Summary
Qui, descriviamo le procedure sviluppate nel nostro laboratorio per la preparazione di polveri di cristalli di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED).
Abstract
Viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di campioni di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED). MicroED è stato sviluppato per risolvere strutture di proteine e piccole molecole utilizzando apparecchiature standard di criomicroscopia elettronica (crio-EM). In questo modo, piccole molecole, peptidi, proteine solubili e proteine di membrana sono state recentemente determinate ad alte risoluzioni. I protocolli sono presentati qui per la preparazione di griglie di farmaci a piccole molecole usando il farmaco carbamazepina come esempio. Vengono presentati protocolli per lo screening e la raccolta dei dati. Ulteriori passaggi nel processo complessivo, come l'integrazione dei dati, la determinazione della struttura e il perfezionamento, sono presentati altrove. Il tempo necessario per preparare le griglie di piccole molecole è stimato in meno di 30 minuti.
Introduction
La diffrazione elettronica a microcristalli (MicroED) è un metodo di criomicroscopia elettronica (cryo-EM) per determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni sub-micrometriche 1,2. I cristalli vengono applicati alle griglie standard del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e congelati immergendosi nell'etano liquido o nell'azoto liquido. Le griglie vengono quindi caricate in un TEM che opera a temperature criogeniche. I cristalli si trovano sulla griglia e vengono schermati per la qualità iniziale della diffrazione. I dati MicroED a rotazione continua vengono raccolti da un sottoinsieme dei cristalli schermati, dove i dati vengono salvati utilizzando una fotocamera veloce come un filmato3. Questi filmati vengono convertiti in un formato cristallografico standard ed elaborati in modo quasi identico come un esperimento di cristallografia a raggi X4.
MicroED è stato originariamente sviluppato per studiare i microcristalli proteici 1,2. Un collo di bottiglia nella cristallografia delle proteine sta crescendo cristalli grandi e ben ordinati per i tradizionali esperimenti di diffrazione dei raggi X di sincrotrone. Poiché gli elettroni interagiscono con la materia ordini di grandezza più forte dei raggi X, i limiti della dimensione del cristallo necessari per produrre la diffrazione rilevabile sono considerevolmente più piccoli5. Inoltre, il rapporto tra eventi di scattering elastici e anelastici è più favorevole per gli elettroni, suggerendo che dati più utili possono essere raccolti con un'esposizione complessiva inferiore5. I costanti sviluppi hanno permesso di raccogliere dati MicroED dai microcristalli più impegnativi 6,7,8,9.
Recentemente, MicroED ha dimostrato di essere un potente strumento per determinare le strutture di farmaci a piccole molecole da materiali apparentemente amorfi10,11,12,13. Queste polveri possono provenire direttamente da una bottiglia di reagente acquistato, da una colonna di purificazione o anche dalla frantumazione di una pillola in una polvere fine10. Queste polveri appaiono amorfe ad occhio, ma possono essere interamente composte da nanocristalli o semplicemente contenere tracce di depositi nanocristallini in una maggiore frazione amorfa non cristallina. L'applicazione del materiale alla griglia è facile e le fasi successive di identificazione dei cristalli, screening e raccolta dei dati potrebbero anche essere automatizzate nel prossimo futuro14. Mentre altri possono utilizzare metodi diversi per la preparazione dei campioni e la raccolta dei dati, qui sono dettagliati i protocolli sviluppati e utilizzati nel laboratorio Gonen per la preparazione di campioni di piccole molecole per MicroED e per la raccolta dei dati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di campioni di piccole molecole
- Trasferire una piccola quantità (0,01 - 1 mg) di polvere, liquido o solidi in un piccolo flaconcino o tubo.
- Per i campioni già in polvere, sigillare il tubo usando il tappo fino a quando il campione è necessario. Essiccare i campioni liquidi in polveri prima di tentare di utilizzare il metodo 1 (fase 3) o 2 (fase 4).
NOTA: i campioni disciolti nel liquido possono utilizzare il metodo 3 (5.X) riportato di seguito.
2. Preparazione delle reti TEM
NOTA: alcuni TEM con sistemi di caricamento automatico richiedono che le griglie vengano tagliate e inserite in una cassetta prima di essere caricate nella colonna TEM. Il clipping comporta il fissaggio fisico della griglia TEM da 3 mm in un anello metallico che il caricatore automatico può manipolare. Questo passaggio e i passaggi successivi possono essere eseguiti utilizzando griglie TEM normali o griglie TEM che sono state ritagliate. Per questi esperimenti, è spesso più facile manipolare le griglie se sono state tagliate in anticipo.
- Avvolgere la pellicola di plastica attorno a un'estremità di un vetrino di copertura.
- Posizionare le griglie TEM sulla pellicola sulla parte superiore della diapositiva di copertura con il lato in carbonio rivolto verso l'alto. Identifica i due lati della griglia sotto una luce. Il lato in rame brilla e appare metallico, mentre il lato in carbonio appare di un colore marrone (Figura 1C,D). Per le griglie ritagliate, il lato in carbonio deve essere rivolto verso la faccia piatta dell'anello della clip.
- Posizionare la diapositiva con le griglie nella camera di scarico del bagliore. Scaricare il coperchio per circa 30 s utilizzando l'impostazione negativa a 15 pA. Conservare le griglie sul vetrino di copertura all'interno di una piastra di Petri di vetro rivestita con carta da filtro prima di aggiungere il campione alle griglie.
3. Applicazione del campione alle griglie creando una polvere fine omogenea (Metodo 1)
- Rimuovere una griglia TEM scaricata a bagliore dalla capsula di Petri coperta usando una pinzetta. Posizionare la griglia su una carta da filtro circolare con il lato in carbonio rivolto verso l'alto.
- Utilizzando una piccola spatola, rimuovere un misurino molto piccolo di polvere (circa 0,1 mg) e posizionarlo su un piccolo vetrino quadrato proprio accanto alla griglia TEM sulla carta da filtro. Posizionare un altro piccolo vetrino quadrato o copricopertina sopra la polvere.
- Con le dita, strofinare delicatamente i due vetrini di vetro insieme per ottenere una polvere fine.
- Inclinare i coprivetrini e posizionarli appena sopra la griglia TEM sulla carta da filtro e continuare a strofinare i vetrini insieme, appena pochi cm sopra la griglia TEM scarica a bagliore (Figura 1).
- Osservare per vedere se la polvere sta cadendo verso la griglia. Scoprire la polvere finemente macinata rimuovendo uno dei due vetrini di vetro. Spazzolare delicatamente la polvere fine dal vetrino usando un pezzo di carta da filtro sulla griglia TEM (Figura 1).
4. Applicazione del campione alle griglie applicando il metodo "scuotimento" (Metodo 2)
- Prendi una griglia usando un paio di pinzette e lasciala cadere nella fiala o nel tubo del campione di polvere. Chiudere il flaconcino utilizzando il tappo di plastica per assicurarsi che nessun materiale fuoriesca quando viene agitato.
- Afferrando il flaconcino in mano, agitare il flaconcino in modo tale che la polvere e la griglia si muovano entrambe per circa 10 - 30 s.
- Svuotare il contenuto del flaconcino su una carta da filtro circolare. Afferrando la griglia su un bordo, toccare delicatamente il bordo della griglia sulla carta da filtro per rimuovere il materiale in eccesso dalla griglia.
NOTA: A seconda del tipo di flaconcino e delle dimensioni, è possibile utilizzare anche una pinzetta per rimuovere la griglia TEM senza svuotare il contenuto.
5. Applicazione del campione alle griglie utilizzando il metodo dell'evaporazione (metodo 3)
- Posizionare una griglia (ritagliata o meno) al centro di un pezzo circolare di carta da filtro con il lato in carbonio rivolto verso l'alto e il lato in rame rivolto verso il basso.
- Utilizzando una siringa a tenuta di gas da 10 μL, applicare una piccola goccia (circa 1 - 3 μL) di composto disciolto sul lato carbonio della griglia.
- Spostare delicatamente la carta da filtro con le griglie in una camera di essiccazione sottovuoto. Coprire la camera e accendere l'aspirapolvere. Lasciare asciugare le griglie sottovuoto per un massimo di un giorno.
- Spegnere l'aspirapolvere e lasciare sfiatare la camera per 5 minuti. Lo sfiato della camera evita che le griglie si muovano o volino via quando è scoperta.
6. Congelamento e caricamento delle griglie nel TEM
- Afferrare il bordo della griglia TEM usando una serie di pinzette, assicurandosi che le punte non forino nessuno dei quadrati della griglia. Sollevare la griglia di 1 - 2 cm sopra la carta da filtro e inclinare la griglia di 90° rispetto alla carta sottostante. Picchiettare delicatamente le pinzette mantenendo la griglia saldamente intrecciata per rimuovere la polvere sciolta.
- Congelare la griglia spostando a mano la punta delle pinzette con la griglia direttamente in un contenitore di azoto liquido. Questo contenitore è in genere la stazione di carico della rete per il TEM, ma può essere qualsiasi contenitore sicuro, come un thermos sicuro per l'azoto liquido, è accettabile per il trasferimento o lo stoccaggio. L'azoto liquido è -196 °C.
- Attendere che la griglia e le pinzette smettano di bollire prima di ulteriori manipolazioni.
- Sotto azoto liquido o in vapori di azoto, posizionare la griglia nel portacampioni con il lato del carbonio orientato in modo tale che il campione venga colpito dal fascio prima del film di supporto del carbonio.
- Caricare il portacampioni nel TEM assicurando che la griglia sia mantenuta sempre a temperature di azoto liquido.
- Per i sistemi di autoloader, posizionare le griglie tagliate in una cassetta in un contenitore raffreddato ad azoto liquido. Questa cassetta trasferita in un contenitore di spola consente alla robotica del caricatore automatico di accettare la cassetta mantenendo i campioni al sicuro per la spola tra il caricatore automatico e la colonna.
- Per le configurazioni TEM side-entry, fissare la rete a un supporto TEM commerciale side-entry. Questi supporti hanno un contenitore di preparazione del campione riempito con azoto liquido per consentire il trasferimento della griglia al supporto senza riscaldare il campione. Il supporto ad ingresso laterale viene inserito nel TEM direttamente con il campione fissato all'estremità.
7. Raccolta dei dati MicroED
- Localizzazione e screening dei nanocristalli
- Aprire le valvole a colonna TEM. Regolare l'ingrandimento utilizzando i pannelli manuali al minor ingrandimento possibile. Trova il raggio regolando la manopola dell'intensità sui pannelli manuali in modo che un'area rotonda e luminosa sia visibile sullo schermo fluorescente.
- Prendere un atlante a griglia intera a basso ingrandimento (50 - 300x) utilizzando il software appropriato14,15,16 (Figura 2). Assicurarsi che il microscopio sia ben allineato per l'imaging a basso e alto ingrandimento prima di raccogliere dati MicroED ad alta risoluzione.
- Identificare i quadrati della griglia senza carbonio rotto e avere un materiale / grani neri o scuri visibili sul film (Figura 2). Naviga intorno alla griglia, usando fisicamente il joystick sui pannelli delle mani, o virtualmente sull'Atlante raccolto, per cercare i quadrati della griglia che non sono rotti e contengono microcristalli.
- Aggiungere il centro di ciascuno di questi quadrati a un elenco di posizioni della griglia per l'indagine. Queste posizioni possono essere aggiunte a un notebook, nell'interfaccia utente del microscopio o nel software di automazione del microscopio.
- Aumentare l'ingrandimento a 500-1.300x e regolare l'altezza eucentrica in ogni posizione della griglia memorizzata e aggiornare il valore Z salvato alle posizioni indicate in 7.1.4.
- Cerca sullo schermo fluorescente o su una fotocamera veloce a questo ingrandimento più elevato per piccole macchie / grani neri sulla griglia. Un buon campione con spesso spigoli vivi ad alto ingrandimento, suggerendo un ordine cristallino.
- Spostare un cristallo potenziale posizionato al centro dello schermo e aumentare l'ingrandimento in modo che il TEM entri in modalità di ingrandimento elevato.
NOTA: questo è indicato come modalità ad alto ingrandimento, Zoom2 o SA su diversi strumenti e in genere corrisponde a ingrandimenti di 3.000x o superiori. - Inserire un'apertura dell'area selezionata. Impostare l'apertura su una dimensione maggiore o minore per assicurarsi che l'area selezionata sia appena più grande del cristallo (Figura 3).
- Passare alla modalità di diffrazione premendo il pulsante di diffrazione sui pannelli manuali TEM, assicurando che lo schermo fluorescente sia inserito. Regolare la lunghezza della fotocamera utilizzando la manopola di ingrandimento in modo che il bordo abbia una risoluzione di almeno 1 Å.
NOTA: La calibrazione delle lunghezze di diffrazione deve essere eseguita da un tecnico dell'assistenza utilizzando un reticolo per cialde d'oro o un campione noto prima di tentare esperimenti MicroED. - Regolare la messa a fuoco di diffrazione in modo che il punto centrale sia il più nitido e piccolo possibile. Utilizzando le manopole del cambio di diffrazione, spostare il fascio centrale al centro dello schermo fluorescente
- Inserire l'arresto del fascio e assicurarsi che il raggio sia dietro di esso. Sollevare lo schermo fluorescente. Effettuare una breve esposizione (circa 1 s) sulla fotocamera (Figura 4).
- Ispezionare il modello di diffrazione corrispondente. Un buon candidato per la raccolta di un set di dati completo avrà punti acuti che sono regolarmente disposti in colonne e righe e la diffrazione si estenderà oltre 2 Å, preferibilmente almeno a 1 Å (Figura 4). Salvare le coordinate del cristallo nell'interfaccia utente TEM o annotandole.
- Ripetere lo screening di diffrazione per tutti i potenziali cristalli di interesse sul quadrato della griglia corrente.
- Raccolta dei dati
- Centrare un cristallo schermato sullo schermo con un ingrandimento elevato (> 1.000x). Regola l'altezza eucentrica del cristallo usando una routine automatica o a mano.
- Inserire l'apertura dell'area selezionata che meglio si adatta alle dimensioni e alla forma del cristallo, come determinato al punto 7.1.8 (Figura 3). Inclinare lo stage nelle direzioni negativa e positiva fino a quando l'immagine non viene occlusa dalle barre della griglia (Figura 3). Notare questi angoli ai fini della raccolta dei dati.
- Determinare il numero di fotogrammi necessari per estendere il cuneo angolare totale del dataset. È tipico utilizzare cunei da 0,5 a 1,0° per ogni fotogramma, con fotogrammi letti ogni 1-5 secondi a seconda della sensibilità della fotocamera. Ad esempio, un cuneo che va da -30° a +30°, ruotando ad una velocità costante di 1° s-1 con un fotogramma letto ogni 1s, richiederebbe 60 fotogrammi totali.
- Considerando l'intervallo di inclinazione totale massimo da -72° a +72°, iniziare a ruotare lo stage a una velocità costante di 1° s-1 e quindi iniziare a leggere i dati ogni 1 secondo su una fotocamera moderna con modalità di lettura rolling shutter (Filmato 1). Questo processo può essere eseguito manualmente o utilizzando software specifici TEM.
- Impostare la velocità di rotazione specificando la % della velocità massima di inclinazione e quando fermarsi nell'interfaccia utente del microscopio o nel software dedicato. In questa indagine, questo è stato misurato per essere 0,3 ° s-1 per ogni % della velocità massima, ma dovrà essere verificato in modo indipendente per ogni microscopio.
NOTA: l'inclinazione e la raccolta dei dati della telecamera sono impostate in modo indipendente qui, ma i programmi software14 possono coordinarlo per semplificare il processo. - Scartare circa 1° su ciascun lato del cuneo specificato nella maggior parte dei casi come tempo morto, in cui lo stadio sta aumentando o rallentando alla velocità di rotazione desiderata.
- Impostare la velocità di rotazione specificando la % della velocità massima di inclinazione e quando fermarsi nell'interfaccia utente del microscopio o nel software dedicato. In questa indagine, questo è stato misurato per essere 0,3 ° s-1 per ogni % della velocità massima, ma dovrà essere verificato in modo indipendente per ogni microscopio.
- Salvate i dati in diversi formati come singoli fotogrammi o come pila di immagini (filmato 1).
- Convertite questi fotogrammi di diffrazione in un tipico formato cristallografico utilizzando gli strumenti MicroED disponibili qui (https://cryoem.ucla.edu). Le immagini di diffrazione salvate in formato SMV sono facilmente elaborate utilizzando software cristallografici documentati17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MicroED è un metodo crioEM che sfrutta le forti interazioni tra elettroni e materia, che consente lo studio di cristalli12,13 infinitamente piccoli. Dopo questi passaggi, ci si aspetta di avere un filmato di diffrazione in formato cristallografico raccolto da microcristalli (Filmato 1). Qui, la tecnica è dimostrata usando carbamazepina12. I risultati mostrano un set di dati MicroED a rotazione continua da un microcristallo di carbamazepina identificato su una griglia TEM (Movie 1). Un buon set di dati ha punti forti e chiari che non sono imbrattati o divisi e ha solo un singolo reticolo su ciascun fotogramma che può essere facilmente seguito scorrendo il filmato19. Questi dati sono facilmente indicizzati, integrati e scalabili utilizzando il software di cristallografia a raggi X standard4. Le macchie divise possono essere viste da un cristallo che è stato incrinato, e due orientamenti dello stesso cristallo sono strettamente allineati, ma non del tutto coincidenti19. Possono verificarsi anche reticoli multipli, in particolare per questi cristalli a piccole molecole, dove più cristalli singoli si sono bloccati insieme in un grumo sulla griglia. Un altro scenario comune si verifica quando i cristalli sono stati congelati in modo errato o trattati troppo duramente durante la frammentazione e non si osserva alcuna diffrazione9.
Dopo la raccolta, l'integrazione e la soluzione della struttura dei dati, ci si aspetta che venga determinata una struttura ad alta risoluzione (Figura 5). L'ottenimento di una soluzione di struttura chiara dipenderà in ultima analisi dalla qualità e dalla completezza dei dati.
Figura 1: Preparazione di una griglia TEM pre-tagliata per lo studio di piccole molecole . (A) Una provetta con una piccola porzione di campione per l'indagine. (B) Campione frantumato tra due vetrini da microscopio. (C) Il lato in carbonio della griglia pre-tagliata e (D) il lato in rame della griglia pre-tagliata. (E) Una griglia TEM pre-tagliata dopo che la polvere frantumata è stata lasciata cadere su di essa. Barre della scala 3mm in (C), (D) e (E). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Identificazione di cristalli di piccole molecole nel TEM . (A) Un atlante o un montaggio a griglia bassa. (B) Una singola immagine a basso ingrandimento utilizzata per lo screening. (C) Immagine di ingrandimento più elevato utilizzata per identificare i grani più piccoli. (D) Micrografia ad alto ingrandimento di un cristallo di piccola molecola raggruppato. Barra scala 750 μm in (A), 50 μm in (B), 10 μm in (C), 1 μm in (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Screening e allineamento dei microcristalli per la raccolta dei dati MicroED . (A) Micrografia ad alto ingrandimento di un microcristallo. (B) Micrografia del cristallo isolato all'interno dell'apertura dell'area selezionata. (C) Lo stesso microcristallo nell'apertura con il palco inclinato a -69 °. Barre di scala tutte 1 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempi di dati MicroED . (A) dati MicroED di alta qualità con punti chiari e nitidi adatti per la determinazione della struttura ad alta risoluzione. (B) Dati MicroED deboli e imbrattati con scarsa definizione del reticolo. In questo esempio anche l'allineamento è disattivato, quindi la diffrazione è evidente solo su un lato dell'immagine (C) Dati MicroED scadenti che mostrano più reticoli e punti divisi e / o imbrattati. Inserto dell'area blu migliorato in basso a destra che mostra macchie spalmate e divise. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Struttura MicroED della carbamazepina. Modello atomico mostrato come bastoncini con atomi di carbonio colorati di bianco, rosso ossigeno e blu azoto. La mappa 2Fo-F c è sagomata al livello di 1,5 σ e colorata in blu. La mappa Fo-F c che mostra gli idrogeni è sagomata al livello di 3,0 σ e colorata di verde. Questa cifra è stata adattata dalle mappe depositate di EMDB-928410. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Filmato 1: Set di dati MicroED da carbamazepina. Il set di dati si estende su quasi 90°, da -68° a +20°. Ogni modello di diffrazione si estende su un cuneo di 0,5° nello spazio reciproco e corrisponde ad un'esposizione di 1s ad un tasso di esposizione di 0,01 e- Å-2 s-1. Clicca qui per scaricare questo film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La preparazione dei campioni è in genere un processo iterativo, in cui le ottimizzazioni vengono effettuate dopo sessioni di screening e raccolta dati. Per i campioni di piccole molecole, è spesso prudente tentare prima la preparazione della griglia senza scaricare le griglie, poiché molti farmaci tendono ad essere idrofobici10,11. Se le griglie hanno troppo pochi depositi nanocristallini, è una buona idea riprovare dopo aver scaricato le griglie. Può darsi che i cristalli delle polveri liofilizzate siano troppo grandi e spessi per raccogliere buoni dati. In questi casi, potrebbe essere possibile raccogliere dati da un bordo o da una parte più sottile di un cristallo più grande. Se ciò si rivela difficile, può essere necessario macinare la polvere fino a una consistenza più fine utilizzando una superficie più ruvida, come un mortaio e un pestello.
I dati MicroED sono tipicamente raccolti con il TEM che opera in modalità microsonda 4,20. Qui, la dimensione del fascio TEM che corrisponde a un tasso di esposizione di 0,01 e- Å-2 s-1 è tipicamente di circa 10 μm di diametro, che è molto più grande dei tipici microcristalli 1,21. Il segnale viene quindi isolato dai cristalli di interesse utilizzando un'apertura dell'area selezionata (Figura 3)2,20. Varie dimensioni di apertura consentono una rapida regolazione della configurazione a diverse dimensioni di cristalli. In alternativa, è possibile raccogliere dati con il TEM operante in modalità nano sonda. Ciò riduce le dimensioni del fascio di circa un fattore 5. Un fascio più piccolo corrisponde a un tasso di esposizione proporzionalmente più elevato nell'impronta del fascio. Poiché molti TEM sono due sistemi di lenti a condensatore, la condizione parallela imporrà che il fascio sia di una singola dimensione in modalità microsonda o nanosonda. Raggiungere un tasso di esposizione di 0,01 e- Å-2 s-1 nella sonda nano senza regolare l'obiettivo della pistola è impegnativo. La scelta tra i due spetta all'utente. Un vantaggio della sonda nano è che c'è meno bisogno di inserire e ritrarre l'apertura dell'area selezionata tra lo screening nelle modalità operative di imaging e diffrazione. Tuttavia, con i microscopi moderni, l'inserimento e la retrazione dell'apertura SA sono automatici e precisi. Microprobe offre una maggiore flessibilità nell'isolamento della diffrazione avendo accesso a più dimensioni di aperture di area selezionate. Il fascio più grande nella microsonda può anche esporre i cristalli vicini, mentre la nano sonda può colpire con maggiore precisione i singoli cristalli.
Il protocollo presentato è l'approccio standard alla raccolta di dati MicroED per piccole molecole utilizzate nel nostro laboratorio10,11,12,13. Ci sono molti adattamenti e modifiche che potrebbero essere implementati. L'approccio migliore per realizzare griglie ad alta densità di cristalli dipende principalmente dalla familiarità dell'utente con un determinato approccio. Ci sono molti casi in cui i farmaci sono presenti come grandi cristalli che sono troppo fragili per frammentarsi fisicamente senza perdere il potere di diffrattura19. In questi casi, il metodo recentemente adattato di fresatura focalizzata a fascio ionico per assottigliare i cristalli per renderli più accessibili a MicroED 6,7,8,9,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il laboratorio Gonen è supportato da fondi dell'Howard Hughes Medical Institute. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T.
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W.
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
