det første kravet å få gode filmer fra mikroskopet, som bevarer strukturell informasjon til høy oppløsning. Hvis dette ikke er tilfellet, kan ikke arbeidsflyten trekke ut HD-informasjon fra dataene. Deretter bør en vellykket prosesseringsarbeidsflyt kunne trekke ut partikler som virkelig samsvarer med strukturen og finne retningene til disse partiklene i 3D-rommet. Hvis noen av trinnene i arbeidsflyten mislykkes, forringes kvaliteten på det rekonstruerte volumet. Scipion tillater bruk av forskjellige pakker i noen av behandlingstrinnene, noe som bidrar til å finne den mest tilstrekkelige tilnærmingen til å behandle dataene. Videre, takket være å ha mange pakker tilgjengelig, kan konsensusverktøy, som øker nøyaktigheten ved å finne en avtale i estimerte utganger av forskjellige metoder, brukes. Det har også blitt diskutert i detalj i delen Representative Results flere valideringsverktøy og hvordan du identifiserer nøyaktige og unøyaktige resultater i hvert trinn i arbeidsflyten, for å oppdage potensielle problemer og hvordan du prøver å løse dem. Det er flere kontrollpunkter langs protokollen som kan bidra til å innse om protokollen kjører som den skal eller ikke. Noen av de mest relevante er: plukking, 2D-klassifisering, innledende volumestimering og 3D-justering. Å sjekke inngangene, gjenta trinnet med en annen metode, eller bruke konsensus, er alternativer som er tilgjengelige i Scipion som brukeren kan bruke til å finne løsninger når problemer oppstår.

Når det gjelder de tidligere tilnærmingene til pakkeintegrasjon i Cryo-EM-feltet, er ^Appion31 den eneste som tillater reell integrasjon av forskjellige programvarepakker. Appion er imidlertid tett forbundet med ^Leginon32, et system for automatisert innsamling av bilder fra elektronmikroskop. Hovedforskjellen med Scipion er at datamodell og lagring er mindre koblet. På en slik måte, for å lage en ny protokoll i Scipion, trenger bare et Python-skript å utvikles. I Appion må imidlertid utvikleren skrive skriptet og endre den underliggende databasen. Oppsummert ble Scipion utviklet for å forenkle vedlikehold og utvidbarhet.

Vi har presentert i dette manuskriptet en komplett arbeidsflyt for Cryo-EM-behandling, ved hjelp av det virkelige saksdatasettet til Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR oppføring: 10028, EMDB oppføring: 2660). Trinnene som dekkes og diskuteres her, kan oppsummeres som filmjustering, CTF-estimering, partikkelplukking, 2D-klassifisering, innledende kartestimering, 3D-klassifisering, 3D-raffinement, evaluering og etterbehandling. Ulike pakker har blitt brukt og konsensusverktøy ble brukt i flere av disse trinnene. Det endelige 3D-rekonstruerte volumet oppnådde en oppløsning på 3 Å, og i det etterbehandlede volumet kan noen sekundære strukturer skille seg ut, som alfa-helikvier, noe som bidrar til å beskrive hvordan atomer er ordnet i rommet.

Arbeidsflyten som presenteres i dette manuskriptet viser hvordan Scipion kan brukes til å kombinere forskjellige Cryo-EM-pakker på en enkel og integrert måte for å forenkle behandlingen, og oppnå mer pålitelig resultat samtidig.

I fremtiden vil utviklingen av nye metoder og pakker fortsette å vokse, og programvare som Scipion for enkelt å integrere dem alle vil være enda viktigere for forskerne. Konsensustilnærminger vil være mer relevante selv da, når mange metoder med forskjellig grunnlag vil være tilgjengelige, og bidra til å oppnå mer nøyaktige beregninger av alle parametrene som er involvert i gjenoppbyggingsprosessen i Cryo-EM. Sporing og reproduserbarhet er nøkkelen i forskningsprosessen og enklere å oppnå med Scipion takket være å ha et felles rammeverk for utførelse av komplette arbeidsflyter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
no material is used in this article	-	-	-