Summary
Burada, mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük moleküllü kristallerin tozlarının hazırlanması için laboratuvarımızda geliştirilen prosedürleri açıklıyoruz.
Abstract
Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük molekül örnekleri hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. MicroED, standart elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) ekipmanı kullanılarak proteinlerin ve küçük moleküllerin yapılarını çözmek için geliştirilmiştir. Bu şekilde, küçük moleküller, peptitler, çözünür proteinler ve membran proteinleri son zamanlarda yüksek çözünürlüklerde belirlenmiştir. Örnek olarak karbamazepin ilacını kullanarak küçük moleküllü farmasötiklerin ızgaralarını hazırlamak için protokoller burada sunulmuştur. Verilerin taranması ve toplanmasına yönelik protokoller sunulmaktadır. Veri entegrasyonu, yapı belirleme ve iyileştirme gibi genel süreçteki ek adımlar başka yerlerde sunulmaktadır. Küçük moleküllü ızgaraları hazırlamak için gereken sürenin 30 dakikadan az olduğu tahmin edilmektedir.
Introduction
Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED), mikrometre altı boyutlu kristallerdenatomik çözünürlük yapılarını belirlemek için kullanılan bir elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) yöntemidir 1,2. Kristaller standart transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ızgaralarına uygulanır ve sıvı etan veya sıvı azota daldırılarak dondurulur. Izgaralar daha sonra kriyojenik sıcaklıklarda çalışan bir TEM'e yüklenir. Kristaller ızgarada bulunur ve ilk kırınım kalitesi için taranır. Sürekli rotasyon MicroED verileri, verilerin film olarak hızlı bir kamera kullanılarak kaydedildiği taranmış kristallerin bir alt kümesinden toplanır3. Bu filmler standart bir kristalografik formata dönüştürülür ve bir X-ışını kristalografi deneyi4 ile neredeyse aynı şekilde işlenir.
MicroED başlangıçta protein mikrokristalleri 1,2'yi araştırmak için geliştirilmiştir. Protein kristalografisindeki bir darboğaz, geleneksel senkrotron X-ışını kırınım deneyleri için büyük, iyi düzenlenmiş kristaller büyüyor. Elektronlar, X-ışınlarından daha güçlü olan madde büyüklük sıralarıyla etkileşime girdiğinden, tespit edilebilir kırınım üretmek için gereken kristal boyutunun sınırlamaları oldukça küçüktür5. Ek olarak, elastik ve elastik olmayan saçılma olaylarının oranı elektronlar için daha elverişlidir, bu da daha küçük bir genel maruz kalma ile daha yararlı verilerin toplanabileceğini düşündürmektedir5. Sürekli gelişmeler, MicroED verilerinin en zorlu mikrokristallerdentoplanmasına izin vermiştir 6,7,8,9.
Son zamanlarda, MicroED'nin görünüşte amorf malzemelerden küçük moleküllü farmasötiklerin yapılarını belirlemek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir10,11,12,13. Bu tozlar doğrudan bir şişe satın alınan reaktiften, bir saflaştırma kolonundan veya hatta bir hapı ince bir toz haline getirmekten gelebilir10. Bu tozlar gözle amorf görünür, ancak ya tamamen nanokristallerden oluşabilir ya da sadece kristalin olmayan, amorf fraksiyonda eser miktarda nanokristalin birikintileri içerebilir. Malzemenin ızgaraya uygulanması kolaydır ve kristal tanımlama, tarama ve veri toplamanın sonraki adımları yakın gelecekte otomatikleştirilebilir14. Diğerleri numune hazırlama ve veri toplama için farklı yöntemler kullanabilirken, burada MicroED için küçük moleküllerin örneklerinin hazırlanması ve veri toplanması için Gönen laboratuvarında geliştirilen ve kullanılan protokoller detaylandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Küçük molekül örneklerinin hazırlanması
- Az miktarda (0.01 - 1 mg) toz, sıvı veya katı maddeyi küçük bir şişeye veya tüpe aktarın.
- Zaten toz halinde olan numuneler için, numuneye ihtiyaç duyulana kadar kapağı kullanarak tüpü kapatın. Yöntem 1 (adım 3) veya 2 (adım 4) denemelerinden önce sıvı numuneleri tozlar halinde kurutun.
NOT: Sıvı içinde çözünmüş numuneler aşağıdaki yöntem 3'ü (5.X) kullanabilir
2. TEM ızgaralarının hazırlanması
NOT: Otomatik yükleyici sistemli bazı TEM'ler, TEM kolonuna yüklenmeden önce ızgaraların kırpılmasını ve bir kasete yerleştirilmesini gerektirir. Kırpma, 3 mm'lik TEM ızgarasını, otomatik yükleyicinin manipüle edebileceği metal bir halkaya fiziksel olarak sabitlemeyi içerir. Bu adım ve sonraki adımlar, normal TEM ızgaraları veya kırpılmış TEM ızgaraları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu deneyler için, önceden kırpılmışlarsa ızgaraları manipüle etmek genellikle daha kolaydır.
- Plastik filmi cam kapak sürgüsünün bir ucunun etrafına sarın.
- TEM ızgaralarını, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde kapak sürgüsünün üstündeki filmin üzerine yerleştirin. Bir ışık altında ızgaranın iki tarafını tanımlayın. Bakır tarafı parlar ve metalik görünürken, karbon tarafı sert, kahverengi bir renkte görünür (Şekil 1C, D). Kırpılmış ızgaralar için, karbon tarafı klips halkasının düz yüzüne bakmalıdır.
- Slaytı ızgaralarla birlikte kızdırma boşaltma odasına yerleştirin. Kızdırma, 15 pA'daki negatif ayarı kullanarak kapak kenarını yaklaşık 30 sn boyunca boşaltır. Izgaralara numune eklemeden önce ızgaraları kapak sürgüsünde filtre kağıdı ile kaplı bir cam Petri kabının içinde saklayın.
3. Homojen ince toz oluşturarak ızgaralara numune uygulanması (Yöntem 1)
- Cımbız kullanarak üzeri kapalı Petri kabından ışıltı boşaltılmış TEM ızgarasını çıkarın. Izgarayı, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde dairesel bir filtre kağıdına yerleştirin.
- Küçük bir spatula kullanarak, çok küçük bir toz kepçesini (yaklaşık 0.1 mg) çıkarın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen yanındaki küçük, kare, cam bir kapak üzerine yerleştirin. Tozun üzerine başka bir küçük kare cam slayt veya kapak kayması yerleştirin.
- Parmaklarınızla, ince bir toz yapmak için iki cam slaytı hafifçe ovalayın.
- Kapak fişlerini açın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen üzerine yerleştirin ve kızdırma deşarjlı TEM ızgarasının sadece birkaç cm yukarısında kapak kapaklarını birbirine sürtmeye devam edin (Şekil 1).
- Tozun ızgaraya doğru düşüp düşmediğini görmek için gözlemleyin. İki cam örtüden birini çıkararak ince öğütülmüş tozu ortaya çıkarın. İnce tozu bir parça filtre kağıdı kullanarak kapak kapağından nazikçe TEM ızgarasına fırçalayın (Şekil 1).
4. "Sallama" yöntemi uygulanarak ızgaralara numune uygulanması (Yöntem 2)
- Bir çift cımbız kullanarak bir ızgara alın ve toz numunesinin şişesine veya tüpüne bırakın. Çalkalandığında hiçbir malzemenin kaçmayacağından emin olmak için plastik kapağı kullanarak şişeyi kapatın.
- Şişeyi elinizde tutarak, şişeyi toz ve ızgaranın her ikisi de yaklaşık 10 - 30 s boyunca hareket edecek şekilde sallayın.
- Flakon içeriğini dairesel bir filtre kağıdına boşaltın. Izgarayı bir kenardan tutarak, fazla malzemeyi ızgaradan çıkarmak için filtre kağıdındaki ızgara kenarına hafifçe dokunun.
NOT: Şişenin türüne ve boyutuna bağlı olarak, içeriği boşaltmadan TEM ızgarasını çıkarmak için cımbız da kullanılabilir.
5. Evaporasyon yöntemi kullanılarak ızgaralara numune uygulanması (Yöntem 3)
- Dairesel bir filtre kağıdı parçasının ortasına, karbon tarafı yukarı ve bakır tarafı aşağı bakacak şekilde bir ızgara (kırpılmış veya kırpılmamış) yerleştirin.
- 10 μL gaz geçirmez bir şırınga kullanarak, ızgaranın karbon tarafına küçük bir damla (yaklaşık 1 - 3 μL) çözünmüş bileşik uygulayın.
- Izgaralı filtre kağıdını yavaşça bir vakum kurutma odasına taşıyın. Odayı örtün ve vakumu açın. Izgaraları bir güne kadar kuruması için vakum altında bırakın.
- Vakumu kapatın ve odanın 5 dakika boyunca havalandırılmasına izin verin. Odanın havalandırılması, ızgaraların ortaya çıktığında hareket etmesini veya uçmasını önler.
6. Izgaraların dondurulması ve TEM'e yüklenmesi
- Bir dizi cımbız kullanarak TEM ızgarasının kenarını tutun ve uçların ızgara karelerinin hiçbirini delmediğinden emin olun. Izgarayı filtre kağıdının 1 - 2 cm yukarısına kaldırın ve ızgarayı aşağıdaki kağıda 90° açıyla açın. Gevşek tozları temizlemek için ızgarayı sıkıca cımbızlı tutarken cımbızlara hafifçe dokunun.
- Cımbızın ucunu ızgara ile birlikte elle doğrudan sıvı azot kabına hareket ettirerek ızgarayı dondurun. Bu konteyner tipik olarak TEM için ızgara yükleme istasyonudur, ancak sıvı azot emniyetli termos gibi herhangi bir güvenli konteyner olabilir, transfer veya depolama için kabul edilebilir. Sıvı azot -196 °C'dir.
- Daha fazla manipülasyondan önce ızgara ve cımbız kaynamayı bırakana kadar bekleyin.
- Sıvı azot altında veya azot buharlarında, ızgarayı numune tutucusuna, karbon tarafı yönlendirilmiş olarak yerleştirin, böylece numune karbon destek filminden önce ışın tarafından vurulacaktır.
- Numune tutucuyu TEM'e yükleyerek ızgaranın her zaman sıvı azot sıcaklıklarında tutulmasını sağlayın.
- Otomatik yükleyici sistemleri için, kırpılmış ızgaraları sıvı azot soğutmalı bir kapta bir kasete yerleştirin. Bu kaset, otomatik yükleyici robotiklerinin kaseti kabul etmesine izin verirken, numuneleri otomatik yükleyici ile sütun arasında dolaşmak için güvenli tutarken bir titreme kabına aktarılır.
- Yandan girişli TEM kurulumları için, ızgarayı ticari bir yandan girişli TEM tutucusuna sabitleyin. Bu tutucular, ızgaranın numuneyi ısıtmadan tutucuya aktarılmasını sağlamak için sıvı azotla doldurulmuş bir numune hazırlama kabına sahiptir. Yan giriş tutucusu, numune sonunda sabitlenmiş olarak doğrudan TEM'e yerleştirilir.
7. MicroED verilerinin toplanması
- Nanokristallerin konumlandırılması ve taranması
- TEM kolon vanalarını açın. El panellerini kullanarak büyütmeyi mümkün olan en düşük büyütmeye ayarlayın. El panellerindeki yoğunluk düğmesini, floresan ekranda yuvarlak, parlak bir alan görünecek şekilde ayarlayarak ışını bulun.
- Uygun yazılımı kullanarak düşük büyütmede (50 - 300x) bir all-grid atlası alın14,15,16 (Şekil 2). Yüksek çözünürlüklü MicroED verilerini toplamadan önce mikroskobun hem düşük hem de yüksek büyütmeli görüntüleme için iyi hizalandığından emin olun.
- Kırık karbon içermeyen ızgara karelerini tanımlayın ve film üzerinde görünür siyah veya koyu renkli bir malzeme / tanecik bulundurun (Şekil 2). Kırılmamış ve mikrokristaller içeren ızgara karelerini aramak için fiziksel olarak el panellerindeki joystick'i kullanarak veya neredeyse toplanan Atlas üzerinde ızgaranın etrafında gezinin.
- Bu karelerin her birinin merkezini, incelenecek ızgara konumları listesine ekleyin. Bu konumlar bir not defterine, mikroskop kullanıcı arabirimine veya mikroskop otomasyon yazılımına eklenebilir.
- Büyütme oranını 500-1.300x'e yükseltin ve depolanan her ızgara konumunda ösentrik yüksekliği ayarlayın ve kaydedilen Z değerini 7.1.4'te belirtilen konumlara güncelleyin.
- Floresan ekranda veya hızlı bir kamerada, ızgaradaki küçük siyah noktalar/tanecikler için bu yüksek büyütmede arama yapın. İyi bir numune genellikle yüksek büyütmede keskin kenarlara sahiptir, bu da kristalin düzeni gösterir.
- Yerleştirilmiş potansiyel bir kristali ekranın ortasına taşıyın ve büyütmeyi, TEM'in yüksek büyütme moduna girmesi için artırın.
NOT: Bu, farklı enstrümanlarda yüksek büyütme, Zoom2 veya SA modu olarak adlandırılır ve tipik olarak 3.000x veya daha yüksek büyütmelere karşılık gelir. - Seçili bir alan diyaframı ekleyin. Seçilen alanın kristalden sadece daha büyük olduğundan emin olmak için diyafram açıklığını daha büyük veya daha küçük bir boyuta değiştirin (Şekil 3).
- TEM el panellerindeki kırınım düğmesine basarak kırınım moduna geçin ve floresan eleğin takılı olduğundan emin olun. Büyütme düğmesini kullanarak kamera uzunluğunu, kenar en az 1 şçözünürlükte olacak şekilde ayarlayın.
NOT: Kırınım uzunluklarının kalibrasyonu, MicroED deneylerini denemeden önce altın waffle ızgarası veya bilinen numune kullanan bir servis mühendisi tarafından yapılmalıdır. - Kırınım odağını, merkezi nokta mümkün olduğunca keskin ve küçük olacak şekilde ayarlayın. Kırınım kaydırma düğmelerini kullanarak, merkezi kirişi floresan ekranın ortasına getirin
- Kiriş durdurucuyu takın ve kirişin arkasında olduğundan emin olun. Floresan ekranı kaldırın. Fotoğraf makinesinde kısa (yaklaşık 1 sn) pozlama yapın (Şekil 4).
- İlgili kırınım desenini inceleyin. Tam bir veri kümesi toplamak için iyi bir aday, düzenli olarak sütunlar ve satırlar halinde düzenlenmiş keskin noktalara sahip olacak ve kırınım 2 Å'nın ötesine, tercihen en az 1 Å'ya kadar uzanacaktır (Şekil 4). Kristal koordinatları TEM kullanıcı arayüzüne veya bir yere yazarak kaydedin.
- Mevcut ızgara karesindeki tüm potansiyel kristaller için kırınım taramasını tekrarlayın.
- Veri toplama
- Ekrandaki ekranlı bir kristali yüksek büyütmede (1.000x> ortalayın). Kristalin ösentrik yüksekliğini otomatik bir rutin kullanarak veya elle ayarlayın.
- 7.1.8'de belirlenen kristal boyutuna ve şekline en uygun seçilen alan diyafram açıklığını ekleyin (Şekil 3). Görüntü ızgara çubukları tarafından tıkanana kadar sahne alanını negatif ve pozitif yönlerde eğin (Şekil 3). Veri toplama amacıyla bu açılara dikkat edin.
- Veri kümesinin toplam açısal dilimine yayılmak için gereken çerçeve sayısını belirleyin. Her kare için 0,5 - 1,0° kama kullanmak tipiktir, çerçeveler kameranın hassasiyetine bağlı olarak her 1 ila 5 saniyede bir okunur. Örneğin, -30° ile +30° arasında değişen, her 1 saniyede bir okunan bir çerçeve ile 1° s-1 sabit bir hızda dönen bir kama, toplam 60 kare gerektirir.
- -72° ila +72° arasındaki maksimum toplam eğim aralığını göz önünde bulundurarak, sahneyi 1° s-1 sabit bir hızda döndürmeye başlayın ve ardından hareketli deklanşör okuma moduna sahip modern bir kamerada her 1 saniyede bir verileri okumaya başlayın (Film 1). Bu işlem manuel olarak veya TEM'e özgü yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Maksimum eğme hızının % 'sini ve mikroskop kullanıcı arayüzünde veya özel yazılımda ne zaman durulacağını belirterek dönüş hızını ayarlayın. Bu araştırmada, bunun maksimum hızın her % 'si için 0.3 ° s-1 olduğu ölçülmüştür, ancak her mikroskop için bağımsız olarak doğrulanması gerekecektir.
NOT: Eğme ve kamera veri toplama burada bağımsız olarak ayarlanır, ancak yazılım programları14 işlemi basitleştirmek için bunu koordine edebilir. - Belirtilen kamanın her iki tarafında yaklaşık 1 ° 'yi atın, çoğu durumda sahne alanının istenen dönüş hızına yükseldiği veya yavaşladığı ölü zaman olarak atın.
- Maksimum eğme hızının % 'sini ve mikroskop kullanıcı arayüzünde veya özel yazılımda ne zaman durulacağını belirterek dönüş hızını ayarlayın. Bu araştırmada, bunun maksimum hızın her % 'si için 0.3 ° s-1 olduğu ölçülmüştür, ancak her mikroskop için bağımsız olarak doğrulanması gerekecektir.
- Verileri tek tek kareler veya görüntü yığını olarak çeşitli biçimlerde kaydedin (Film 1).
- Bu kırınım çerçevelerini, burada bulunan MicroED araçlarını kullanarak tipik bir kristalografik formata dönüştürün (https://cryoem.ucla.edu). SMV formatında kaydedilen kırınım görüntüleri, belgelenmiş kristalografik yazılım17,18 kullanılarak kolayca işlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MicroED, elektronlar ve madde arasındaki güçlü etkileşimlerden yararlanan ve kaybolan küçük kristallerin araştırılmasına izin veren bir kriyoEM yöntemidir12,13. Bu adımlardan sonra, mikrokristallerden toplanan kristalografik formatta bir kırınım filmine sahip olması beklenmektedir (Film 1). Burada, teknik karbamazepin12 kullanılarak gösterilmiştir. Sonuçlar, bir TEM ızgarasında tanımlanan bir karbamazepin mikrokristalinden sürekli rotasyonlu bir MicroED veri setini göstermektedir (Film 1). İyi bir veri kümesi, bulaşmamış veya bölünmemiş güçlü, net noktalara sahiptir ve her karede,film 19'da adım adım izlenerek kolayca takip edilebilecek tek bir kafese sahiptir. Bu veriler, standart X-ışını kristalografi yazılımı4 kullanılarak kolayca dizine eklenir, entegre edilir ve ölçeklendirilir. Bölünmüş noktalar, çatlamış bir kristalden görülebilir ve aynı kristalin iki yönü yakından hizalanır, ancak tam olarak tesadüf19 değildir. Özellikle birden fazla tek kristalin ızgaradaki bir kümede birbirine yapıştığı bu küçük moleküllü kristaller için çoklu kafesler de oluşabilir. Diğer bir yaygın senaryo, kristallerin parçalanma sırasında yanlış dondurulduğu veya çok sert muamele gördüğü ve kırınım gözlenmediği durumlarda ortaya çıkar9.
Veri toplama, tümleştirme ve yapı çözümünden sonra yüksek çözünürlüklü bir yapının belirlenmesi beklenmektedir (Şekil 5). Net bir yapı çözümü elde etmek, sonuçta verilerin kalitesine ve eksiksizliğine bağlı olacaktır.
Resim 1: Küçük molekül araştırması için önceden kırpılmış bir TEM ızgarasının hazırlanması . (A) Araştırma için numunenin küçük bir kısmını içeren bir tüp. (B) İki mikroskop lamidi arasında ezilmiş numune. (C) Önceden kırpılmış ızgaranın karbon tarafı ve (D) önceden kırpılmış ızgaranın bakır tarafı. (E) Ezilmiş toz üzerine bırakıldıktan sonra önceden kırpılmış bir TEM ızgarası. Ölçek çubukları 3 mm (C), (D) ve (E). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TEM'deki küçük moleküllü kristallerin tanımlanması. (A) Düşük büyütmede tüm ızgaralı bir atlas veya montaj. (B) Tarama için kullanılan tek bir düşük büyütmeli görüntü. (C) Daha küçük tanecikleri tanımlamak için kullanılan daha yüksek büyütme görüntüsü. (D) Topaklanmış küçük moleküllü bir kristalin yüksek büyütmeli mikrografisi. Ölçek çubuğu 750 μm in (A), 50 μm in (B), 10 μm in (C), 1 μm in (D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MicroED veri toplama için mikrokristallerin taranması ve hizalanması . (A) Bir mikrokristalin yüksek büyütme mikrografisi. (B) Seçilen alan açıklığı içindeki izole kristalin mikrografisi. (C) Sahne alanı -69 ° 'ye eğilmiş olarak diyafram açıklığındaki aynı mikrokristal. Ölçek çubuklarının tümü 1 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MicroED verilerine örnekler . (A) Yüksek çözünürlüklü yapı belirlemeye uygun net, keskin noktalara sahip yüksek kaliteli MicroED verileri. (B) Zayıf kafes tanımına sahip zayıf, bulaşmış MicroED verileri. Bu örnekte hizalama da kapalıdır, bu nedenle kırınım görüntünün yalnızca bir tarafında görünür (C) Birden fazla kafes ve bölünmüş ve/veya bulaşmış noktaları gösteren zayıf MicroED verileri. Sağ altta bulaşmış ve bölünmüş noktaları gösteren mavi alan girintisi gelişmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Karbamazepinin MicroED yapısı. Atomik model, beyaz, oksijen kırmızısı ve azot mavisi renkli karbon atomlu çubuklar olarak gösterilmiştir. 2Fo-F c haritası 1,5 σ seviyesinde konturlu ve mavi renklidir. Hidrojenleri gösteren Fo-F c haritası 3.0 σ seviyesinde konturlanmış ve yeşil renktedir. Bu rakam EMDB-928410'un biriken haritalarından uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Karbamazepinden MicroED veri seti. Veri kümesi, -68° ile +20° arasında neredeyse 90° aralığındadır. Her kırınım paterni, karşılıklı uzayda 0,5°'lik bir kama kapsar ve 0,01 e- Å-2 s-1 pozlama hızında 1'lik bir pozlamaya karşılık gelir. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numune hazırlama tipik olarak, tarama ve veri toplama oturumlarından sonra optimizasyonların yapıldığı yinelemeli bir işlemdir. Küçük moleküllü numuneler için, birçok farmasötik hidrofobik olma eğiliminde olduğundan, ızgaraları kızdırmadan ilk önce ızgara hazırlamayı denemek genellikle ihtiyatlıdır10,11. Izgaralarda çok az nanokristal birikintisi varsa, ızgaraları ilk kez kızdırdıktan sonra tekrar denemek iyi bir fikirdir. Liyofilize tozlardan elde edilen kristallerin iyi veri toplamak için çok büyük ve kalın olması söz konusu olabilir. Bu gibi durumlarda, daha büyük bir kristalin kenarından veya daha ince bir kısmından veri toplamak mümkün olabilir. Bunun zor olduğu kanıtlanırsa, harç ve havane gibi daha pürüzlü bir yüzey kullanarak tozun daha ince bir kıvama getirilmesi gerekebilir.
MicroED verileri tipik olarak 4,20 mikroprobmodunda çalışan TEM ile toplanır. Burada, 0,01 e- Å-2 s-1 maruz kalma hızına karşılık gelen TEM ışınının boyutu tipik olarak çapı yaklaşık 10 μm'dir ve bu da tipik mikrokristaller 1,21'den çok daha büyüktür. Sinyal daha sonra seçilen bir alan açıklığı kullanılarak ilgili kristallerden izole edilir (Şekil 3)2,20. Çeşitli diyafram açıklığı boyutları, kurulumun değişen kristal boyutlarına hızlı bir şekilde ayarlanmasını sağlar. Alternatif olarak, nano prob modunda çalışan TEM ile veri toplamak mümkündür. Bu, kirişin boyutunu yaklaşık 5 kat azaltır. Daha küçük bir ışın, ışın ayak izinde orantılı olarak daha yüksek bir pozlama oranına karşılık gelir. Birçok TEM iki kondenser lens sistemi olduğundan, paralel koşul, ışının mikroprob veya nano prob modunda tek bir boyutta olmasını gerektirecektir. Tabanca lensini ayarlamadan nano probda 0,01 e- Å-2 s-1 pozlama oranına ulaşmak zordur. İkisi arasındaki seçim kullanıcıya kalmış. Nano probun bir avantajı, görüntüleme ve kırınım çalışma modları arasında seçilen alan açıklığını yerleştirmeye ve geri çekmeye daha az ihtiyaç duyulmasıdır. Bununla birlikte, modern mikroskoplarda SA açıklığının yerleştirilmesi ve geri çekilmesi otomatik ve doğrudur. Mikroprob, seçilen alan açıklıklarının birden fazla boyutuna erişerek kırınımı izole etmede daha fazla esneklik sunar. Mikroprobdaki daha büyük ışın yakındaki kristalleri de açığa çıkarabilirken, nano prob bireysel kristalleri daha hassas bir şekilde hedefleyebilir.
Sunulan protokol, laboratuvarımızda kullanılan küçük moleküller için MicroED veri toplamaya standart yaklaşımdır 10,11,12,13. Uygulanabilecek birçok uyarlama ve değişiklik vardır. Yüksek kristal yoğunluğuna sahip ızgaralar yapmak için en iyi yaklaşım, kullanıcının belirli bir yaklaşıma aşinalığına bağlıdır. İlaçların, kırınım gücünü kaybetmeden fiziksel olarak parçalanamayacak kadar kırılgan olan büyük kristaller olarak bulunduğu birçok durum vardır19. Bu durumlarda, kristalleri MicroED 6,7,8,9,22 için daha erişilebilir hale getirmek için inceltmek için yakın zamanda uyarlanmış odaklanmış iyon ışını frezeleme yöntemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Gonen laboratuvarı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nün fonlarıyla desteklenmektedir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri P41GM136508 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T.
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W.
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
