Summary
Her præsenterer vi en protokol til genredigering i primære menneskelige T-celler ved hjælp af CRISPR Cas Technology til at ændre CAR-T-celler.
Abstract
Adoptivcellebehandlinger ved hjælp af kimær antigenreceptor T-celler (CAR-T-celler) har vist bemærkelsesværdig klinisk effekt hos patienter med hæmatologiske maligniteter og er i øjeblikket ved at blive undersøgt for forskellige solide tumorer. CAR-T-celler genereres ved at fjerne T-celler fra en patients blod og konstruere dem til at udtrykke en syntetisk immunreceptor, der omdirigerer T-cellerne til at genkende og eliminere måltumorceller. Genredigering af CAR-T-celler har potentiale til at forbedre sikkerheden af de nuværende CAR-T-celleterapier og yderligere øge effekten af CAR-T-celler. Her beskriver vi metoder til aktivering, udvidelse og karakterisering af human CRISPR-konstruerede CD19-instruerede CAR-T-celler. Dette omfatter transduktion af CAR lentiviral vektor og brug af enkelt guide RNA (sgRNA) og Cas9 endonuclease til at målrette gener af interesse i T-celler. De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes universelt på andre CAR-konstruktioner og målrette gener ud over dem, der anvendes til denne undersøgelse. Desuden diskuterer denne protokol strategier for gRNA design, bly gRNA udvælgelse og mål gen knockout validering til reproducerativt opnå højeffektive, multiplex CRISPR-Cas9 engineering af kliniske grade menneskelige T-celler.
Introduction
Kimær antigen receptor (CAR)-T celleterapi har revolutioneret området for adoptivcellebehandlinger og kræft immunterapi. CAR-T-celler er manipuleret T-celler udtrykker en syntetisk immunreceptor, der kombinerer en antigen-specifik enkeltkæde antistof fragment med signalering domæner stammer fra TCRzeta kæde og costimulatory domæner nødvendige og tilstrækkelige til T-celle aktivering og co-stimulation1,2,3,4 . Fremstillingen af CAR-T-celler starter med at udtrække patientens egne T-celler, efterfulgt af ex vivo viral transduktion af CAR-modulet og udvidelse af CAR-T-celleproduktet med magnetiske perler, der fungerer som kunstigt antigen, der præsenterer cellerne5. Udvidede CAR-T-celler tilføres patienten igen, hvor de kan indpode, eliminere måltumorceller og endda fortsætte i flere år efter infusion6,7,8. Selvom CAR-T celleterapi har resulteret i bemærkelsesværdige responsrater i B-celle maligniteter, klinisk succes for faste tumorer er blevet udfordret af flere faktorer, herunder dårlig T-celle infiltration9, en immunosuppressiv tumor mikromiljø10, antigen dækning og specificitet, og CAR-T celle dysfunktion11,12 . En anden begrænsning af nuværende CAR-T celleterapi omfatter brugen af autologe T-celler. Efter flere runder af kemoterapi og høj tumor byrde, CAR-T celler kan være af dårlig kvalitet i forhold til allogene CAR-T produkter fra raske donorer ud over den tid og udgift, der er forbundet med fremstilling af autologe CAR-T celler. Genredigering af CAR-T-celleproduktet fra CRISPR/Cas9 repræsenterer en ny strategi for at overvinde de nuværende begrænsninger i CAR-T-cellerne13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 er et tokomponentsystem, der kan bruges til målrettet genomredigering ipattedyrcellerne 18,19. Crispr-associerede endonuclease Cas9 kan fremkalde stedspecifikke dobbeltstrengspauser styret af små RNA'er gennem baseparring med mål-DNA-sekvens20. I mangel af en reparation skabelon, er dobbelt-streng pauser repareret af den fejlbehæftede nonhomologous ende sammenføjning (NHEJ) vej, hvilket resulterer i frameshift mutationer eller for tidlig stop codons gennem indsættelse og sletning mutationer (INDELs)19,20,21. Effektivitet, brugervenlighed, omkostningseffektivitet og muligheden for multiplex-genomredigering gør CRISPR/Cas9 til et effektivt værktøj til at øge effektiviteten og sikkerheden af autologe og allogene CAR-T-celler. Denne fremgangsmåde kan også bruges til at redigere TCR-styrede T-celler ved at erstatte CAR-konstruktionen med en TCR. Derudover kan allogene CAR-T-celler, der har begrænset potentiale til at forårsage graft versus værtssygdom, også genereres ved genredigering af TCR, b2m og HLA locus.
I denne protokol viser vi, hvordan CRISPR-engineering af T-celler kan kombineres med viral vektormedieret levering af CAR-Transgene for at generere genom-redigerede CAR-T-celleprodukter med forbedret effektivitet og sikkerhed. Der vises et skemadiagram over hele processen i figur 1. Ved hjælp af denne tilgang har vi demonstreret højeffektiv gen knockout i primære menneskelige CAR-T-celler. Figur 2A beskriver i detaljer tidslinjen for hvert trin til redigering og fremstilling af T-celler. Strategier for guide RNA design og knockout validering er også drøftet for at anvende denne tilgang til forskellige mål gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human T-celler blev indkøbt gennem University of Pennsylvania Human Immunology Core, som opererer under principperne i Good Laboratory Practice med etablerede standard driftsprocedurer og / eller protokoller for prøvekvittering, behandling, frysning og analyse i overensstemmelse med MIATA og University of Pennsylvania etiske retningslinjer.
1. Lentiviral vektor produktion
BEMÆRK: De virale produkter er blevet gjort replikations-defekte ved adskillelse af emballagekonstruktioner (Rev, gag / pol / RRE, VSVg og transfer plasmid) til fire separate plasmider, hvilket i høj grad reducerer sandsynligheden for rekombinationshændelser, der kan resultere i replikationskomplikationskomplikationskombinus.
- Forbered HEK293T celler en dag før transfektionen. Plade ca. 6 x 106 celler i T150-kulturbeholdere i 30 mL standardkulturmedier (kaldet R10:RPMI 1640 suppleret med 10% føtal kalveserum, 10 mM HEPES, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamin) og inkuberer natten over ved 37 °C. 18-24 timer senere, cellerne skal være 60-70% sammenvandrede og se sunde ud (dendritiske fremskrivninger og ensartet fordeling over kolben). Hvis cellerne ser sunde ud, skal du gå videre til trin 1.2.
- Transfectionblandingen, der indeholder lipofectionreagens (96 μL), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) emballageplasmider og 15 μg udtryk plasmid (CD19bbzFv klonet i pTRPE).
- For hver transfectionreaktion skal der forberedes et rør, der indeholder 1 mL af minimale minimale medier med reduceret serum plus de fire plasmider, der er beskrevet i trin 1.2, samt et rør, der indeholder 2 mL af reduceret serum minimale essentielle medier plus 90 μL fedtsugningsreagens. Kombiner disse to løsninger ved dropwise tilsætning af 1 mL plasmid mix til 2 mL lipofection reagens mix. Sørg for kraftigt at blande opløsningen ved at pipetter op og ned flere gange. Inkuber opløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- I mellemtiden aspirere medierne fra HEK293T celle kolbe og forsigtigt vaske celler med 10 mL af reduceret serum minimal væsentlige medier og aspirere igen.
- Skånsomt tilsættes omskæringsblandingen (3 mL) fra trin 1.2.1 til det nederste hjørne af cellekulturkolbe ved hjælp af en 5 mL serologisk pipette. Vip forsigtigt kolben for jævnt at fordele transfectionblandingen på tværs af cellekulturkolben og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Sørg for ikke at forstyrre cellemonomeren. Efter en inkubation på 10 min tilsættes 35 mL R10-medier, og kolbe returneres til inkubatoren i 24 timer.
- Efter 24 timer opsamles supernatanten fra HEK293T-cellekulturflaskerne og overføres til 50 mL koniske rør. Tilsæt frisk R10 til HEK29T-cellerne og læg cellerne tilbage i inkubatoren i yderligere 24 timer. Skru ned for supernatanten (300 x g) for at fjerne cellerester og filtrere supernatanten gennem et 0,45 μm filter.
- Koncentrer filtratet fra trin 1.3 ved høj hastighed ultracentrifugering (25.000 x g i 2,5 h eller 8000 x g natten over (O/N)). 24 timer viruspillen ved 4 °C, mens 48 timer er puljet.
- Gentag trin 1.3-1.4 for 48 timers indsamling og kombinere 24 timer og 48 h virus samlinger. Pellets fra 48 h indsamling vil indeholde en kombineret høst af lentivirus.
- Resuspend viral pellet i ca 1 mL af kold R10 og aliquot i 100 μL hætteglas. Rist straks aliquoterne ved hjælp af tøris, og opbevar den ved -80 °C.
- Beregn funktionel viral titer i transfremkaldende enheder/mL ved at transducingere en fast mængde CD3/CD28 perleaktiverede primære menneskelige T-celler med serielle fortyndinger af den lentiviral supernatant. Mål CAR-Transduktion efter 72 timer ved flowcytometri.
- Plet til den CD19-styrede CAR med et anti-FCM63 scFv antistof. For andre kimær antigen receptorer, plet ved hjælp af fluorophore-mærket rekombinant protein, der er specifik for CAR scFv. Virus fortynding, der genererer under 20% CAR positive celler ved flow-cytometri er den mest præcise fortynding til at beregne viral titer fra. Over 20% CAR-positive celler øges chancen for, at hver positiv celle overføres to gange, hvilket resulterer i en undervurdering af antallet af transfremkaldende partikler. Beregn de transfremkaldende enheder pr. ML(TU/mL ) = (antal celler transduced x procent CAR positive celler x fortyndingsfaktor)/(transduktionsvolumen i mL).
2. Design af sgRNAs og genforstyrrelser i primære menneskelige T-celler
- Design af CRISPR SGRNA'er
BEMÆRK: Flere servere og programmer letter udformningen af målspecifikke sgRNA'er. I denne protokol blev CRISPR-sgRNAs designet ved hjælp af CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) og gRNA-designportalen fra Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- For hvert målgen skal du designe seks til ti sgRNA-sekvenser for at målrette tidlige kodnings exonsekvenser.
BEMÆRK: SgRNA bør have en høj on-target effekt og lav off target effekt. Hver maskinlæringsalgoritme til bestemmelse af sgRNA-effekten fungerer lidt anderledes. Derfor anbefales det at sammenligne flere sgRNA-designværktøjer og kuratere en liste over seks til ti sgRNA til screening.
- For hvert målgen skal du designe seks til ti sgRNA-sekvenser for at målrette tidlige kodnings exonsekvenser.
- Genforstyrrelser i primære menneskelige T-celler
- Få autologe perifere blod mononukleare celler (PBMC's) fra raske frivillige donorer. En skematisk tidslinje for protokollen er beskrevet i figur 2A og beskrevet nedenfor.
- Isoler CD4+ og CD8+ T-celler ved hjælp af kommercielt tilgængelige CD4- og CD8-markeringssæt.
- Kombiner CD4+ og CD8+ T-celler i et 1:1-forhold og inkuber natten over ved 3x106 celler/mL i R10 suppleret med 5 ng/mL huIL-7 og huIL-15 hver. Tilføjelse af IL-7 og IL-15 anbefales, da de er kendt for at fremme en central hukommelse fænotype og CAR-T celler udvidet med IL-7 og IL-15 har overlegen anti-tumor effekt i forhold til IL-2 udvidet CAR-T celler22,23,24.
- Den næste dag, tælle T-celler og centrifuge 5-10 x 106 celler ved 300 x g i 5 min. Kassér alle supernatant og vask cellepillen i reduceret serum minimal væsentlige medier. Brugpillen i 100 μL kerneopløsning i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger (Materialetabel).
- Under vask af cellerne skal ribonukleoproteinkomplekset (RNP) tilberedes med Cas9 og gRNA ved at inkubere 10 μg Cas9-nuklease med 5 μg sgRNA i 10 min ved stuetemperatur (RT). Molarforholdet cas9 til sgRNA er 1:2.4. En mock kontrol, der indeholder Cas9 og elektroporation forstærker, men ingen sgRNA, anbefales.
BEMÆRK: Multiplex genredigering kan udføres på dette trin ved at gøre RNP komplekser for hvert mål separat og kombinere dem med celler på det tidspunkt nucleofection som beskrevet i det næste trin. At vælge reagenserne til at samle RNP-komplekset er nøglen til at få høj KO-effektivitet. For eksempel har Cas9-nukleaser fra forskellige leverandører varierende off-target-effekter, og kemisk modificeret gRNA reducerer toksiciteten for T-celler, hvilket øger KO-effektiviteten. - De opslæmlede celler kombineres fra trin 2.2.4 med RNP-komplekset fra trin 2.2.5 og tilsættes 4,2 μL af 4 μM elektroporation forstærker (ssDNA oligonucleotid, der ikke er homolog til det menneskelige genom). Bland godt og overfør til elektroporation cuvettes. Undgå bobler, da de forringer elektroporationens effektivitet.
- Elektroopratceller ved hjælp af pulskoden EH111. Efter elektroporering inkuberes celler i R10 suppleret med 5 ng/mL huIL-7 og huIL-15 ved 5x106 celler/mL ved 30 °C i 48 timer i 12-brøndsplader. Efter 48 timer skal du fortsætte med T-celleaktivering og udvidelse.
3. T-celleaktivering, lentiviral transduktion og ekspansion
BEMÆRK: Til screening af sgRNA'er er lentiviral transduktion (trin 3.2) i CAR-konstruktionen ikke nødvendig.
- T-celler, der er elektroporated, og fortynd dem til en koncentration på 1 x 106 celler/mL ved hjælp af varm R10 suppleret med 5 ng/mL huIL-7 og huIL-15. Aktiver celler ved at tilføje anti-CD3/anti-CD28 monoklonale antistof belagt magnetiske perler i et forhold på 3 perler pr levende T-celle.
BEMÆRK: Elektroporation forårsager betydelig celledød, hvilket resulterer i ca. 60 % ± 15 % levedygtige celler sammenlignet med ikke-elektropotatane celler. Brug en levende / død celle tæller til at bestemme den passende mængde af perler. Cellerne overføres til 37 °C, og inkuber natten over. - Efter stimulering fra den ene dag til den anden, transduce CRISPR-manipulerede T-celler med lentiviral supernatant fra trin 1. Der tilsættes det relevante volumen baseret på den virale titer, der er beregnet i trin 1.7 for at opnå en mangfoldighed af infektion (MOI) på 3 og inkuberes celler i 72 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Viruspillen, der er suspenderet igen i R10, tilsættes simpelthen oven på cellerne i henhold til cellekoncentrationen, viral titer og den ønskede MOI. - Efter 72 timer fodres celler med 50% af det nuværende kulturvolumen R10, der indeholder 10 ng/mL huIL-7 og huIL-15, og de returneres til inkubatoren i yderligere 48 timer. Forstyr ikke de klynger, der er dannet mellem T-cellerne og perlerne.
- Efter 48 timer fjernes perlerne fra cellerne ved forsigtigt at genoplive celleperleblandingen efterfulgt af magnetisk adskillelse. Tæl celler efter fjernelse af perle og bring cellerne i koncentration på 0,8 x 106 celler/mL ved hjælp af R10 suppleret med 5 ng/mL huIL-7 og huIL-15. Efter af-beading skal cellenumrene svare til celletallet på dag 1 før elektroporation (Figur 2B).
- Efter 24 timer tælle celler og foder til en koncentration på 1 x 106 celler / mL med R10 + 5 ng/mL huIL-7 og huIL-15. Gentag dette hver 24 timer, indtil vækst kinetika og cellestørrelse demonstrere celler har hvilet fra stimulation.
BEMÆRK: Fra dette punkt fordobles T-celler ca. hver 24 timer. T-celle gennemgår normalt 5-7 befolkning fordoblinger og har et cellevolumen på ca. 300 ± 50 fL, når de er udhvilet. - Når udhvilet, spin ned CRISPR-manipuleret CAR-T celler og genbruges i fryse medier (1:1 X-Vivo og FBS plus 10% DMSO) for cryopreservation. CAR-T-celler, der anvendes, skal optøs og hviles ved 37 °C i 16 timer før et forsøg.
BEMÆRK: Hold ca. 10x106 celler reserveret til måling af knockout effektivitet og CAR integration. Forventede befolkningsfordoblinger og volumenændringer under udvidelsen er blevet vist i figur 2B, 2C. Derudover viser figur 2D niveauer af CAR-udtryk på både Mock- og genredigeringerede CAR-T-celler.
4. CRISPR-effektivitet
- Genomisk DNA-udvinding og målgenforstærkning
- Fra hver screening kultur, spin ned 3-5 x 106 T-celler. Celler kan enten fryses ned som en tør pellet eller man kan fortsætte med genomisk DNA-ekstraktion. På tidspunktet for DNA-ekstraktionen, genanvende pellets i 200 μL af Fosfat Buffer Saltvand (PBS) og udtrække genomisk DNA fra elektroporated celler ved hjælp af en standard DNA ekstraktion kit i henhold til fabrikanten instruktion.
- Kort sagt, lyse celler med proteinase K og indlæse lysat på en DNA bindende kolonne. Under centrifugering er DNA bindende for membranen, mens forurenende stoffer vil passere igennem. Efter to vasketrin for at fjerne de resterende forurenende stoffer og enzymhæmmere, elute DNA i vand.
- Forstærk 200-300 ng genomisk DNA ved hjælp af standard PCR-blanding, der indeholder DNA-polymerase, tilbehør proteiner, salte og dNTPs og 10 μM frem og omvendt primere flankerer regionen af den påtænkte dobbelt-streng pause.
BEMÆRK: For PCR primer design, reference genomisk sekvens (kan findes ved hjælp af http://www.ensemble.org) flankerer gRNA cut site er indtastet i NCBI primer blast værktøj (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). PCR primere skal være designet således, at amplicon har en målstørrelse på 600-700bp. Denne længde gør det muligt at designe sekventeringsgrundere, der binder sig inden for ampliconen med tilstrækkelig afstand fra gRNA-cutstedet (mindst 150 bp) for at sikre god sekventeringskvalitet omkring cas9-inducerede indels (se 4.2.1). Hver gRNA kræver en unik primer par, medmindre gRNA cut sites er i nærheden. - Kør hele PCR-produktet på en 1% agarosegel og rengør ampliconen ved hjælp af et standard agarose gelrensningssæt.
BEMÆRK: Processen med at bestemme den optimale Tm til PCR kan tage flere runder fejlfinding. Dette skyldes, at KO-sekvensen har indels, og målgenet bør primes til sekventering, hvor der normalt ikke ville være indels 100 bp opstrøms eller nedstrøms af cutstedet. Dette kan variere meget på grund af indels som følge af ikke-homologe ende sammenføjning. Design indlejret sekventering primere til PCR primere og øge koncentrationen af produkt sekventeret kan fjerne problemer med sekventering.
- Fra hver screening kultur, spin ned 3-5 x 106 T-celler. Celler kan enten fryses ned som en tør pellet eller man kan fortsætte med genomisk DNA-ekstraktion. På tidspunktet for DNA-ekstraktionen, genanvende pellets i 200 μL af Fosfat Buffer Saltvand (PBS) og udtrække genomisk DNA fra elektroporated celler ved hjælp af en standard DNA ekstraktion kit i henhold til fabrikanten instruktion.
- Sekventering og registrering af indel
- Design sekventering primere, der binder sig til gel renset amplicon og sende mock og knockout amplicons for Sanger sekventering. Når rækkefølgen er færdig, uploade sporfiler til Desktop Genetics software (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) for TIDE analyse.
- For sekventering primer design, indtaste sekvensen af PCR amplicon i en standard primer design software (NCBI, Eurofins eller andre offentligt tilgængelige værktøjer). Designsoftwaren vil foreslå flere primersekvenser, der er egnede til sekvensering.
- Vælg frem og omvendte primere, der binder i ampliconen mindst 150 bp opstrøms eller nedstrøms af gRNA cut site for at sikre god sekventering kvalitet omkring indels. Sekvenseringskromatogrammet vil blive brugt i 4.2 til TIDE-analyse, derfor er det vigtigt, at sekventeringskvaliteten er god til nøjagtig nedbrydning af indel (se Hultquist et al.) 25.
- Brug TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) analyse til at opdage knock out (KO) effektivitet på genomisk niveau26. Algoritmen rekonstruerer præcist spektret af indels fra sekvenssporene og beregner R2-værdier, hvilket afspejler godhed af pasform efter ikke-negativ lineær modellering af TIDE-softwaren.
- Design sekventering primere, der binder sig til gel renset amplicon og sende mock og knockout amplicons for Sanger sekventering. Når rækkefølgen er færdig, uploade sporfiler til Desktop Genetics software (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) for TIDE analyse.
- Målret mod påvisning af protein
- For målgener, hvis genprodukt udtrykkes på overfladen af T-celler, skal ca. 1 x 105 celler pletteres fra hver screeningskultur med et fluorokromt antistof, der er specifikt for målproteinet. Sammenlign udtryksniveauer for målproteinet mellem mock control- og knockoutgrupperne efter flowcytometri som vist i figur 3A,3B.
- For målgener, hvis genprodukt udtrykkes intracellulært, skal du lyse ca. 3 x 106 millioner celler pr. screeningsgruppe i lysisbuffer og følge standardprotokoller for SDS-PAGE og western blotting. Alternativt kan overflade eller intracellulær flowcytometri bruges til at sondere for målproteinet.
5. Overvågning off-target effekter ved hjælp af iGUIDE - Bibliotek forberedelse, DNA sekventering, og analyse
BEMÆRK: iGUIDE-teknik giver mulighed for påvisning af steder af Cas9 guidet kavalergang og kvantificere fordelingen af disse DNA dobbeltstrengede pauser.
- Udfør iGUIDE som beskrevet af Nobles et al.21. Off-target-effekterne af sgRNA rettet mod TRAC locus ved hjælp af iGUIDE-teknikken er blevet vist i Stadtmauer et al., 202013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver her en protokol til genetisk manipulere T-celler, der kan bruges til at generere både autologe og allogene CAR-T-celler, samt TCR omdirigeret T-celler.
Figur 1 indeholder en detaljeret beskrivelse af de faser, der er involveret i processen med fremstilling af CRISPR-redigerede T-celler. Processen begynder med at designe sgRNA til genet af interesse. Når sgRNA er designet og syntetiseret de bruges derefter til at gøre RNP komplekser med den relevante Cas protein. T-celler er isoleret fra enten en sund donor eller en patientaferese, og RNP-komplekser leveres enten ved elektroporation eller nukleofection. Efter redigering aktiveres og transducedes T-cellerne med den lentivirale vektorkodning til CAR- eller TCR-konstruktionen. Efter aktivering udvides T-celler i kultur og kryopreserveret til fremtidige undersøgelser. Den detaljerede protokol, der følges i laboratoriet, er beskrevet i figur 2. Under udvidelsen spores populationen fordobling og volumenændringer i hele protokollen, og et eksempel er vist i figur 2B og C for både mock og redigerede CAR-T-celler. Figur 2B, C, viser, at ko af genet af interesse ikke forårsagede nogen væsentlige ændringer i spredning og aktivering under udvidelsen. Disse resultater afhænger imidlertid af, at målgenet redigeres og derfor måske eller måske ikke fører til ændringer i spredning og ekspansion.
Når cellerne er kryopreserveret, niveauer af CAR udtryk bestemmes også for yderligere funktionelle undersøgelser. I dette tilfælde, som vist i figur 2D kontrollerede vi CD19 CAR-udtrykket på både Mock-redigerede og KO CAR-T-cellerne og så ingen væsentlige ændringer. Dette vil igen afhænge af genet af interesse, der redigeres. Endelig kan KO-effektiviteten bestemmes ved hjælp af flere teknikker såsom flowcytometri og vestlig blot til påvisning af proteinniveau og også Sanger sekventering til påvisning af genniveau af KO. Figur 3A og 3B viser repræsentative flowcytometriområder, hvor PDCD1 og TRAC locus er målrettet ved hjælp af sgRNA, hvilket viser en effektivitet på 90% for PDCD1 sgRNA og 98% for TRAC sgRNA på tværs af flere sunde donorer. Således kan denne protokol opnå høj effektivitet knockout med minimal tab i levedygtighed.
Figur 1. Skematisk diagram, der viser T-celleredigering ved hjælp af CRISPR Cas9-teknologi og fremstilling af primære menneskelige CAR-T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Udvidelse af redigerede CAR-T-celler og deres befolkning fordobles. (A) Tidslinje for CRISPR-redigering og fremstilling i primære menneskelige CART-celler. (B) Population Doubleings in Mock og CRISPR redigerede CD19 CAR-T-celler målt ved hjælp af en Coulter Counter under udvidelsen af CAR-T-cellerne (n=3 raske donorer; KO=knockout) (C) Cellestørrelse (μm3) målt ved hjælp af en Coulter Counter under udvidelsen af CAR-T-cellerne (n=3 raske donorer). (D) Repræsentativ flow cytometri plots viser CAR farvning og gennemsnit i flere donorer viser CAR udtryk i både mock og redigeret CAR-T celler. CAR udtryk blev opdaget ved hjælp af en anti-idiotype antistof konjugeret til en fluorophore og gated på lymfocytter / Singlets / Live Cells (n = 3 raske donorer, UTD = uoversat,). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Karakterisere KO-effektivitet i redigerede CAR-T-celler ved hjælp af flowcytometri. (A) Repræsentativ flow cytometri plots viser PD-1 farvning og gennemsnit i flere donorer viser PD-1 KO effektivitet ved hjælp af en gRNA rettet mod TRAC locus i mock og redigerede CAR-T celler. PD-1-ekspression blev detekteret ved hjælp af PD-1 antistof (Clone EH12.2H7), der er bøjet for fluorophore og gated på lymfocytter/singlets/liveceller (n=3 raske donorer). Fejllinjer angiver middel±standardfejl i middelværdien (SEM). p<0,0001, *** p=0,0005, ** p=0,001 ved Welch's t-test. (B) Repræsentativ flow cytometri plots viser CD3 farvning og gennemsnit i flere donorer viser CD3 KO effektivitet ved hjælp af en gRNA rettet mod TRAC græshoppe i mock og redigeret CAR-T celler. CD3-udtryk blev detekteret ved hjælp af CD3-antistof (Clone OKT3), der er konjugeret til fluorophore og gated på lymfocytter/singlets/live cells (n=3 raske donorer). Fejllinjer angiver middel±standardfejl i middelværdien (SEM). p<0,0001, *** p=0,0005, ** p=0,001 ved Welch's t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi tilgange til genredigering af CAR-T-celler ved hjælp af CRISPR Cas9-teknologi og fremstiller produkter til yderligere test for funktion og effektivitet. Ovenstående protokol er blevet optimeret til udførelse af CRIPSR genredigering i primære menneskelige T-celler kombineret med engineering T-celler med kimær antigen receptorer. Denne protokol giver mulighed for høj knockout effektivitet med minimal donor-til-donor variabilitet. Modifikation ved hjælp af CRISPR kan forbedre både effekten og sikkerheden af CAR-T-celler ved at eliminere receptorer, der hæmmer T-cellers funktion og fremstiller allogene CAR-T-celler.
For små ekspansion protokoller, begyndende med 106 celler per gruppe fører til omkring 5006 CAR-T celler med et gennemsnit på 6 befolkning fordoblinger i en sund normal donor. Dette kan dog variere afhængigt af, om genet af interesse påvirker T-celleaktivering, transduktion og spredning. Fem hundrede millioner celler er tilstrækkelige til at bekræfte KO effektivitet, in vitro assays og in vivo assays. Der er forskellige variationer i protokollen, hvor CRISPR-redigering kan udføres før eller efter aktivering og CAR-Transduction. Ren et al beskrevet en sådan variation, hvor celler er redigeret efter perle stimulation og CAR-Transduction15. Fordelen ved CRISPR-redigering før perlestimulering er lavere cellemængder skal redigeres, da T-cellerne endnu ikke har spredt sig, hvilket gør proceduren mindre tidskrævende og mere omkostningseffektiv. Derudover kan det oversættes direkte til klinikken at udføre redigering på forhånd. Faktisk er mange trin i denne protokol blevet informeret af, hvad der kan vedtages i klinikken, hvilket øger konsistensen af KO-effektiviteten, når man flytter fra bænk til seng.
Der er flere variabler, der kan vælges på hvert trin i protokollen. T-celler kan f.eks. elektroporated eller nucleofected. Mens begge opnår sammenlignelige KO effektivitetsgevinster, i vores erfaring ved hjælp af nucleofector har højere levedygtighed efter redigering og dermed foretrækkes. Brug af elektroporatoren kan dog vise sig at være mere omkostningseffektiv i det lange løb. Begge disse udstyr bruges til små T-celleudvidelser. For udvidelser i stor skala og klinisk skala skal protokollerne optimeres til at udføre redigering og kræver forskelligt udstyr til nucleofection. Der er flere teknologiske platforme, der kan bruges til både små og storstilet redigering og udvidelse afhængigt af brugerens behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Vi anerkender Human Immunology Core for at levere normale donor T-celler og Flow Cytometry Core ved University of Pennsylvania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
