Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

Published: March 15, 2021 doi: 10.3791/62313
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

Summary

במאמר זה אנו מתארים את ההליכים שפותחו במעבדה שלנו להכנת אבקות של גבישי מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים במיקרו-גבישים (MicroED).

Abstract

מתואר פרוטוקול מפורט להכנת דגימות מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים (MicroED). MicroED פותחה כדי לפתור מבנים של חלבונים ומולקולות קטנות באמצעות ציוד קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים סטנדרטית (cryo-EM). בדרך זו, מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה נקבעו לאחרונה לרזולוציות גבוהות. פרוטוקולים מוצגים כאן להכנת רשתות של תרופות מולקולות קטנות באמצעות התרופה carbamazepine כדוגמה. מוצגים פרוטוקולים לסינון ואיסוף נתונים. שלבים נוספים בתהליך הכולל, כגון שילוב נתונים, קביעת מבנה וחידוד מוצגים במקום אחר. הזמן הדרוש להכנת רשתות המולקולות הקטנות מוערך בפחות מ-30 דקות.

Introduction

עקיפה אלקטרונית מיקרוקריסטלית (MicroED) היא שיטת קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים (cryo-EM) לקביעת מבני רזולוציה אטומית מגבישים בגודל תת-מיקרומטרי 1,2. גבישים מיושמים על רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטיות (TEM) ומוקפאים על ידי צלילה לתוך אתאן נוזלי או חנקן נוזלי. לאחר מכן נטענות רשתות לתוך TEM הפועל בטמפרטורות קריוגניות. הגבישים ממוקמים על הרשת ומוקרנים לאיכות עקיפה ראשונית. סיבוב רציף נתוני MicroED נאספים מתת-קבוצה של הגבישים המוקרנים, כאשר הנתונים נשמרים באמצעות מצלמה מהירה כסרט3. סרטים אלה מומרים לפורמט קריסטלוגרפי סטנדרטי ומעובדים באופן כמעט זהה לניסוי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן4.

MicroED פותחה במקור כדי לחקור מיקרו-גבישים חלבוניים 1,2. צוואר בקבוק בקריסטלוגרפיה של חלבונים הוא גידול גבישים גדולים ומסודרים היטב עבור ניסויי עקיפה מסורתיים של קרני רנטגן סינכרוטרון. מכיוון שאלקטרונים מתקשרים עם חומר בסדרי גודל חזקים יותר מקרני רנטגן, מגבלות גודל הגביש הדרושות ליצירת עקיפה ניתנת לגילוי קטנות בהרבה5. בנוסף, היחס בין אירועי פיזור אלסטיים לבלתי אלסטיים הוא חיובי יותר עבור אלקטרונים, מה שמרמז על כך שניתן לאסוף נתונים שימושיים יותר עם חשיפה כוללת קטנה יותר5. התפתחויות בלתי פוסקות אפשרו איסוף נתוני MicroED מהמיקרו-גבישים המאתגרים ביותר 6,7,8,9.

לאחרונה, MicroED הוכח ככלי רב עוצמה לקביעת המבנים של תרופות מולקולות קטנות מחומרים אמורפיים לכאורה 10,11,12,13. אבקות אלה יכולות להגיע היישר מבקבוק של מגיב קנוי, עמוד טיהור, או אפילו מריסוק גלולה לאבקה דקה10. אבקות אלה נראות אמורפיות בעין, אך עשויות להיות מורכבות לחלוטין מננו-גבישים או פשוט מכילות כמויות זעירות של משקעים ננו-גבישיים בחלק גדול יותר שאינו גבישי, אמורפי. היישום של החומר ברשת הוא קל, והשלבים הבאים של זיהוי, סינון ואיסוף נתונים עשויים אפילו להיות אוטומטיים בעתיד הקרוב14. בעוד שאחרים עשויים להשתמש בשיטות שונות להכנת דגימות ואיסוף נתונים, כאן מפורטים הפרוטוקולים שפותחו ושימשו במעבדת גונן להכנת דגימות של מולקולות קטנות עבור MicroED ואיסוף נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת דגימות מולקולות קטנות

  1. העבירו כמות קטנה (0.01 - 1 מ"ג) של אבקה, נוזל או מוצקים לבקבוקון קטן או לצינור.
  2. עבור דגימות שכבר נמצאות בצורת אבקה, אטמו את הצינורית באמצעות המכסה עד שיהיה צורך בדגימה. יבשו את דגימות הנוזלים לאבקות לפני ניסיונות בשיטה 1 (שלב 3) או 2 (שלב 4).
    הערה: דגימות מומסות בנוזל עשויות להשתמש בשיטה 3 (5.X) להלן

2. הכנת רשתות TEM

הערה: רכיבי TEM מסוימים עם מערכות טוען אוטומטי דורשים לגזור את הרשתות ולהכניס אותן לקלטת לפני הטעינה לעמודה TEM. חיתוך כרוך באבטחה פיזית של רשת TEM 3 מ"מ לתוך טבעת מתכת כי autoloader יכול לתפעל. שלב זה והשלבים הבאים יכולים להתבצע באמצעות רשתות TEM רגילות, או רשתות TEM שנחתכו. עבור ניסויים אלה, לעתים קרובות קל יותר לתפעל את הרשתות אם הן נחתכו מראש.

  1. עטפו סרט פלסטיק סביב קצה אחד של שקופית כיסוי זכוכית.
  2. הניחו את רשתות ה-TEM על סרט הצילום בחלק העליון של שקופית הכיסוי כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה. זהה את שני צידי הרשת תחת אור. צד הנחושת זוהר ונראה מתכתי, ואילו צד הפחמן נראה בצבע חום אפרורי (איור 1C,D). עבור רשתות חתוכות, צד הפחמן צריך לפנות למשטח השטוח של טבעת הקליפ.
  3. מקם את השקופית עם הרשתות בתא הפריקה הזוהר. זוהר פורק את הכיסוי למשך כ- 30 שניות באמצעות ההגדרה השלילית ב- 15 pA. אחסנו את הרשתות על שקופית הכיסוי בתוך צלחת פטרי מזכוכית מרופדת בנייר סינון לפני הוספת דוגמה לרשתות.

3. מריחת דגימה על רשתות על ידי יצירת אבקה עדינה הומוגנית (שיטה 1)

  1. הסר רשת TEM משוחררת זוהרת מצלחת הפטרי המכוסה באמצעות פינצטה. הניחו את הרשת על נייר מסנן עגול כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה.
  2. בעזרת מרית קטנה, מוציאים כף מדידה קטנה מאוד של אבקה (כ-0.1 מ"ג) ומניחים אותה על מכסה זכוכית קטן ומרובע ממש ליד רשת TEM על נייר הסינון. מניחים עוד מגלשת זכוכית מרובעת קטנה או מכסה על גבי האבקה.
  3. בעזרת האצבעות, שפשפו בעדינות את שתי מגלשות הזכוכית זו בזו ליצירת אבקה דקה.
  4. סובבו את החלקות הכיסויים בזווית ומקמו אותן ממש מעל רשת ה-TEM על נייר הסינון והמשיכו לשפשף את הכיסויים זה בזה, רק כמה סנטימטרים מעל רשת ה-TEM המשוחררת הזוהרת (איור 1).
  5. התבונן כדי לראות אם האבקה נופלת לכיוון הרשת. חשוף את האבקה הטחונה דק על ידי הסרת אחד משני כיסויי הזכוכית. הברישו בעדינות את האבקה העדינה מהמכסה באמצעות פיסת נייר סינון לרשת TEM (איור 1).

4. החלת דגימה על רשתות על ידי יישום שיטת "טלטול" (שיטה 2)

  1. תפוס רשת באמצעות זוג פינצטה ושחרר אותה לתוך בקבוקון או שפופרת של דגימת אבקה. סגרו את הבקבוקון באמצעות מכסה הפלסטיק כדי להבטיח שאף חומר לא יברח בעת טלטול.
  2. תופסים את הבקבוקון ביד, מנערים את הבקבוקון כך שהאבקה והרשת נעות שתיהן במשך כ 10 - 30 שניות.
  3. רוקנו את תכולת הבקבוקון על נייר סינון עגול. תופס את הרשת בקצה, מקיש בעדינות על קצה הרשת על נייר הסינון כדי להסיר חומר עודף מהרשת.
    הערה: בהתאם לסוג הבקבוקון ולגודלו, ניתן גם להשתמש בפינצטה כדי להסיר את רשת TEM מבלי לרוקן את התוכן.

5. החלת דגימה על רשתות בשיטת האידוי (שיטה 3)

  1. הניחו רשת (חתוכה או לא) על מרכזה של פיסת נייר פילטר עגולה, כאשר צד הפחמן פונה כלפי מעלה וצד הנחושת פונה כלפי מטה.
  2. בעזרת מזרק אטום לגז בגודל 10 μL, יש למרוח טיפה קטנה (בערך 1-3 מיקרוליטר) של תרכובת מומסת על צד הפחמן של הרשת.
  3. העבירו בעדינות את נייר הסינון עם הרשתות לתוך תא ייבוש ואקום. מכסים את החדר ומדליקים את הוואקום. השאירו את הרשתות תחת ואקום לייבוש עד יום אחד.
  4. כבו את השואב ואפשרו לתא להתאוורר למשך 5 דקות. אוורור התא מונע מהרשתות לזוז או לעוף כאשר הוא חשוף.

6. הקפאה וטעינה של רשתות לתוך TEM

  1. תפוס את קצה רשת TEM באמצעות קבוצה של פינצטה, וודא שהקצוות אינם מנקבים אף אחד מריבועי הרשת. הרם את הרשת 1-2 ס"מ מעל נייר הסינון וסובב את הרשת בזווית של 90° לנייר שמתחת. טפחו בעדינות על הפינצטה תוך שמירה על הפינצטה הדוקה ברשת כדי להסיר אבקה רופפת.
  2. מקפיאים את הרשת על ידי הזזת קצה הפינצטה עם הרשת ישירות לתוך מיכל חנקן נוזלי ביד. מיכל זה הוא בדרך כלל תחנת טעינת הרשת עבור TEM, אך יכול להיות כל מיכל בטוח, כגון תרמוס בטוח לחנקן נוזלי, מקובל להעברה או אחסון. חנקן נוזלי הוא -196 °C.
  3. חכו עד שהרשת והפינצטה יפסיקו לרתוח לפני מניפולציות נוספות.
  4. תחת חנקן נוזלי או באדי חנקן, הניחו את הרשת במחזיק הדגימה עם כיוון צד הפחמן, כך שהדגימה תיפגע על ידי הקרן לפני סרט התמיכה בפחמן.
  5. טען את מחזיק הדגימה לתוך TEM כדי להבטיח שהרשת נשמרת בטמפרטורות חנקן נוזלי בכל עת.
    1. עבור מערכות טוען אוטומטי, מקם את הרשתות החתוכות לתוך קלטת במיכל מקורר חנקן נוזלי. קלטת זו מועברת למיכל תריס המאפשר לרובוטיקה של המעמיס האוטומטי לקבל את הקלטת תוך שמירה על הדגימות בטוחות למעבר בין הטוען האוטומטי לעמודה.
    2. עבור הגדרות TEM לכניסה צדדית, אבטח את הרשת למחזיק TEM מסחרי בכניסה צדדית. למחזיקים אלה יש מיכל להכנת דגימה המלא בחנקן נוזלי כדי לאפשר העברת הרשת למחזיק מבלי לחמם את הדגימה. מחזיק הכניסה הצדדית מוכנס ל- TEM ישירות עם הדגימה המאובטחת בסוף.

7. איסוף נתוני MicroED

  1. איתור וסינון ננו-גבישים
    1. פתח את שסתומי העמודה TEM. התאימו את ההגדלה באמצעות לוחות היד להגדלה הנמוכה ביותר האפשרית. מצא את הקרן על ידי התאמת ידית העוצמה בלוחות היד כך שאזור עגול ובהיר ייראה על מסך הפלואורסצנט.
    2. קח אטלס של כל הרשת בהגדלה נמוכה (50 - 300x) באמצעות תוכנה מתאימה14,15,16 (איור 2). ודא שהמיקרוסקופ מיושר היטב להדמיית הגדלה נמוכה וגבוהה לפני איסוף נתוני MicroED ברזולוציה גבוהה.
    3. זהו ריבועי רשת ללא פחמן שבור, ויש להם חומר/גרגרים שחורים או כהים גלויים על היריעה (איור 2). נווטו ברחבי הרשת, בין אם באמצעות הג'ויסטיק שעל לוחות היד, או באופן וירטואלי באטלס שנאסף, על מנת לחפש ריבועי רשת שאינם שבורים ומכילים מיקרו-גבישים.
    4. הוסף את המרכז של כל אחד מהריבועים הללו לרשימת מיקומי הרשת לצורך בדיקה. ניתן להוסיף מיקומים אלה למחשב נייד, בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה לאוטומציה של מיקרוסקופ.
    5. הגדל את ההגדלה ל- 500-1,300x והתאם את הגובה האוצנטרי בכל מיקום רשת מאוחסן ועדכן את ערך Z שנשמר למיקומים שצוינו ב- 7.1.4.
    6. חפש במסך הפלואורסצנטי או במצלמה מהירה בהגדלה גבוהה זו אחר כתמים שחורים/גרגרים קטנים על הרשת. מדגם טוב עם לעתים קרובות יש קצוות חדים בהגדלה גבוהה, מה שמרמז על סדר גבישי.
    7. הזז גביש פוטנציאלי ממוקם למרכז המסך והגדל את ההגדלה כך שה- TEM ייכנס למצב הגדלה גבוהה.
      הערה: מצב זה מכונה מצב הגדלה גבוהה, Zoom2 או SA במכשירים שונים ובדרך כלל מתאים להגדלות של פי 3,000 ומעלה.
    8. הוספת מפתח צמצם של אזור שנבחר. שנו את הצמצם לגודל גדול או קטן יותר כדי להבטיח שהאזור שנבחר פשוט גדול יותר מהגביש (איור 3).
    9. עבור למצב עקיפה על ידי לחיצה על לחצן העקיפה בלוחות היד של TEM, וודא שמסך הפלואורסצנט מוכנס. כוונן את אורך המצלמה באמצעות ידית ההגדלה כך שהקצה יהיה ברזולוציה של 1 Å לפחות.
      הערה: כיול אורכי העקיפה צריך להתבצע על ידי מהנדס שירות באמצעות סורג וופל זהב או דגימה ידועה לפני ניסיון ניסויי MicroED.
    10. התאימו את מוקד העקיפה כך שהנקודה המרכזית תהיה חדה וקטנה ככל האפשר. באמצעות ידיות היסט העקיפה, הזז את הקרן המרכזית למרכז המסך הפלואורסצנטי
    11. הכנס את מעצור הקרן וודא שהקרן נמצאת מאחוריה. הרם את מסך הפלואורסצנט. בצעו חשיפה קצרה (כשנייה אחת) במצלמה (איור 4).
    12. בדוק את דפוס העקיפה המתאים. מועמד טוב לאיסוף מערך נתונים מלא יהיה בעל נקודות חדות המסודרות באופן קבוע בעמודות ובשורות, והעקיפה תתרחב מעבר ל-2 Å, רצוי לפחות עד 1 Å (איור 4). שמור את קואורדינטות הגביש בממשק המשתמש של TEM או על-ידי כתיבתן.
    13. בדיקת עקיפה חוזרת עבור כל הגבישים הפוטנציאליים המעניינים בריבוע הרשת הנוכחי.
  2. איסוף נתונים
    1. מרכז גביש מוקרן על המסך בהגדלה גבוהה (> פי 1,000). כוונן את הגובה האוצנטרי של הגביש באמצעות שגרה אוטומטית או ידנית.
    2. הכנס את מפתח הצמצם שנבחר המתאים ביותר לגודל ולצורה של הגביש כפי שנקבע ב- 7.1.8 (איור 3). הטו את הבמה בכיוון השלילי והחיובי עד שהתמונה תוסתר על-ידי פסי הרשת (איור 3). שים לב לזוויות אלה למטרות איסוף נתונים.
    3. קבע את מספר המסגרות שיידרשו כדי לפרוס את הטריז הזוויתי הכולל של ערכת הנתונים. אופייני להשתמש בטריזים של 0.5 - 1.0 ° עבור כל פריים, כאשר הפריימים נקראים כל 1 עד 5 שניות בהתאם לרגישות המצלמה. לדוגמה, טריז המשתרע בין -30° ל- +30°, המסתובב בקצב קבוע של 1° s-1 עם מסגרת המוקראת, כל 1 שניות, ידרוש 60 מסגרות בסך הכל.
    4. בהתחשב בטווח ההטיה הכולל המרבי של -72° עד +72°, התחל לסובב את הבמה בקצב קבוע של 1° s-1 ולאחר מכן התחל לקרוא את הנתונים כל 1s במצלמה מודרנית עם מצב קריאת תריס מתגלגל (סרט 1). תהליך זה יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות תוכנה ספציפית TEM.
      1. הגדר את קצב הסיבוב על ידי ציון % ממהירות ההטיה המרבית ומתי לעצור בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה ייעודית. בחקירה זו, זה נמדד להיות 0.3° s-1 עבור כל % של מהירות מקסימלית, אבל יהיה צורך לאמת באופן עצמאי עבור כל מיקרוסקופ.
        הערה: איסוף נתוני ההטיה והמצלמה מוגדרים כאן באופן עצמאי, אך תוכנות14 יכולות לתאם זאת כדי לפשט את התהליך.
      2. יש להשליך כ-1° מכל צד של הטריז שצוין ברוב המקרים כזמן מת, שבו השלב עולה או מאט למהירות הסיבוב הרצויה.
    5. שמור נתונים במגוון תבניות כמסגרות נפרדות או כערימת תמונות (סרט 1).
    6. המר מסגרות עקיפה אלה לפורמט קריסטלוגרפי טיפוסי באמצעות כלי MicroED -זמין כאן (https://cryoem.ucla.edu). תמונות עקיפה הנשמרות בפורמט SMV מעובדות בקלות באמצעות תוכנה קריסטלוגרפית מתועדת17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MicroED היא שיטת cryoEM הממנפת את האינטראקציות החזקות בין אלקטרונים לחומר, המאפשרת חקירה של גבישים קטנים נעלמים12,13. לאחר שלבים אלה, צפוי להיות סרט עקיפה בפורמט קריסטלוגרפי שנאסף ממיקרו-גבישים (סרט 1). כאן, הטכניקה מודגמת באמצעות carbamazepine12. התוצאות מראות מערך נתונים MicroED של סיבוב רציף ממיקרו-גביש קרבמזפינים שזוהה ברשת TEM (סרט 1). למערך נתונים טוב יש נקודות חזקות וברורות שאינן נמרחות או מפוצלות, ויש לו רק סריג אחד בכל פריים שניתן לעקוב אחריו בקלות על ידי מעבר לאורך הסרט19. נתונים אלה ניתנים לאינדקס, שילוב וקנה מידה בקלות באמצעות תוכנת קריסטלוגרפיה סטנדרטית של קרני רנטגן4. ניתן לראות כתמים מפוצלים מגביש שנסדק, ושני כיוונים של אותו גביש מיושרים זה לזה, אך לא ממש מקריים19. סריגים מרובים יכולים להתרחש גם כן, במיוחד עבור גבישים אלה של מולקולות קטנות, שבהם גבישים בודדים מרובים נדבקו זה לזה בגוש על הרשת. תרחיש נפוץ נוסף מתרחש כאשר הגבישים הוקפאו בצורה שגויה או טופלו בצורה קשה מדי במהלך הפיצול, ולא נצפתה עקיפה9.

לאחר פתרון איסוף, אינטגרציה ומבנה נתונים, צפוי להיקבע מבנה ברזולוציה גבוהה (איור 5). קבלת פתרון מבנה ברור יהיה תלוי בסופו של דבר באיכות ושלמות הנתונים.

Figure 1
איור 1: הכנת רשת TEM חתוכה מראש לחקירת מולקולות קטנות . (A) צינור עם חלק קטן של דגימה לחקירה. (B) דגימה כתושה בין שתי שקופיות במיקרוסקופ. (C) צד הפחמן של הרשת שנחתכה מראש, ו-(D) צד הנחושת של הרשת שנחתכה מראש. (E) רשת TEM חתוכה מראש לאחר שהאבקה המרוסקת הוטלה עליה. פסי קנה מידה של 3 מ"מ ב- (C), (D) ו- (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי גבישי מולקולות קטנות ב-TEM . (A) אטלס או מונטאז' של כל הרשת בהגדלה נמוכה. (B) תמונה אחת בהגדלה נמוכה המשמשת להקרנה. (C) תמונת הגדלה גבוהה יותר המשמשת לזיהוי גרגרים קטנים יותר. (D) מיקרוגרף בהגדלה גבוהה של גביש מולקולה קטנה מגובש. סרגל קנה מידה 750 מיקרומטר אינץ' (A), 50 מיקרומטר אינץ' (B), 10 מיקרומטר אינץ' (C), 1 מיקרומטר אינץ' (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סינון ויישור מיקרו-גבישים עבור איסוף נתוני MicroED . (A) מיקרוגרף בהגדלה גבוהה של מיקרו-גביש. (B) מיקרוגרף של הגביש המבודד בתוך צמצם השטח שנבחר. (C) אותו מיקרו-גביש בצמצם כאשר הבמה מוטה ל-69°-. סרגל קנה מידה כל 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דוגמאות לנתוני MicroED. (A) נתוני MicroED באיכות גבוהה עם נקודות ברורות וחדות המתאימות לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. (B) נתוני MicroED חלשים ומרוחים עם הגדרת סריג גרועה. בדוגמה זו, היישור גם הוא כבוי, כך שהעקיפה ניכרת רק בצד אחד של התמונה (C) נתוני MicroED גרועים המציגים סריגים מרובים וכתמים מפוצלים ו/או מרוחים. כניסה של אזור כחול משופר בפינה השמאלית התחתונה המציגה כתמים מרוחים ומפוצלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מבנה MicroED של Carbamazepine. מודל אטומי מוצג כמקלות עם אטומי פחמן בצבע לבן, אדום חמצן וכחול חנקן. מפת 2Fo-F c מסומנת ברמת 1.5 σ וצבועה בכחול. מפת Fo-F c המציגה מימנים מסומנת ברמת 3.0 σ וצבועה בירוק. נתון זה נלקח מהמפות שהופקדו של EMDB-928410. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרט 1: ערכת נתונים MicroED מ carbamazepine. מערך הנתונים משתרע על פני כמעט 90°, מ- -68° עד +20°. כל תבנית עקיפה משתרעת על טריז של 0.5° במרחב הדדי ומתאימה לחשיפה של 1s בקצב חשיפה של 0.01 e- Å-2 s-1. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנת דגימה היא בדרך כלל תהליך איטרטיבי, שבו אופטימיזציות נעשות לאחר מפגשים של סינון ואיסוף נתונים. עבור דגימות של מולקולות קטנות, לעתים קרובות זה נבון לנסות תחילה להכין את הרשת מבלי לפרוק זוהר ברשתות, שכן תרופות רבות נוטות להיות הידרופוביות10,11. אם ברשתות יש מעט מדי משקעים ננו-גבישיים, כדאי לנסות שוב לאחר פריקת הזוהר הראשונה של הרשתות. ייתכן שהגבישים מאבקות ליופיליות גדולים ועבים מכדי לאסוף נתונים טובים. במקרים אלה, ייתכן שניתן יהיה לאסוף נתונים מקצה או מחלק דק יותר של גביש גדול יותר. אם זה מתגלה כקשה, ייתכן שיהיה צורך לטחון את האבקה למרקם עדין יותר באמצעות משטח מחוספס יותר, כגון טיט ומזיק.

נתוני MicroED נאספים בדרך כלל כאשר ה-TEM פועל במצב microprobe 4,20. כאן, גודל קרן TEM המתאים לשיעור חשיפה של 0.01 e- Å-2 s-1 הוא בדרך כלל סביב 10 מיקרומטר קוטר, שהוא הרבה יותר גדול מאשר מיקרוקריסטלים טיפוסיים 1,21. לאחר מכן מבודדים את האות מהגבישים המעניינים באמצעות מפתח צמצם של אזור נבחר (איור 3)2,20. גדלי צמצם שונים מאפשרים התאמה מהירה של ההתקנה לגדלים שונים של גבישים. לחלופין, ניתן לאסוף נתונים כאשר ה-TEM פועל במצב nano probe. זה מקטין את גודל הקרן בערך פי 5. קרן קטנה יותר מתאימה לשיעור חשיפה גבוה יותר בהתאמה בטביעת הרגל של הקרן. מכיוון שמערכות TEM רבות הן שתי מערכות עדשות מעבות, התנאי המקביל יכתיב שהקרן תהיה בגודל יחיד במצב מיקרו-פרוב או ננו-פרוב. הגעה לשיעור חשיפה של 0.01 e- Å-2 s-1 בננו גשושית ללא התאמת עדשת האקדח היא מאתגרת. הבחירה בין השניים נתונה בידי המשתמש. יתרון של ננו פרוב הוא שיש פחות צורך להכניס ולמשוך את צמצם השטח שנבחר בין הקרנה במצב הדמיה ועקיפה. עם זאת, עם מיקרוסקופים מודרניים החדרה ונסיגה של צמצם SA היא אוטומטית ומדויקת. Microprobe מציע גמישות גדולה יותר בבידוד עקיפה על ידי גישה לגדלים מרובים של צמצמי שטח נבחרים. הקרן הגדולה יותר במיקרו-פרוב עשויה גם לחשוף גבישים קרובים, בעוד שננו-גשושית יכולה לכוון בצורה מדויקת יותר לגבישים בודדים.

הפרוטוקול המוצג הוא הגישה הסטנדרטית לאיסוף נתוני MicroED עבור מולקולות קטנות המשמשות במעבדה שלנו10,11,12,13. ישנן התאמות ושינויים רבים שניתן ליישם. הגישה הטובה ביותר ליצירת רשתות עם צפיפות גבישית גבוהה תלויה ביותר בהיכרות של המשתמש עם גישה נתונה. ישנם מקרים רבים בהם קיימים סמים כגבישים גדולים שהם שבירים מכדי להתפרק פיזית מבלי לאבד כוח עקיפה19. במקרים אלה, השיטה שהותאמה לאחרונה של כרסום קרן יונים ממוקדת לדלל את הגבישים כדי להפוך אותם לנגישים יותר ל- MicroED 6,7,8,9,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מעבדת גונן נתמכת על ידי כספי המכון הרפואי הווארד יוז. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות P41GM136508.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-1.5mL Eppendorf tubes Fisher Scientific 14-282-300 Any vial or tube will do.
Autogrid clips Thermo-Fisher 1036173 Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.
Autogrid C-rings Thermo-Fisher 1036171
Carbamazapine Sigma C4024-1G Any amount will suffice for these experiments
CMOS based detector Thermo-Fisher CetaD 16M We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. 
Delphi software Thermo-Fisher N/A Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage
EPU-D software Thermo-Fisher N/A Commercial software for the acquisition of MicroED data
Glass cover slides Hampton HR3-231
Glow discharger Pelco easiGlow
High PrecisionTweezers EMS 78325-AC Any high precision tweezer will do
Liquid nitrogen vessel Spear Lab FD-800 A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL
SerialEM software UC Boulder N/A Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology
TEM grids Quantifoil/EMS Q310CMA Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. 
transmission electron microscope (TEM) Thermo-Fisher Talos Arctica
Whatman circular filter paper Millipore-Sigma WHA1001090 90mm or larger

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
  3. Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
  4. Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
  5. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  6. Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
  7. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
  8. Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
  9. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  10. Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
  11. Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
  12. Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
  13. Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
  14. de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
  15. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  16. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  17. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  18. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  19. de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
  20. Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
  21. Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
  22. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 169
עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martynowycz, M. W., Gonen, T.… More

Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules. J. Vis. Exp. (169), e62313, doi:10.3791/62313 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter