Summary
Detta protokoll beskriver användningen av en speciell intravenös kateter, standardiserade sterila engångsrör, temperaturkontroll kompletterad med realtidsövervakning och ett larmsystem för tvåstegs kollagenasperfusionsförfarande för att förbättra konsistensen i livskraften, utbytet och funktionaliteten hos isolerade primära råtthepatocyter.
Abstract
Primära hepatocyter används ofta i grundforskning om leversjukdomar och för toxicitetstestning in vitro. Tvåstegs kollagenasperfusionsproceduren för primär hepatocytisolering är tekniskt utmanande, särskilt vid kannulering av portalvener. Förfarandet är också benäget för tillfällig kontaminering och variationer i perfusionsförhållanden på grund av svårigheter vid montering, optimering eller underhåll av perfusionsinställningen. Här presenteras ett detaljerat protokoll för ett förbättrat tvåstegs kollagenasperfusionsförfarande med multiparameterperfusionskontroll. Primära råtthepatocyter isolerades framgångsrikt och tillförlitligt genom att vidta nödvändiga tekniska försiktighetsåtgärder vid kritiska steg i proceduren och genom att minska driftssvårigheterna och mildra variationen i perfusionsparametrar genom antagande av en speciell intravenös kateter, standardiserad steril engångsslang, temperaturkontroll och realtidsövervaknings- och larmsystem. De isolerade primära råtthepatocyterna uppvisar konsekvent hög cellviabilitet (85% -95%), utbyte (2-5 x 108 celler per 200-300 g råtta) och funktionalitet (albumin, urea och CYP-aktivitet). Förfarandet kompletterades med ett integrerat perfusionssystem, som är tillräckligt kompakt för att ställas in i den laminära flödeshuven för att säkerställa aseptisk drift.
Introduction
Primära hepatocyter är viktiga verktyg för leverrelaterad grundforskning, sjukdomsbehandling och tillämpning som drogtestning. Den nuvarande guldstandarden för primär hepatocytisolering är tvåstegs kollagenasperfusionsproceduren 1,2,3 som introducerades av Seglen på 1970-talet4. Denna procedur är dock tekniskt utmanande och har en hög felfrekvens när den utförs av nybörjare. Även när en perfusion anses vara framgångsrik kan drastiska skillnader i hepatocytviabilitet (vanligtvis 60% -95%) och utbyte (0,5-5 x 108 per 200-300 g råtta) observeras mellan isoleringar. Detta påverkar kvaliteten och omfattningen av nedströms experiment. Bortsett från den tekniska proceduren är perfusionsinställningen som används för isoleringen, antingen kommersiellt tillgänglig eller specialbyggd, en bidragande faktor. Uppmärksamhet måste ägnas åt montering, optimering och underhåll av perfusionsinställningen. Syftet med detta protokoll är att förbättra framgångsgraden och stabiliteten mellan isoleringar av primära råtthepatocyter genom multiparameterperfusionskontroll av det tekniska förfarandet och perfusionsinställning av tvåstegs kollagenasperfusionsproceduren.
Ur den tekniska aspekten är det svåraste steget i proceduren portalvenens kannulering. När det gäller de andra stegen, om god praxis följs och allmänna försiktighetsåtgärder vidtas, kan isoleringens stabilitet förbättras. Därför är förståelse för resonemanget för varje steg viktigt så att kirurgen kan svara på olika variabler som kan uppstå under proceduren.
Olika protokoll för isolering av hepatocyter och lever icke-parenkymala celler från råtta och mus har publicerats 1,2,5,6,7,8,9. Perfusionsinställningarna som användes i dessa protokoll hade flera nackdelar, som inkluderar återanvändning av perfusionsrör, problem med temperaturkontroll, behov av rutinoptimering av perfusionsparametrar och / eller användning av olämplig typ av intravenös (IV) kateter för portalvenkannulering. Återanvändning av perfusionsslangar ökar risken för kontaminering, särskilt om slangen inte rengjordes och desinficerades ordentligt. Återanvändning av slangar utan rutinmässigt byte kommer också att utsätta perfusionsinställningen för problem som läckande slangar eller kontakter, igensatt bubbelfälla och trånga slangar, som alla avsevärt kommer att minska perfusattrycket och flödeshastigheten, vilket påverkar leverens matsmältningseffektivitet. Utan en konstant värmekälla i vissa inställningar för temperaturkontroll kommer förvärmda buffertar att svalna med tiden, vilket leder till låg kollagenasaktivitet och matsmältning. Även om andra inställningar använder en mantlad glaskondensor ansluten till en vattencirkulation för att värma bufferten, är de skrymmande och kräver noggrann rengöring. Temperatur, tryck och flödeshastighet för buffert som lämnar katetern måste mätas och optimeras innan isoleringen påbörjas för att säkerställa ett stabilt perfusionstillstånd. Även efter optimering kan parametrarna fortfarande förändras halvvägs under isolering på grund av operatörens handlingar, vilket leder till suboptimal perfusion och matsmältning. De flesta typer av IV-kateter är inte lämpliga för portalvenkannulering eftersom de inte tillåter kontinuerlig perfusion under kannulering. De kan inte omedelbart informera kirurgen när kannuleringen är framgångsrik. Dessutom är det utmanande att säkra portalvenen på den mjuka katetern utan att deformera den.
Här tar vi itu med dessa problem med hjälp av standardiserade sterila engångsrör, en silikonvärmarjacka för exakt och stabil temperaturkontroll, realtidsövervakning och larmsystem med datalagring och hantering och användning av en speciell IV-kateter, vilket möjliggör kontinuerlig perfusion medan du punkterar portalvenen under kannulering. Så vitt vi vet är vi den första gruppen som kombinerar alla dessa funktioner i ett integrerat perfusionssystem (IPS) som är kompakt, vilket gör det mycket bärbart och kan passas in i en laminär flödeshuv för att säkerställa aseptisk drift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer och djurhem utfördes under protokollnummer R15-0027 och R19-0669 i enlighet med kraven från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid National University of Singapore.
1. Beredning av lösningar och kirurgiska instrument
- Förbered buffertar och cellodlingsmedier i tabell 1 med ultrarent vatten.
- Förvärm den kalciumfria bufferten och kollagenasbufferten till 37 °C i ett vattenbad före användning.
- Autoklavera följande kirurgiska instrument och laboratorieutrustning: ett par skarpa trubbiga kirurgiska saxar, en trubbig-trubbig kirurgisk sax, ett par böjda kirurgiska saxar, två par tandvävnadstångar, två par böjda pincett, två venklämmor, en 5 cm lång 3-0 silkekirurgisk sutur, ett 100 μm nylonnätfilter, en 400 ml bägare, och ett steg (flytande mikrocentrifugrörställ).
2. Ställa in IPS (se figur 1)
- Torka av den laminära flödeshuven med 70% etanol. Torka av IPS med 70% etanol och flytta den in i laminärflödeshuven. Sterilisera med UV i >15 minuter innan du slår på huven.
VARNING: Exponering för UV-ljus kan orsaka smärtsamma ögon och hudbrännskador. Se till att skärmen är helt stängd när UV-ljuset tänds. - Montera en ny uppsättning engångsslangar på IPS. Linda slangen nedströms den peristaltiska pumpen i en silikonvärmarmantel. Montera perfusionsmonitorn på slangen nedströms silikonvärmarmanteln.
- Se till att rullklämmorna för båda slanginloppen är helt lossade. Anslut varje slanginlopp till den avsmalnande änden av en steril 2 ml aspirationspipett. Lämna båda aspirationspipetterna (inloppen) och IV-katetern (utloppet) i en 1 L-flaska med kalciumfri buffert för att möjliggöra återcirkulation av bufferten under efterföljande grundningssteg.
- Slå på IPS. Utför följande åtgärder på pekskärmens kontrollpanel. Programvaran kommer att utföra ett omfattande självtest varje gång den startas.
VARNING: IPS är en elektrisk utrustning som är ansluten till en extern strömkälla. Vätskespill på IPS eller strömkablar kan ge elektriska faror.- Se till att självteststatus visas på skärmen (bild 2). Komponenter som har klarat självtestet visas i grönt; de som har misslyckats kommer att visas i rött. Efter korrigering trycker du på Testikonen för att upprepa självtestet igen eller trycker på ikonen Ange system för att komma in direkt i driftsgränssnittet.
- Tryck var som helst på skärmen för att logga in på operationsgränssnittet.
- I det övre vänstra hörnet av operationsgränssnittet (bild 3) trycker du på någon av de cirkulära pilikonerna för att ställa in rotationsriktningen för den peristaltiska pumpen. På den högra panelen i gränssnittet trycker du på upp/ nedpilikonerna för att ställa in värden för motsvarande parametrar. Ställ in flödet på konstant flödesläge; Värmemantelns temperatur till 42 °C (ska justeras för att säkerställa att perfusatets temperatur hålls vid 37 °C). och pumphastighet till 38 rpm för en flödeshastighet på ~ 33 ml / min.
- I den nedre högra panelen i operationsgränssnittet kontrollerar du om det finns status för bubbellarmet, perfusionsstopplarmet och mute-ikonen.
- Kontrollera temperaturen, trycket och flödeshastigheten för perfusatet i den vänstra panelen. Ställ in intervallen manuellt genom att klicka på upp-nedpilarna längst upp och längst ner i kolumnerna. Sök efter realtidsdata som visas som värden i mitten av kolumnerna. Färgen på kolumnen blir från grön till röd om realtidsdata flyttas utanför det inställda intervallet.
- Leta reda på ikonerna för att starta, pausa och stoppa perfusionen och ikonen för att växla från realtidsdatavisning till diagramläge i mittpanelen. Tryck på startikonen för att starta perfusionen och primera slangen med kalciumfri buffert. En ny logg skapas. Ange filnamnet och användarnamnet i popup-fönstret (bild 4).
Figur 3: Operativt gränssnitt.
Bild 4: Popup-fönster som frågar efter filnamn och användarnamn.
- Fyll droppkammaren till halvfull. Se till att det inte finns några instängda luftfickor i slangen under grundningen.
- Ta bort alla bubblor som bildas nedströms bubbelfiltret genom att svepa på slangen för att ta bort bubblan och låta den spolas ut.
OBS: Bubblor kan bildas längs slangen när bufferten värms upp av värmemanteln. - Fyll en 400 ml bägare med 200 ml kollagenasbuffert. Lägg scenen ovanpå bägaren. Utan att föra in någon luft i slangen, dra åt rullklämman helt för ett av slanginloppen och flytta aspirationspipetten för inloppet i bägaren.
3. Djuriskt förfarande
- Förbered en ung vuxen manlig Wistar råtta runt 200-300 g i kroppsvikt.
OBS: Detta protokoll optimerades för råttor runt 200-300 g i kroppsvikt. Hanråttor är att föredra eftersom hormonella förändringar under estrouscykeln hos honråttor kommer att påverka hepatocytfunktionen. - Anestesi
- Dra upp den erforderliga volymen antikoagulerande heparin (5 000 IE/ml; 0,2 ml/100 g kroppsvikt) och råttanestesiketamin/xylazincocktail (37,5 mg/ml ketamin, 5 mg/ml xylazin; 0,2 ml/100 g kroppsvikt) i 1 ml sprutor med 27 G nål.
VARNING: Anestesi och heparin är skadliga ämnen. Var försiktig när du hanterar vassa föremål. - Håll tillbaka råttan. Injicera heparin intraperitonealt följt av ketamin/xylazincocktail i nedre högra kvadranten i buken.
OBS: Caecum har en högre sannolikhet att vara placerad till vänster. Undvik att punktera caecum under injektionen för att minska risken för kontaminering. - Efter 10 min, kontrollera anestesidjupet genom att bedöma pedalreflexen på båda fötterna på råttan. Fortsätt att kontrollera då och då och vänta tills råttan inte längre svarar på tånypor. Ytterligare anestesi kan injiceras vid behov.
- Dra upp den erforderliga volymen antikoagulerande heparin (5 000 IE/ml; 0,2 ml/100 g kroppsvikt) och råttanestesiketamin/xylazincocktail (37,5 mg/ml ketamin, 5 mg/ml xylazin; 0,2 ml/100 g kroppsvikt) i 1 ml sprutor med 27 G nål.
- Placera råttan i ryggläge med lemmarna utsträckta på en aluminiumfolieklädd polystyrenplattform ovanpå en bricka. Tejpa råttans fötter och fäst tejpen ordentligt på plattformen med 27 G nålar.
- Desinficera bröstet och buken genom att spruta och dränka dem med 70% etanol. Rakning före desinfektion är valfritt. Sätt råttan i huven. Fortsätt nästa steg medan pälsen fortfarande är våt.
OBS: Dränkning med 70% etanol håller också mjäll och pälsdamm till ett minimum. - Separera huden från muskeln.
- Med ett par tandvävnadstångar i ena handen lyfter du huden nära bukets botten. Med en par skarp-trubbiga operationssaxar i andra handen skär du tälthuden. Tryck in saxens vassa ände under huden och gör ett snitt i mittlinjen på huden från strax ovanför bakbenen till strax under frambenen.
- Medan du drar upp och sträcker huden lätt med tången, skär all bindväv som håller huden på muskeln i bröstet och buken. För att minska risken för kontaminering, förhindra att lös päls faller på muskeln. För att ta bort uppbyggd lös päls på saxen, torka av dem på den desinficerade utsidan av huden.
- Gör laterala snitt på huden, från mittlinjen till båda sidor av råttan något ovanför bakbenen och något under frambenen. Tryck hudflikarna åt sidorna för att exponera muskeln.
- Skär upp bukmuskeln för att exponera organen.
- Med ett nytt par tandvävnadstångar i ena handen lyfter du muskeln nära bukets botten. Med en trubbig-trubbig operationssax i andra handen skär du försiktigt igenom muskeln utan att nicka något av organen. Gör ett mittlinjesnitt på muskeln från något ovanför bakbenen till bröstbenen.
- Gör laterala snitt på muskeln, från mittlinjen till båda sidor av råttan något ovanför bakbenen och strax under bröstkorgen, utan att nicka något av organen. Tryck muskelflikarna åt sidorna för att exponera organen. Se till att de laterala snitten i huden och muskeln når sidorna av råttan så att blod och buffertar kan strömma ut från bukhålan vid senare steg.
- Portal ven kannulering
- Med baksidan av böjda pincett, tryck försiktigt tarmarna åt höger. Vänd försiktigt upp leverloberna för att exponera portalvenen.
- Använd en 3-0 silke kirurgisk sutur för att göra en mycket lös ligatur runt portalvenen nära levern, strax innan venen grenar vänster och höger in i olika leverlober. Dra inte åt ligaturen för att undvika att störa blodflödet genom portalvenen. Ett mycket tunt membran under gallgången måste brytas igenom med spetsen på de böjda tångarna innan suturen kan passera under och slingas runt portalvenen (och gallgången).
- Använd spetsarna på två par böjda pincett och punktera försiktigt ett hål genom vävnaden under portalvenen utan att skada portalvenen. Gör detta ca 2-3 cm uppströms den första ligaturen, strax innan magvenen förgrenar sig från portalvenen. Vävnaden är tunnare på denna specifika plats.
- Sträck försiktigt hålet större med tången. Detta hål gör att tången kan stödja upp portalvenen under kannulering.
- Sänk pumphastigheten till 4 rpm för en flödeshastighet på ~ 3 ml / min. Se till att utflödet av kalciumfri buffert från IV-katetern reduceras till ett långsamt dropp.
OBS: Tryckuppbyggnad i levern kommer att orsaka hepatocytdöd. En lägre flödeshastighet bör bromsa tryckuppbyggnaden i levern vid framgångsrik insättning av kanylen i portalvenen i ett senare steg. - Stöd försiktigt upp portalvenen med pincett. Håll med den andra handen fast i IV-katetern med nålens avfasning uppåt. Rikta nålen in i portalvenen i en 10-20 ° vinkel och avancera långsamt tills hela avfasningen är inne i venen. När nålen har satts in korrekt i portalvenen börjar levern blanchera och förlora sin mörkröda färg.
OBS: Hela nålens avfasning måste sättas in i venen för att skapa ett hål som är tillräckligt stort för att sätta in kanylen. Sätt dock inte in nålen för djupt in för att undvika att överpunkta venen. - För kanylen över nålen och in i venen. Dra sedan tillbaka nålen tills den är 2-3 mm bakom kanylen; precis tillräckligt så att den vassa spetsen är säkert i kanylen. Använd tummen och långfingret för att hålla i katetern och använd pekfingret för att dra tillbaka vingen för att dra tillbaka nålen.
- Fäst snabbt portalvenen på katetern med en venklämma. Fäst inte direkt på nålens sidohål för att undvika att störa perfusatflödet. Klipp istället under den.
- Skär omedelbart den infrahepatiska underlägsna vena cava (IVC) för att förhindra tryckuppbyggnad i levern. Vid det här laget kommer den infrahepatiska IVC och intilliggande blodkärl att döljas av blod från portalvenen. För att säkerställa att IVC var korrekt skuren och avskuren, observera för blod som sprutar ut i pulser; blod kommer bara att sippra ut från intilliggande kärl.
OBS: Att ta för lång tid att skära den infrahepatiska IVC efter kannulering eller underlåtenhet att skära den innan du går vidare till nästa steg kommer att orsaka hepatocytdöd. Djuren avlivas under anestesi genom exsanguination (genom skärning av IVC) under detta steg. Förfarandet bör fortsätta medan blodförlust pågår. Döden kan bekräftas genom visuell observation av upphörande av hjärtslag /andning när brösthålan öppnas vid ett senare steg. - Öka pumphastigheten till 38 rpm för en flödeshastighet på ~ 33 ml / min. Spola levern tre gånger genom att stänga IVC med pincett i 2-3 s (men inte för länge) och öppna den igen.
OBS: Under spolning kommer levern att expandera något innan den återgår till det normala. Spolning underlättar permeationen av perfusat i hela levern. Efter spolning ska levern vara helt ljusbrun i färg. - Se till att kanylspetsen placeras före den punkt där portalvenen förgrenar sig i olika leverlober, för att säkerställa perfusion av alla leverlober. Lossa vid behov portalvenen och justera kanylens position. Klipp om efteråt.
- Dra åt den lösa ligaturen runt portalvenen, något uppströms om förgreningspunkten. Gör tre knop på där den mjuka kanylen stöds av den hårda metallnålen, mellan fasningen och sidohålet. Se till att knutarna fixerar kanylen på plats, säkrar den i portalvenen och förhindrar återflöde av buffertar.
- Resect hela levern intakt.
- Perfusera levern med kalciumfri buffert vid flödet ~33 ml/min under de kommande 12 minuterna (se figur 5A). Under tiden utför leverresektion. Perfusionstiden kan förlängas vid behov men se till att den kalciumfria bufferten inte tar slut.
- Använd en krökt sax och lossa försiktigt portalvenen från tarmarna genom att klippa mesenteriet som förbinder dem med varandra. Nicka inte mag-tarmkanalen (matstrupe, mage och små och stora tarmar) för att säkerställa att ingen förorening uppstår.
OBS: Detta för att förhindra att portalvenen rivs när levern flyttas runt under resektion. - Lossa levern från mag-tarmkanalen genom att skära bindväv, bukspottkörtel och mesenteri som förbinder levern med mag-tarmkanalen. För att lossa, skär alltid med sax och dra inte för att riva. Återigen, nicka inte eller skära mag-tarmkanalen.
- Vänd försiktigt ner levern för att exponera membranet. Skär membranet efter revbenens väggar. Se till att det mesta av membranet förblir anslutet till levern. Var försiktig så att du inte petar eller får blåmärken på levern.
- När bröstkaviteten har öppnats kan två kanaler ses: den vitaktiga suprahepatiska IVC till vänster och den gulaktiga matstrupen till höger. Klipp den suprahepatiska IVC och klipp den precis ovanför klippet. Klippning av den suprahepatiska IVC är valfritt. Det förhindrar att bröstkaviteten blir översvämmad.
OBS: Observera visuellt för upphörande av hjärtslag / andning för att bekräfta djurdöd. - Matstrupen är omgiven av membranet. För att isolera matstrupen från membranet, skär genom membranet från höger mot matstrupen. Skär eventuella återstående bindväv som förbinder matstrupen och magen med levern och membranet.
- Tryck bort mag-tarmkanalen till höger. Överför venklämman från den suprahepatiska IVC till den infrahepatiska IVC; buffert kommer nu att perfuse ut från den suprahepatiska IVC.
OBS: Under perfusion kommer kanylen och infrahepatisk IVC att täckas av levern. Starkt buffertutflöde från den suprahepatiska IVC hjälper kirurgen att utesluta perfusionsläckage. - Skär eventuellt kvarvarande membran som förbinder levern med bröstkaviteten. Klipp av vävnader som förbinder levern med bukhålan. Var försiktig så att du inte skär den infrahepatiska IVC ovanför klämman för att undvika att klämman lossnar från levern.
- För att säkerställa att levern är helt resekterad, lyft försiktigt levern genom att hålla fast vid membranet med pincett. Om det finns några återstående vävnader som förbinder levern med bukhålan, skär av dem. Om njuren och mjälten fortfarande är anslutna till levern, lossa dem.
4. Leverperfusion och matsmältning
- Om resektion slutfördes tidigt, vänta tills levern har perfuserats med kalciumfri buffert i 12 minuter.
- Ändra perfusionsbufferten till kollagenasbuffert. Lossa rullklämman helt för kollagenasbuffert innan du drar åt rullklämman helt för kalciumfri buffert (se figur 5B). När kollagenasbufferten når levern genom slangen, spola levern tre gånger genom att stänga den suprahepatiska IVC i 2-3 s och öppna den igen.
- Flytta försiktigt levern till scenen ovanpå bägaren för återcirkulation av kollagenasbuffert. Flytta levern genom att hålla i membranet med pincett medan du stöder katetern. Undvik att dra i katetern för att förhindra oavsiktlig kateteravlossning.
OBS: Om katetern lossnar och portalvenen är för skadad för återkannulering, kannulera den suprahepatiska IVC och låt bufferten tränga ut från portalvenen. Se till att den infrahepatiska IVC förblir klippt. - Smält levern i 12 minuter. Observera för utseendet på genomskinliga fläckar / nätverk när levern börjar förlora sin släta bruna konsistens. Levern blir större och mjukare när den smälts. När levern har en grumlig konsistens, stoppa perfusionen. Digestionstiden kan förlängas vid behov.
OBS: Om Glissons kapsel har brutits kan kollagenasbufferten i bägaren bli grumlig på grund av förrymda leverceller.
5. Hepatocytisolering
- Ta försiktigt bort kanylen genom att klippa av portalvenen. Ta försiktigt bort klämman. Överför levern till en 150 mm skål som innehåller 60 ml kall Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Knacka försiktigt på levern med baksidan av de böjda tångarna för att bryta och dra av Glissons kapsel. Sväng sedan försiktigt levern sida till sida i DMEM för att frigöra leverceller. Fortsätt att göra detta tills levercellerna är helt dissocierade i DMEM.
OBS: Ibland kommer hela levern eller vissa lober endast att smälta delvis. Genom att inte skrapa levern som med våld kommer att ta bort och skada odissocierade hepatocyter kan en högre och mer konsekvent cellviabilitet erhållas. - Gunga försiktigt 150 mm skålen tills levercellerna fördelas väl i DMEM. För att ta bort vävnadsbitar och cellklumpar, häll cellsuspensionen genom ett nylonnätfilter på 100 μm porer placerat över en ny 150 mm skål. Skölj den gamla skålen med 30 ml DMEM och överför suspensionen till nätfiltret. Tryck försiktigt på nätfiltret så att fångade enskilda leverceller kan passera igenom.
- Ta bort nätfiltret och gunga försiktigt den nya 150 mm skålen tills levercellerna fördelas väl. Dela upp suspensionen lika i 4 x 50 ml rör. Skölj skålen med 30 ml DMEM och dela suspensionen lika i samma rör. Se till att varje rör har en lika stor volym cellsuspension.
- Centrifugera 4 x 50 ml rör med cellsuspension vid 50 x g i 2 minuter vid 4 °C. Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa den lösa pelleten. Kassera supernatanten. Tillsätt 20 ml DMEM i varje rör och gunga försiktigt rören för att återsuspendera cellpelleten. Kombinera cellsuspensionen från fyra rör i två.
- Centrifugera rören på 2 x 50 ml vid 20 x g i 2 minuter vid 4 °C. Aspirera och kassera supernatanten. Tillsätt 20 ml DMEM i varje rör och gunga försiktigt rören för att återsuspendera cellpelleten. Kombinera cellsuspension från två rör till ett. Håll cellerna på is tills de används.
- Förbered trypan blå lösning genom att blanda 400 μL 1x PBS med 50 μL trypanblått. Tillsätt 50 μl hepatocytsuspension i den trypanblå lösningen. Räkna antalet livskraftiga och döda hepatocyter med en hemocytometer under ljusmikroskopet.
6. Hepatocytkultur
- Utför alla cellodlingssteg i huven. Tillsätt 1 ml kollagenbeläggningslösning i en 35 mm skål och inkubera i 4 timmar. Skölj diskarna tre gånger med 1x PBS.
- Späd hepatocytsuspension i hepatocytodlingsmedium till en koncentration av 0,8 miljoner celler / ml. Tillsätt 1 ml utspädd hepatocytsuspension i 35 mm skålen.
OBS: Hepatocyter är känsliga för skjuvspänning under pipettering. Överväg att använda breda borrpipettspetsar. - Rock skålen för att fördela hepatocyterna jämnt. Inkubera vid 37 °C, 5 %CO2 i 3–4 timmar så att hepatocyterna kan fästa.
- För smörgåskultur.
- Ta bort hepatocytodlingsmediet. Skölj en gång med 1 ml hepatocytodlingsmedium för att ta bort oanslutna celler. Tillsätt 1 ml kollagenöverlagringslösning. Tillsätt kollagenöverlagringslösning på skålens väggar för att undvika att bubblor införs i lösningen.
- Inkubera vid 37 °C, 5 %CO2 över natten för att möjliggöra kollagengelering.
- Tillsätt 1 ml färskt hepatocytodlingsmedium. Inkubera vid 37 °C, 5 %CO2.
- För monolayer kultur.
- Efter steg 6.3, ta bort hepatocytodlingsmediet. Skölj en gång med 1 ml hepatocytodlingsmedium för att ta bort de obundna cellerna.
- Tillsätt 1 ml färskt hepatocytodlingsmedium. Inkubera vid 37 °C, 5 %CO2.
- Bedöm hepatocytrenhet och funktion genom att utföra immunfärgning för hepatocytspecifik markör och funktionella analyser som beskrivits tidigare10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kirurg kan berätta om leverperfusion pågår smidigt genom att observera resultatet efter vissa steg. Det första resultatet kan observeras vid kannulering, skärning av den infrahepatiska IVC och återställande av perfusionsflödet. Levern borde ha helt ändrat färg från mörkröd till brun, samtidigt som volymen bibehålls. Om levern ser något tömd ut och har en rödaktig nyans eller fläckar av rött, betyder det att perfusionsflödeshastigheten ställdes in felaktigt (för lågt), eller att portalvenen inte kannulerades korrekt. Om levern inte bara blir brun utan blir uppblåst och stel betyder det att flödeshastigheten ställdes in felaktigt (för högt), eller att den infrahepatiska IVC inte skars ordentligt. Om bara några lober inte perfuseras väl betyder det att katetern sattes in för djupt och bara perfuserar en gren av portalvenen. Det andra resultatet kan observeras efter resektion och klippning av den infrahepatiska IVC. Om utflödet från den suprahepatiska IVC är långsamt och svagt kan det betyda att katetern hade lossnat under resektion, eller att den infrahepatiska IVC inte klipptes ordentligt. Det tredje resultatet kan observeras under matsmältningen. På den bruna levern bör genomskinliga fläckar / nätverk visas och förstoras. Levern ska förlora sin fjädrande konsistens och bli mjuk och grumlig. Vi optimerar vår kollagenaskoncentration så att detta tillstånd kan nås inom 12 minuter. När du testar en ny massa kollagenas bör matsmältningstiden förlängas tills detta tillstånd uppnås. Det fjärde resultatet kan observeras när celler frigörs från levern. När cellerna släpps ska media se grumligt ut. Om mycket kornig konsistens observeras kan det betyda att levern inte smälts tillräckligt. Om matsmältningen är klar bör endast vita webbliknande kärl lämnas. Även om matsmältningen är partiell (Figur 6) är det fortfarande möjligt att förvärva goda celler.
Vårt protokoll som beskrivs här genererar konsekvent högre cellutbyte på upp till 5 × 108 hepatocyter per isolering från råttor som väger 200-300 g och cellviabilitet mellan 88% -94,8% enligt trypanblå räkning 12,13,14,15,16 (tabell 2). Hepatocytrenhet erhållen som bestäms genom immunfärgning av albumin var 96,8 ± 2,0%11 (figur 7). Hepatocyter i sandwichkultur bildade distinkt gallkanaliculi och hade god cell-cellkontakt (figur 8). Hepatocyterna har hög funktionalitet som visas av albumin, urea och CYP-analyser10 (tabell 3).
Figur 1: Schematiskt diagram över IPS. Perfusatet börjar i perfusatpåsen eller flaskan (1, 2). Två flödesregulatorer (3, 4) arbetar tillsammans för att kontrollera passagen av perfusat. Perfusate fortsätter till en bubbelfälla (5). Efterföljande processer styrs av LCD-pekskärmen (6) i huvudsystemet. Perfusat dras sedan av en peristaltisk pump (7) och passerar genom en silikonmantlad elektronisk värmare (8), som värmer upp perfusatet till önskad temperatur. Silikonvärmarmanteln (8) är ansluten till huvudsystemet med en kontakt (9). Vid behov kan en engångstryckgivare (10) anslutas till huvudsystemet med en kontakt (11) för att möjliggöra mätning av perfusionstrycket. Perfusatet passerar sedan genom en perfusionsmonitor (12), som mäter perfusatets temperatur och detekterar närvaron av bubblor. Monitorn kan också avgöra om perfusatet har tagit slut. Monitoravläsningar överförs till huvudsystemet via LoRa. Perfusatet fortsätter sedan till ett bubbelfilter (13) och kommer in i levern genom portalvenens kanyl (14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Schematiskt diagram över tvåstegs kollagenasperfusion för primär råtta hepatocytisolering. Rullklämman lossas helt för inlopp 1 och dras åt helt för inlopp 2. (B) Leverrötning med kollagenasbuffert. Resekterad lever överförs till toppen av en bägare för att möjliggöra buffertcirkulation. Rullklämman är helt lös för inlopp 2 och helt åtdragen för inlopp 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Lever efter kollagenasuppslutning och hepatocytisolering. Visas är en delvis smält leverlob. Osmälta delar av levern förblev bruna. I smälta delar av levern lämnades endast vita kärl kvar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Immunfärgning av hepatocytisk markör för kvantifiering av hepatocytrenhet. (A) Sandwichkultur av orenad levercellssuspension (före differentiell centrifugering; vänster) och renad hepatocytsuspension (efter differentiell centrifugering; höger) sådd vid låg celltäthet. (B) Representativa bilder visar celler färgade med DAPI (kärna; blå) och antikropp mot albumin (hepatocytspecifik markör; grön). (C) Kvantifiering av hepatocytrenhet. Renheten bestämdes genom att räkna albuminpositiva fluorescerande färgade celler i förhållande till det totala cellantalet som visualiserades genom DAPI-kärnfärgning. Bilder i falska färger visades. Albumin (grön), kärna av celler med albumin (blå), kärna av celler utan albumin (röd). Skala staplar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Faskontrastbild av isolerade primära råtthepatocyter från tvåstegs kollagenasperfusion i sandwichkultur vid dag 3. Skalstreck 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Namn på buffertar/media | Slutlig koncentration | Belopp | Kommentarer/Beskrivning |
| Hepatocyt kultur media | |||
| Williams E-media | 500 ml | Tillsätt alla reagenser i Williams E-media. Filtrera genom 0,22 μm filter. Förvaras vid 4 °C. | |
| Bsa | 1 mg/ml | 0,5 g | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 1X | 5 ml | |
| Insulin (20 mg/ml) | 0,5 μg/ml | 12,5 μl | |
| Dexametason (1 mM) | 100 nM | 50 μl | |
| Linolsyra (7,5 μg/ml) | 50 ng/ml | 3,33 μl | |
| Glutamax (100X) | 1X | 5 ml | |
| Kollagenas buffert | |||
| NaCl | 0,100 g | Lös upp i 380 ml ultrarent vatten. Justera till pH 7,49 - 7,51 med NaOH. Fyll på upp till 400 ml med ultrarent vatten. Filtrera genom 0,22 μm filter. Förvaras vid 4 °C. | |
| KCl | 0,789 g | ||
| Kollagenas typ IV | 80 - 200 U/ml | ||
| CaCl2·2H2O | 0,140 g | ||
| HEPES | 4.800 g | ||
| Kalciumfri buffert | |||
| KH2PO4 | 0,0815 g | Lös upp i 900 ml ultrarent vatten. Justera till pH 7,49-7,51 med HCl. Fyll på upp till 1 L med ultrarent vatten. Filtrera genom 0,22 μm filter. | |
| NaHCO3 | 1,0500 g | ||
| NaCl | 3,4480 g | ||
| KCl | 0,1750 g | ||
| DMEM för cellisolering | |||
| DMEM | 1 påse | Fyll på upp till 1 L med ultrarent vatten. Filtrera genom 0,22 μm filter. Förvaras vid 4 °C. | |
| NaHCO3 | 1,5 g | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 1X | 10 ml | |
| Kollagen överlägg (1 ml) | |||
| 0,1 M NaOH | 1 del | 20,8 μl | Förbered färskt. Tillsätt kollagen sist. |
| 10X PBS | 1 del | 20,8 μl | |
| 1X PBS | 6 delar | 125 μl | |
| Hepatocyt kultur media | 32 artiklar | 667 μl | |
| Kollagen av typ I från nötkreatur | 8 delar | 167 μl | |
| Kollagen beläggningslösning (1 ml) | |||
| Kollagen av typ I från nötkreatur | 1 del | 0,5 ml | Förbered färskt. |
| 0,01 N HCl | 1 del | 0,5 ml | |
Tabell 1: Recept för buffertar och lösningar.
| Hepatocyt livskraft (%) | Hepatocytutbyte (x 108 celler) | Livskraftigt hepatocytutbyte (x 108 celler) |
| 91.4 ± 3.4 | 4.39 ± 1.58 | 4.04 ± 1.48 |
Tabell 2: Cellviabilitet och utbyte. Värden ± SD från 18 olika experiment visas.
| Urea (μg/miljoner celler/dag) | Albumin (μg/miljoner celler/dag) | CYP1A2-aktivitet (μg/miljoner celler/dag) | CYP2B1/2-aktivitet (μg/miljoner celler/dag) | CYP3B2-aktivitet (μg/miljoner celler/dag) | |
| Dag 1 | 124 ± 2.6 | 39,0 ± 3,6 | |||
| Dag 3 | 65.7 ± 3.8 | 516,0 ± 95,1 | 2249 ± 56 | 188 ± 49 | 93,7 ± 0,6 |
Tabell 3: Funktionella nivåer av isolerad primär råtta hepatocyt i smörgåskultur. Värden ± SD av urea-, albumin-, CYP1A2-, CYP2B1/2- och CYP3B2-analyser från tre olika experiment visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns några punkter som är särskilt viktiga att observera för tvåstegs kollagenasperfusionsförfarande i allmänhet. För det första måste särskild försiktighet ges vid resektering av levern. Se till att mag-tarmkanalen inte skadas eftersom läckage av innehållet kommer att leda till bakteriell kontaminering. Undvik dessutom att skada Glissons kapsel, som täcker leverns yta under djurproceduren. Om tåren är tillräckligt stor kan det tillåta för tidig frisättning av disassocierade hepatocyter i kollagenasbufferten. För det andra kan kollagenas förmåga att smälta levern samtidigt som man säkerställer god hepatocyt livskraft variera beroende på partiantal. Mängden kollagenas som används måste optimeras för varje nytt parti kollagenas5. Det är lämpligt att testa några massor av kollagenas och välja det bästa partiet innan du köper i bulk. Se till att vattnet är ultrarent och att pH-värdet är korrekt. Föroreningar i vattnet som järn- och järnjoner och fel pH kan påverka kollagenasaktiviteten, vilket då drastiskt kommer att påverka kvaliteten på de isolerade cellerna. Även om kollagenasbuffertåtercirkulation i detta protokoll kan vara valfritt, är det inte tillrådligt eftersom volymen kollagenasbuffert som behövs kommer att öka till >400 ml. Slutligen bör perfusionstryck och flödeshastighet ligga inom ett lämpligt område. Högt tryck och flödeshastighet kommer att leda till levercelldöd medan lågt tryck och flödeshastighet kommer att resultera i otillräckligt buffertflöde genom de mindre kärlen10. Under kalciumfri buffertperfusion kommer trycket initialt att stiga. Men vid kollagenasbuffertperfusion kommer trycket sedan långsamt att sjunka med tiden eftersom matsmältningen med kollagenas minskar flödesmotståndet. Om tryckfallet inte observerades kan matsmältningstiden förlängas efter behov. Eftersom IPS har den valfria trycksensorn är det möjligt att variera perfusatets flödeshastighet för att kompensera för tryckvariationer. På en annan anmärkning, även om spolning av kretsen med en oxygenator användes i vissa protokoll 2,5, fann vi att det inte var kritiskt för hepatocytens livskraft och utbyte. Således innehåller vår enhet inte en oxygenator.
I motsats till den vanliga praxisen för leverförtunning före resektion, involverar detta protokoll resektion av levern före matsmältningen. Tillvägagångssättet i detta protokoll har flera fördelar jämfört med vanlig praxis. För det första kan översmältning av levern undvikas. Beroende på kirurgens skicklighet kan leverresektion ta allt från 5-10 min. Efter vanlig praxis, även om perfusionen har stoppats, motsvarar detta fortfarande ytterligare 5-10 minuter där levern utsätts för kollagenas. Översmältning kan minska cellviabiliteten och minska hepatocytfästet och funktionen. För det andra kan detta tillvägagångssätt potentiellt minska hepatocytförlusten. Glissons kapsel är mindre benägna att riva när levern fortfarande är fjädrande före matsmältningen, jämfört med när den är mjuk och grötig efter matsmältningen. Slutligen möjliggör resektion av levern före matsmältningen möjligheten till kollagenascirkulation. Kollagenasåtercirkulation eliminerar förekomsten av misslyckade isoleringar på grund av otillräcklig volym kollagenas som framställs. Vårt tillvägagångssätt gör att matsmältningstiden kan förlängas vid behov. Det har också en mindre fördel att minska mängden kollagenas som behövs per isolering. Den största nackdelen med detta tillvägagångssätt är att det introducerar ett nytt problem med kateteravlossning halvvägs under perfusion, men som kan åtgärdas med några tekniska försiktighetsåtgärder. En annan skillnad är att detta protokoll inte involverar användning av densitetsgradient såsom Percoll. Genom att ta bort döda celler har Percoll rapporterats öka den slutliga livskraften hos celler med viss förlust av utbyte, från 20% -50% 16. Vår cellviabilitet är hög eftersom vi testar och väljer kollagenaspartier. Från vår erfarenhet ger vissa kollagenaspartier konsekvent lägre livskraft. Utan densitetscentrifugering kommer det att vara nödvändigt att undvika dåliga kollagenaspartier genom tidigare testning. För dem som inte har sådan frihet och måste överväga densitetsgradient, bör försiktighet ges under Percoll utspädning för att undvika val av hepatocyt subpopulationer med en något annorlunda metabolisk profil17,18.
Vårt tillvägagångssätt för att använda en IPS för primär råtta hepatocytisolering löser flera problem med befintliga perfusionsinställningar 1,2,5,6,7,8,9. Användning av sterila engångsrör sparar tid genom att ta bort behovet av att rengöra och desinficera perfusionsrör före och efter varje isolering. Det minskar brandrisken eftersom perfusionsslangen inte behöver fyllas med brandfarlig 70% etanol när den inte används för att bibehålla steriliteten. Risken för kontaminering på grund av felaktig desinfektion och lagring kan också elimineras. Viktigast av allt är att behovet av rutinmässigt byte av gamla slangar kan kringgås; denna process är viktig men är ofta komplicerad och tidskrävande. Tillsatsen av ett bubbelfilter till slangen nära katetern gör att bubblor kan fly innan de når katetern och förhindrar att luft passerar igenom när perfusionsbufferten tar slut. Användning av en silikonvärmarjacka som temperaturkontrollsystem möjliggör exakt och stabilt underhåll av perfusattemperaturen under matsmältningen, i motsats till förvärmda buffertar som kommer att svalna avsevärt med tiden. Dessutom är silikonvärmarjackan kompakt och kan enkelt underhållas, till skillnad från en glasjacka kopplad till en vattenbadscirkulator. Användning av övervakningssensorer för temperatur och tryck ersätter optimeringssteget före isolering. Temperaturvariationer kan förekomma under eller mellan experiment. Trycket (och därmed flödeshastigheten) kan också förändras på grund av problem med perfusionsrör. Placering av sensorer nära kanylen möjliggör mer exakt avläsning av buffertens temperatur som perfuserar i levern. Sensorlarm kan påminna användaren om att vidta korrigerande åtgärder. Den inspelade loggen möjliggör också felsökning. Användning av en speciell IV-kateter för kannulering förenklar kannulering av portalvenen. Till skillnad från andra typer av IV-kateter tillåter katetern som beskrivs här vätskekommunikation mellan kanylen och slangen i både dess punktliga och indragna nålläge på grund av ett hål vid sidan av nålen. Således kan kirurger använda färgförändring i levern som ett tecken på framgångsrik kannulering. Vid framgångsrik kannulering kan nålspetsen dras in bakom kateterspetsen för att förhindra återpiercing av portalvenen. Den indragna nålen kan också fungera som en grund för ligaturen för att säkra portalvenen på den mjuka kanylen och förhindra att den deformeras. Denna kateter kan manövreras med en hand; därför kan den icke-dominerande handen användas för att stödja portalvenen med pincett. Den kompakta integrerade designen gör att hela perfusionsanordningen kan sättas in i den laminära huven, vilket minskar risken för kontaminering och sparar utrymme. Detta är särskilt viktigt om djurproceduren ska utföras i en särskild djuranläggning där platstillgång kan vara en utmaning.
I jämförelse med tidigare rapporterade isoleringsprotokoll för råtta hepatocyt med användning av tvåstegs kollagenasperfusionsproceduren1, genererar de beskrivna förhållandena konsekvent högre cellutbyte på upp till 5 x 108 hepatocyter per isolering, cellviabilitet mellan 88% -94,8% och god hepatocytspecifik funktion.
Detta protokoll kan samtidigt användas för att isolera andra icke-parenkymala leverceller såsom Kupffer-celler, leverndotelceller och hepatiska stellatceller från samma råtta. Detta protokoll kan också modifieras för isolering av leverceller från möss genom att använda en mindre gauge IV-kateter för kannulering och minska perfusionsflödeshastigheten till ett område som är lämpligt för musarter6. Perfusionsförfarandet för möss kan förenklas genom att återställa levern efter matsmältningen.
IPS-enheten som används i detta experiment kan också användas för ex vivo leverperfusionsapplikation såsom experiment på levertransplantation samt decellularisering av gnagare och kasserade mänskliga lever19,20. IPS har en fördel där levern måste perfuseras under långa perioder eftersom IPS kan övervaka perfusionsförhållanden i realtid och tillåta avbrytande av perfusionen efter avslutad antingen automatiskt eller manuellt med fjärrkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Zhou Yan och Hanry Yu förklarar konkurrerande intressen eftersom de har eget kapital i Vasinfuse, som tillverkar och marknadsför det integrerade perfusionssystemet. Hanry Yu äger andelar i Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate och Synally Futuristech som inte har några konkurrerande intressen med den information som rapporteras här.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiologiska institutet i Singapore (R-714-106-004-135); och Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Projektnummer IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 och MedCaP-LOA-18-02) finansiering till Hanry Yu. Ng Chan Way är forskare vid National University of Singapore. Vi vill tacka Confocal Microscopy Unit &Flow Cytometry Unit vid National University of Singapore för hjälp och råd inom hepatocytrenhetsanalys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
