Summary
Denne protokol er til bestemmelse af lipider i havvand og biologiske prøver. Lipider i filtrater ekstraheres med chloroform eller blandinger af chloroform og methanol i tilfælde af faste stoffer. Lipid klasser måles ved stang tynd-lag kromatografi med flamme ionisering afsløring og deres sum giver det samlede lipid indhold.
Abstract
Lipider består i vid udstrækning af kulstof og brint og giver derfor en større specifik energi end andre organiske makromolekyler i havet. At være kulstof- og brintrige er de også hydrofobiske og kan fungere som opløsningsmiddel og absorptionsbærer for organiske forurenende stoffer og kan således være drivkræfter for forurenende bioakkumulering i marine økosystemer. Deres hydrofobiske natur letter deres isolering fra havvand eller biologiske prøver: marine lipidanalyse begynder med prøveudtagning og derefter udvinding i ikke-polære organiske opløsningsmidler, hvilket giver en bekvem metode til deres adskillelse fra andre stoffer i en akvatisk matrix.
Hvis der er udtaget prøver af havvand, omfatter det første trin normalt adskillelse i operationelt definerede "opløste" og "partikelfraktioner" ved filtrering. Prøver indsamles og lipider isoleres fra prøvematrixen typisk med kloroform for virkelig opløst stof og kolloider og med blandinger af chloroform og methanol til faste stoffer og biologiske prøver. Sådanne ekstrakter kan indeholde flere klasser fra biogene og menneskeskabte kilder. På dette tidspunkt, samlede lipider og lipid klasser kan bestemmes. Total lipid kan måles ved at opsummere individuelt bestemte lipid klasser, som sædvanligvis er blevet kromatisk adskilt. Tyndt lag kromatografi (TLC) med flammeionisering detektion (FID) bruges regelmæssigt til kvantitativ analyse af lipider fra marine prøver. TLC-FID giver synoptisk lipid klasse information og, ved opsummering klasser, en total lipid måling.
Lipid klasse information er især nyttig, når de kombineres med målinger af individuelle komponenter, f.eks fedtsyrer og / eller steroler, efter deres frigivelse fra lipid ekstrakter. Den brede vifte af lipidstrukturer og -funktioner betyder, at de anvendes bredt i økologisk og biogeokemisk forskning, der vurderer økosystemets sundhed og graden af indflydelse fra menneskeskabte virkninger. De er blevet anvendt til at måle stoffer af kosten værdi for havfauna (f.eks. aquafeeds og/eller byttedyr) og som en indikator for vandkvaliteten (f.eks. kulbrinter).
Introduction
De metoder, der er beskrevet her, vedrører stoffer, der defineres operationelt som marine lipider. Denne definition er baseret på deres evne til væskevæskeudvinding i ikke-polære organiske opløsningsmidler, og den giver en bekvem metode til deres adskillelse fra andre stoffer i en akvatisk matrix. Deres hydrofobiske natur letter deres isolation fra havvand eller biologiske prøver samt deres berigelse og fjernelse af salte og proteiner.
Målingen af lipidindhold og dets sammensætning i marine organismer har været af stor interesse for fødevarenetøkologi, akvakultur ernæring og fødevarevidenskab i årtier. Lipider er universelle komponenter i levende organismer, der fungerer som væsentlige molekyler i cellemembraner, som vigtige kilder til biotilgængelig energi, der giver varmeisolering og opdrift og tjener som signalmolekyler. Selv om procedurerne for lipidbestemmelse på andre områder er blevet beskrevet godt, kræver deres anvendelse sammen med marineprøver almindeligvis modifikationer for at tilpasse sig feltforholdene samt til prøvetype1.
For havvandsprøver kræver det første trin normalt adskillelse i de operationelt definerede "opløste" og »partikelfraktioner«, normalt ved filtrering (protokoltrin 1). Partikelfraktionen er det, der bevares af filteret, og størrelsen af porerne er vigtig for at definere cut-off2. Ofte når vi prøver partikler, vil vi gerne relatere lipidkoncentrationer til de samlede massekoncentrationer, i hvilket tilfælde der skal udtages en separat, mindre prøve (f.eks. 10 mL) til dette formål (protokoltrin 1, bemærk). For at få en nøjagtig massebestemmelse er det vigtigt at tilføje ammoniumformat (35 g/L) i slutningen af filtreringen.
Havvandsfiltratet fra den større prøve skal udgøre mellem 250 mL og 1 L afhængigt af prøvetypen og udsættes for væskevæskeudvinding i en separatortragt (protokoltrin 2). Lipiders hydrofobiske karakter betyder, at de kan adskilles fra andre forbindelser ved ekstraktion i et ikkepolar opløsningsmiddel som chloroform. Et tolagssystem er skabt, hvor lipider partition i det organiske lag, mens vandopløselige komponenter forbliver i det vandige lag.
Partikelprøver på et filter eller biologiske prøver ekstraheres med en modificeret Folch et al. ekstraktion3, der også involverer chloroform (protokoltrin 3). Igen skabes et organisk / vandigt system, hvor lipider opdeles i den organiske fase, mens vandopløselige molekyler forbliver i den vandige fase, og proteiner udfældes. Faktisk bruger de fleste laboratorier for faste stoffer en vis variation af Folch et al. extraction3-proceduren, der involverer chloroform og methanol. For filtre er det første skridt at homogenisere i 2 mL kloroform og 1 mL methanol.
Under udvindingen skal det sikres, at lipider beskyttes mod kemisk eller enzymatisk modifikation ved at opbevare prøver og opløsningsmidler på is for at reducere esterbinding hydrolyse eller kulstof-carbon dobbeltbindingsinoxidation. Væv og celle lipider er ganske godt beskyttet af naturlige antioxidanter og ved opdeling4; Efter homogeniseringen af prøver kombineres celleindholdet dog, hvilket gør lipider mere tilbøjelige til at ændre sig, kemisk eller enzymatisk. Nogle lipider, såsom de fleste steroler, er meget stabile, mens andre, såsom dem, der indeholder flerumættede fedtsyrer, er mere modtagelige for kemisk oxidation. Andre, såsom steroler med konjugerede dobbeltbindinger, er tilbøjelige til oxidation katalyseret af lys5. Efter ekstraktioner er lipider meget mere modtagelige for kemisk oxidation, og prøver bør opbevares under en inert gas som nitrogen. En blid strøm af kvælstof vil også blive brugt til at koncentrere ekstrakter.
Efter koncentration ville lipider normalt blive kvantificeret i løs vægt, da de er en vigtig komponent i marine økosystemer, der giver en høj koncentration af energi, mere end det dobbelte af kJ / g af kulhydrater og proteiner. Uvægerligt vil de næste blive kvantificeret som individuelle komponenter: den omfattende analyse af lipider indebærer generelt adskillelse i enklere kategorier i henhold til deres kemiske karakter. Således indebærer en fuld analyse måling af samlede lipider, lipidklasser og individuelle forbindelser.
Total lipid kan bestemmes ved at tage summen af individuelt målte lipid klasser adskilt af kromatografi6. En marine lipid ekstrakt kan indeholde mere end et dusin klasser fra biogene og menneskeskabte kilder. Den brede vifte af lipid strukturer betyder meget information kan opnås ved at bestemme individuelle gruppering af strukturer. Lipid klasser individuelt, eller i visse grupper, er blevet brugt til at signalere tilstedeværelsen af visse typer af organismer, samt deres fysiologiske status og aktivitet2. De er også blevet anvendt som en indikator for oprindelsen af organisk materiale, herunder opløst organisk materiale (DOM) samt hydrofobiske forurenende stoffer.
Triacylglycerols, fosfolipider og steroler er blandt de mere vigtige biogene lipidklasser. De to første er biokemisk beslægtede, da de har en glycerol rygrad, hvortil to eller tre fedtsyrer er esterificeret (figur 1). Triacylglyceroler er sammen med voksestere meget vigtige opbevaringsstoffer, mens andre fedtsyreholdige lipidklasser såsom diacylglyceroler, frie fedtsyrer og monoacylglyceroler generelt er mindre bestanddele. Frie fedtsyrer er til stede ved lavere koncentrationer i levende organismer, da de umættede kan være giftige7. Steroler (både i deres frie og esterificerede former) og fede alkoholer er også inkluderet blandt de mindre polære lipider, mens glycolipider og fosfolipider er polære lipider. Polar lipider har en hydrofil gruppe, som giver mulighed for dannelse af lipid bilayers findes i cellemembraner. Gratis steroler er også membran strukturelle komponenter, og når de tages i forhold til triacylglycerols de giver en tilstand eller ernæringsmæssige indeks (TAG : ST), som har været meget udbredt8. Når de tages i forhold til fosfolipider (ST : PL), kan de bruges til at indikere plantens følsomhed over for salt: højere værdier opretholder strukturel integritet og reducerer membranens permeabilitet9. Det inverse forhold (PL : ST) er blevet undersøgt i toskallet væv under temperaturtilpasning10.
Marine lipid klasser kan adskilles af tyndt lag kromatografi (TLC) på silica gel belagt stænger (Protokol trin 4) og derefter detekteres og kvantificeres ved flamme ionisering detektion (FID) i en automatisk FID scanner. TLC/FID er rutinemæssigt blevet brugt til marine prøver, da det hurtigt leverer synoptiske lipidklassedata fra små prøver og ved at tage summen af alle klasser, en værdi for total lipider. TLC/FID har været underkastet en kvalitetssikringsvurdering og blev fundet at opfylde de standarder, der kræves for konsekvent ekstern kalibrering, lave emner og præcis replikeringsanalyse11. Variationskoefficienter (CV) eller relative standardafvigelser er omkring 10 %, og FID-scannerens samlede lipiddata er normalt omkring 90 % af dem, der opnås ved gravimetriske og andre metoder2. Gravimetry giver højere samlede lipider sandsynligvis, fordi FID scanner måler kun ikke-flygtige forbindelser, og også som et resultat af mulig optagelse af ikke-lipid materiale i gravimetriske målinger.
Oplysningerne fra lipid klasse analyse er især nyttige, når de kombineres med bestemmelser af fedtsyrer som enkeltpersoner, eller steroler, eller de to i kombination. Det første skridt i retning af disse analyser omfatter frigivelse af alle komponent fedtsyrer sammen med steroler i lipid ekstrakter (protokol trin 5). Den brede vifte af lipidstrukturer og -funktioner betyder, at de har set bred anvendelse i økologiske og biogeokemiske undersøgelser, der vurderer økosystemets sundhed og i hvilket omfang de er blevet påvirket af menneskeskabte og terrestriske input. De er blevet anvendt til at måle biosyntese af stoffer af kosten værdi til marine fauna samt til at angive kvaliteten af vandprøver. Måling af lipider i sedimentkerneprøver hjælper med at vise sedimenternes følsomhed over for ændringer i menneskers arealanvendelse nær land-hav-margenen.
Det primære værktøj til at identificere og kvantificere individuelle lipidforbindelser har traditionelt været gaskromatografi (GC) med FID. Før analyse dog, disse forbindelser er gjort mere flygtige ved derivatization. Fedtsyrer frigives i nærværelse af en sur katalysator (H2SO4) fra acyl lipidklasser (Figur 1). I organisk kemi er acylgruppen (R-C=O) normalt afledt af en carboxylic syre (R-COOH). De er derefter re-esterified til fedtsyrer methyl estere (FAME), som giver bedre adskillelser på GC kolonner (Protokol trin 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: For at rengøre glasvarer, instrumenter og filtre til lipidanalyser skal de vaskes 3 gange med methanol efterfulgt af 3 vaskes med kloroform eller opvarme dem til 450 °C i mindst 8 timer.
1. Filtreringsprocedure for opløst havvand og partikellipider
BEMÆRK: Den særlige del af interessen er operationelt defineret ved filtreringsproceduren. I dette tilfælde er porestørrelsen 1,2 μm.
- Sæt filtreringsmanifolden op uden filter, og skyl opsætningen med filtreret havvand.
- Brug rene sammenkrammer placere en 47 mm glasfiber (GF / C) filter, der er blevet vasket, i det rene filtreringssystem.
- Tag prøven og hvirvl forsigtigt for at genbruge materiale, der måtte have lagt sig på bunden af opsamlingsbeholderen. Nøjagtigt måle en kendt diskenhed, i dette tilfælde 1 L, og filtrere dette gennem filteret.
BEMÆRK: Volumenet vil afhænge af mængden af partikler i prøven: normalt mellem 250 mL og 5 L afhængigt af sæson og placering. - Når prøven er målt ud, skal filteret forsigtigt våds med filtreret havvand. Tilsæt hele prøven langsomt til filtreringssystemet og skyl den graduerede cylinder med filtreret havvand for at sikre, at alle partikler tilsættes til filteret. Skyl opsætningen med filtreret havvand på siderne for at sikre, at alle partikler skylles ned på filteret.
- Lad alt havvand passere gennem filteret, men lad ikke filteret tørre helt ud, da det kan forstyrre cellerne på filteret; sugning, da det sidste af vandet forsvinder.
- Ved hjælp af rene sammenkrulninger og en ren pipette foldes filteret i halve, derefter i tredjedele og derefter i halve på langs for at rulle filteret ind i et rør. Læg den i et rent, mærket 10 mL glasglasglas.
- Dæk filteret med 2 mL kloroform. Fyld hovedrummet med nitrogen og tætning med PTFE-tape. Placer i et stativ i en -20 °C fryser. Prøverne vil være stabile ved denne temperatur op til et år.
BEMÆRK: For at relatere lipidkoncentrationer til de samlede massekoncentrationer er der også behov for en tørvægtmåling. Dette indebærer at sætte et 24 mm forvejet filter i en tørvægtfiltreringsopsætning, omrøring af prøven og tage et lille undersalmple, som filtreres på det lille filter. Når filteret er næsten tørt, tilsættes ca. 10 mL 3,5% ammoniumformat til filteret. Filteret foldes i halve, returneres til en mærket Petriskål og placeres i en fryser.
2. Væskevæskeudvinding af havvand eller flydende prøver
-
Forudindpakning af prøven
- Mål en kendt mængde filtrat i en lipid rent glas gradueret cylinder. Læg prøven i en ren 1 L-separatortragt. Tilsæt derefter 20 mL kloroform til prøven og ryst i 2 min, udluftning ofte.
-
Fjernelse af første ekstrakt og tilsætning af syre efter første adskillelse
- Wrap tragt i aluminiumsfolie og vente 5 til 10 minutter for adskillelse at forekomme. Skræl bunden af folien tilbage for at se de to lag. Saml bunden, organisk lag gennem stophanen i en ren rundbundet kolbe, pas på ikke at inkludere noget af det øverste lag. Hætte den runde bundkolbe under nitrogen og læg den i fryseren.
- Prøven tilsættes til prøven i separatorragten, og tragten rystes forsigtigt.
- Tilsæt 10 mL kloroform og ryst kraftigt i 2 min, mens udluftning ofte. Lad adskillelsen finde sted.
-
Anden og tredje adskillelse
- Vent på adskillelsen og tilsæt det nederste lag i den runde bundkolbe.
- Tilsæt en tredje 10 mL kloroform, og ryst i 2 minutter, igen udluftning ofte. Efter adskillelse skal du tilføje det nederste lag til den runde bundkolbe.
- Ekstraktet overføres i den runde bundkolbe til en roterende fordamper, fordamper og overføres til et 2 mL-hætteglas.
3. Ekstraktionsprotokol for faste stoffer (modificeret Folch et al. 3-udvinding)
-
Installationsprogrammet
BEMÆRK: Udsugningsopsætningen kræver en isoleret beholder fyldt med is. Opløsningsmidler omfatter methanol, kloroformt udvundet vand og 2:1 chloroform:methanol. Alle opløsningsmidler skal placeres på is, så de er kolde, når udvindingerne startes. Prøverne går også på is, så alt forbliver koldt.- Skyl alle rør og PTFE forede hætter 3 gange med methanol og derefter 3 gange med kloroform. Der kræves et centrifugerør og et 15 mL hætteglas med hætte til hver ekstraktion.
- Prøven anbringes i et centrifugerør, der indeholder 2 mL kloroform. Størrelsen af prøven afhænger af mængden af lipid til stede, ca 5 til 10 mg lipid foretrækkes.
-
Slibning og udvinding
- Tilsæt ca. 1 mL iskoldt methanol, og prøven slibes hurtigt i en pulp med en ren homogenisator eller PTFE/metalafkølet stang.
- Stangen skylles tilbage i røret med ca. 1 mL iskold 2:1 kloroform: methanol og derefter med 1/2 mL iskoldt kloroformt udvundet vand. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge et rent sæt af sammentak til at tvinge partikler tilbage i hætteglasset før vask. Cap røret og sonikere blandingen i 4 minutter i et ultralydsbad (35 - 42 kHz).
-
Dobbelt pipettering: Centrifuge prøven i 2 min ved 1800 × g. Saml hele det organiske lag (nederste lag) ved hjælp af dobbelt pipettering teknik, hvor en 5 3 /4 "pipette med pæren på løst er forsigtigt skubbet gennem de to lag, mens klemme pæren, forårsager bobler til at komme ud.
- Når bunden af det andet lag er nået, skal du bruge tommelfingeren til at fjerne pæren uden at trække det organiske lag ind i pipetten. Placer en 9"pipette inde i 5 3/4"-en, og fjern det nederste lag gennem 5 3/4"-pipetten.
- Anbring ekstraktet i et rent hætteglas. Fortsæt med at tage det nederste lag af, indtil det hele er fjernet.
-
Vaskepipetter: Skyl 9" pipetten i hætteglaset, der indeholder det organiske lag, ved hjælp af 1,5 mL iskold kloroform til at skylle ned på ydersiden af pipetten og 1,5 mL for at skylle indersiden ned. Drej forsigtigt pipetten, mens du vasker, og sørg for, at al kloroformen løber ned ad pipetten til hætteglas.
- Skyl 5 3/4" pipetten i røret, der indeholder vandige lag på samme måde.
- Sonikere og centrifuge prøverne og dobbelt pipette, når de adskilles, ved hjælp af nye pipetter hver gang. Gentag mindst tre gange og pulje alle organiske lag. Når det organiske lag er fjernet for tredje gang, vaskes begge pipetter i hætteglasset, der indeholder det organiske lag.
- Brug en blid strøm af kvælstof, koncentrer dig ned til volumen, forsegles derefter med PTFE-tape og opbevares i en fryser.
4. Udvikling af systemer og trin til stang TLC adskillelse af marine lipid klasser
-
Prepping stængerne til TLC
- Scan blankt stængerne i den automatiske FID-scanner tre gange
- Spotting en prøve: Påfør prøver og standarder med en sprøjte til stængerne på eller lige under oprindelsen. Hæld 0,5 μL ud, og tryk på dråben til stangen. Lad det tørre, før du placerer den næste dråbe på samme sted. Spot alle prøver i en linje på stænger.
- Fokusering i acetone:Fokus prøver to gange (tre gange, hvis prøverne er meget koncentreret) i 70 ml acetone. Se opløsningsmidlet foran, da det klatrer stangen, indtil bunden af stedet smelter sammen med toppen. Fjern stængerne, tør dem i ca. 5 s, og gentag derefter proceduren for at producere et smalt bånd af lipidmateriale nær bunden af stangen.
- Tør og konditioner stængerne i et konstant fugtighedskammer i 5 min. Et konstant fugtighedskammer er en udtørrer med en mættet opløsning af calciumchlorid under pladen.
-
Sekvens, der fører til det første kromatogram (kulbrinte til keton)
-
Første udviklingssystem: Det første udviklingssystem er hexan:diethyl ether:formic acid, 98.95:1:0.05. Brug en sprøjte til at tilføje myresyren, men skyl først sprøjten 3× med myresyre. Skyl myresyren ud af sprøjten umiddelbart efter med kloroform. Brug 30 mL af blandingen til at våd papiret og skylle tanken. Kassér skylleopløsningen, og tilsæt de resterende 70 mL til tanken.
- Tag stativerne og sænk dem forsigtigt ned i tanken. Hold øje, indtil opløsningsmiddelfronten når prøvepletterne, og start derefter timeren. Efter 25 min skal du fjerne stængerne fra udviklingskammeret, tørre i konstant fugtighedskammeret i 5 minutter og ombygge den samme opløsning i yderligere 20 minutter.
- Tør stængerne i 5 minutter i den automatiske FID-scanner og scan derefter til det laveste punkt bag ketontoppen ved hjælp af en PPS-scanning på 25.
-
Første udviklingssystem: Det første udviklingssystem er hexan:diethyl ether:formic acid, 98.95:1:0.05. Brug en sprøjte til at tilføje myresyren, men skyl først sprøjten 3× med myresyre. Skyl myresyren ud af sprøjten umiddelbart efter med kloroform. Brug 30 mL af blandingen til at våd papiret og skylle tanken. Kassér skylleopløsningen, og tilsæt de resterende 70 mL til tanken.
-
Sekvens, der fører til det andet kromatogram (triacylglycerol til diacylglycerol):
- Konditioner stængerne i 5 minutter i konstant fugtighedskammeret.
- Andet udviklingssystem: Det andet udviklingssystem er hexan:diethylther:formic acid, 79:20:1. Tilsæt ~ 30 mL til udviklingstanken for at våd papiret og skylle tanken. Kassér derefter og udvikl stængerne i 40 min i de resterende 70 mL. For den bedste adskillelse mellem TAG (mættet) og TAG (flerumættede) toppe bruge en blanding af 79.9:20:0.1, men for adskillelse af ST og DAG toppe bruge en blanding af 79:20:1.
- Tør og scan til laveste punkt bag diacylglycerol peak i en anden delvis scanning ved hjælp af en PPS scanning 11.
-
Sekvens, der fører til det tredje kromatogram (acetone-mobil polar lipid og fosfolipid)
- Konditioner stængerne i 5 minutter i konstant fugtighedskammeret.
- Udvikl stængerne to gange i 15 minutter i 70 ml acetone. Mellem udviklingen lufttørre stængerne i ca 30 sekunder.
- Konditioner stængerne i 5 minutter i konstant fugtighedskammeret.
- Tredje udviklingssystem: Det tredje udviklingssystem er en blanding af chloroform, methanol og kloroformt udvundet vand, 50:40:10. Udvikl stængerne to gange i 10 minutter i 70 mL af blandingen. Mellem udviklingen tørrer luften stængerne i ca. 30 sekunder.
- Tør og scan hele længden af stænger.
5. FAME derivatization med H2SÅ4 i MeOH
-
Gør Hilditch reagens
- Tilbering af methanolen: Læg 100 mL MeOH i en ren volumetrisk kolbe, og drys derefter forsigtigt i vandfri NaSO4, indtil bunden af kolben er dækket. Når det er dækket, vendes to gange, så noget vand i metanol absorberes af NaSO4. Efter invertering og rysten skal den sidde i mindst 5 min.
- Tilsætning af syren: Langsomt dekanter methanolen i en glaskrukke (nu er NaSO4 en hård klump i bunden af kolben), og H2SO4 tilsættes. Tilsæt langsomt 1,5 mL svovlsyre til methanolen ved hjælp af en pipette. Tilsæt et par dråber ad gangen, og når al syren er tilsat, hætte og forsigtigt rør for at blande. Løsningen er nu klar til at blive brugt til derivater, men den skal laves ugentligt.
-
Fremstilling af derivater
- Overfør ca. 200 μg lipider fra et ekstraktglas, der har fået volumenet bragt op til en kendt mængde, til et rent, 15 mL hætteglas og fordamper under nitrogen til tørhed. Den fjernede mængde bestemmes af koncentrationen af prøven fra TLC/FID. Brug en ren pipette til at fjerne prøven.
- Når prøven er tørret, tilsættes 1,5 mL dichlormethan og 3 mL af det nyfremstillede Hilditch-reagens.
- Vortex prøven, og sonikere det i et ultralyd bad i 4 minutter for at fjerne lipider, der har klæbet til glasglasset. Fyld hætteglasset med nitrogen, hætte, og forsegle det med PTFE tape og varme ved 100 ° C i 1 time.
-
Standsning af reaktionen
- Lad prøverne køle helt af til stuetemperatur i 10 minutter efter fjernelse fra ovnen, og åbn derefter hætteglassene forsigtigt.
- Tilsæt langsomt ca. 0,5 mL mættet natriumbicarbonatopløsning (9 g/100 mL kloroform-ekstraheret vand), derefter 1,5 mL hexan. Ryst eller hvirvler hætteglasset, så lad stå, så det adskiller sig i 2 lag.
-
Indsamling af FAME's
- Fjernelse af det øverste lag: Når derivatiseringen er standset, og der er klar adskillelse, skal du fjerne den øverste, organiske fase og placeres i et lipid rent 2 mL hætteglas.
- Opløsningsmidlet fordampes i 2 mL-hætteglasset til tørhed, og genopfyld det med hexan til ca. 0,5 mL.
- Fyld hætteglasets hovedrum med nitrogen, hætte og forsegle hætteglasset med PTFE-tape, sonikere i yderligere 4 minutter for at suspendere fedtsyrerne igen, og så er det klar til at gå til GC.
BEMÆRK: Hvis der er behov for fedtsyrer, skal vandige lag vaskes tre gange med hexan og alle de organiske lag samlet i 2 mL hætteglaset. Dette indebærer tilsætning af 2 mL hexan, hvirvlende prøven, centrifugering, og fjerne det organiske lag, alle gentages 3 gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som den hurtigst voksende fødevareproduktionssektor udvikler akvakulturen sig med hensyn til teknologiske innovationer og tilpasninger for at opfylde skiftende krav. En af disse er at mindske afhængigheden af fiskemel og fiskeolie, der stammer fra vilde kilder, og som leverer foderingredienser til mange akvakulturarter. Terrestriske planteolier undersøges som bæredygtige og økonomiske erstatninger for fiskeolie i aquafeeds, og leveren er et målvæv til analyse, fordi det er det primære sted for lipid metabolisme12. Figur 2 viser de rå TLC-FID-kromatogram fremstillet af vores nikomponentstandard, en kost, vi formulerede med fiskeolie på 7% og rapsolie på 5%, og levervæv fra en atlanterhavslaks fodret med denne diæt. Tabel 1 viser de data, der er opnået efter analyse af kost replicateter og prøver fra forskellige fisk. Disse data blev indhentet efter konstruktion af standardkurver fra scanner-FID-svar for at kvantificere lipidklasserne i uddragene ved hjælp af Peak Simple-software (version 4.54). Dataene viser forekomsten af triacylglyceroler i kostvaner og lever og også betydningen af membranfosfolipider i leveren.
Kontinentale margener har generelt meget høj biologisk produktivitet, og de er særligt vigtige i cykling af kulstof. Overflade primær produktivitet når havbunden mere i lavere vand, og så måling af mængden og kvaliteten af partikler bosætte sig fra det øverste blandede lag i den bentiske føde web er af stor interesse. Lipider er rige på kulstof og har et meget højt energiindhold og er vigtige komponenter i kontinentalhyldernes produktivitet. Historisk set støttede farvande ved siden af Newfoundland og Labrador et af de største fiskerier i verden i omkring fem århundreder, og vi har studeret produktion og overførsel af lipider i dette system13. Figur 3 viser TLC-FID kromatrammer fremstillet fra vores standard, lipider i afregning partikler indsamlet på 220 m ud for kysten af Newfoundland, og lipider i en lille mysid, Erythrops erythrophtalma indsamlet nær samme dybde. Denne gang er kromatogrammet blevet behandlet gennem plottesoftware, og de to delvise scanninger er blevet kombineret med den endelige komplette scanning. Tabel 2 viser de data, der er opnået efter analyse af gentagne prøver af afregning af partikler og mysid. Blandt 19 taxa fra 5 phyla havde den lille mysid i gennemsnit den højeste lipidkoncentration (6% af vådvægt)13.
Figur 1: Hovedlipidklasser i marineprøver i en omtrentlig rækkefølge af stigende polaritet. Hver struktur tegnes med den mest hydrofobiske del af molekylet, der peger mod højre for figuren. Repræsentative forbindelser til lipidklasser er:- kulbrinte: nonadecane; voks ester: hexadecyl palmitat; steryl ester: cholesteryl palmitat; methyl ester: methylpalitat; keton: 3-hexdecanone; triacylglycerol: tripalmitin; fri fedtsyrer: palmesyre; alkohol: fyto; sterol: kolesterol; diacylglycerol: dipalmitoyl glycerol; monoacylglycerol: monopalmitoyl glycerol; glycolipid: digalactosyl diacylglycerol; fosfolipid: dipalmitoylphosphatidylcholin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: TLC-FID-kromatrammer af lipidsammensætning fra et akvakulturfoderforsøg. Ekstrakter blev spottet på silica gel-coated TLC stænger og en tre-trins udviklingssystem blev brugt til at adskille lipid klasser. Det første og andet udviklingssystem var henholdsvis hexan:diethylether:formic syre (98.95:1:0.05) og (79.9:20:0.1) for at adskille neutrale lipider, herunder triacylglycerol, fri fedtsyre og sterol til scanning i den automatiske FID-scanner. Det tredje udviklingssystem bestod af 100% acetone før chloroform:methanol:vand (5:4:1) for at adskille acetone-mobile polar lipider og fosfolipider. Standardkurver (dvs. nonadecane, cholesteryl palmitat, 3-hexdecanone, tripalmitin, palmitic syre, cetylalkohol, kolesterol, monopalmitoylglycerol, dipalmitoylphosphatidylcholin) blev brugt til at kvantificere lipidklasserne i ekstrakterne ved hjælp af Peak Simple software (version 4.54). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: TLC-FID kromatogrammer af lipid sammensætning af nærbundsprøver fra kystnære Newfoundland. a) ni komponent standard, b) 220 m afregning partikler fra Conception Bay, Newfoundland, c) lipid klasser i mysid, Erythrops erythrophtalma. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Fiskeolie/rapsolie kost | Lakselever fra Atlanterhavet | |
| Kulbrinter | 1.3±0.9 | 0,5±0,2 |
| Steryl estere/voks estere | 0,4±0,6 | 0,6±0,3 |
| Ethyl Estere | 0 | 0 |
| Methyl estere | 0 | 0 |
| Ethyl ketoner | 0 | 0,3±0.2 |
| Methyl ketoner | 0 | 0 |
| Glyceryl Ethers | 0 | 0 |
| Triacylglycerols | 145.0±26.3 | 16.9±8.1 |
| Frie fedtsyrer | 21.9±2.2 | 1.2±0.9 |
| Alkoholer | 0 | 1.4±0.4 |
| Steroler | 6.8±2.1 | 2.6±0.2 |
| Diacylglycerols | 0 | 0 |
| Acetone Mobile Polar Lipids | 14.0±2.5 | 2.2±0.6 |
| Fosfolipider | 12.5±4.0 | 22.0±2.0 |
| Lipider i alt | 201.8±27.4 | 47.7±11.8 |
Tabel 1: Lipidsammensætning i et akvakulturfoderforsøg. Data er (middelværdi±standardafvigelse) af en eksperimentel kost, der indeholder 6,80% fiskeolie og 4,80% rapsolie, som fodret (mg g-1 vådvægt) og af lever af atlanterhavslaks (mg g-1 vådvægt) efter fodring af denne diæt i 12 uger.
| Afregning af partikler | Erythrops erythrophtalma | |
| Steryl Estere /Voks Estere (% samlede lipid) | 10.2±8.28 | 8.85±1.67 |
| Triacylglyceroler (% total lipid) | 19.7±5.35 | 58.5±9.19 |
| Fosfolipider (% total lipid) | 16.2 ± 3.51 | 21.4±5.35 |
| Neutral Lipider (% total lipid) | 12.5±4.0 | 73.4±5.46 |
| Lipolyseindeks (%) | 18.1±5.20 | 2.77±2.78 |
| Lipider i alt | 0,57±0,25 | 5.86±1.44 |
| Neutrale lipider: kulbrinter, voks og sterylestere, ketoner, triacylglyceroler, frie fedtsyrer; (FFA), alkoholer (ALC), steroler, diacylglyceroler; LI: lipolyseindeks [(FFA + ALC) (acyl lipider + ALC)–1]; Lipid i alt (summen af TLC/FID-bestemte lipidklasser) partikler - vægtprocent, Mysid - % vådvægt | ||
Tabel 2: Lipid sammensætning af nærbundsprøver fra kystnære Newfoundland. Data er (middel±standard afvigelse) af 220 m afregning partikler fra Conception Bay Newfoundland, og mysid, Erythrops erythrophtalma.
Fodnote: Neutrale lipider: kulbrinter, voks og sterylestere, ketoner, triacylglyceroler, frie fedtsyrer; (FFA), alkoholer (ALC), steroler, diacylglyceroler; LI: lipolyseindeks [(FFA+ ALC) (acyl lipider + ALC)-1]; Total lipid (summen af FID-bestemte lipidklasser) partikler - % tørvægt, Mysid - % vådvægt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den hastighed, hvormed TLC-FID-systemet giver synoptisk lipidklasseinformation fra små prøver, gør TLC-FID til et muligt værktøj til screening af havprøver, før der iværksættes mere involverede analyseprocedurer. Sådanne analyser kræver normalt frigivelse af komponentforbindelser fra lipidekstrakter og derivatisering for at øge volatiliteten i tilfælde af gaskromatografi. TLC-FID kombineret med GC-FID har vist sig at være en stærk kombination for ekstrakter af fisk og skaldyr og andre fødevarer14. For vellykkede marine lipidanalyser er det afgørende, at prøverne er beskyttet mod nedbrydning og forurening hele vejen igennem, og at der udvises stor omhu med påføringen af prøven på stangen. En fremgangsmåde er at anvende hele marineprøven på stangen ved hjælp af en mikrokapillær pipettor15, og en nyskabelse inden for marine prøvetyper er at tilføje mikrolag og aerosolprøver til havvandsprøver16.
FID-systemet i den automatiske scanner giver hurtig mikrogram kvantitet uden derivatisering eller oprydning. Det er dog ikke så følsomt, præcist eller lineært som findes i gaskromatografer. Det betyder, at der skal konstrueres kalibreringskurver, og at det af og til kan være nødvendigt at analysere prøver ved to forskellige belastninger for at holde både mindre og større lipidklassetoppe inden for kalibreringsintervaller.
Ved at bruge den delvise scanningsfacilitet i FID-scanneren er det muligt at adskille flere klasser lipider fra en enkelt prøveapplikation til en stang. Kromatografi på silicsyre løser imidlertid ikke voksestere (WE) og sterylestere (SE), og et par klasser kan medtages i den "acetone-mobile polar lipid" (AMPL) top17. WE-SE var den største lipid klasse i bonefish oocytter, og det foreslås, at de bruges til at støtte opdrift og / eller energilagring18.
I AMPL fra fotosyntetiske organismer elver glycoclycerolipids ofte sammen med monoacylglyceroler og pigmenter i acetone. Dette kan give kvantitet bekymring som chlorophyll a og glycolipider monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) og digalactosyl diacylglycerol (DGDG) har forskellige FID svar i scanneren; vi bruger dog 1-monopalmitoyl glycerol som standard for AMPL-klassen, og dette har et respons mellemprodukt blandt dem17.
Mens nogle FID scanner toppe kan indeholde mere end én lipid klasse, er det nogle gange nyttigt at funktionelt omgruppere adskilt lipid klasser. For eksempel, AMPL og PL er blevet grupperet i polar lipider og derefter i strukturelle lipider med tilsætning af sterol19. Sådanne grupperinger blev brugt til at studere kritiske perioder for lipidbrug under udvikling i hvirvelløse dyr19. Andre grupper , der omfatter frie fedtsyrer og alkoholer , kan anvendes somnedbrydningsindikatorer som f.eks. LI er lipolyseindekset for alle acyl lipider, mens HI er hydrolyseindekset for ikke-polære acyl lipider. LI-værdier er altid lavere end værdierne for HI for enhver prøve, fordi alle acyl lipider er inkluderet.
Lejlighedsvis peak opdeling forekommer i stang adskillelser af ekstrakter af marine prøver på grund af tilstedeværelsen af høje niveauer af flerumættede arter, som kan gøre identifikation vanskelig. Dette er blevet observeret med voksestere (figur 3), triacylglyceroler og frie fedtsyrer20,21og kræver co-spotting med autentiske standarder og / eller bekræftelse med andre kromatografiske teknikker. På samme måde kan der forekomme topsplitning i polarlipidregionen (figur 2 og figur 3), og der kan foretages yderligere udviklinger for at adskille komponentglykolipider og pigmenter17,22 og fosfolipidklasse22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) tilskud nummer 105379 til C.C. Parrish. Memorial University's Core Research Equipment &Instrument Training (CREAIT) Network hjalp med at finansiere denne publikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C.
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C.
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
