Summary
Detta protokoll är för bestämning av lipider i havsvatten och biologiska exemplar. Lipider i filtrater extraheras med kloroform eller blandningar av kloroform och metanol när det gäller fasta ämnen. Lipidklasser mäts genom stång tunnskiktskromatografi med flamjoniseringsdetektering och deras summa ger det totala lipidinnehållet.
Abstract
Lipider består till stor del av kol och väte och ger därför en större specifik energi än andra organiska makromolekyler i havet. Som kol- och väterika är de också hydrofobiska och kan fungera som lösningsmedels- och absorptionsbärare för organiska föroreningar och kan därmed vara drivkrafter för förorenande bioackumulering i marina ekosystem. Deras hydrofoba natur underlättar deras isolering från havsvatten eller biologiska exemplar: marin lipidanalys börjar med provtagning och sedan extraktion i icke-polära organiska lösningsmedel, vilket ger en bekväm metod för deras separation från andra ämnen i en vattenmatris.
Om havsvatten har provtagits innebär det första steget vanligtvis separation i operativt definierade "upplösta" och "partikelgrupper" genom filtrering. Prover samlas in och lipider isoleras från provmatrisen vanligtvis med kloroform för verkligt upplöst materia och kolloider, och med blandningar av kloroform och metanol för fasta ämnen och biologiska prover. Sådana extrakt kan innehålla flera klasser från biogena och antropogena källor. Vid denna tidpunkt kan totala lipider och lipidklasser bestämmas. Total lipid kan mätas genom summering av individuellt bestämda lipidklasser som vanligtvis har separerats kromatografiskt. Tunnskiktskromatografi (TLC) med flamjoniseringsdetektering (FID) används regelbundet för kvantitativ analys av lipider från marina prover. TLC-FID tillhandahåller synoptisk lipidklassinformation och, genom summeringsklasser, en total lipidmätning.
Lipidklassinformation är särskilt användbar i kombination med mätningar av enskilda komponenter, t.ex. fettsyror och/eller steroler, efter att de släppts ut från lipidextrakt. Det stora utbudet av lipidstrukturer och funktioner innebär att de används brett i ekologisk och biogeokemisk forskning som bedömer ekosystemens hälsa och graden av påverkan av antropogena effekter. De har använts för att mäta ämnen av kostvärde till marina djur (t.ex. vattenfoder och/eller byten) och som en indikator på vattenkvaliteten (t.ex. kolväten).
Introduction
De metoder som beskrivs här gäller ämnen som definieras operativt som marina lipider. Denna definition är baserad på deras mottaglighet för vätske-vätskeutvinning i icke-polära organiska lösningsmedel, och det ger en bekväm metod för deras separation från andra ämnen i en vattenmatris. Deras hydrofoba natur underlättar deras isolering från havsvatten eller biologiska exemplar, liksom deras berikning och avlägsnande av salter och proteiner.
Mätningen av lipidinnehåll och dess sammansättning i marina organismer har varit av stort intresse för livsmedelsvävekologi, vattenbruksnäring och livsmedelsvetenskap i årtionden. Lipider är universella komponenter i levande organismer, fungerar som väsentliga molekyler i cellmembran, som viktiga källor till biotillgänglig energi, vilket ger värmeisolering och flytkraft och fungerar som signalmolekyler. Även om förfaranden för lipidbestämning inom andra områden har beskrivits väl, kräver deras användning med marina prover vanligtvis modifiering för att anpassa sig till fältförhållandena samt för att prov typ1.
För havsvattenprover kräver det första steget vanligtvis att de driftsdefinierade "upplösta" och "partikelfraktionerna" separeras, normalt genom filtrering (protokoll steg 1). Partikelfraktionen är vad som behålls av filtret, och porernas storlek är viktig för att definiera avskärningen2. Ofta när vi tar prover på partiklar vill vi relatera lipidkoncentrationer till totala masskoncentrationer, i vilket fall ett separat, mindre, prov (t.ex. 10 ml) måste tas för detta ändamål (protokoll steg 1, notera). För att få en korrekt massbestämning är det viktigt att lägga till ammoniumformat (35 g /L) i slutet av filtreringen.
Havsvattenstarratet från det större provet bör uppgå till mellan 250 ml och 1 L beroende på provtyp och utsättas för vätske-vätskeutvinning i en separatortratt (protokollsteg 2). Lipidernas hydrofoba natur innebär att de kan separeras från andra föreningar genom extraktion i ett icke-polärt lösningsmedel som kloroform. Ett tvåskiktssystem skapas där lipider delas upp i det organiska skiktet medan vattenlösliga komponenter stannar kvar i vattenskiktet.
Partikelprover på ett filter eller biologiska provexemplar extraheras med en modifierad folch et al. extraktion3, även med kloroform (protokollsteg 3). Återigen skapas ett organiskt/vattenhaltigt system där lipider delas upp i den organiska fasen, medan vattenlösliga molekyler förblir i vattenfasen och proteiner fälls ut. Faktum är att för fasta ämnen använder de flesta laboratorier någon variation av Folch et al. extraktion3-förfarandet som involverar kloroform och metanol. För filter är det första steget att homogenisera i 2 ml kloroform och 1 ml metanol.
Under extraktionen bör man vara noga med att skydda lipider från kemisk eller enzymatisk modifiering genom att hålla prover och lösningsmedel på is för att minska hydrolysering av esterbindning eller kolkolsoxidation av dubbelbindning. Vävnader och cellfetter är ganska väl skyddade av naturliga antioxidanter och genom compartmentalization4; Efter homogeniseringen av proverna kombineras dock lipider som är mer benägna att ändras, kemiskt eller enzymatiskt. Vissa lipider, såsom de flesta steroler, är mycket stabila, medan andra, såsom de som innehåller fleromättade fettsyror, är mer mottagliga för kemisk oxidation. Andra, såsom steroler med konjugerade dubbla bindningar, är benägna att oxidation katalyseras av ljus5. Efter extraktioner är lipider mycket mer mottagliga för kemisk oxidation, och prover bör lagras under en inert gas som kväve. En mild ström av kväve skulle också användas för att koncentrera extrakt.
Efter koncentrationen skulle lipider sedan normalt kvantifieras i bulk eftersom de är en viktig komponent i marina ekosystem som ger en hög koncentration av energi, mer än dubbelt så mycket som kJ/g kolhydrater och proteiner. De skulle alltid kvantifieras som enskilda komponenter: den omfattande analysen av lipider innebär i allmänhet separation i enklare kategorier, beroende på deras kemiska natur. Således innebär en fullständig analys att mäta totala lipider, lipidklasser och enskilda föreningar.
Total lipid kan bestämmas genom att ta summan av individuellt uppmätta lipidklasser åtskilda av kromatografi6. En marina lipid extrakt kan innehålla mer än ett dussin klasser från biogena och antropogena källor. Det stora utbudet av lipidstrukturer innebär att mycket information kan erhållas genom att bestämma enskilda grupper av strukturer. Lipidklasser individuellt, eller i vissa grupper, har använts för att signalera förekomst av vissa typer av organismer, liksom deras fysiologiska status och aktivitet2. De har också använts som en indikator på ursprunget för organiskt material, inklusive upplöst organiskt material (DOM) samt hydrofoba föroreningar.
Triacylglycerols, fosfolipider och steroler är bland de viktigare biogena lipidklasserna. De två första är biokemiskt besläktade eftersom de har en glycerol ryggrad till vilken två eller tre fettsyror är förestedade (figur 1). Triacylglycerols, tillsammans med vaxestrar är mycket viktiga lagringsämnen, medan andra fettsyrahaltiga lipidklasser som diacylglyceroler, fria fettsyror och monoacylglyceroler i allmänhet är mindre beståndsdelar. Fria fettsyror finns vid lägre koncentrationer i levande organismer, eftersom de omättade kan vara giftiga7. Steroler (både i sina fria och förestade former) och feta alkoholer ingår också bland de mindre polära lipiderna, medan glykolipider och fosfolipider är polära lipider. Polafetter har en hydrofil grupp, vilket möjliggör bildandet av lipidbilayers som finns i cellmembran. Fria steroler är också membranstrukturkomponenter, och när de tas i förhållande till triacylglyceroler ger de ett tillstånd eller näringsindex (TAG: ST) som har använts i stor utsträckning8. När de tas i förhållande till fosfolipider (ST: PL) kan de användas för att indikera växtens känslighet för salt: högre värden upprätthåller strukturell integritet och minskar membrangenomsläppligheten9. Inversen av detta förhållande (PL: ST) har studerats i tvåskaliga vävnader under temperaturanpassning10.
Marina lipidklasser kan separeras av tunnskiktskromatografi (TLC) på kiselgelbelagda stavar (protokollsteg 4) och sedan detekteras och kvantifieras genom flamjoniseringsdetektering (FID) i en automatisk FID-skanner. TLC/FID har blivit rutinmässigt använt för marina prover eftersom det snabbt tillhandahåller synoptiska lipidklassdata från små prover och genom att ta summan av alla klasser, ett värde för totala lipider. TLC/FID har genomgått en kvalitetssäkringsbedömning (QA) och har visat sig uppfylla de standarder som krävs för konsekvent extern kalibrering, låga ämnen och exakt replikatanalys11. Variationskoefficienter (CV) eller relativa standardavvikelser är cirka 10%, och FID-skannerns totala lipiddata är normalt cirka 90% av dem som erhålls med gravimetriska och andra metoder2. Gravimmetri ger högre totala lipider sannolikt eftersom FID-skannern endast mäter icke-flyktiga föreningar, och även som ett resultat av eventuell inkludering av icke-lipidmaterial i gravimetriska mätningar.
Informationen som tillhandahålls av lipidklassanalys är särskilt användbar i kombination med bestämningar av fettsyror som individer, eller steroler, eller de två i kombination. Det första steget mot dessa analyser är frisättning av alla komponentfettsyror tillsammans med steroler i lipidextrakten (protokollsteg 5). Det stora utbudet av lipidstrukturer och lipidfunktioner innebär att de har sett en bred användning i ekologiska och biogeokemiska studier som bedömer ekosystemens hälsa och i vilken utsträckning de har påverkats av antropogena och terrestra insatsvaror. De har använts för att mäta biosyntesen av ämnen av kostvärde till den marina faunan samt för att ange kvaliteten på vattenprover. Mätning av lipider i sedimentkärnprover hjälper till att visa sedimentens känslighet för förändringar i människans markanvändning nära land-havsmarginalen.
Det primära verktyget för att identifiera och kvantifiera enskilda lipidföreningar har traditionellt varit gaskromatografi (GC) med FID. Före analys görs dock dessa föreningar mer flyktiga genom härledning. Fettsyror frigörs i närvaro av en sur katalysator (H2SO4) från acylfettklasser (figur 1). I organisk kemi kommer akrylgruppen (R-C=O) vanligtvis från en karboxylsyra (R-COOH). De re-esterified sedan till fettsyra metylestrar (FAME) som ger bättre separationer på GC kolonner (protokoll steg 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: För att rengöra glas, instrument och filter för lipidanalyser, tvätta dem 3 gånger med metanol följt av 3 tvättar med kloroform, eller värm dem till 450 °C i minst 8 timmar.
1. Filtreringsförfarande för havsvatten upplöst och partikelfetter
OBS: Den särskilda delen av räntan definieras operativt av filtreringsförfarandet. I detta fall är porstorleken 1,2 μm.
- Ställ in filtreringsgrenröret utan filter och skölj installationen med filtrerat havsvatten.
- Placera med hjälp av rena tångar ett 47 mm glasfiberfilter (GF/C) som har tvättats i det rena filtreringssystemet.
- Ta provet och snurra försiktigt för att återanvända allt material som kan ha satt sig på botten av uppsamlingsbehållaren. Mät noggrant ut en känd volym, i det här fallet 1 L, och filtrera detta genom filtret.
OBS: Volymen beror på mängden partiklar i provet: vanligtvis mellan 250 ml och 5 L beroende på säsong och plats. - När provet har mätts ut, blöt försiktigt filtret med filtrerat havsvatten. Tillsätt hela provet långsamt till filtreringssystemet och skölj den graderade cylindern med filtrerat havsvatten för att säkerställa att alla partiklar tillsätts till filtret. Skölj inställningen med filtrerat havsvatten på sidorna för att säkerställa att alla partiklar sköljs ner på filtret.
- Låt allt havsvatten passera genom filtret men låt inte filtret torka ut helt eftersom det kan störa cellerna på filtret; bryta suget när det sista vattnet försvinner.
- Använd rena tångar och en ren pipett, vik filtret i hälften, sedan i tredjedelar och sedan i halv längd för att rulla filtret i ett rör. Placera den i en ren, märkt 10 ml glasflaska.
- Täck filtret med 2 ml kloroform. Fyll huvudutrymmet med kväve och försegla med PTFE-tejp. Placera i ett rack i en -20 °C frys. Proverna kommer att vara stabila vid denna temperatur upp till ett år.
OBS: För att relatera lipidkoncentrationer till totala masskoncentrationer behövs också en torrviktsmätning. Detta innebär att sätta ett 24 mm förvägt filter i en torrviktsfiltreringsinställning, röra om provet och ta ett litet delsampel som filtreras på det lilla filtret. När filtret är nästan torrt tillsätts ca 10 ml 3,5% ammoniumformat till filtret. Filtret viks i hälften, återförs till en märkt Petri-maträtt och placeras i en frys.
2. Vätskevätskeextraktion av havsvatten eller flytande prover
-
Förbereda provet
- Mät en känd mängd filtrat i en lipid ren glas graderad cylinder. Placera detta prov i en ren 1 L separatorisk tratt. Tillsätt sedan 20 ml kloroform till provet och skaka i 2 minuter, ventilera ofta.
-
Avlägsnande av första extraktet och tillsatsen av syra efter första separationen
- Linda tratt i aluminiumfolie och vänta 5 till 10 min för separation. Skala tillbaka botten av folien för att se de två lagren. Samla det nedre, organiska skiktet genom kranen i en ren rund bottenkolv, var försiktig så att du inte inkluderar något av det övre lagret. Kapsej den runda bottenkolven under kväve och lägg den i frysen.
- Tillsätt 0,25 ml koncentrerad H2SO4 för varje liter prov, till provet i separatorytratten och skaka tratten försiktigt.
- Tillsätt 10 ml kloroform och skaka kraftigt i 2 minuter medan du ventilerar ofta. Låt separationen ske.
-
Andra och tredje separationerna
- Vänta tills separationen och lägg bottenskiktet i den runda bottenkolven.
- Tillsätt en tredje 10 ml kloroform och skaka i 2 minuter, ventilera ofta igen. Tillsätt bottenskiktet i den runda bottenkolven efter separationen.
- Överför extraktet i den runda bottenkolven till en roterande förångare, avdunsta och överför till en 2 ml flaska.
3. Extraktionsprotokoll för fasta ämnen (modifierad Folch et al.3 extraktion)
-
Installationen
OBS: Extraktionsinställningen kräver en isolerad behållare fylld med is. Lösningsmedel inkluderar metanol, kloroform extraherat vatten och 2:1 kloroform: metanol. Alla lösningsmedel ska placeras på is så att de är kalla när extraktionerna påbörjas. Proverna går också på is, så att allt förblir kallt.- Skölj alla rör och PTFE-fodrade lock 3 gånger med metanol och sedan 3 gånger med kloroform. Ett centrifugrör och en 15 ml flaska med lock behövs för varje extraktion.
- Placera provet i ett centrifugrör som innehåller 2 ml kloroform. Provets storlek beror på mängden lipid som finns, cirka 5 till 10 mg lipid som föredras.
-
Slipning och extraktion
- Tillsätt cirka 1 ml iskall metanol och slipa provet i en massa snabbt med en ren homogenisator eller PTFE/metallsänkt stång.
- Tvätta stången tillbaka in i röret med cirka 1 ml iskall 2:1 kloroform: metanol och sedan med 1/2 ml iskallt kloroformextraktat vatten. Använd vid behov en ren uppsättning tång för att tvinga tillbaka partiklar i injektionsflaskan innan du tvättar. Cap röret och sonicate blandningen i 4 minuter i ett ultraljudsbad (35 - 42 kHz).
-
Dubbel pipettering:Centrifugera provet i 2 min vid 1800 × g. Samla hela det organiska skiktet (bottenskiktet) med hjälp av den dubbla pipetteringstekniken där en 5 3/4" pipett med glödlampan på löst trycks försiktigt genom de två lagren, samtidigt som glödlampan kläms, vilket gör att bubblor kommer ut.
- När botten av det andra lagret har nåtts, använd tummen för att ta bort glödlampan utan att dra det organiska skiktet i pipetten. Placera en 9" pipett inuti 5 3/4" en och ta bort bottenskiktet genom 5 3/4" pipetten.
- Placera extraktet i en ren flaska. Fortsätt att ta bort det nedre lagret tills allt är borttaget.
-
Tvättrör :Skölj 9" pipetten i injektionsflaskan som innehåller det organiska skiktet med 1,5 ml iskall kloroform för att skölja ner pipettens utsida och 1,5 ml för att skölja ner insidan. Vrid försiktigt pipetten under tvätt och se till att all kloroform rinner ner pipetten till injektionsflaska.
- Skölj 5 3/4" pipetten i röret som innehåller vattenskiktet på samma sätt.
- Sonikera och centrifugera proverna och dubbelpipetten när de separeras, med hjälp av nya pipetter varje gång. Upprepa minst tre gånger och slå samman alla organiska lager. Efter att ha tagit bort det organiska skiktet för tredje gången, tvätta båda pipetterna i injektionsflaskan som innehåller det organiska skiktet.
- Använd en mild ström av kväve, koncentrera dig ner till volym, försegla sedan med PTFE-tejp och förvara i en frys.
4. Utveckla system och steg för stång TLC-separation av marina lipidklasser
-
Förbereda stavarna för TLC
- Blank skanning av stavarna i den automatiska FID-skannern tre gånger
- Spotting av ett prov: Applicera prover och standarder med en spruta på stavarna vid eller strax under ursprunget. Dispensera 0,5 μL och rör vid droppen till stången. Låt torka innan du placerar nästa droppe på samma plats. Se alla prover i en linje på stavar.
- Fokusering i aceton: Fokusera prover två gånger (tre gånger om proverna är mycket koncentrerade) i 70 ml aceton. Titta på lösningsmedlets front när den klättrar på stången tills botten av platsen smälter samman med toppen. Ta bort stavarna, torka dem i cirka 5 s och upprepa sedan proceduren för att producera ett smalt band av lipidmaterial nära botten av stången.
- Torka och konditionera stavarna i en konstant fuktighetskammare i 5 min. En konstant fuktighetskammare är en desiccator med en mättad lösning av kalciumklorid under plattan.
-
Sekvens som leder till det första kromatogrammet (kolväte till keton)
-
Första utvecklingssystemet: Det första utvecklingssystemet är hexan:dietyleter:myrsyra, 98.95:1:0.05. Använd en spruta för att tillsätta myrsyran men skölj först sprutan 3× med myrsyra. Skölj ut myrsyran ur sprutan omedelbart efteråt med kloroform. Använd 30 ml av blandningen för att blöta papperet och skölj tanken. Kassera sköljlösningen och tillsätt resterande 70 ml till tanken.
- Ta racken och sänk dem försiktigt i tanken. Titta tills lösningsmedlets front når provfläckarna och starta sedan timern. Efter 25 min, ta bort stavarna från utvecklingskammaren, torka i konstant fuktighetskammaren i 5 min och bygga om i samma lösning i ytterligare 20 min.
- Torka stavarna i 5 minuter i den automatiska FID-skannern och skanna sedan till den lägsta punkten bakom ketontoppen med en PPS-skanning på 25.
-
Första utvecklingssystemet: Det första utvecklingssystemet är hexan:dietyleter:myrsyra, 98.95:1:0.05. Använd en spruta för att tillsätta myrsyran men skölj först sprutan 3× med myrsyra. Skölj ut myrsyran ur sprutan omedelbart efteråt med kloroform. Använd 30 ml av blandningen för att blöta papperet och skölj tanken. Kassera sköljlösningen och tillsätt resterande 70 ml till tanken.
-
Sekvens som leder till det andra kromatogrammet (triacylglycerol till diacylglycerol):
- Konditionera stavarna i 5 min i den konstanta fuktighetskammaren.
- Andra utvecklingssystemet: Det andra utvecklingssystemet är hexan:dietyleter:myrsyra, 79:20:1. Tillsätt ~ 30 ml till utvecklingstanken för att blöta papperet och skölj tanken. Kassera sedan och utveckla stavarna i 40 min i de återstående 70 ml. För bästa separation mellan TAG (mättad) och TAG-topparna (fleromättade) använd en blandning av 79.9:20:0.1, men för separation av ST- och DAG-topparna använd en blandning av 79:20:1.
- Torka och skanna till lägsta punkten bakom diacylglycerol topp i en andra partiell skanning med hjälp av en PPS scan 11.
-
Sekvens som leder till det tredje kromatogrammet (acetonmobil polarfett och fosfolipid)
- Konditionera stavarna i 5 minuter i den konstanta fuktighetskammaren.
- Utveckla stavarna två gånger i 15 minuter i 70 ml aceton. Mellan utvecklingen lufttorka stavarna i ca 30 sekunder.
- Konditionera stavarna i 5 minuter i den konstanta fuktighetskammaren.
- Tredje utvecklingssystemet: Det tredje utvecklingssystemet är en blandning av kloroform, metanol och kloroformsextraktat vatten, 50:40:10. Utveckla stavarna två gånger i 10 minuter i 70 ml av blandningen. Mellan utvecklingen torkar luftstavarna i ca 30 sekunder.
- Torka och skanna hela längden på stavarna.
5. FAME härledning med H2SO4 i MeOH
-
Göra Hilditch reagens
- Beredning av metanol:Placera 100 ml MeOH i en ren volymetrisk kolv och strö sedan försiktigt i vattenfri NaSO4 tills kolvens botten är täckt. När du har täckt, vänd två gånger så att något vatten i metanol absorberas av NaSO4. Efter invertering och skakning, låt den sitta i minst 5 min.
- Tillsats av syra:Dekantera metanolen långsamt i en glasburk (vid det här laget är NaSO4 en hård klump i botten av kolven) och H2SO4 tillsätts. Tillsätt långsamt 1,5 ml svavelsyra till metanolen med hjälp av en pipett. Tillsätt några droppar i taget och när all syra har tillsatts, lock och rör försiktigt om för att blanda. Lösningen är nu klar att användas för derivat, men den måste kompenseras varje vecka.
-
Att göra derivaten
- Överför cirka 200 μg lipider från en extraktflaska som har fått volymen upp till en känd mängd, till en ren, 15 ml flaska och avdunsta under kväve till torrhet. Den borttagna mängden kommer att bestämmas av koncentrationen av provet från TLC/FID. Använd en ren pipett för att ta bort provet.
- När provet har torkat tillsätt 1,5 ml diklormetan och 3 ml av det nytillverkade Hilditch-reagenset.
- Virvel provet, och sonicate det i ett ultraljud bad i 4 min för att ta bort lipider som har klibbat till glasflaskan. Fyll injektionsflaskan med kväve, lock och försegla den med PTFE-tejp och värm vid 100 °C i 1 timme.
-
Stoppa reaktionen
- Låt proverna svalna helt till rumstemperatur i 10 minuter efter att de har tagits ut ur ugnen och öppna sedan injektionsflaskan försiktigt.
- Tillsätt långsamt cirka 0,5 ml mättad natriumbikarbonatlösning (9 g/100 ml kloroformextraktat vatten), sedan 1,5 ml hexan. Skaka eller virvla injektionsflaskan och låt sedan stå så att den separeras i 2 lager.
-
Samla fames
- Ta bort det övre lagret: När härledningen har stoppats, och det finns tydlig separation, ta bort den övre, organiska fasen och placera i en lipidren 2 ml flaska.
- Avdunsta lösningsmedlet i 2 ml flaska till torrhet och fyll på det med hexan till cirka 0,5 ml.
- Fyll injektionsflaskans huvudutrymme med kväve, lock och försegla injektionsflaskan med PTFE-tejp, sonkat i ytterligare 4 minuter för att suspendera fettsyrorna igen, och sedan är den redo att gå till GC.
OBS: Om fettsyrakoncentrationer krävs måste vattenskiktet tvättas tre gånger med hexan och alla organiska skikt som slås samman i 2 ml injektionsflaskan. Detta innebär att tillsätta 2 ml hexan, virvla provet, centrifugera och ta bort det organiska skiktet, allt upprepat 3 gånger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som den snabbast växande livsmedelsproduktionssektorn utvecklas vattenbruket när det gäller tekniska innovationer och anpassningar för att möta förändrade krav. En av dessa är att minska beroendet av fiskmjöl och fiskolja från vilda källor, som ger foderingredienser för många vattenbruksarter. Terrestra växtoljor undersöks som hållbara och ekonomiska ersättningar för fiskolja i aquafeeds, och levern är en målvävnad för analys eftersom det är den primära platsen för lipidmetabolism12. Figur 2 visar de råa TLC-FID-kromatogrammen som erhållits från vår niokomponentstandard, en diet som vi formulerade med fiskolja på 7% och rapsolja på 5%, och levervävnad från en atlantlax som matas med den kosten. Tabell 1 visar de data som erhållits efter analys av dietrepliter och prover från olika fiskar. Dessa data erhölls efter att ha konstruerat standardkurvor från skanner FID-svar för att kvantifiera lipidklasserna i extrakten med hjälp av Peak Simple-programvara (version 4.54). Uppgifterna visar prevalensen av triacylglyceroler i dieter och lever och även vikten av membranfosfolipider i levern.
Kontinentala marginaler har i allmänhet mycket hög biologisk produktivitet och de är särskilt viktiga i kretsloppet av kol. Ytans primära produktivitet når havsbotten mer så i grundare vatten, så att mäta kvantitet och kvalitet på partiklar som sätter sig från det övre blandade lagret till den bentiska näringsväven är därför av stort intresse. Lipider är rika på kol och har ett mycket högt energiinnehåll och är viktiga komponenter i kontinentalhyllornas produktivitet. Historiskt sett stödde vatten intill Newfoundland och Labrador ett av de största fiskena i världen i ungefär fem århundraden, och vi har studerat produktion och överföring av lipider i detta system13. Figur 3 visar TLC-FID kromatogram erhållna från vår standard, lipider i sedimentering av partiklar som samlats in på 220 m utanför Newfoundlands kust och lipider i en liten mysid, Erythrops erytrophtalma samlas in nära samma djup. Den här gången har kromatogrammen bearbetats genom plottningsprogram och de två partiella skanningarna har kombinerats med den slutliga fullständiga skanningen. Bland 19 taxa från 5 phyla hade den lilla mysiden i genomsnitt den högsta lipidkoncentrationen (6% av våtvikten)13.
Figur 1: Huvudsakliga lipidklasser i marina prover i ungefärlig ordning av ökande polaritet. Varje struktur ritas med den mest hydrofoba delen av molekylen som pekar mot figurens högra sida. Representativa föreningar för lipidklasser är: - kolväte: nonadecane; vaxestrar: hexadecylpalmitat; sterylestrar: kolesterylpalmetitat; metylester: metylpalmetat; keton: 3-hexdecanone; triacylglycerol: tripalmitin; fri fettsyra: palmitsyra; alkohol: fytol; sterol: kolesterol; diacylglycerol: dipalmitoyl glycerol; monoacylglycerol: monopalmitoyl glycerol; glykolipid: digalaktosyldiacylglycerol; fosfolipid: dipalmitoylfosfatidylcholin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: TLC-FID-kromatogram av lipidsammansättning från ett vattenbruksfoderexperiment. Extrakt upptäcktes på kiseldioxid gel-belagda TLC stavar och ett trestegs utvecklingssystem användes för att separera lipid klasser. Den första och andra utvecklingssystemen var hexan: diethyleter: myrsyra (98.95:1:0.05) respektive (79.9:20:0.1) för att separera neutrala lipider inklusive triacylglycerol, fri fettsyra och sterol för skanning i den automatiska FID-skannern. De tredje utvecklingssystemen bestod av 100% aceton före kloroform:metanol:vatten (5:4:1) för att separera acetonmobila polära lipider och fosfolipider. Standardkurvor (dvs. nonadecane, cholesterylpalmitat, 3-hexdecanone, tripalmitin, palmitsyra, cetylalkohol, kolesterol, monopalmitoylglycerol, dipalmitoylfosfatidylkolin) användes för att kvantifiera lipidklasserna i extrakten med hjälp av Peak Simple-programvara (version 4.54). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: TLC-FID-kromatogram av lipidsammansättning av prover nära botten från kusten Newfoundland. a) nio komponentstandard, b) 220 m sedimentering av partiklar från Conception Bay, Newfoundland, c) lipidklasser i mysid, Erythrops erytrophtalma. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Fiskolja/rapsolja diet | Atlantisk laxlever | |
| Kolväten | 1.3±0.9 | 0,5±0.2 |
| Steryl esters/vax esters | 0.4±0.6 | 0,6±0.3 |
| Etylester | 0 | 0 |
| Metyl esters | 0 | 0 |
| Etyl ketoner | 0 | 0.3±0.2 |
| Metyl ketoner | 0 | 0 |
| Glyceryleter | 0 | 0 |
| Triacylglycerols | 145,0±26,3 | 16.9±8.1 |
| Fria fettsyror | 21.9±2.2 | 1.2±0.9 |
| Alkoholer | 0 | 1.4±0.4 |
| Steroler | 6.8±2.1 | 2.6±0.2 |
| Diacylglycerols | 0 | 0 |
| Aceton Mobila Polar Lipider | 14.0±2.5 | 2.2±0.6 |
| Fosfolipider | 12.5±4.0 | 22.0±2.0 |
| Totalt lipider | 201,8±27,4 | 47.7±11.8 |
Tabell 1: Lipidsammansättning i ett vattenbruksfoderexperiment. Data är (medelvärde±standardavvikelse) av en experimentell diet som innehåller 6,80% fiskolja och 4,80% rapsolja, som utfodrad (mg g-1 våtvikt) och av lever av atlantlax (mg g-1 våtvikt) efter utfodring av denna diet i 12 veckor.
| Sedimentering av partiklar | Erytroper erytrophtalma | |
| Steryl esters/vax esters (% total lipid) | 10.2±8.28 | 8.85±1.67 |
| Triacylglycerols (% total lipid) | 19.7±5.35 | 58.5±9.19 |
| Fosfolipider (% total lipid) | 16.2 ± 3.51 | 21.4±5.35 |
| Neutrala lipider (% total lipid) | 12.5±4.0 | 73.4±5.46 |
| Lipolys index (%) | 18.1±5.20 | 2.77±2.78 |
| Totalt lipider | 0,57±0.25 | 5.86±1.44 |
| Neutrala lipider: kolväten, vax- och sterylester, ketoner, triacylglyceroler, fria fettsyror; (FFA), alkoholer (ALC), steroler, diacylglyceroler; LI: lipolys index [(FFA + ALC) (acyl lipider + ALC)-1]; Total lipid (summan av TLC/FID bestämda lipidklasser) partiklar - % torrvikt, Mysid - % våtvikt | ||
Tabell 2: Lipidsammansättning av nästan bottenprover från newfoundlandkusten. Data är (medelvärde±standardavvikelse) på 220 m sedimentering av partiklar från Conception Bay Newfoundland, och av mysid, Erythrops erytrophtalma.
Fotnot: Neutrala lipider: kolväten, vax- och sterylester, ketoner, triacylglyceroler, fria fettsyror. (FFA), alkoholer (ALC), steroler, diacylglyceroler; LI: lipolys index [(FFA+ ALC) (acyl lipider + ALC)-1]; Totalt lipid (summan av FID-bestämda lipidklasser) partiklar - % torrvikt, Mysid - % våtvikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den hastighet med vilken TLC-FID-systemet tillhandahåller information om synoptisk lipidklass från små prover gör TLC-FID till ett verktyg för screening av marina prover innan man genomför mer involverade analytiska förfaranden. Sådana analyser kräver vanligtvis frisättning av komponentföreningar från lipidextrakt och härledning för att öka volatiliteten vid gaskromatografi. TLC-FID i kombination med GC-FID har visat sig vara en kraftfull kombination för extrakt av skaldjur och andra livsmedel14. För framgångsrika marina lipidanalyser är det viktigt att prover skyddas mot nedbrytning och kontaminering genomgående och att stor försiktighet iakttas vid applicering av provet på stången. Ett tillvägagångssätt är att applicera hela det marina provet på stången med hjälp av en mikrokapillärrör15,och en innovation inom marina provtyper är att lägga till mikroskikts- och aerosolprover på havsytan i havsvattenproverna16.
FID-systemet i den automatiska skannern ger snabb mikrogramkvantitet utan härledning eller rensning. Det är dock inte så känsligt, exakt eller linjärt som finns i gaskromatografer. Detta innebär att kalibreringskurvor måste konstrueras och att det ibland kan vara nödvändigt att analysera prover vid två olika belastningar för att hålla både mindre och större lipidklasstoppar inom kalibreringsområden.
Genom att använda den partiella skanningsanläggningen i FID-skannern är det möjligt att separera flera klasser av lipider från en enda provapplikation till en stång. Kromatografi på kiselsyra lyckas dock inte lösa vaxestrar (WE) och sterylester (SE), och några klasser kan ingå i "aceton-mobile polar lipid" (AMPL) topp17. WE-SE var den största lipidklassen i benfiskoocyter och det föreslås att de används för att stödja flytkraft och/ eller energilagring18.
I AMPL från fotosyntetiska organismer eltenar glykoclycerolipiderna ofta tillsammans med monoacylglyceroler och pigment i aceton. Detta kan presentera en mängd oro som klorofyll a och glykolipider monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) och digalaktosyl diacylglycerol (DGDG) har olika FID svar i skannern. emellertid, vi använder, 1-monopalmitoyl glycerol som standard för AMPL klassen, och detta har ett svar mellanliggande bland dem17.
Medan vissa FID-skannertoppar kan innehålla mer än en lipidklass, är det ibland användbart att funktionellt omgruppera separerade lipidklasser. Till exempel har AMPL och PL grupperats i polära lipider och sedan i strukturella lipider med tillsats av sterol19. Sådana grupperingar användes för att studera kritiska perioder för lipidanvändning under utveckling hos ryggradslösa djur19. Andra grupperingar som omfattar fria fettsyror och alkoholer kan användas som nedbrytningsindikatorer såsom lipolysindex (tabell 2) eller hydrolysindex1. LI är lipolysindexet för alla acylfetter medan HI är hydrolysindexet för icke-polära akrylfetter. LI-värden är alltid lägre än för HI för något prov eftersom alla acylfetter ingår.
Ibland uppstår toppdelning i stångseparationer av extrakt av marina prover på grund av förekomsten av höga nivåer av fleromättade arter som kan försvåra identifieringen. Detta har observerats med vaxestrar (figur 3),triacylglyceroler och fria fettsyror20,21, och kräver samfläckning med autentiska standarder och / eller bekräftelse med andra kromatografiska tekniker. På samma sätt kan toppdelning förekomma i polarfettområdet(figur 2 och figur 3), och ytterligare utveckling kan göras för att separera komponentglykolipider och pigment17,22 och fosfolipidklasserna22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) anslagsnummer 105379 till C.C. Parrish. Memorial Universitys Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Network hjälpte till att finansiera denna publikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C.
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C.
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
